DE4141794C2

DE4141794C2 - Verfahren zur Reinigung von Insulin und/oder Insulinderivaten

Info

Publication number: DE4141794C2
Application number: DE19914141794
Authority: DE
Inventors: Rainer Dr Dickhardt; Bernhard Dr Unger; Claudia Graefe
Original assignee: Hoechst AG
Current assignee: Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Priority date: 1991-12-18
Filing date: 1991-12-18
Publication date: 1993-11-18
Anticipated expiration: 2011-12-19
Also published as: DE4141794A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von Insulin und/oder Insulinderivaten gemäß den Patentansprüchen.

Aus analytischen Trennverfahren ist die Reinigung von Insulinen oder Insulinderivaten an lipophil modifizierten (reversed phase) Kieselgelen bekannt und wird seit vielen Jahren in der Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) erfolgreich angewendet (WS Welinder et al., J. Chrom., 361, (1986) 357-367). Im analytischen Maßstab werden Proteinmengen im µg-Bereich auf eine mit modifiziertem Kieselgel gefüllte Säule aus Stahl, Glas oder Kunststoff aufgetragen und anschließend durch ein strömendes Flüssigkeitsgemisch (zumeist saure, wäßrige Pufferlösungen mit konstanter oder variabler organischer Lösemittelkonzentration) eluiert. Die Proteinbeladung beträgt hierbei weit weniger als 30 µg/ml Säulenvolumen.

Bisherige Reinigungsverfahren wenden häufig die im Labor genutzten - relativ toxischen - Lösemittel (Acetonitril) und korrosiven, teuren Pufferkomponenten wie Tetraalkylammoniumsalze, Alkylsulfonate, Hexafluoraceton oder Trifluoracetat an (E.P. Kroeff et al., J. Chrom., 461, (1989), 45-61). Diese Laufmittel führen bei stärker mit insulinähnlichen Substanzen verunreinigten Gemischen zu keiner befriedigenden präparativen Trennung im Hinblick auf Qualität oder Ausbeute der Hauptkomponente (J. Rivier, R. McClintock; J. Chrom., 268 (1983) 112-119; Peter et al., J. Chrom. 408 (1987) 43-52).

Die WO 89/01185 beschreibt ein Verfahren zur Reinigung von Peptiden, wobei das Elutionsmittel die folgenden Elemente enthält, ein organisches Lösungsmittel, pH der Pufferlösung zwischen 2 und 10, ein Chelierungsmittel und eine stark polare organische Verbindung. Mit dem Begriff stark polare organische Verbindung werden die Verbindungen Hexamethylenphosphortriamid, Dimethylsulfoxid, Diemethylformamid und N-Methylpyrrolidon bezeichnet.

Insuline aus vorherigen chemischen Umwandlungen wie beispielsweise aus stark sauren Esterspaltungen oder enzymatischen (Trans-)Peptidierungsprozessen, aus Kristallisationsreinigungen enthalten zumeist Begleitstoffe mit ähnlichen Eigenschaften. Sie lassen sich durch die Wahl bestimmter pH-Werte über Ionenaustauschchromatographie reinigen, wenn genügend elektrische Ladungsunterschiede vorhanden sind (US-PS 4 129 560). Der Nachteil dieser Methode liegt im Verdünnungseffekt und damit Verlust an Wertstoffen in den Überständen bei der Aufarbeitung der Fällungen, in der relativ langen Zykluszeit oder darin, daß die Gesamtwiederfindung und damit die Ausbeute geringer ist.

Insulinzubereitungen mit Depoteigenschaften enthalten häufig Protamine, die die Wirkdauer von Insulinen verlängern. Protamine sind argininreiche Proteine, die aus Rogen stammen. Qualitätsuntersuchungen von Depotinsulinzubereitungen zeigten immer wieder einen unerklärlichen Verlust der Depoteigenschaften nach längerer Lagerung der Zubereitung. Solche Insulinzubereitungen sind für den Patienten völlig ungeeignet, weil es damit leicht zu einer Insulinüberdosierung kommt, die unter Umständen über einen hypoglykämischen Schock zum Tod des Patienten führen kann.

Genaue Untersuchungen dieser Insulinzubereitungen zeigten, daß der Verlust der Depoteigenschaften durch einen langsamen Abbau der Protamine durch Spuren von Proteasen verursacht wird. Ferner zeigte es sich, daß die Hauptmenge an Proteasen in diesen Zubereitungen aus der enzymatischen Transpeptidierung von Schweineinsulin zu Humaninsulin-Ester/Ether oder aus proteolytischen Spaltprozessen von insulinähnlichen Vorprodukten stammt. Ein Großteil der Proteasen, beispielsweise Trypsin, wird zwar durch die gängigen Chromatographieverfahren abgetrennt, trotzdem erreichen offensichtlich Restmengen an Proteasen die Insulinzubereitungen und führen dort zum Verlust der Depoteigenschaften.

Es wurde schon ein Verfahren zur Reinigung von Insulin und/oder Insulinderivaten durch Chromatographie in wäßrigen, gepufferten Lösungsmitteln, die mit Wasser mischbare organische Lösungsmittel enthalten, an lipophil modifiziertem Kieselgel vorgeschlagen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß in den gepufferten Lösungsmitteln Zwitterionen gelöst sind oder der pH-Wert des Lösungsmittelgemisches in der Nähe des isoelektrischen Punkts des zu reinigenden Insulins oder Insulinderivats liegt und Zwitterionen anwesend sind (DE 40 28 120 A1). Die annähernd proteasefreie Gewinnung von Insulin und/oder Insulinderivaten ist durch dieses Verfahren allerdings nicht erreichbar.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, ein Verfahren zur chromatographischen Reinigung von Insulin und Insulinderivaten zu entwickeln, bei dem die vorhandenen Proteasen annähernd vollständig abgetrennt werden.

Es wurde nun ein Verfahren gefunden, durch das sich Proteasen annähernd vollständig von Insulin und Insulinderivaten durch eine zweistufige Chromatographie in wäßrigen, gepufferten Lösungsmitteln, an lipophil modifiziertem Kieselgel abtrennen lassen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man

1A) das Gemisch aus Proteasen, Insulin und/oder Insulinderivaten in einem Puffer löst,
1B) die Elution mit einem gepufferten Lösungsmittel, das Zwitterionen enthält und gegebenenfalls auf einen pH-Wert, der bis zu 1 pH-Einheit unter oder über dem isoelektrischen Punkt des zu reinigenden Insulins und/oder Insulinderivats eingestellt worden ist, durchführt, wobei die Konzentration der Zwitterionen 1 mMol/l bis 140 mMol/l, bezogen auf Wasser als Lösungsmittel, beträgt

und anschließend die gewonnenen Insulinfraktionen

2A) in einem Auflösepuffer, der 5 bis 50 Volumenprozent Aceton oder Acetonitril enthält und der pH-Wert 1 bis 6 beträgt, löst,
2B) die erhaltene Lösung auf die Säule aufträgt,
2C) die Säule mit dem Auflösepuffer nachspült und
2D) die zu reinigenden Insuline und/oder Insulinderivate mit einem gepufferten Lösungsmittel, das Zwitterionen enthält und gegebenenfalls auf einen pH-Wert, der bis zu 1 pH-Einheit unter oder über dem isoelektrischen Punkt des zu reinigenden Insulins und/oder Insulinderivats eingestellt worden ist, eluiert, wobei die Konzentration der Zwitterionen 10 mMol/l bis 1 Mol/l, bezogen auf Wasser als Lösungsmittel, beträgt.

Überraschenderweise bewirkt die Anwesenheit von Aceton oder Acetonitril im Auflösepuffer des zweiten Chromatographieschrittes die deutlich verbesserte Abtrennung der Proteasen von den Insulinen oder Insulinderivaten, so daß die beschriebenen Probleme mit Insulinformulierungen, die Protamine enthalten, nicht mehr auftreten.

Die zu reinigenden Gemische aus Proteasen, Insulin und/oder Insulinderivaten können aus einer Vielzahl enzymatischer Prozesse stammen, beispielsweise proteolytische Abspaltung von Prä- und/oder Prosequenzen von Präproininsulinen, Abspaltung von C- oder N-terminalen Aminosäuren des Insulins oder Umamidierungen von Schweineinsulin zu Humaninsulin oder Humaninsulinderivaten.

Die im Verfahren abtrennbaren Proteasen sind beispielsweise Trypsin, Lysylendopeptidase, Carborypeptidase A, Clostripain oder Achromobacter-Protease. Bevorzugt ist Trypsin.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren können alle Insuline eingesetzt werden, wie z. B. Insuline, die tierischen oder menschlichen Ursprungs sind, Insulinvorläufer, wie z. B. Proinsuline oder Präproinsuline, oder rekombinante Insuline oder Insulinderivate, die von genetisch modifizierten Mikroorganismen exprimiert werden. Ferner können auch Insulinderivate eingesetzt werden, die beispielsweise durch chemische oder enzymatische Derivatisierung hergestellt wurden, z. B. Des-Phe-B1-Insulin, Insulin-β- Ketensulfonat, Diarginininsulin (B31, B32), Monoargininsulin oder Diphenylalanininsulin (B31, B32) (US-PS 4 601 852).

Bevorzugt werden Insulinderivate der Formel I

in welcher
R³⁰ für den Rest einer genetisch kodierbaren L-Aminosäure,
X für eine Hydroxygruppe, eine physiologisch unbedenkliche organische Gruppe basischen Charakters mit bis zu 50 C-Atomen, eine genetisch kodierbare L-Aminosäure und deren gegebenenfalls vorhandene endständige Carboxylfunktion frei, als Esterfunktion, als Amidfunktion, als Lacton oder zu CH₂OH reduziert vorliegen kann,
n für eine ganze Zahl von 0 bis 10,
Y für Wasserstoff oder L-Phenylalanin steht
und die A- und B-Kette die Sequenzen tierischen oder menschlichen Insulins haben, eingesetzt.

Besonders bevorzugt werden Insulinderivate der Formel I, in welcher
R³⁰ für L-Alanin oder L-Threonin und
X für eine oder mehrere L-Aminosäuren aus der Gruppe L-Arginin, L-Lysin oder L-Phenylalanin steht, eingesetzt.

Die Insuline und Insulinderivate können sowohl in verhältnismäßig unreinem Zustand, als auch in vorgereinigter Form (z. B. durch Gelchromatographie), eingesetzt werden. Insulin ist nach mehrfacher Kristallisation und auch nach Gelchromatographie noch mit Insulin-ähnlichen Begleitstoffen sehr ähnlichen Molekulargewichts verunreinigt, die sich bei passend gewähltem pH in ihrem Ladungszustand untereinander und vom Insulin unterscheiden, aber mit Insulin Komplexe bilden (US-PS 4 129 560). Beispiele solcher Substanzen sind: Desamidoinsuline, Arginin- und Diarginininsulin, Insulin-ethylester und andere.

Unter lipophil modifiziertem Kieselgel wird ein Kieselgel verstanden, auf das eine hydrophobe Matrix aufgebracht wurde. Beispiele für eine hydrophobe Matrix sind Alkane mit einer Kettenlänge von 3 bis 20 Kohlenstoffatomen, insbesondere 8 bis 18 Kohlenstoffatome. Ferner kann die Korngröße in einem weiten Bereich schwanken, beispielsweise von 5 bis 60 µm, insbesondere von 10 bis 50 µm. Die Porenweite kann auch in einem weiten Bereich schwanken, günstige Porenweiten liegen von 50 bis 300 Å, insbesondere von 100 bis 200 Å. Besonders bevorzugte liphophil modifizierte Kieselgelmaterialien sind beispielsweise:

- ®Nucleosil, Firma Macherey & Nagel, Aachen, FRG sphärische und nicht sphärische Materialien verschiedener Korngröße bis zu 45 µm, 100 Å Porenweite, C8- bzw. C18-modifiziert.
- ®Lichtroprep, Firma E.Merck, Darmstadt, FRG nicht sphärische und sphärische Materialien verschiedener Korngrößen bis 40 µm, 60-250 Å Porenweite, C8-C18-modifiziert;
- ®Lichrospher Select B, Firma E.Merck, Darmstadt, FRG sphärisches Material bis 25 µm Korngröße, C8-modifiziert;
- ®Waters Prep, Firma Pharmacia LKB GmbH, Freiburg, FRG C 18-modifiziert, 50-105 µm nichtsphärisch, 100 Å Porenweite;
- ®Zorbax Pro10, Firma DuPont de Nemours GmbH, Bad Homburg, FRG C8-modifiziert, 10 µm, sphärisch, 100 Å Porenweite;
- ®Kromasil, Firma EKA Nobel Chemieprodukte GmbH, Düsseldorf, FRG C4-, C8-C18-modifiziert, bis 16 µm, sphärisch, 100,150 oder 200 Å Porenweite.

Zwitterionen sind Verbindungen, die Protonen aufnehmen und auch abspalten können, d. h. in saurer Lösung Kationen und in alkalischer Lösung Anionen bilden, wie beispielsweise α-Aminosäuren, Betain oder Betainderivate. Bevorzugte Zwitterionen sind Glycin, Glutamin oder Betain (N-Trimethyl-glycin). Besonders bevorzugt ist Glycin.

Der isoelektrische Punkt (IEP) eines Insulins oder Insulinderivates ist derjenige pH- Wert, in der die Summe der kationischen Ladungen und anionischen Ladungen des gelösten Insulins gleich Null ist. Beispielsweise liegt der IEP von Schweineinsulin zwischen pH 5,3 und 5,4 (H. Neurath, K. Bailey, Protein Hormones, Vol. II/A, The Proteins, s. 636). Mit dem Begriff "in der Nähe des isoelektrischen Punkts" sind pH-Werte gemeint, die ca. um 1 pH-Einheit über oder unter dem IEP des zu reinigenden Insulins liegen. Besonders bevorzugt sind pH-Werte, die bis zu 0,5 pH-Einheiten über oder unter dem IEP liegen.

Die Elutionsmittel enthalten eine Puffersubstanz, um den pH-Wert des Elutionsmittels konstant zu halten. Geeignete Puffersubstanzen sind in der Literatur bekannt, beispielsweise Phosphate, Alkali- oder Erdalkalimetallsalze, wie Natriumcitrat oder Kaliumacetat, Ammoniumcitrat, -acetat, -sulfat oder -chlorid. Ferner enthalten die Elutionsmittel mit Wasser mischbare organische Lösungsmittel wie beispielsweise Alkohole, Ketone, Methylacetat, Dioxan, Dimethylsulfoxid oder Acetonitril. Bevorzugt werden Alkohole wie n- oder iso-Propanol, Methanol, Ethanol oder Methylacetat.

Für den ersten Chromatographieschritt beträgt die Konzentration der mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel 1 bis 70 %, bevorzugt 10 bis 50 %, besonders bevorzugt 10 bis 35 %. Die Konzentration der Puffersubstanz beträgt etwa 1 mMol/l bis 140 mMol/l, bezogen auf Wasser als Lösungsmittel, bevorzugt 2 mMol/l bis 120 mMol/l. Die Konzentration der Zwitterionen kann in einem weiten Bereich schwanken. Die Mengen sind 1 mMol/l bis 140 mMol/l, bezogen auf Wasser als Lösungsmittel, bevorzugt 10 mMol/l bis 110mMol/l.

Die Temperatur während der Chromatographie beträgt 0°C bis 50°C, vorzugsweise 15 bis 30°C, besonders bevorzugt 15 bis 20°C. Der Betriebsdruck während der Chromatographie ist weitgehend konstant. Die Chromatographie kann mit unterschiedlichem Druck durchgeführt werden, z. B. kann die Chromatographie bei einem Druck von 5 bis 400 bar durchgeführt werden, insbesondere bei 20 bis 100 bar.

Die Beladung der Säulen, Chromatographie und Elution der Insuline und Insulinderivate erfolgt nach bekannten, üblichen, technischen Methoden. Die Beladung der Säule mit der zu reinigenden Insulinlösung erfolgt bevorzugt mit wäßrig-alkoholischer oder rein wäßriger Pufferlösung. Die Insulinlösung hat einen Proteinanteil von etwa 1 bis 10 %, bevorzugt 3 %.

Die Elution der Insuline erfolgt mit dem erfindungsgemäßen Verfahren bei konstanter Konzentration der Puffersubstanzen (isokratisch) oder durch Veränderung des mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittelanteils am Puffer. Die Veränderung des organischen Lösungsmittelanteils erfolgt in der Weise, daß die Konzentration des verwendeten organischen Lösungsmittels in Abhängigkeit vom Elutionsvolumen steigt, und zwar vorzugsweise in linearer Abhängigkeit.

Die Abtrennung des Insulins nach der Chromatographie aus den Eluaten geschieht durch Ausfällung mit Zink oder durch Kristallisation. Dabei kann die Lösung wahlweise vorher mittels Vakuumdestillation weitgehend vom Lösungsmittel befreit oder dessen Konzentration durch Verdünnen mit Wasser reduziert werden. Auf jeden Fall sollte die Lösungsmittelkonzentration vor der Fällung oder Kristallisation bei 10 % oder darunter liegen, um den Proteingehalt im Überstand auf <50 mg/l zu halten. Die entstandenen Insulinniederschläge lassen sich durch Dekantieren, Zentrifugieren oder Filtration isolieren und trocknen.

Für den zweiten Chromatographieschritt beträgt die Konzentration der mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel 1 bis 90 %, bevorzugt 10 bis 60 %, besonders bevorzugt 10 bis 35 %. Die Konzentration der Puffersubstanz beträgt etwa 1 mMol/l bis 2 Mol/l, bezogen auf Wasser als Lösungsmittel, bevorzugt 25 mMol/l bis 1 Mol/l. Die Konzentration der Zwitterionen kann in einem weiten Bereich schwanken. Die Mengen sind 10 mMol/l bis 1 Mol/l, bezogen auf Wasser als Lösungsmittel, bevorzugt 20 mMol/l bis 500 mMol/l.

Die Beladung der Säulen, Chromatographie und Elution der Insuline und Insulinderivate erfolgt nach bekannten, üblichen, technischen Methoden. Die Beladung der Säule mit den zu reinigenden Insulinen und/oder Insulinderivaten erfolgt mit einem Auflösepuffer, der Aceton enthält. Der Auflösepuffer enthält eine Puffersubstanz, um den pH-Wert des Auflösepuffers konstant zu halten. Geeignete Puffersubstanzen sind in der Literatur bekannt, beispielsweise Phosphate, Alkali- oder Erdalkalimetallsalze, wie Natriumcitrat oder Kaliumacetat, Ammoniumcitrat, Ammoniumacetat, -sulfat oder -chlorid. Ferner können im Auflösepuffer auch Zwitterionen anwesend sein. Die Konzentration des Acetons oder Acetonitrils kann in weiten Grenzen schwanken. Als günstig haben sich Acetonmengen von 5 Volumenprozent bis 50 Volumenprozent erwiesen. Bevorzugt sind Acetonkonzentrationen von 10 bis 40 Volumenprozent, insbesondere von 25 bis 35 Volumenprozent.

Der pH-Wert des Auflösepuffers beträgt etwa pH 1 bis 6, bevorzugt pH 2 bis 5, insbesondere pH 3 bis 4.

Die Säule wird ein- bis fünfmal mit dem Auflösepuffer gewaschen, bevorzugt ein- bis dreimal gewaschen, insbesondere einmal gewaschen. Die Insulinlösung hat einen Proteinanteil, von etwa 1 bis 10 %, bevorzugt 3 %.

Die Abtrennung des Insulins nach der Chromatographie aus den Eluaten geschieht durch Ausfällung mit Zink oder durch Kristallisation. Dabei kann die Lösung wahlweise vorher mittels Vakuumdestillation weitgehend vom Lösungsmittel befreit oder dessen Konzentration durch Verdünnen mit Wasser reduziert werden. Auf jeden Fall sollte die Lösungsmittelkonzentration vor der Fällung oder Kristallisation bei 10 % oder darunter liegen, um den Proteingehalt im Überstand auf <50 mg/l zu halten. Die entstandenen reinen Insulinniederschläge lassen sich durch Dekantieren, Zentrifugieren oder Filtration isolieren und trocknen.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich nicht nur zur analytischen Chromatographie, sondern auch zur präparativen Chromatographie, insbesondere wenn das erfindungsgemäße Verfahren mit einer präparativen HPLC-Anlage durchgeführt wird.

Unter dem Begriff "präparative Chromatographie" wird ein Reinigungsverfahren verstanden, mit dem Ziel Reinprodukte zu gewinnen und nicht nur zu analysieren. Die Menge der Reinprodukte kann in weiten Grenzen schwanken, beispielsweise von 1 mg bis 50 kg, bevorzugt von 50 mg bis 15 kg.

In den folgenden Beispielen wird das erfindungsgemäße Verfahren im einzelnen beschrieben. Prozentangaben beziehen sich auf das Gewicht, sofern nicht anders angegeben.

Beispiel 1

Puffer A: 0,15 M Ammoniumsulfat, 0,15 M Glycin, 0,025 M Natriumacetat, pH 5,5, 5% n-Propanol;
Puffer B: 0,15 M Ammoniumsulfat, 0,15 M Glycin, 0,025 M Natriumacetat, pH 5,5 Wasser/n-Propanol im Verhältnis 1 : 1.
Sorbens: Kromasil C8, 13 µm, 100 Å Porenweite, Fa. EKA Nobel.
Säulenabmessung: 30 cm×30 cm.

Die Säule wird mit einer Lösung von 10 g Reaktionsgemisch aus der Umamidierung von Schweineinsulin mit Trypsin, gelöst in 200 ml 0,1 M Glycin/HCl-Puffer, pH 2,8, beladen. Die Trypsinaktivität beträgt mehr als 10000 mAU/min. Innerhalb von 120 Minuten werden bei einem Fluß von 40 ml/min und Erhöhung der Propanol konzentration von 14 auf 30 % die einzelnen Proteinkomponenten getrennt eluiert. Man erhält nach Kristallisation bzw. Fällung und Trocknung als Hauptfraktion Humaninsulin-B30-di-tert.butylthreoninester/ether mit einer Reinheit von <97 % mit einer Ausbeute von 93 %, bezogen auf das eingesetzte Insulin.

Die Bestimmung der Proteaseaktivität wird wie folgt durchgeführt:

Bei diesem Test wird die Kinetik der Abspaltung eines Chromophors (4-Nitroanilid) von dem Substrat Garbobenzoxy-VaI-GIy-Arg-4-nitroanilid-acetat (Chromozym-Try; Best.-Nr. 378488 Fa. Boehringer Mannheim) bestimmt. Der Fortgang der Abspaltungsreaktion wird spektralphotometrisch über einen Zeitraum von 60 min. bei einer Wellenlänge von 405 nm gemessen. Die Zunahme der gemessenen Absorption ist dabei direkt porportional zur tryptischen Aktivität in dem Produkt. Die Steigung der Absorptionsgeraden wird bestimmt (Einheit: milli absorption units pro Minute (mAU/min.)) und ist ein direktes Maß für den Proteasegehalt.

Der Test wird wie folgt durchgeführt:

7,5 mg Humaninsulin werden in einem Milliliter Lösepuffer unter Rühren innerhalb von 30 min gelöst.
Lösepuffer:
200 mM TRIS pH 8,0
1 mM EDTA

Das Chromozymsubstrat wird mit einer Konzentration von 1 mg/ml in Wasser gelöst.

Die Reaktion wird bei 37°C durch Zugabe von 200 µl Substratlösung zu 1 ml Probelösung gestartet und dann sofort spektralphotometrisch bei 405 nm vermessen. Die Absorption der Reaktionslösung bei dieser Wellenlänge wird kontinuierlich für 60 Minuten registriert. Zur Ermittlung der tryptischen Aktivität wird die Steigung der Absorptionsgeraden bestimmt.

Es wird eine tryptische Aktivität von 250 mAU/min gemessen.

Beispiel 2

Die Chromatographie erfolgt wie in Beispiel 1 beschrieben, wobei die Bedingungen wie folgt geändert wurden:

0,1 M Glycin
0,05 M Ammoniumsulfat
Säulenabmessungen: 6 cm×25 cm
Es wird eine tryptische Aktivität von 5 bis 10 mAU/min gemessen.

Beispiel 3 (erfindungsgemäß)

A)
Puffer A: 0,05 M Ammoniumsulfat, 0,1 M Glycin, 0,025 M Natriumacetat, pH 5,5; 5 % Propanol;
Puffer B: 0,05 M Ammoniumsulfat, 0,1 M Glycin, 0,025 M Natriumacetat, pH 5,5, Wasser/n-Propanol im Verhältnis 1 : 1.
Sorbens: Kromasil C8, 13 µm, 100 Å Porenweite, Fa. EKA Nobel.
Säulenabmessung: 6 cm×25 cm.
Die Säule wird mit einer Lösung von 10 g Reaktionsgemisch aus der Trifluoressigsäurespaltung von Humaninsulin-B30-di-tert.butylthreoninester/ether gelöst in 200 ml 0,1 M Glycin/HCl-Puffer, pH 2,8, beladen. Die Trypsinaktivität beträgt mehr als 10 000 mAU/min. Innerhalb von 120 Minuten werden bei einem Fluß von 40 ml/min und Erhöhung der Propanolkonzentration von 14 auf 30% die einzelnen Proteinkomponenten getrent eluiert. Man erhält nach Kristallisation bzw. Fällung und Trocknung als Hauptfraktion Humaninsulin-B30-di- tert.butylthreoninester/ether mit einem Proteinanteil von 79%.
Die Bestimmung der Proteaseaktivität erfolgt wie in Beispiel 1.
Es wird eine tryptische Aktivität von 5 bis 10 mAU/min gemessen.
B)
Das Produkt aus Verfahrensschritt A) wird in 200 ml 0,1 M Glycin, 0,1 M NaCl,, 32 Volumenprozent Aceton, pH 3,5 (Auflösepuffer), gelöst und auf die obengenannte Säule aufgetragen.
Nach dem Auftragen auf die Säule wird mit einem Säulenvolumen des Auflösepuffers nachgewaschen. Anschließend erfolgt die Elution durch einen Gradienten von 17% Puffer B auf 19% B innerhalb von 45 min. Alle anderen Bedingungen sind analog Verfahrensschritt A).
Die tryptische Aktiviät beträgt weniger als 0,05 mAU/min.

Beispiel 4

Die Chromatographie erfolgt wie in Beispiel 3, Verfahrensschritt A), beschrieben, wobei die Säulenabmessungen 30 cm×30 cm betragen.

Es wird eine tryptische Aktivität von 20 bis 25 mAU/min gemessen.

Anschließend wird wie in Beispiel 3, Verfahrensschritt B, vorgegangen. Die Säulenabmessungen sind 30 cm×30 cm. Die tryptische Aktivität beträgt weniger als 0,05 mAU/min.

Claims

1. Verfahren zur Reinigung von Insulin und/oder Insulinderivaten durch eine zweistufige Chromatographie in wäßrigen, gepufferten Lösungsmitteln, die mit Wasser mischbare, organische Lösungsmittel enthalten, an lipophil modifiziertem Kieselgel, dadurch gekennzeichnet, daß man

1A) das zu reinigende Gemisch aus Proteasen, Insulin und/oder Insulinderivaten in einem Puffer löst,
1B) die Elution mit einem gepufferten Lösungsmittel, das Zwitterionen enthält und gegebenenfalls auf einen pH-Wert, der bis zu 1-pH-Einheit unter oder über dem isoelektrischen Punkt des zu reinigenden Insulins und/oder Insulinderivats eingestellt worden ist, durchführt, wobei die Konzentration der Zwitterionen 1 mMol/l bis 140 mMol/l, bezogen auf Wasser als Lösungsmittel beträgt

und anschließend die gewonnenen Insulinfraktionen

2A) in einem Auflösepuffer, der 5 bis 50 Volumenprozent Aceton oder Acetonitril enthält und der pH-Wert 1 bis 6 beträgt, löst,
2B) die erhaltene Lösung auf die Säule aufträgt,
2C) die Säule mit dem Auflösepuffer nachspült und
2D) die zu reinigenden Insuline und/oder Insulinderivate mit einem gepufferten Lösungsmittel, das Zwitterionen enthält und gegebenenfalls auf einen pH- Wert, der bis 1-pH-Einheit unter oder über dem isoelektrischen Punkt des zu reinigenden Insulins und/oder Insulinderivats eingestellt worden ist, eluiert, wobei die Konzentration der Zwitterionen 10 mMol/l bis 1 Mol/l, bezogen auf Wasser als Lösungsmittel, beträgt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Auflösepuffer 10 bis 40 Volumenprozent Aceton enthält.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Auflösepuffer 25 bis 35 Volumenprozent Aceton enthält.

4. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert des Auflösepuffers pH 2 bis 5 beträgt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert 3 bis 4 beträgt.