LT3329B - Method for the purification of insulin - Google Patents
Method for the purification of insulin Download PDFInfo
- Publication number
- LT3329B LT3329B LTIP713A LTIP713A LT3329B LT 3329 B LT3329 B LT 3329B LT IP713 A LTIP713 A LT IP713A LT IP713 A LTIP713 A LT IP713A LT 3329 B LT3329 B LT 3329B
- Authority
- LT
- Lithuania
- Prior art keywords
- insulin
- buffer
- molar
- glycine
- derivatives
- Prior art date
Links
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 100
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 title claims abstract description 56
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 title claims abstract description 56
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 title claims abstract description 46
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 238000000746 purification Methods 0.000 title abstract description 7
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical class O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims abstract description 10
- 239000011877 solvent mixture Substances 0.000 claims abstract description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 74
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 37
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 24
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 16
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N glycine betaine Chemical compound C[N+](C)(C)CC([O-])=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 229960003237 betaine Drugs 0.000 claims description 9
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 7
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 claims description 7
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 claims description 5
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 claims description 5
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 4
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 4
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 4
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 claims description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 claims description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 2
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 claims description 2
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 claims description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 2
- 235000008206 alpha-amino acids Nutrition 0.000 claims description 2
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 claims description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 2
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 2
- 125000000962 organic group Chemical group 0.000 claims description 2
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 claims description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims 2
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 claims 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N L-Alanine Natural products C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 claims 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims 1
- 150000001370 alpha-amino acid derivatives Chemical class 0.000 claims 1
- 125000000686 lactone group Chemical group 0.000 claims 1
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 claims 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 abstract description 16
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 abstract description 12
- 239000004026 insulin derivative Substances 0.000 abstract description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 52
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N n-propyl alcohol Natural products CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 35
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 32
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 30
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 30
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 21
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 20
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 20
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 16
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 16
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 14
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 14
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 9
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 9
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M Propionate Chemical compound CCC([O-])=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- KXKVLQRXCPHEJC-UHFFFAOYSA-N acetic acid trimethyl ester Natural products COC(C)=O KXKVLQRXCPHEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 7
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 7
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 7
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 7
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 6
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 6
- -1 alkaline-earth metal salts Chemical class 0.000 description 5
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 5
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010005991 Pork Regular Insulin Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 3
- 230000002608 insulinlike Effects 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 2
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 2
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 2
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000004237 preparative chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 2
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000011121 sodium hydroxide Nutrition 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- YWYZEGXAUVWDED-UHFFFAOYSA-N triammonium citrate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[NH4+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O YWYZEGXAUVWDED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- SAUDSWFPPKSVMK-LBPRGKRZSA-N (2s)-2-(n-phenylanilino)propanoic acid Chemical compound C=1C=CC=CC=1N([C@@H](C)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 SAUDSWFPPKSVMK-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- QDGAVODICPCDMU-UHFFFAOYSA-N 2-amino-3-[3-[bis(2-chloroethyl)amino]phenyl]propanoic acid Chemical group OC(=O)C(N)CC1=CC=CC(N(CCCl)CCCl)=C1 QDGAVODICPCDMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-SCSAIBSYSA-N D-arginine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-SCSAIBSYSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000026 Pentaerythritol tetranitrate Substances 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-M Trifluoroacetate Chemical compound [O-]C(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000003929 acidic solution Substances 0.000 description 1
- 150000001335 aliphatic alkanes Chemical class 0.000 description 1
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 description 1
- 229940045714 alkyl sulfonate alkylating agent Drugs 0.000 description 1
- 150000008052 alkyl sulfonates Chemical class 0.000 description 1
- 150000001371 alpha-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000005056 compaction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 108700025187 desamido (A21)- insulin Proteins 0.000 description 1
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 1
- SQNZJJAZBFDUTD-UHFFFAOYSA-N durene Chemical compound CC1=CC(C)=C(C)C=C1C SQNZJJAZBFDUTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VBZWSGALLODQNC-UHFFFAOYSA-N hexafluoroacetone Chemical compound FC(F)(F)C(=O)C(F)(F)F VBZWSGALLODQNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 125000004356 hydroxy functional group Chemical group O* 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 1
- 150000002596 lactones Chemical class 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 108010066381 preproinsulin Proteins 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 150000005621 tetraalkylammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 description 1
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
Išradimas skirtas insulino ir/arba jo darinių chromatografiniam gryninimo ant lipofiliškai modifikuoto silikagelio metodui, panaudojant vandeninius, buferinius tirpalus, į kurių sudėtį įeina besimaišantys su vandeniu organiniai tirpikliai, be to, vandeniniame buferiniame tirpale ištirpinti jonai ir/arba tirpalo pH reikšmė yra artima gryninamo insulino arba jo darinio izoelektriniam taškui.
Iš analitinių išskyrimo metodų yra žinomas insulinų arba jų darinių gryninimas ant lipofiliškai modifikuotų silikagelių (grįžtamoji fazė), kuri daugelį metų sėkmingai naudojama AESCh (aukšto efektyvumo skysčių chromatografija) (WS Welinder ir kt., J. Chrom. 361, 1986, 357-367). Dirbant analitiniais kiekiais, baltymas (|im) įleidžiamas į stiklo arba plastmasės kolonėlę ir po to plaunamas pratekančiu skysčių mišinio eliuentu (daugiausia rūgštūs, vandeniniai, buferiniai tirpalai su pastovia arba besikeičiančia organinio tirpiklio koncentracija). Šiuo atveju baltymo pilama mažiau kaip 30 gm/ml kolonėlės tūrio.
Iki šiol gryninimo metoduose dažnai naudojami palyginti toksiški, laboratorijoje naudojami tirpikliai (acetonitrilas) bei koroziją sukeliantys brangūs buferiniai komponentai, pavyzdžiui, tetraalkilamonio druskos, alkilsulfonatai, heksafluoracetonas, trifluoracetatas (E.P. Kroeff ir kt., J. Chrom., 461, 1989, 45-61. Mišinių, stipriai užterštų panašiomis į insuliną medžiagomis, atveju patenkinamas preparatyvinis atskyrimas, naudojant šiuos tirpiklius, yra nepasiekiamas, turint omenyje, šiuo atveju, kokybę, pagrindinių komponentų išeigą ir jų bendrą kiekį (J. Rivier, R. McClintock, J. Chrom., 268, 1983, 112-119; Peter ir kt., J. Chrom., 408, 1987, 43-52).
Insulinai, gauti prieš tai įvykdytų cheminių reakcijų metu, pavyzdžiui, stipriai rūgštinio eterinio skaidymo arba fermentinių (trans-)peptidinių procesų, kristalizacinio gryninimo procesų metu dažniausiai turi panašiomis savybėmis pasižyminčių priemaišų. Juos galima išgryninti, parinkus atitinkamą pH reikšmę, jonų mainų chromatografijos metodu, jei tik yra pakankamas potencialų skirtumas (US Nr. 4129560). Šio metodo trūkumas - praskiedimo efektas, kadangi jo metu, perdirbant nuosėdas, prarandamos vertingos medžiagos, be to, palyginti ilgas ciklas bei nedidelis galutinio produkto kiekis ir išeiga.
Preparatyvinis išskyrimas iš principo yra galimas, didinant kolonėlės tūrį, užpildymo laipsnį ir eliuento sunaudojimą. Būtini organinių tirpiklių kiekiai yra m3 eilės, pavyzdžiui, kolonėlės, kurios diametras daugiau kaip 20 cm, atveju. Analitinėje AESCh naudojami tirpikliai (pavyzdžiui, acetonitrilas, DMFA, metanolis, dioksanas ir kt.) yra toksiški, todėl šių metodų panaudojimas preparatyvinėje gamyboje reikalauja išlaidų apsaugos priemonėms. Šio išradimo tikslas yra insulinų ir jų darinių chromatografinio gryninimo metodo sukūrimas, kurio metu išlieka insulinų biologinis aktyvumas. Chromatografiniu metodu pasiekiamas aukštas švarumo laipsnis, sutrumpėja ciklo trukmė, kolonėlės eksploatacijos trukmė siekia daugiau kaip 50 chromatografinių ciklų, silikagelio stacionarinė fazė regeneruojama be ilgo sutankinimo proceso, panaudojami netoksiški tirpikliai, visa tai palengvina preparatyvinio išskyrimo panaudojimą gamybiniu mastu.
Sukurtas metodas, kuriuo remiantis galima išgryninti insuliną ir jo darinius chromatografiniu būdu vandeniniuose, buferiniuose tirpikliuose, kurių sudėtyje yra su vandeniu besimaišantys tirpikliai, ant lipofiliškai modifikuoto silikagelio, besiskiriantis tuo, kad buferiniuose tirpikliuose ištirpinti amfoteriniai jonai arba tirpiklio pH reikšmė yra artima gryninamo insulino arba jo darinio izoelektriniam taškui ir dalyvauja amfoteriniai jonai.
Amfoterinių jonų dalyvavimas arba chromatografija, kai tirpiklio pH reikšmė yra artima gryninamo insulino izoelektriniam taškui ir amfoterinių jonų dalyvavimas palengvina ne tik vertingo produkto gerą atskyrimą nuo priemaišų, bet ir gerą baltymų atskyrimą nuo stacionarinės fazės (lipofiliškai modifikuotas silikagelis). Pasiekiamas toks atskyrimas, kad galima išgryninti netgi insulino tirpalus, užterštus į insuliną panašiais komponentais, pavyzdžiui, A21-dezamidoinsulinas atskiriamas nuo insulino ir jo darinių. Be to, sėkmingai atskyrus baltymus· nuo kietos fazės, pailgėja kolonėlės eksploatacijos trukmė ir galima padidinti insulino išeigą.
Taigi, išradimas skirtas insulino ir/arba jo darinių chromatografiniam gryninimo metodui vandeniniuose, buferiniuose tirpikliuose, į kurių sudėtį įeina su vandeniu besimaišantys organiniai tirpikliai, ant lipofiliškai modifikuoto silikagelio, besiskiriančiam tuo, kad buferiniuose tirpikliuose ištirpinti amfoteriniai jonai arba tirpiklių mišinio pH reikšmė yra artima gryninamo insulino ar jo darinių izoelektriniam taškui ir dalyvauja amfoteriniai jonai.
Remiantis šiuo išradimo metodu, gali būti panaudoti visi insulinai, pavyzdžiui, visų rūšių žmogaus arba gyvulinės kilmės insulinai, insulino pirmtakai, tokie kaip, pavyzdžiui, proinsulinas arba pre-proinsulinas, rekombinuoti insulinai arba jų dariniai, išskirti iš genetiškai modifikuotų mikroorganizmų. Taip pat galima įvesti insulino darinius, gautus cheminių arba fermentinių reakcijų metu, pavyzdžiui, dez-Fen-BILT 3329 B insulinas, insulin-p-keten-sulfonatas, diarginininsulinas (B31, B32) , monoarginininsulinas arba difenilalanininsulinas (B31, B32) (US Nr. 4601852).
Dažniausiai įveda insulino darinius, kurių formulė (1),
A 2.Ą
As,
A/ £>
I
Liz. -Z kur
R30 - genetiškai koduotos L-aminorūgšties liekana,
X - hidroksigrupė; fiziologiškai inertinė bazinio tipo organinė grupė, Ci-C50; genetiškai koduota Laminorūgštis, gale turinti laisvą karboksilo funkcinę grupę, tokią kaip, pavyzdžiui, esterinę, amidinę, laktono grupę arba redukuotą iki CH2OH grupę, n - sveikas skaičius nuo 0 iki 10,
Y - vandenilis arba L-fenilalaninas,
A - ir B-grandinės - žmogaus arba gyvulinės kilmės insulino grandinės. Pirmenybė ypač teikiama formulės (1) insulino dariniams, kur R30 - Lalaninas arba L-treoninas ir
X - viena arba kelios L-aminorūgštys, priklausančios L-arginino, L-lizino arba L-fenilalanino grupei.
Insulinai ir jų dariniai gali būti įvedami tiek santykinai nevalytoje formoje, tiek ir preliminariai išvalytoje formoje (pavyzdžiui, chromatografiškai). Po daugkartinės kristalizacijos, o taip pat ir po gelchromatografijos insulinas dar yra užterštas panašiomis į insuliną, artimų molekulinių masių lydinčiomis priemaišomis, kurios, esant tam tikrai parinktai pH reikšmei, įtemptame būvyje skiriasi viena nuo kitos ir nuo insulino, bet su insulinu sudaro kompleksus (US Nr. 4129560) . Tokių medžiagų pavyzdžiu gali būti insulinetilo esteris ir kt. Lipofiliškai modifikuotas silikagelis yra toks silikagelis, kuris padengtas hidrofobine matrica. Pavyzdžiui, hidrofobine matrica galima naudoti alkanus su ilga grandine (nuo C3 iki C20) · Ypač geri yra šie lipofiliškai modifikuoti silikageliai:
- (R) NUKLEOSIL, firma MACHEREY + NAGEL sferinės ir nesferinės medžiagos su skirtingu grūdelių dydžiu (iki 45 ųm), porų dydis iki ĮOOA, modifikuoti C8 arba C18;
- (R) LICHREPREP, firma MERCK nesferinės arba sferinės medžiagos su skirtingu grūdelių dydžiu (iki 40 ųm), porų dydis 60-250A, modifikuoti C8-C18;
- (R) LICHREPREP SELECT, firma MERCK sferinės medžiagos, kurių grūdelių dydis iki 25 ųm, modifikuotas C8;
- (R) WATERS PREP modifikuotas C18, nesferiniai grūdeliai 50-105 μπι dydžio, porų dydis ĮOOA;
- (R) ZORBAX PRO 10, firma DU PENT modifikuotas C8, 10 μπι, sferiniai grūdeliai, porų dydis ĮOOA;
- (R) KROMASIL, firma EKA NEHEL modifikuotas C4-, C8-C18, iki 16 μπι, sferiniai grūdeliai, porų dydis 100, 150 arba 200A.
Amfoteriniai jonai - tai junginiai, kurie gali prijungti arba atskelti protonus, t.y., rūgščiuose tirpaluose sudaro katijonus, o šarminiuose tirpaluose anijonus, pavyzdžiui, α-aminorūgštys, betainas arba jo dariniai. Tinkamiausi amfoteriniai jonai - tai glicinas, glutaminas arba betainas (N-trimetilglicinas). Ypač tinkamas yra glicinas.
Insulino arba jo darinių izoelektrinis taškas (IET) tai tokia insulino tirpalo pH reikšmė, kuriai esant ištirpinto insulino katijonų ir anijonų krūvių suma lygi nuliui. Pavyzdžiui, kiaulės insulino IET yra tarp pH 5,3 ir 5,4 (H. Neurath, K. Baily, Protein Hormones, vol. II/A The Proteins, p. 636). Išsireiškimas arti izoelektrinio taško reiškia, kad turimos omenyje tokios pH reikšmės, kurios yra 1 pH vienetu didesnės arba mažesnės už gryninamo insulino IET. Daugiausia yra naudojamos tokios pH reikšmės, kurios yra 0,5 pH vieneto didesnės arba mažesnės už IET.
Eliuentas turi buferines medžiagas, kurios palaiko pastovią eliuento pH reikšmę. Tinkamos, literatūroje aprašytos buferinės medžiagos, tai fosfatai, šarminių arba žemės šarminių metalų druskos, pavyzdžiui, natrio citratas arba kalio acetatas, o taip pat ir amonio citratas, acetatas, sulfatas ir chloridas. Be to, į eliuentų sudėtį įeina besimaišantys su vandeniu organiniai tirpikliai, tokie kaip, pavyzdžiui, alkoholiai, ketonai, metilacetatas, dioksanas, dimetilsulfoksidas arba acetonitrilas. Tinkamiausi yra alkoholiai, pavyzdžiui, n- arba izopropanolis, metanolis, etanolis arba metilacetatas.
Tirpiklių, besimaišančių su vandeniu, koncentracija yra ribose nuo 1 iki 90%, dažniausiai nuo 10 iki 60%, dar geriau nuo 10 iki 35%. Buferinių medžiagų koncentracija yra nuo 1 mmol/1 iki 2 mol/1, perskaičiavus vandeniui kaip tirpikliui, dažniausiai nuo 25 mmol/1 iki 1 mol/1. Amfoterinių jonų koncentracija gali svyruoti plačiose ribose. Tinkamiausi kiekiai yra nuo 10 mmol/1 iki 1 mol/1, perskaičiavus vandeniui kaip tirpikliui, geriausia - nuo 20 mmol/1 iki 500 mmol/1.
Chromatografinio proceso metu temperatūra yra nuo 0°C iki 50°C, geriausia nuo 10 iki 30°C, ypač gerai nuo 15 iki 20°C. Chromatografijos metu naudojamas slėgis lieka pastoviu. Chromatografijos metu slėgis gali būti įvairus, pavyzdžiui, nuo 5 iki 400 bar, ypač gerai esant slėgiui 20-100 bar.
Kolonėlės užpildymas, chromatografija ir insulino bei jo darinių plovimas eliuentu atliekamas žinomais, įprastais, techniniais metodais. Kolonėlės užpildymas gryninamu insulino tirpalu atliekamas panaudojant vandeninius-alkoholinius arba, dažnai, grynai vandeninius buferinius tirpalus. Baltymų dalis insulino tirpale sudaro 1-10%, dažniausiai 3%.
Remiantis šiuo išradimu, insulinų praplovimas eliuentu atliekamas esant pastoviai buferinių medžiagų koncentracijai (izokritinė) arba keičiantis buferyje organinio tirpiklio, besimaišančio su vandeniu, daliai. Organinio tirpiklio dalis keičiasi taip, kad organinio tirpiklio koncentracija didėja priklausomai nuo eliuento tūrio, t.y., ji dažniausiai yra linijinėje priklausomybėje.
Po chromatografijos insulinas išskiriamas iš eliuento nusodinant cinku arba kristalinant. Tirpiklis iš tirpalo gali būti pašalinamas nudistiliuojant vakuume ir po to atstatant tirpalo koncentraciją praskiedus vandeniu. Kiekvienu atveju tirpiklio koncentracija prieš nusodinimą arba kristalinimą turi būti 10% arba mažiau, kad palaikyti baltymų koncentraciją 50 mg/1. Gautas grynas insulino nuosėdas galima išskirti dekantuojant, centrifuguojant arba filtruojant ir po to džiovinant.
Metodas, remiantis šiuo išradimu, tinka ne tik analitinei, bet ir preparatyvinei chromatografijai, ypač tuo atveju, jei, remiantis šiuo išradimu, šiuo metodu dirbama naudojant preparatyvinį AESCh įrenginį.
Išsireiškimas ’’preparatyvinė chromatografija suprantamas kaip gryninimo metodas su tikslu gauti gryną produktą ne tik analizei. Gryno produkto kiekis gali svyruoti plačiose ribose, pavyzdžiui, nuo 1 mg iki 50 kg, dažniausiai nuo 50 mg iki 15 kg.
Sekančiuose pavyzdžiuose atskirai pateikti šiame išradime aprašyti metodai.
PAVYZDYS
| Buferis A: | 0,2 molio amonio sulfato, 0,1 molio glicino, 0,05 molio natrio citrato, pH 5,5, vien tik vandens tirpalas; |
| Buferis B: | 0,1 molio amonio sulfato, 0,1 molio glicino, 0,05 molio natrio citrato, pH 5,5 vanduo/n-propanolis santykiu 1:1; |
| Sorbentas: | NUCLEOSIL C18, 15-25 gm, sferiniai, porų dydis ĮOOA, firma MACHEREY + NAGEL, Duren. |
Kolonėlės dydis: 40 mm x 250 mm.
Kolonėlė užpildoma 3,5 g žmogaus insulinu (HI) - gautu skaidant trifluoracto rūgštimi žmogaus insulino-B30ditretbutilo eterą/eteris - baltymo dalis 79,1%. Insulinas plaunamas eliuentu, aukšto slėgio siurblio pagalba sumaišant maišymo Įrenginyje buferius A ir B; dėl to susidaro propanolio gradientas nuo 14 iki 20%, jeigu siurbliu paduodamas 46 ml/min eliuento. Po frakcionavimo ir kristalinio žmogaus insulino (HI) išskyrimo, gaunamas produktas, turintis 97% baltymų pagrindinėje frakcijoje (išeiga 88,5%) ir 85,7% baltymų
| šalutinėje kiekis 96%. | frakcijoje (išeiga 7,5%). Bendras insulino |
| 2 PAVYZDYS | |
| Buferis A: | 0,1 molio amonio sulfato, 0,1 molio glicino, 0,025 molio natrio citrato, pH 5,5, vien tik vandens tirpalas; |
| Buferis B: | 0,05 molio amonio sulfato, 0,1 molio glicino, 0,025 molio natrio citrato, pH 5,5 vanduo/n-propanolis santykiu 1:1; |
io
Sorbentas: NUCLEOSIL C18-P, 15-25 m, sferiniai, porų dydis 100 A, firma MACHEREY + NAGEL.
Kolonėlės dydis: 40 mm x 250 mm.
Aukšto slėgio siurblio pagalba kolonėlė užpildoma 7,0 g žmogaus insulinu (HI) (baltymo dalis 86,1%), gautu skaidant žmogaus insulino-di-tret-butilo eterį/eteris, kuris naudojamas 3%-tinio tirpalo buferyje 0,1 mol glicino/druskos rūgšties pavidale, pH 2,8. Po to plaunama, esant slėgiui, eliuentu - aukščiau aprašytais buferiniais tirpalais n-propanolio gradiente. Propanolio koncentracija 60 min. bėgyje išauga nuo 14 iki 17,5%. Po frakcionavimo ir kristalinimo aukščiau minėtais metodais gaunamas produktas, turintis 98,7% baltymo. Išgryninto žmogaus insulino išeiga sudaro 91%, skaičiuojant pagal įvestą insuliną.
PAVYZDYS
Buferis A: 0,1 molio amonio sulfato, 0,1 molio glicino, 0,025 molio natrio acetato, pH 5,5, vien tik vandens tirpalas;
Buferis B: 0,05 molio amonio sulfato, 0,1 molio glicino, 0,025 molio natrio acetato, pH 5,5, vanduo/n-propanolis santykiu 1:1.
Sorbentas: LICHRESPHER SELECT B, C8, 15-25 μπι, porų dydis 60A, firma
Kolonėlės dydis: 50 mm x 250 mm.
Kolonėlė užpildoma 10 g reakcijos mišinio tirpalu, į kurio sudėtį įeina peramidintas kiaulių insulinas su tripsinu, ištirpinti 200 ml buferio - 0,1 molio glicino/druskos rūgšties, pH 2,8. Plaunama 120 minučių n
bėgyje eliuentu, esant padavimo greičiui 40 ml/min. ir didėjant propanolio koncentracijai nuo 14 iki 30%, po to baltymai išskiriami į atskirus komponentus. Po kristalinimo arba nusodinimo ir džiovinimo, kaip pagrindinė frakcija gaunamas žmogaus insulino-B30-ditret-butiltreonino eteris/eteris, kurio grynumo
| laipsnis daugiau kaip pagal įvestą insuliną. 4 PAVYZDYS | 97% ir išeiga 93%, | skaičiuojant |
| Buferis A: 0,1 molio | natrio chlorido, | 0,1 molio |
| glicino, | 0,025 molio natrio | acetato, pH |
| 5,5, vien | tik vandens tirpalas; | r |
| Buferis B: 0,05 molio | i natrio chlorido, | 0,1 molio |
| glicino, | 0,025 molio natrio | acetato, pH |
5,5, vanduo/n-propanolis santykiu 1:1.
Sorbentas: ZORBACH PRO 10, C8, 10 μιη, firma Du Pont.
Kolonėlės dydis: 5 cm x 25 cm.
7,5 g HI, gauto skaidant trifluoracto rūgštimi žmogaus insulino B30-di-tret-butiltreonino eterį/eteris, ištirpinto 100 ml 0,1 molio glicino/druskos rūgšties tirpalo, plaunama eliuentu panaudojant siurblį ir esant padavimo greičiui 80 ml/min. Buferio B koncentracija 60 minučių bėgyje padidėja iki 18-25%, sulaikymo laikas - apie 37 minutes. Po kristalinimo ir džiovinimo, iš pagrindinės frakcijos galima išskirti iki 96,8% HI, skaičiuojant pagal įvestą kiekį, grynumo laipsnis mažiau kaip 50%.
PAVYZDYS
Buferis A: 0,2 molio natrio sulfato, 0,1 molio glicino, 0,03 molio amonio acetato, pH 5,5, 10%-tinis metilacetatas;
Buferis B: 0,05 molio natrio sulfato, 0,1 molio glicino, 0,03 molio amonio acetato, pH 5,5, 20%-tinis metilacetatas.
Sorbentas: KROMASIL C8, 13 m, porų dydis 100A, firma
EKA NEBEL.
Kolonėlės dydis: 5 x 25 cm.
Stambių raguočių insulinas įvedamas į kolonėlę (8 g/1 kolonėlės tūrio), panaudojant buferį, susidedantį iš 0,1 molio glicino/druskos rūgšties, ir balansuojant 30%-tiniu buferio B tirpalu. Buferio B koncentracija 90 minučių bėgyje padidėja iki 80% (=18% metilacetato). Stambių raguočių insulinas, išplautas eliuentu po 65 minučių, grynumo laipsnis pagrindinėje frakcijoje daugiau kaip 97,5% (išeiga 63,5%), nusodinamas cinko chloridu, prieš tai praskiedus vandeniu. Bendras baltymų kiekis 92,5%.
Buferis B:
PAVYZDYS
Buferis A: 0,1 molio amonio sulfato, 0,1 molio glicino, 0,025 molio natrio acetato, pH 5,5, 5% n-propanolio;
0,05 molio amonio sulfato, 0,1 molio glicino, 0,025 molio natrio acetato, pH 5,5, vanduo/n-propanolis santykiu 1:1.
Sorbentas: KROMASIL Cfl, 13 gm. Porų dydis ĮOOA, firma
EKA NEBEL.
Kolonėlės dydis: 5 cm x 25 cm.
Kolonėlė užpildoma 4 g žmogaus insulino (=8 g/1), gauto skaidant trifluoracto rūgštimi žmogaus insulino-B30-ditret-butiltreonino eterį/eteris, grynumo laipsnis apie 92%. Buferio gradientas 18-25% 90 minučių bėgyje išplauna žmogaus insuliną, po 45 minučių insulino grynumo laipsnis pagrindinėje frakcijoje daugiau kaip 97% (išeiga 91,8%), o šalutinėje frakcijoje - 80,5% (išeiga 4,7).
PAVYZDYS
Buferis A: 0,1 molio amonio sulfato, 0,1 molio glicino, 0,026 molio natrio acetato, pH 5,5, 10% n-propanolio;
Buferis B: 0,05 molio amonio sulfato, 0,1 molio glicino, 0,025 molio natrio acetato, pH 5,5, vanduo/n-propanolis santykiu 1:1.
Sorbentas: KROMASIL C8, 13 gm, porų dydis ĮOOA, firma
EKA NEBEL.
Kolonėlės dydis: 10 cm x 40 cm.
Į kolonėlę įvedama 18 g kiaulių insulino, esančio 1,8 litro buferio, pagaminto iš 0,1 molio glicino/ druskos rūgšties, pH 3,0, su 5% n-propanolio. Gradientas 70 minučių bėgyje padidina buferio kiekį nuo 9% (=13,6% n-propanolio) iki 11% (=14,4% n-propanolio). Kiaulių insulinas plaunamas eliuentu po 50 minučių, baltymo kiekis pagrindinėje frakcijoje daugiau kaip 98% (išeiga 89%). Bendras baltymo kiekis 96,8%, skaičiuojant pagal įvestą.
PAVYZDYS
Buferis A: 0,2 molio amonio chlorido, 0,1 molio glicino, 0,025 molio natrio citrato, 5% npropanolio, pH 5,5.
Buferis B: kaip ir A buferis, tik papildomai pridėta
50% n-propanolio.
Sorbentas: KROMASIL C8, 13 μπι. Porų dydis ĮOOA, firma
EKA NOBEL, Švedija.
Kolonėlės dydis: 50 mm x 250 mm.
g gentechniškai gauto žmogaus insulino (89,5% baltymo) ištirpinama 0,1 molio glicino buferyje, pH 3,0; gautas 2% baltymo tirpalas aukšto slėgio siurbliu paduodamas į kolonėlę. Plaunama eliuentu linijiniais gradientais nuo 13 iki 16% n-propanolio 70 minučių bėgyje, esant padavimui 80 ml/min. Po frakcionavimo ir kristalinimo, pagrindinėje frakcijoje gaunamas žmogaus insulinas, turintis 98% baltymo, išeiga 93%. Bendras baltymo kiekis 98%, skaičiuojant pagal įvestą kiekį.
PAVYZDYS
Buferis A: 0,2 molio amonio sulfato, 0,1 molio glicino, 0,025 molio amonio citrato, 5% etanolio, pH 5,5.
Buferis B: kaip ir buferis A, tik pridėta 50% etanolio.
Sorbentas: KROMASIL C8, 10 μιη, porų dydis ĮOOA, firma
EKA NEBEL, Švedija.
Kolonėlės dydis: 50 mm x 250 mm.
250 ml glicino buferio, pH 3,0, ištirpinama 4,5 g gentechniškai gauto žmogaus insulino (86,3% baltymo) ir po to siurbliu paduodama į kolonėlę. Baltymo chromatografijai, dviejų aukšto slėgio siurblių pagalba, sukuriamas linijinis gradientas iš abiejų A ir B buferių. Plaunama eliuentu, praėjus 100 minučių, esant 33% etanolio koncentracijai ir pastoviam 80 ml/min. padavimui. Po frakcionavimo ir kristalinimo pagrindinėje frakcijoje gaunama žmogaus insulinas, turintis 96% baltymo, bendras baltymo kiekis 93%, skaičiuojant pagal įvestą produktą.
PAVYZDYS
| Buferis A: | 0,2 molio amonio chlorido, 0,1 molio glicino, 0,025 molio natrio citrato, 10% metilacetato, pH 5,5. |
| Buferis B: | tos pačios druskų koncentracijos, kaip ir A buferyje, tik 20% metilacetato. |
| Sorbentas: | KROMASIL C8, 10 ųm, porų dydis ĮOOA, firma EKA NEBEL, Švedija. |
Chromatografijai ištirpinama 200 ml vandeninio glicino buferio 4,6 g nevalyto žmogaus insulino, gauto perdirbant gentechniškai sukurtą insuliną ir po to siurbliu paduodama į AESCh kolonėlę, kurios dydis 50 x 250 mm. Kolonėlės medžiaga išbalansuojama A ir B buferiais dviejų aukšto slėgio siurblių pagalba iki metilacetato koncentracijos 13%. Po to, žmogaus insulinas plaunamas 90 min. bėgyje eliuentu, esant linijiniam gradientui 13-17% metilacetato. Pagrindinis produktas išskiriamas kristalinant iš eliuato. Gaunama
3,8 g žmogaus insulino, kuriame 96% baltymo. Bendras baltymo kiekis 93%, skaičiuojant pagal pradinę medžiagą.
PAVYZDYS
Buferis A: 0,2 molio amonio sulfato, 0,1 molio betaino, 0,05 molio citrinos rūgšties, pH 5,5, pašarminus natrio šarmu (vien tik vandeninis tirpalas);
Buferis B: 0,1 molio amonio sulfato, 0,1 molio betaino, 0,05 molio citrinos rūgšties, pH 5,5, pašarminus natrio šarmu (vanduo/izopropanolis santykiu 1:1).
Sorbentas:
Kolonėlė:
Padavimas:
NUCLEOSIL C18, 15-25 μιη, sferiniai, ĮOOA.
mm x 250 mm.
ml/min.
Kolonėlė užpildoma 3 g (79% baltymo) žmogaus insulinu, gautu skaidant žmogaus insulino-di-tret-butilo eterį/eteris. Užpildoma 3%-tiniu tirpalu buferyje, kuris paruoštas iš 0,1 molio betaino/druskos rūgšties, pH 3,0, aukšto slėgio siurblio pagalba. Po to plaunama eliuentu - aukščiau minėta buferių sistema, esant 44% B buferio. Sulaikymo laikas maždaug 35 minutės. Po frakcionavimo, pagrindinėje frakcijoje gaunama 98,1% žmogaus insulino, išeiga 80,5%. Bendras baltymo kiekis - 90,5%.
PAVYZDYS
Buferis A: 0,1 molio amonio sulfato, 0,1 molio gliutamino rūgšties, 0,05 molio citrinos rūgšLT 3329 B ties, pH 5,45, pašarminus natrio šarmu (vien tik vandeninis tirpalas);
Buferis B: 0,1 molio amonio sulfato, 0,1 molio gliutamino rūgšties, 0,05 molio citrinos rūgšties, pH 5,5, pašarminus natrio šarmu, (vanduo:n-propanolis = 1:1).
Sorbentas: NUCLEOSIL C18-P, 15-25 pm, sferiniai, ĮOOA.
Kolonėlė:
mm x 250 mm.
Padavimas: 60 ml/min.
Kolonėlė užpildoma 6 g žmogaus insulino (73% baltymo), gauto skaidant žmogaus insulino-di-tret-butilo eterį/ eteris. Užpildoma 3%-niu tirpalu 0,1 molio acto rūgšties, pH 3,0, aukšto slėgio siurblio pagalba. Po to plaunama eliuentu - aukščiau minėta buferių sistema, esant 25-28% B buferio gradientui. Sulaikymo laikas maždaug 25 minutės. Po frakcionavimo pagrindinėje frakcijoje gaunama 98,6% žmogaus insulino, išeiga 65%. Bendras baltymo kiekis 88,5%.
PAVYZDYS
Buferis A: 0,15 molio amonio sulfato, 0,1 molio trietilamino, pH 6,5, parūgštinus sieros rūgštimi (vien tik vandeninis tirpalas);
Buferis B: 0,08 molio amonio sulfato, 0,05 molio trietilamino, pH 6,5, parūgštinus sieros rūgštimi (vanduo: 2-propanolis = 1:1).
Sorbentas: NUCLEOSIL C18-P, 15-25 pm, sferiniai, ĮOOA.
Kolonėlė:
mm x 250 mm.
| Padavimas: | 18 60 ml/min. |
Užpildžius kolonėlę 5 g žmogaus insulino, gauto trifluoracto rūgštimi skaidant insulino-di-tretbutiltreonino eterį/eteris, 3% tirpalu, plaunama eliuentu, esant buferio B koncentracijai nuo 32 iki 42%. Sulaikymo laikas - 40 minučių. Po frakcionavimo ir kristalinimo, pagrindinėje frakcijoje gaunama 72%, grynumo laipsnis 92,7%. Bendras baltymo kiekis 76%, skaičiuojant pagal įvestą kiekį.
PAVYZDYS
| Buferis A: | 0,1 molio citrinos rūgšties, 0,2 molio amonio sulfato, pH 2,5, parūgštinus druskos rūgštimi, vien tik vandeninis tirpalas; |
| Buferis B: | 0,1 molio citrinos rūgšties, 0,1 molio amonio sulfato, pH 2,5, parūgštinus druskos rūgštimi, vanduo: n-propanolis = 1:1. |
| Sorbentas: | NUCLEOSIL C18, firma MACHEREY + NAGEL |
| Kolonėlė: | 40 x 250 mm. |
| Padavimas: | 45 ml/min. |
Užpildžius kolonėlę 3 g žmogaus kilmės insulino, gauto trifluoracto rūgštimi skaidant žmogaus insulino-ditret-butiltreonino eterį/eteris, 3% tirpalu 0,1 molio glicino buferyje, pH 3,0, plaunama eliuentu, esant buferio B koncentracijai nuo 34 iki 35%. Sulaikymo laikas - 45 minutės. Po frakcionavimo, kristalinimo ir džiovinimo išskiriama 57% pagrindinėje frakcijoje, skaičiuojant pagal įvestą kiekį (grynumo laipsnis 94,8%) ir 16% šalutinėje frakcijoje (grynumo laipsnis 84%) .
PAVYZDYS
Buferis A: 0,1 molio citrinos rūgšties, 0,2 molio amonio sulfato, pH 3,5, parūgštinus druskos rūgštimi, vien tik vandeninis tirpalas;
Buferis B: 0,1 molio citrinos rūgšties, 0,1 molio amonio sulfato, pH 3,5, parūgštinus druskos rūgštimi, vanduo:n-propanolis = 1:1.
Sorbentas: NUCLEOSIL C18, firma MACHEREY + NAGEL
Kolonėlė: 40 x 250 mm
Padavimas: 45 ml/min.
Kolonėlė užpildoma kaip ir 14 pavyzdyje. Sulaikymo laikas - apie 40 minučių. Po frakcionavimo, kristalinimo ir džiovinimo gaunama 51% pagrindinėje frakcijoje, skaičiuojant pagal įvestą žmogaus insuliną, grynumo laipsnis 97,5%, ir 4% šalutinėje frakcijoje, grynumo laipsnis 68%.
PAVYZDYS
Buferis A: 0,1 molio Tris, 0,1 molio glicino, 0,1 molio amonio chlorido, pH 8,5, parūgštinus druskos rūgštimi, vien tik vandeninis tirpalas;
Buferis B: 0,1 molio Tris, 0,1 molio glicino, 0,1 mo-
| lio amonio chlorido, pH 8,5, parūgštinus druskos rūgštimi vanduo: n-propanolis = 1:1. | |
| Sorbentas: | KROMASIL C8, 13 ųm, 100A. |
| Kolonėlė: | 50 mm x 250 mm |
| Padavimas: | 60 ml/min. |
| Kolonėlė, | subalansuota 33%-tiniu B buferiu, užpildoma |
g žmogaus insulino, gauto skaidant trifluoracto rūgštimi (žr. 14 pavyzdį), 3% tirpalu 0,1 molio Tris buferyje, pH 8,5. Po 35 minučių plaunama eliuentu. Po funkcionavimo ir kristalinimo pagrindinėje frakcijoje gaunama 96,6% žmogaus insulino, kurio išeiga 86%. Bendras baltymo kiekis - 95%.
PAVYZDYS
Buferis A: 0,1 molio amonio chlorido, 0,025 molio citrinos rūgšties, pH 5,5, pašarminus amoniaku, 50% (tūrio) n-propanolio.
Sorbentas: KROMASIL C8, 13 μιη, 100A.
| Kolonėlė: | 50 mm x 250 mm. |
| Srautas: | 60 ml/min. |
Kolonėlė užpildoma, kaip jau buvo aprašyta, 6 g žmogaus insulinu, gautu skaidant trifluoracto rūgštimi (žr. 14 pavyzdį). Gradientas nusistato 60 min. bėgyje, esant B buferio kiekiui 21-25%. Po to insulinas plaunamas eliuentu, sulaikymo laikas - 40 minučių. Pagrindinėje frakcijoje yra 91%, skaičiuojant pagal įvestą produktą, grynumo laipsnis 97,5%. Bendras baltymo kiekis - 96%.
PAVYZDYS
Buferis A: 0,1 molio kalio chlorido, 0,025 molio citrinos rūgšties, pH 5,5, pašarminus kalio šarmu, 5% (tūrio) n-propanolio.
Buferis B: 0,1 molio kalio chlorido, 0,025 molio citrinos rūgšties, pH 5,5, pašarminus kalio šarmu, 50% (tūrio) n-propanolio.
Sorbentas:
Kolonėlė:
KROMASIL C8, 13 ųm, 100A.
mm x 250 mm
Srautas:
ml/min.
Užpildymas ir gradientas kaip 17 pavyzdyje. Plovimas eliuentu po 35 minučių. Pagrindinėje frakcijoje yra 90% žmogaus insulino, skaičiuojant pagal įvestą kiekį, grynumo laipsnis 96,5%. Bendras baltymo kiekis - 93%.
19-24 PAVYZDŽIAI
Pavyzdžiuose 19-24 chromatografija atliekama tomis pačiomis sąlygomis kaip ir 14 pavyzdyje. Keičiasi tik buferis arba amfoterinių jonų koncentracija.
PAVYZDYS
Buferis A: 0,15 molio amonio sulfato, 0,1 molio trietilamino, pH 7,0, parūgštinus sieros rūgštimi.
Buferis B: 0,08 molio amonio sulfato, 0,05 molio trietilamino, pH 7,0, parūgštinus sieros rūgštimi.
| 22 | |
| Rezultatas: | pagrindinės frakcijos grynumas 95,2%, pagrindinės frakcijos išeiga 67%. |
| 20 PAVYZDYS |
Buferis kaip 16 pavyzdyje, tik be 0,1 molio glicino.
| Rezultatas: | pagrindinės frakcijos grynumas 96,1%, pagrindinės frakcijos išeiga 65%, šalutinės frakcijos išeiga 25%. |
| 21 PAVYZDYS |
Buferis kaip 15 pavyzdyje, bet papildomai įvesta 0,1 molio glicino.
| Rezultatas: | pagrindinės frakcijos grynumas 96%, pagrindinės frakcijos išeiga 66%, šalutinės frakcijos išeiga 6%. |
PAVYZDYS
| Buferis A: | 0,1 molio amonio chlorido, 0,025 molio citrinos rūgšties, pH 4,5, pašarminus amoniaku, 5% (tūrio) n-propanolio, 0,1 molio glicinbetaino. |
| Buferis B: | kaip ir buferis A, bet papildomai 50% npropanolio. |
| Rezultatas: | pagrindinės frakcijos išeiga 88%, šalutinės - 6%, pagrindinės frakcijos grynumas - 98,1%. |
PAVYZDYS
Buferis, kaip 22 pavyzdyje, bet pH 5,4 ir 0,1 molio glicino vietoj glicinbetaino.
Rezultatas: pagrindinės frakcijos grynumas 97,9%, pagrindinės frakcijos išeiga 92%, šalutinės - 8%.
PAVYZDYS
Buferis kaip 13 pavyzdyje, bet pH 6,0 ir papildomai 0,1 molio glicino.
Rezultatas:
pagrindinės pagrindinės šalutinės frakcijos frakcijos
13%.
grynumas išeiga
94,3%,
77%,
PAVYZDYS
1 Lentelėje pateiktos insulinų išeigos ir grynumas priklausomai priklausomai nuo pH reikšmių ir/arba eliuate esančių amfoterinių jonų.
Lentelė
| Pavyz- džio Nr. | pH reikšmė | Amfoteri- niai jonai | Pagrindinės frakcijos grynumas (%) | Išeiga (%) | |
| Pagrindinė frakcija | Šalutinė frakcija | ||||
| 14 | 2,5 | - | 94,8 | 57 | 16 |
| 15 | 3,5 | - | 97,5 | 51 | 4 |
| 13 | 6, 5 | - | 92, 7 | 72 | 4 |
| 19 | 7,0 | - | 95,2 | 67 | - |
| 20 | 8,5 | - | 96,1 | 65 | 25 |
| 17 | 5,5 | - | 97,5 | 91 | 5 |
| 18 | 5,5 | - | 96,5 | 90 | 3 |
| 21 | 3,5 | glicinas glicin- | 96,0 | 66 | 6 |
| 22 | 4,5 | betainas | 98,1 | 88 | 6 |
| 23 | 5,4 | glicinas | 97, 9 | 92 | 8 |
| 8 | 5,5 | glicinas | 98, 0 | 93 | 5 |
| 16 | 8,5 | glicinas | 96, 6 | 86 | 9 |
| 24 | 6,0 | glicinas | 94,0 | 77 | 13 |
Claims (8)
1. Insulino ir/arba jo darinių chromatografinio gryninimo ant lipofiliškai modifikuoto silikagelio metodas, panaudojant vandeninius buferinius tirpalus, į kurių sudėtį įeina su vandeniu besimaišantys organiniai tirpikliai, besiskiriantis tuo, kad naudoja buferinius tirpalus, kuriuose ištirpinti amfoteriniai jonai arba tirpalo pH reikšmė yra artima gryninamo insulino arba jo darinių izoelektriniam taškui ir dalyvauja amfoteriniai jonai.
2. Metodas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad tirpiklių mišinio pH reikšmė yra iki 1 pH vieneto aukštesnė arba žemesnė už gryninamo insulino arba jo darinių izoelektrinį tašką.
3. Metodas pagal 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad tirpiklių mišinio pH reikšmė yra iki 0,5 vieneto žemesnė arba aukštesnė už gryninamo insulino izoelektrinį tašką.
4. Metodas pagal vieną ar kelis punktus iš 1-3 punktų, besiskiriantis tuo, kad amfoteriniais jonais naudoja α-aminorūgštį arba betainą.
5. Metodas pagal 4 punktą, besiskiriantis tuo, kad amfoteriniais jonais naudoja gliciną, gliutamino rūgštį arba glicinbetainą.
6. Metodas pagal vieną ar kelis punktus iš 1-5 punktų, besiskiriantis tuo, kad naudojami insulino dariniai, kurių bendra formulė (I), y-
-OH
Lt z kurioje
R30 - genetiškai koduotos L-aminorugšties liekana,
X - hidroksigrupė, fiziologiškai inertinė bazinio tipo organinė grupė Ci C50; genetiškai koduota L-aminorūgštis, turinti gale laisvą karboksilo funkcinę grupę, tokią amido, laktono grupę grupę.
n - sveikas skaičius nuo 0
Y - vandenilis arba L-feni kaip, pavyzdžiui, esterio, arba redukuotą iki CH2OH iki 10, alaninas,
A- ir B-grandinės - žmogaus arba gyvulinės kilmės insulino grandinės.
7. Metodas pagal 6 punktą, besiskiriantis tuo, kad (I) formulėje
R30 - L-alaninas arba L-treoninas ir
X - viena arba kelios L-aminorūgštys, priklausančios L-arginino, L-lizino arba L-fenilalanino grupei.
8. Metodas pagal vieną arba kelis punktus iš 1-7 punktų, besiskiriantis tuo, kad naudoja įrenginius, skirtus preparatyvinei aukšto efektyvumo skysčių chromatografijai (AESCh).
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4028120A DE4028120C2 (de) | 1990-09-05 | 1990-09-05 | Verfahren zur Reinigung von Insulin und/oder Insulinderivaten |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| LTIP713A LTIP713A (en) | 1995-01-31 |
| LT3329B true LT3329B (en) | 1995-07-25 |
Family
ID=6413631
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| LTIP713A LT3329B (en) | 1990-09-05 | 1993-06-25 | Method for the purification of insulin |
Country Status (28)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5245008A (lt) |
| EP (1) | EP0474213B1 (lt) |
| JP (1) | JP3161770B2 (lt) |
| KR (1) | KR100191699B1 (lt) |
| AT (1) | ATE128145T1 (lt) |
| AU (1) | AU637255B2 (lt) |
| CA (1) | CA2050644C (lt) |
| CZ (1) | CZ283356B6 (lt) |
| DE (2) | DE4028120C2 (lt) |
| DK (1) | DK0474213T3 (lt) |
| ES (1) | ES2078405T3 (lt) |
| FI (1) | FI98216C (lt) |
| GR (1) | GR3017750T3 (lt) |
| HR (1) | HRP940716B1 (lt) |
| HU (1) | HU207100B (lt) |
| IE (1) | IE68956B1 (lt) |
| IL (1) | IL99384A (lt) |
| LT (1) | LT3329B (lt) |
| LV (1) | LV10105B (lt) |
| NO (1) | NO180681C (lt) |
| NZ (1) | NZ239650A (lt) |
| PL (1) | PL168114B1 (lt) |
| PT (1) | PT98864B (lt) |
| RU (1) | RU2037500C1 (lt) |
| SK (1) | SK278099B6 (lt) |
| UA (1) | UA26375A1 (lt) |
| YU (1) | YU147591A (lt) |
| ZA (1) | ZA917006B (lt) |
Families Citing this family (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2099193T3 (es) * | 1991-12-18 | 1997-05-16 | Hoechst Ag | Procedimiento para la obtencion de soluciones con contenido en insulina. |
| JP3279362B2 (ja) * | 1992-10-05 | 2002-04-30 | 井上 聰一 | 糖尿病判定方法及び糖尿病判定装置 |
| JP3319812B2 (ja) * | 1993-04-05 | 2002-09-03 | 井上 聰一 | リウマチ判定方法及びリウマチ判定装置 |
| US6869930B1 (en) * | 1993-09-17 | 2005-03-22 | Novo Nordisk A/S | Acylated insulin |
| DE4405179A1 (de) * | 1994-02-18 | 1995-08-24 | Hoechst Ag | Verfahren zur Gewinnung von Insulin mit korrekt verbundenen Cystinbrücken |
| DE19652713C2 (de) * | 1996-12-18 | 2001-11-22 | Aventis Pharma Gmbh | Verfahren zur Reinigung von Insulin und Insulinderivaten durch Chromatographie an stark saurem Kationenaustauscher |
| RU2122549C1 (ru) * | 1997-12-29 | 1998-11-27 | Закрытое акционерное общество "Фосфосорб" | Способ хроматографического выделения и очистки белков, пептидов и их комплексов |
| DE19838097A1 (de) * | 1998-08-24 | 2000-03-02 | Hoechst Marion Roussel De Gmbh | Verfahren zur chromatographischen Reinigung von Insulinen |
| US6248683B1 (en) * | 1999-04-07 | 2001-06-19 | Silicycle Inc. | Process for the regeneration of used silica gel |
| US7309581B2 (en) * | 2000-11-01 | 2007-12-18 | Sysmex Corporation | Method of staining, detection and counting bacteria, and a diluent for bacterial stain |
| UA46666C2 (en) * | 2001-12-29 | 2006-01-16 | Omakooe Ltd Liability Company | Method for preparing dosage form of short-term acting insulin |
| UA46668C2 (en) * | 2001-12-29 | 2006-01-16 | Omakooe Ltd Liability Company | Method for preparing combined dosage form of human insulin |
| UA46669C2 (uk) * | 2001-12-29 | 2005-12-15 | Товариство З Обмеженою Відповідальністю "Мако" | Спосіб приготування готової лікарської форми інсуліну пролонгованої дії |
| BRPI0408978B8 (pt) * | 2003-04-08 | 2021-07-27 | Novo Nordisk As | processos para regenerar uma fase estacionária cromatográfica |
| EP1613409B1 (en) * | 2003-04-08 | 2019-08-07 | Novo Nordisk A/S | Regeneration of chromatographic stationary phases |
| RU2251426C1 (ru) * | 2003-09-18 | 2005-05-10 | Цыганков Владимир Владимирович | Способ получения инсулина из природного источника и инсулин |
| KR101002296B1 (ko) * | 2005-07-06 | 2010-12-20 | 주식회사 코오롱 | 전방향족 폴리아미드 필라멘트의 제조방법 |
| GB0524782D0 (en) * | 2005-12-05 | 2006-01-11 | Chiron Srl | Analysis of samples |
| CN102015762B (zh) * | 2008-02-19 | 2015-03-18 | 百康有限公司 | 获得纯化的生物活性异源蛋白的方法 |
| BRPI1016071A2 (pt) * | 2009-07-09 | 2019-09-24 | Biocon Ltd | método cromatográfico preparativo baseado em gradiente não linear e seus produtos purificados. |
| KR20120055653A (ko) * | 2009-08-11 | 2012-05-31 | 바이오콘 리미티드 | 크로마토그래피 방법 및 그의 정제된 화합물 |
| US9422330B2 (en) | 2010-03-01 | 2016-08-23 | Novo Nordisk A/S | Preparative RP-HPLC method for purifying peptides |
| EP2570183A1 (en) | 2011-09-15 | 2013-03-20 | InstrAction GmbH | Sorbent comprising on its surface an aliphatic unit for the purification of organic molecules |
| US10155799B2 (en) | 2014-07-21 | 2018-12-18 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Chromatography process for purification of insulin and insulin analogs |
| CN115505035B (zh) * | 2022-08-22 | 2023-09-05 | 南京汉欣医药科技有限公司 | 一种司美格鲁肽中间体多肽的纯化方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4601852A (en) | 1981-01-17 | 1986-07-22 | Hoechst Aktiengesellschaft | Process for the preparation of human or the derivatives thereof from pig insulin or the derivatives thereof |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2629568C3 (de) * | 1976-07-01 | 1981-09-10 | Hoechst Ag, 6000 Frankfurt | Verfahren zur Reinigung von Insulin, seinen Analogen und Derivaten |
| DE3147842A1 (de) * | 1981-12-03 | 1983-06-23 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | "verfahren zur trennung von gemischen aus insulin, insulinderivaten und gegebenenfalls verunreinigungen" |
| GB2119248A (en) * | 1982-04-28 | 1983-11-16 | John Kenneth Mcmullen | Insulin formulations and method of producing them |
| WO1989001485A1 (en) * | 1987-08-14 | 1989-02-23 | Gebro Broschek Kg | Purification of raw peptides by preparative medium-pressure liquid chromatography |
-
1990
- 1990-09-05 DE DE4028120A patent/DE4028120C2/de not_active Expired - Lifetime
-
1991
- 1991-09-03 US US07/754,003 patent/US5245008A/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-03 UA UA5001389A patent/UA26375A1/uk unknown
- 1991-09-03 NZ NZ239650A patent/NZ239650A/en not_active IP Right Cessation
- 1991-09-03 FI FI914150A patent/FI98216C/fi not_active IP Right Cessation
- 1991-09-03 IL IL9938491A patent/IL99384A/en not_active IP Right Cessation
- 1991-09-03 RU SU915001389A patent/RU2037500C1/ru active
- 1991-09-04 NO NO913476A patent/NO180681C/no not_active IP Right Cessation
- 1991-09-04 DE DE59106519T patent/DE59106519D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-04 CZ CS912717A patent/CZ283356B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1991-09-04 PT PT98864A patent/PT98864B/pt not_active IP Right Cessation
- 1991-09-04 KR KR1019910015402A patent/KR100191699B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-04 SK SK2717-91A patent/SK278099B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1991-09-04 JP JP22324291A patent/JP3161770B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-04 ES ES91114936T patent/ES2078405T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-04 DK DK91114936.7T patent/DK0474213T3/da active
- 1991-09-04 AU AU83568/91A patent/AU637255B2/en not_active Expired
- 1991-09-04 PL PL91291616A patent/PL168114B1/pl unknown
- 1991-09-04 YU YU147591A patent/YU147591A/sh unknown
- 1991-09-04 CA CA002050644A patent/CA2050644C/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-04 ZA ZA917006A patent/ZA917006B/xx unknown
- 1991-09-04 IE IE311591A patent/IE68956B1/en not_active IP Right Cessation
- 1991-09-04 EP EP91114936A patent/EP0474213B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-04 AT AT91114936T patent/ATE128145T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-09-05 HU HU912874A patent/HU207100B/hu unknown
-
1993
- 1993-05-04 LV LVP-93-285A patent/LV10105B/lv unknown
- 1993-06-25 LT LTIP713A patent/LT3329B/lt not_active IP Right Cessation
-
1994
- 1994-10-20 HR HRP-1475/91A patent/HRP940716B1/xx not_active IP Right Cessation
-
1995
- 1995-10-16 GR GR950402850T patent/GR3017750T3/el unknown
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4601852A (en) | 1981-01-17 | 1986-07-22 | Hoechst Aktiengesellschaft | Process for the preparation of human or the derivatives thereof from pig insulin or the derivatives thereof |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| A. PÉTER, G. SZEPESI, L. BALáSPIRI, K. BURG: "Coordinative interactions in the seperation of insulin and its derivatives by high-performance liquid cromatography", JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A, 1987, pages 43 - 52, XP026554989, DOI: doi:10.1016/S0021-9673(01)81789-1 |
| B. S. WELINDER ET AL.: "Reversed-phase high-performance liquid chromatography of insulin ☆: Resolution and recovery in relation to column geometry and buffer components", JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A, 1986, pages 357 - 367 |
| JEAN RIVIER AND RICHARD MCCLINTOCK: "Reversed-phase high-performance liquid chromatography of insulins from different species", JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A, 1983, pages 112 - 119, XP026749379, DOI: doi:10.1016/S0021-9673(01)95395-6 |
| KROEFF EP ET AL.: "Production scale purification of biosynthetic human insulin by reversed-phase high-performance liquid chromatography", J CHROMATOGR., 1989, pages 45 - 61, XP026476057, DOI: doi:10.1016/S0021-9673(00)94274-2 |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| LT3329B (en) | Method for the purification of insulin | |
| US5631347A (en) | Reducing gelation of a fatty acid-acylated protein | |
| JP4975895B2 (ja) | 高圧液体クロマトグラフィーによるインシュリンの単離方法 | |
| DE69130790T2 (de) | Parathyroidhormon-Derivate | |
| KR100574580B1 (ko) | 정확하게 결합된 시스틴 브릿지를 갖는 인슐린 또는 인슐린유도체를 수득하는 방법 | |
| US9422330B2 (en) | Preparative RP-HPLC method for purifying peptides | |
| NO318424B1 (no) | Fremgangsmate for isolering av insulin med korrekt koblede cysteinbroer | |
| FI108644B (fi) | Menetelmä insuliinipitoisten liuosten valmistamiseksi | |
| KR890001244B1 (ko) | 성장 호르몬-양 물질의 정제방법 | |
| EP0037255B1 (en) | Process for producing an insulin precursor | |
| GB2038340A (en) | Process for purifying insulin | |
| CN114773427A (zh) | 一种纯化含半胱氨酸多肽的方法 | |
| RU2816581C2 (ru) | Очистка аналогов глюкагоноподобного пептида-1 | |
| DE4141794C2 (de) | Verfahren zur Reinigung von Insulin und/oder Insulinderivaten | |
| EP0079362A1 (en) | A process for the preparation of insulin derivatives | |
| JPH04282399A (ja) | 放射性ヨウ素標識インシュリン様成長因子ｉ |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC9A | Transfer of patents |
Free format text: AVENTIS PHARMA DEUTSCHLAND GMBH, 65926 FRANKFURT AM MAIN, INDUSTRIEPARK HOCHST, DE 000928 |
|
| PD9A | Change of patent owner |
Owner name: SANOFI-AVENTIS DEUTSCHLAND GMBH, DE Effective date: 20051026 |
|
| MK9A | Expiry of a patent |
Effective date: 20130625 |