FI108644B

FI108644B - Menetelmä insuliinipitoisten liuosten valmistamiseksi

Info

Publication number: FI108644B
Application number: FI925719A
Authority: FI
Inventors: Bernhard Unger; Rainer Dickhardt; Claudia Graefe
Original assignee: Aventis Pharma Gmbh
Priority date: 1991-12-18
Filing date: 1992-12-16
Publication date: 2002-02-28
Also published as: EP0547544B1; GR3023431T3; JP2736214B2; NO924899L; FI925719A; US5621073A; JPH05308989A; DE59208181D1; ATE150032T1; EP0547544A2; CA2085719A1; DK0547544T3; CA2085719C; SG44748A1; FI925719A0; NO924899D0; NO304743B1; ES2099193T3; EP0547544A3

Description

108644

Menetelmä insuliinipitoisten liuosten valmistamiseksi

Analyyttisistä erotusmenetelmistä tunnetaan insuliinien tai insuliinijohdosten puhdistus lipofiilisesti 5 modifioiduilla (reversed phase) silikageeleillä ja menetelmää on käytetty monien vuosien ajan menestyksekkäästi korkeapainenestekromatografiässä (HPLC) (WS Welinder et ai., J. Chrom., 361 (1986) 357 - 367). Analyyttisessä mittakaavassa mikrogramma-alueella olevia proteiinimääriä 10 kaadetaan modifioidulla silikageelillä täytettyyn teräksestä, lasista tai muovista valmistettuun pylvääseen ja sen jälkeen eluoidaan virtaavalla nesteseoksella (useimmiten happamia, vesipitoisia puskuriliuoksia, joissa on vakiona pysyvät tai vaihtelevat orgaaniset liuotinpitoisuu-15 det). Proteiinikuormitus on tällöin paljon pienempi kuin 30 pg/ml pylvään tilavuutta.

Aiemmista kemiallisista reaktioista kuten esimerkiksi voimakkaasti happamista esterilohkaisuista tai ent-symaattisista (trans-)peptidointiprosesseista ja kiteyttä-20 mällä suoritetuista puhdistuksista saadut insuliinit si- ftt sältävät yleensä mukana samankaltaisia ominaisuuksia omaa- • » ' ·* via aineita. Ne voidaan puhdistaa ioninvaihtokromatogra- ’ * fian avulla valitsemalla tietyt pH-arvot, jos sähköiset : ’·· varauserot ovat riittävät (US-4 129 560). Tämän menetelmän ·,· j 25 haittana on laimennusvaikutus ja siten arvokkaiden aines- : ten häviäminen ylitteisiin saostusprosessien yhteydessä, suhteellisen pitkä kiertoaika tai se, että kokonaistal-teenotto ja siten saanto on pieni.

Insuliini valmisteet, joilla on depot-ominaisuuksia, ·, 30 sisältävät tavallisesti protamiineja, jotka pidentävät insuliinien vaikutuksen kestoa. Protamiinit ovat runsaasti « ; arginiinia sisältäviä proteiineja, jotka ovat peräisin "I mädistä. Depot-insuliinivalmisteiden laatututkimuksissa kävi yhä uudelleen ilmi selittämätön depot-ominaisuuksien 35 katoaminen valmisteen pitkähkön varastoinnin jälkeen. Sei- 108644 2 laiset insuliinivalmisteet ovat potilaalle täysin sopimattomia, koska niitä käytettäessä seurauksena on helposti insuliinin yliannostus, joka voi mahdollisesti johtaa hy-poglykeemisen shokin vaikutuksesta potilaan kuolemaan.

5 Näiden insuliinivalmisteiden tarkat tutkimukset osoittivat, että depot-ominaisuuksien häviäminen aiheutuu protamiinien hitaasta hajoamisesta proteaasien jäänteiden vaikutuksesta. Lisäksi kävi ilmi, että pääjoukko näissä valmisteissa olevista proteaaseista on peräisin sikainsu-10 liinin entsymaattisesta transpeptidoinnista ihmisinsulii- niesteriksi/eetteriksi tai insuliininkaltaisten esituot-teiden proteolyyttisistä hajoamisprosesseista. Suurin osa proteaaseista, esimerkiksi trypsiini, erotetaan tosin tavallisilla kromatografointimenetelmillä, mutta siitä huo-15 limatta ilmeisesti jäännökset proteaaseista saavuttavat insuliinivalmisteet ja johtavat niissä depot-ominaisuuksien häviämiseen.

Insuliinin geeniteknisessä valmistuksessa mikro-organismi asetyloi sivutuotteena myös insuliinin asemassa 20 A9 olevan seriinin, niin että syntyy seriinin hydroksyyli-ryhmän suhteen asetyloitu insuliinijohdos. Tämä insulii-' nijohdos on havaittu tähän asti vain insuliinin geenitek- nisen valmistuksen yhteydessä käytettäessä Escherichia · : '·· colia. Tämän asetyloidun insuliini johdoksen täydellinen : j : 25 eristäminen ihmisinsuliinista on tähän asti onnistunut vain ihmisinsuliinin matalan saannon kustannuksella, kun

I I

käytetään EP-patenttihakemuksessa julkaisunumero 0 474 213 kuvattua menetelmää. Lisäksi tästä menetelmästä käy ilmi, että erotus ei ole enää mahdollista, jos asetyloidun insu-... 30 liinin pitoisuus ylittää 5 prosenttia. Lisäksi tämän mene- 1’ telmän avulla ei saavuteta läheskään proteaasitonta insu- :: liinin tuottoa.

Nyt keksittiin menetelmä sellaisen insuliinin val-:·. mistamiseksi, joka on lähes vapaa proteaaseista ja/tai .··., 35 asemaan A9 asetyloidusta insuliinista, käyttäen kromato- 108644 3 grarafointia vesipitoisissa, puskuroiduissa eluenteissa, jotka sisältävät veteen sekoittuvia, orgaanisia liuottimia, lipofiilisesti modifioidun silikageelin avulla, jolle menetelmälle on tunnusomaista se, että 5 IA) proteaaseista ja/tai asemaan A9 asetyloidusta insuliinista ja insuliinista muodostuva seos liuotetaan puskuriin, IB) suoritetaan eluointi puskuroidulla eluentilla, joka sisältää kahtaisioneja ja joka on mahdollisesti pus-10 kuroitu pH-arvoon, joka on lähellä puhdistettavan insuliinin isoelektristä pistettä, saadut insuliinifraktiot mahdollisesti väkevöidään ja sen jälkeen saadut insuliinifraktiot 2A) liuotetaan liuotuspuskuriin, joka sisältää ase-15 töniä tai asetonitriiliä, 2B) saatu liuos siirretään pylvääseen, 2C) pylvästä huuhdellaan liuotuspuskurilla ja 2D) puhdistettavaa insuliinia eluoidaan puskuroidulla eluentilla, joka sisältää kahtaisioneja ja jonka pH 20 on mahdollisesti säädetty arvoon, joka on lähellä puhdistettavan insuliinin isoelektristä pistettä.

Yllättävästi asetonin tai asetonitriilin mukana olo ' * menetelmävaiheen 2A liuotuspuskurissa saa aikaan selvästi : ’·· parantuneen proteaasien ja asemaan A9 asetyloitujen insu- • j * 25 liinien erottumisen insuliinista, niin että kuvattuja on- gelmia ei enää esiinny sellaisten insuliinivalmistemuoto-j" *j jen yhteydessä, jotka sisältävät protamiineja.

Puhdistettavat seokset, jotka sisältävät proteaa-seja ja/tai asemaan A9 asetyloitua insuliinia ja insulii-... 30 nia, voivat olla peräisin suuresta joukosta entsymaattista prosesseja, esimerkiksi preproinsuliinien pre- ja/tai pro-.sekvenssien proteolyyttinen lohkaisu, insuliinin C- tai : N-terminaalisten aminohappojen lohkaisu tai sikainsuliinin amidoinnit ihmisinsuliiniksi tai ihmisinsuliinijohdoksik-... 35 si. Lisäksi puhdistettavissa seoksissa mukana oleva ase- 4 108644 maan A9 asetyloitu insuliini voi olla peräisin suuresta joukosta geeniteknisesti ilmaistuja insuliinirakenteita.

Menetelmässä erotettavia proteaaseja ovat esimerkiksi trypsiini, lysyleenidipeptidaasi, karboksipeptidaasi 5 A, Clostripain ja Achromobacter-proteaasit. Edullinen on trypsiini.

Tässä keksinnössä käsitteellä insuliini tarkoitetaan seuraavia yhdisteitä. Insuliineja, jotka ovat ihmistä! eläinalkuperää, esimerkiksi ihmisinsuliinia tai sika-10 insuliinia, insuliinin esiasteita, kuten esimerkiksi pro-insuliineja tai preproinsuliineja, tai yhdistettyjä insuliineja tai insuliinijohdoksia, joita kuvaavat geneettisesti modifioidut mikro-organismit. Lisäksi voidaan käyttää myös insuliinijohdoksia, joita on valmistettu käyttäen 15 esimerkiksi kemiallista tai entsymaattista johtamista, esimerkiksi Des-Phe-Bl-insuliini, insuliini-p-keteenisul-fonaatti, diarginiini-insuliini (B31, B32), monoarginii-niinsuliini tai difenyylialaniini-insuliini (B31, B32) (US-4 601 852) tai GlyA21-ArgB31-ArgB32-ihmisinsuliini 20 (EP-368 187).

Keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetään edulli-·;·’ sesti insuliineja, joilla on kaava I

',··: jossa S-S A 2 0 : * _1_i_

• 25 H- A-ketju C y s - Z-OH

* · t > ^-1-1- SS ( | ) : Il

S S

B 2_| | B 29 c 108644 5 ί ! ! sa on korkeintaan 50 C-atomia, geneettisesti koodattavissa olevaa L-aminohappoa ja jossa mahdollisesti mukana pääte-ryhmänä oleva karboksyyliryhmä voi olla vapaa, esteriryh-mänä, amidiryhmänä, laktonina tai ryhmäksi CH20H pelkisty-5 neenä, n tarkoittaa kokonaislukua 0-10, Y on vety tai L-fenyylialaniini ja Z on geneettisesti koodattavissa oleva, amidiryhmiä sisältämätön L-aminohappo 10 ja A- ja B-ketjulla on eläin- tai ihmisinsuliinin sekvenssit.

Edullisesti käytetään insuliineja, joilla on kaava I, jossa R30 tarkoittaa L-alaniinia tai L-treoniinia ja 15 X tarkoittaa yhtä tai useampaa L-aminohappoa ryh mästä L-arginiini, L-lysiini tai L-fenyylialaniini ja Z tarkoittaa L-glysiiniä, L-alaniinia, L-seriiniä, L-treoniinia, L-asparagiinihappoa tai L-glutamiinihappoa ja AI - A20 tai B2 - B29 tarkoittavat ihmis-, sika- tai 20 nautainsuliinin aminohapposekvenssiä.

... Ihmisinsuliinin aminohapposekvenssi AI - A20 on: *' ’ Gly Ile Vai Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser

Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys (SEQ ID NO: 1) • · · · 25 Ihmisinsuliinin aminohapposekvenssi B1 - B29 on:

Phe Vai Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Vai Glu Ala Leu Tyr Leu Vai Cys Gly Glu Arg ,.: Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys (SEQ ID NO: 2) 30

Lisäksi keksittiin, että edellä mainitun kromato-grafiamenetelmän menetelmävaiheet 2A - 2D sopivat yksin ilman menetelmävaiheita IA ja IB erinomaisesti insuliinin saamiseen insuliiniseoksista, jotka sisältävät insuliinia, 35 asemaan A9 asetyloitua insuliinia ja proteaaseja, sekä 6 108644 insuliiniseoksia, jotka sisältävät insuliinia ja asemaan A9 asetyloitua insuliinia.

Keksinnön mukaisessa menetelmässä erotettavissa olevat asemaan A9 asetyloidut insuliinit ovat esimerkiksi 5 asemaan A9 asetyloitu ihmisinsuliini tai A9-asetyloitu insuliini, jolla on kaava I, jolloin merkinnöillä R30, X, n, Y ja Z on edellä mainitut määritelmät.

Edullisesti erotetaan insuliinijohdoksia, joilla on kaava I, asemaan A9 asetyloiduista insuliineista, joilla 10 on kaava I. Erityisesti suoritetaan A9-asetyloidun ihmis-insuliinin erotus ihmisinsuliinista.

Insuliinia ja insuliinijohdoksia voidaan käyttää sekä suhteellisen epäpuhtaassa tilassa että esipuhdistet-tuna (esimerkiksi geelikromatografian avulla) muotona.

15 Insuliinissa on vielä monta kertaa suoritetun kiteytyksen ja myös geelikromatografoinnin jälkeen jäljellä epäpuhtautena hyvin samanlaisen moolimassan omaavia insuliinin kaltaisia aineita, jotka sopivasti valitulla pH-arvolla eroavat varaustilansa suhteen toisistaan ja insuliinis-20 ta, mutta muodostavat insuliinin kanssa komplekseja (US-4 129 560). Esimerkkejä sellaisista aineista ovat des-amidoinsuliinit, arginiini- ja diarginiini-insuliini ja • ‘ insuliinietyyliesteri.

• t : ’·· Lipofiilisesti modifioidulla silikageelillä tarkoi- j.j J 25 tetaan silikageeliä, jolle on levitetty hydrofobinen mat- riisi. Esimerkkejä hydrofobisesta matriisista ovat alkaa- nit, joiden ketjun pituus on 3 - 20 hiiliatomia. Lisäksi hiukkaskoko voi vaihdella laajalla alueella, esimerkiksi >(i>; 5-60 pm, erityisesti 10 - 50 pm. Myös huokoskoko voi » » ... 30 vaihdella laajalla alueella, edulliset huokoskoot ovat 50 - 300 A , erityisesti 100 - 200 A. Esimerkkejä lipofii-: ' ; lisesti modifioiduista silikageelimateriaaleista ovat: RNucleosil, valmistaja Macherey & Nagel GmbH + Co.

KG, Diiren, Saksa, pallomaisia ja ei pallomaisia, erilai- 108644 7 sen, korkeintaan 45 μπι:η hiukkaskoon omaavia materiaaleja, huokoskoko 100 A, C8-ja Cl8-modifioitu.

RLiChroprep, valmistaja Merck, Darmstadt, Saksa, ei pallomaisia ja pallomaisia, erilaisen, korkeintaan 40 pm:n 5 hiukkaskoon omaavia materiaaleja, huokoskoko 60 - 250 A, C8- ja C18-modifioitu; RLiChrospher Select B, valmistaja Merck, Darmstadt, Saksa, pallomainen materiaali, jonka hiukkaskoko korkeintaan 25 pm, C8-modifoitu; 10 RWaters Prep, valmistaja Millipore GmbH, Eschborn,

Saksa, C18-modifioitu, 50 - 105 pm, ei pallomainen, huokoskoko 100 A; RZorbax ProlO, valmistaja DuPont de Nemours (Saksa) GmbH, C8-modifioitu, 10 pm, pallomainen, huokoskoko 100 A; 15 RKromasil, valmistaja EKA Nobel, Nobel Industries,

Ruotsi, C4-, C8-ja C18-modifioitu, korkeintaan 16 pm, pallomainen, huokoskoko 100, 150 tai 200 A.

Kahtaisionit ovat yhdisteitä, jotka voivat sitoa ja myös vapauttaa protoneja, eli ne muodostavat happamassa 20 liuoksessa kationeja ja emäksisessä liuoksessa anioneja, kuten esimerkiksi α-aminohapot, betaiini tai betaiinijoh-’ dokset. Edullisia kahtaisioneja ovat glysiini, glutamiini ·’ · tai betaiini (N-trimetyyliglysiini). Erityisen edullinen * · : on glysiini.

• » j; : 25 Insuliinin tai insuliinijohdoksen isoelektrinen piste (IEP) on sellainen pH-arvo, jossa liuotetun insulii-nin kationisten varausten ja anionisten varausten summa on nolla. Esimerkiksi sikainsuliinin IEP on pH-alueella 5,3 -,5,4. Käsitteellä "lähellä isoelektristä pistettä" tarkoi-. 30 tetaan erityisesti pH-arvoja, jotka ovat noin yhden pH-yk- sikön verran puhdistettavan insuliinin IEP:n ylä- tai alapuolella. Erityisen edullisia ovat pH-arvot, jotka ovat korkeintaan 0,5 pH-yksikköä IEP:n ylä- tai alapuolella.

Käsitteellä "lähes proteaasiton insuliini" tarkoi- I I · ’ . 35 tetaan insuliinin ja proteaasien seoksia, joissa proteaa- 108644 8 siaktiivisuus on 0 - 4 mAU/min, edullisesti 0,01 - 1 mAU/-min, erityisesti 0,02 - 0,08 mAU/min.

Proteaasiaktiivisuus määrätään mittaamalla kromo-forin (4-nitroanilidi) lohkaisun kinetiikkaa substraa-5 tista karbobentsoksi-Val-Gly-Arg-4-nitroanilidiasetaatti (Chromozym-Try; tilausnumero 378488, valmistaja Boehringer Mannheim). Lohkaisureaktiota mitataan spektrofotometrises-ti 60 min:n aikana aallonpituudella 405 nm. Mitatun absorption lisääntyminen on tällöin suoraan verrannollinen 10 tuotteen tryptiseen aktiivisuuteen. Absorptiosuorien kal tevuudella on yksikkönä milliabsorptioyksikköä minuutissa (mAU/min).

Käsitteellä "insuliini, joka on lähes vapaa asemaan A9 asetyloidusta insuliinista" tarkoitetaan insuliinival-15 misteita, joilla on sellainen A9-asetyloidun insuliinin pitoisuus, joka on pienempi kuin 0,5 %, edullisesti pienempi kuin 0,2 %, erityisesti pienempi kuin 0,1 %.

Eluentit sisältävät puskurointiainetta, joka pitää eluentin pH-arvon vakiona. Sopivia puskurointiaineita tun-20 netaan kirjallisuudesta, esimerkiksi fosfaatit, alkali-tai maa-alkalimetallisuolat kuten natriumsitraatti tai ’·' ‘ kaliumasetaatti, ammoniumsitraatti, -asetaatti, -sulfaatti tai -kloridi. Lisäksi eluentit sisältävät veteen sekoittu- • » : ·* via orgaanisia liuottimia kuten esimerkiksi alkoholeja, · 25 ketoneja, metyyliasetaattia, dioksaania tai asetonitrii- liä. Edullisia ovat alkoholit kuten n- tai isopropanoli, metanoli, etanoli tai metyyliasetaatti.

Ensimmäistä kromatografointivaihetta (menetelmä-vaiheet IA - IB) varten veteen sekoittuvien orgaanisten 30 liuottimien pitoisuus on 1 - 70 %, edullisesti 10 - 50 %, / erityisen edullisesti 10 - 35 %. Puskurointiaineen pitoi- ’ ; suus on noin 1 mmol/1 - 140 mmol/1 laskettuna liuottimena käytetyn veden suhteen, edullisesti 2 mmol/1 - 120 mmol/1. Kahtaisionien pitoisuus voi vaihdella laajalla alueella.

> ' » . 35 Edullisia määriä ovat 1 mmol/1 - 140 mmol/1 laskettuna 9 108644 liuottimena käytetyn veden suhteen, edullisesti 10 - 110 nunol/1.

Lämpötila kromatografoinnin aikana on 0 °C - 50 °C, edullisesti 15 - 30 °C, erityisen edullisesti 15 - 20 eC.

5 Käyttöpaine kromatografoinnin aikana on suurin piirtein vakio. Kromatografointi voidaan suorittaa käyttäen erilaisia paineita, esimerkiksi kromatografointi voidaan suorittaa paineessa 5 - 400 bar, erityisesti 20 - 100 bar.

Pylväiden täyttö, insuliinien ja insuliinijohdosten 10 kromatografointi ja eluointi suoritetaan käyttäen tunnettuja, tavallisia, teknisiä menetelmiä. Pylvään täyttö puhdistettavalla insuliiniliuoksella suoritetaan edullisesti käyttäen vesi- ja alkoholipitoista tai pelkästään vesipitoista puskurointiliuosta. Insuliiniliuoksen proteiini-15 osuus on välillä noin 1 - 10 %, edullisesti 3 %.

Insuliinien eluointi suoritetaan keksinnön mukaisella menetelmällä käyttäen puskuroivien aineiden vakiopi-toisuutta (isokraattisesti) tai muuttamalla veteen sekoittuvan orgaanisen liuottimen osuutta puskurissa. Orgaanisen 20 liuottimen osuuden muuttaminen suoritetaan siten, että käytetyn orgaanisen liuottimen pitoisuus kohoaa eluointi-;* ‘ tilavuudesta riippuen, ja edullisesti riippuvuus on line- aarinen.

• * ; *·· Insuliinin väkevöiminen eluaateista kromatografoin- : : ; 25 nin jälkeen tapahtuu seostamalla sinkillä tai kiteyttämäl- lä. Tällöin liuoksesta on joko etukäteen poistettu suurim-maksi osaksi liuotin alipainetislauksen avulla tai sen pitoisuutta on pienennetty laimentamalla vedellä. Joka ,tapauksessa liuottimen pitoisuuden tulisi olla ennen saos-... 30 tusta tai kiteytystä noin 10 % tai sitä pienempi, jotta proteiinipitoisuus pysyisi ylitteessä pienempänä kuin 50 ; * mg/1. Syntyneet puhtaat insuliinisaostumat voidaan eristää : dekantoimalla, sentrifugoimalla tai suodattamalla ja kui- , ! vata.

108644 10

Toista kromatografointivaihetta (menetelmävaiheet 2A - 2B) varten veteen sekoittuvien orgaanisten liuottimien pitoisuus on 1 - 90 %, edullisesti 10 - 60 %, erityisen edullisesti 10 - 35 %. Puskurointiaineen pitoisuus on 5 noin 1 mmol/1 - 2 mol/1 laskettuna liuottimena käytetyn veden suhteen, edullisesti 25 mmol/1 - 1 mol/1. Kahtais-ionien pitoisuus voi vaihdella laajalla alueella. Edullisia määriä ovat 10 mmol/1 - 1 mol/1 laskettuna liuottimena käytetyn veden suhteen, edullisesti 20 - 500 mmol/1.

10 Lämpötila kromatografoinnin aikana on 0 - 50 °C, edullisesti 15 - 30 °C, erityisen edullisesti 15 - 20 °C. Käyttöpaine kromatografoinnin aikana on suurin piirtein vakio. Kromatografointi voidaan suorittaa käyttäen erilaisia paineita, esimerkiksi kromatografointi voidaan suorit-15 taa paineessa 5 - 400 bar, erityisesti 20 - 100 bar.

Pylväiden täyttö, insuliinien ja insuliinijohdosten kromatografointi ja eluointi suoritetaan käyttäen tunnettuja, tavallisia, teknisiä menetelmiä. Pylvään täyttö puhdistettavilla insuliineilla ja/tai insuliinijohdoksilla 20 suoritetaan käyttäen liuotuspuskuria, joka sisältää asetonia tai asetonitriiliä. Sopivia puskurointiaineita tunne-‘;’ ‘ taan kirjallisuudesta, esimerkiksi fosfaatit, alkali- tai ' maa-alkalimetallisuolat kuten natriumsitraatti tai kalium- • · • asetaatti, ammoniumsitraatti, ammoniumasetaatti, -sulfaat- f 25 ti tai -kloridi. Lisäksi liuotuspuskurit voivat sisältää I t t · myös kahtaisioneja. Asetonin tai asetonitriilin pitoisuus voi vaihdella laajoissa rajoissa. Edullisiksi ovat osoit- » tautuneet asetonimäärät tai asetonitriilimäärät 5 tilavuusprosenttia - 50 tilavuusprosenttia. Edullisia ovat 30 asetoni- tai asetonitriilipitoisuudet 10 - 40 tilavuusprosenttia, erityisesti 25 - 35 tilavuusprosenttia.

Liuotuspuskurin pH-arvo on noin 1-6, edullisesti 2-5, erityisesti 3-4.

i ^ 08 6 44 11

Pylväs pestään 1-5 kertaa liuotuspuskurilla, edullisesti 1-3 kertaa, erityisesti kerran. Insuliini-liuoksen proteiiniosuus on noin 1 - 10 %, edullisesti 3 %.

Insuliinien eluointi suoritetaan keksinnön mukai-5 sella menetelmällä käyttäen puskurointiaineiden vakiopi-toisuutta ja veden kanssa sekoittuvien orgaanisten liuo-tinten vakiopitoisuutta (isokraattisesti) tai muuttamalla veteen sekoittuvan orgaanisen liuottimen osuutta puskurissa. Orgaanisen liuottimen osuuden muuttaminen suoritetaan 10 siten, että käytetyn orgaanisen liuottimen pitoisuus kohoaa eluointitilavuudesta riippuen, ja edullisesti riippu- | I vuus on lineaarinen.

Insuliinin erotus eluaateista kromatografoinnin jälkeen tapahtuu saostamalla sinkillä tai kiteyttämällä. 15 Tällöin liuoksesta on joko etukäteen poistettu suurimmaksi osaksi liuotin alipainetislauksen avulla tai sen pitoisuutta on pienennetty laimentamalla vedellä. Joka tapauksessa liuottimen pitoisuuden tulisi olla ennen saostusta tai kiteytystä noin 10 % tai sitä pienempi, jotta prote-20 iinipitoisuus pysyisi ylitteessä pienempänä kuin 50 mg/1. Syntyneet puhtaat insuliinisaostumat voidaan eristää de-' _ kantoimalla, sentrifugoimalla tai suodattamalla ja kuiva ta.

: ” Keksinnön mukainen menetelmä ei sovi vain analyyt- • · i 25 tiseen kromatografiaan, vaan myös preparatiiviseen kroma- tografiaan, erityisesti jos keksinnön mukainen menetelmä toteutetaan preparatiivisella HPLC-laitteistolla.

Käsitteellä "preparatiivinen kromatografia" tarkoi-tetaan puhdistusmenetelmää, jossa tarkoituksena on saada .···. 30 puhdastuotteita eikä vain suorittaa analyysi. Puhdastuot- • _ teiden määrä voi vaihdella laajoissa rajoissa, esimerkiksi ' '· 1 mg - 50 kg, edullisesti 50 mg - 15 kg.

' Seuraavissa esimerkeissä keksinnön mukaista mene telmää kuvataan yksityiskohtaisesti. Prosenttiluvut on 108644 12 ilmoitettu massan suhteen, mikäli toisin ei ole ilmoitettu.

Esimerkki 1

Puskuri A: 0,1 M ammoniumsulfaatti, 0,1 M glysiini, 5 0,025 M natriumasetaatti, pH 5,5, 5 % propanolia

Puskuri B: 0,1 M ammoniumsulfaatti, 0,1 M glysiini, 0,025 M natriumasetaatti, pH 5,5, vesi/n-propanoli suhteessa 1:1

Sorbenssi: RKromasil C8, huokoskoko 100 A 10 Pylvään mitat: 2 cm x 25 cm.

Pylväs täytetään geeniteknisestä valmistuksesta peräisin olevalla ihmisinsuliinilla, joka sisältää 2,5 % asetyloitua ihmisinsuliinia 25 ml:ssa liuotuspuskuria, joka sisältää 0,1 M glysiiniä, 0,1 M NaCl, 32 tilavuus-% 15 asetonia, pH 3,5.

Ihmisinsuliiniliuoksen pylvääseen johtamisen jälkeen pestään pylvästilavuudella liuotuspuskuria.

Yksittäiset proteiinikomponentit eluoidaan 90 minuutin aikana käyttäen virtausta 9 ml/min ja kasvattamalla 20 propanolipitoisuutta arvosta 14 % arvoon 25 %. Kiteytyksen tai saostuksen ja kuivauksen jälkeen saadaan pääfraktio-na ihmisinsuliinia, jonka puhtaus on yli 98 %, saantona [ 86,2 % käytetyn insuliinin suhteen.

• A9-asetyloidun ihmisinsuliiniin pitoisuuden määri- : 25 tys suoritetaan seuraavalla tavalla: • » *. · Analyysiä varten käytetään RNucleosil C18:lla, : 120 A, 5 pm, täytettyjä HPLC-pylväitä (4 mm x 250 mm) (Machery & Nagel, Diiren).

*:·· Puskuri A: . ·. 30 35 mM natriumfosfaattia 300 mM natriumkloridia 25 % asetonitriiliä 75 % vettä pH 3,0 ' ,, Puskuri B: . 35 35 mM natriumfosfaattia 108644 13 ! 50 mM natriumkloridia 65 % asetonitriiliä 35 % vettä pH 3,0

Pylväslämpötilassa 40 °C käyttäen virtausta 1 5 ml/min ja gradienttia 12 % puskuria B - 21 % puskuria B eluoidaan asetyloitu johdos pylväästä 25 min:n aikana vii-pymäaikaeron ollessa 6 min ihmisinsuliinipiikin jälkeen. Tällä analyysimenetelmällä insuliinijohdos voidaan oikein hyvin erottaa ihmisinsuliinista, identifioida ja kvanti-10 toida.

A9-asetyloidun ihmisinsuliinin pitoisuus on puhdistuksen jälkeen pienempi kuin 0,1 %.

Esimerkki 2

Seuraavassa vertailuesimerkissä kromatografointi 15 suoritetaan kuten esimerkissä 1, jolloin liuotuspuskuri sisältää kuitenkin vain 0,1 M glysiiniä/HCl, pH 2,8.

Saanto: 58 %, puhtaus yli 98 %.

A9-asetyloidun ihmisinsuliinin pitoisuus on 0,2 %.

Esimerkki 3 20 Puskuri A: 0,15 M ammoniumsulfaatti, 0,15 M glysii- • ni, 0,025 M natriumasetaatti, pH 5,5, 5 % n-propanolia;

Puskuri B: 0,15 M ammoniumsulfaatti, 0,15 M glysii- ,, ni, 0,025 M natriumasetaatti, pH 5,5, vesi/n-propanoli • '* suhteessa 1:1.

• * • · » : : : 25 Sorbenssi: Kromasil C8, 13 pm, huokoskoko 100 Ä, valmistaja EKA Nobel.

* * ( V '· Pylvään mitat: 6 cm x 25 cm.

Pylväs täytetään käyttäen liuosta, joka sisältää ;··| 10 g reaktioseosta, joka on saatu sikainsuliinin amidoin- 30 nista trypsiinillä, liuotettuna 200 ml:an 0,1 M glysii-ni/HCl-puskuria, pH 2,8. 120 min:n aikana käyttäen vir- tausta 40 ml/min ja kohottamalla propanolipitoisuus arvos-“· ta 14 % arvoon 30 % eluoidaan yksittäiset proteiinikompo- nentit erilleen. Kiteytyksen tai saostuksen ja kuivauksen i ,*··. 35 jälkeen saadaan pääfraktiona ihmisinsuliini-B30-di-tert. - 14 1 O 8 6 4 4 butyylitreoniiniesteri/eetteriä, jonka puhtaus on yli 97 % ja saanto 93 % käytetyn insuliinin suhteen.

Proteaasiaktiivisuus määritetään seuraavalla tavalla: 5 Tässä kokeessa määritetään kromoforin (4-nitroani- lidi) substraatista karbobentsoksi-Val-Gly-Arg-4-nitroani-lidiasetaatti (Chromozym-Try; tilausnumero 378488, valmistaja Boehringer Mannheim) lohkaisun kinetiikka. Lohkaisu-reaktion etenemistä mitataan spektrofotometrisesti 60 10 min:n aikana aallonpituudella 405 nm. Mitatun absorption lisääntyminen on tällöin suoraan verrannollinen tryptiseen aktiivisuuteen tuotteessa. Absorptiosuorien kaltevuus määritetään (yksikkö: milliabsorptioyksikköä minuutissa (mAU/min)), ja se on suora mitta proteaasipitoisuudelle. 15 Koe suoritetaan seuraavalla tavalla: 7,5 mg ihmisinsuliinia liuotetaan yhteen millilit-raan liuotuspuskuria samalla sekoittaen 30 min:n aikana.

Liuotuspuskuri:

200 mM TRIS pH 8,0 20 1 mM EDTA

Kromotsymisubstraatti liuotetaan veteen pitoisuutena 1 mg/ml.

Reaktio käynnistetään lämpötilassa 37 °C lisäämällä • 200 μΐ substraattiliuosta 1 ml:aan koeliuosta ja sen jäl- 25 keen mitataan heti spektrofotometrisesti käyttäen aallon-pituutta 405 nm. Reaktioliuoksen absorptiota tällä aallon-: pituudella rekisteröidään jatkuvasti 60 min:n ajan. Tryp- tisen aktiivisuuden määrittämiseksi määritetään absorptio-*· * suorien kaltevuus.

30 Mitataan tryptinen aktiivisuus 250 mAU/min.

Esimerkki 4

Kromatografointi suoritetaan esimerkissä 3 kuvatulla tavalla, jolloin olosuhteita muutettiin seuraavalla ·' ,, tavalla: 108644 15 0,1 M glysiiniä 0,05 M ammoniumsulfaattia

Pylvään mitat: 6 cm x 25 cm

Mitataan tryptinen aktiivisuus 5-10 mAU/min.

5 Esimerkki 5

Kromatografointi suoritetaan esimerkissä 4 kuvatulla tavalla, jolloin pylvään mitat ovat 30 cm x 30 cm.

Mitataan tryptinen aktiivisuus 20 - 25 mAU/min.

Esimerkki 6 10 Puskuri A: 0,05 M ammoniumsulfaatti, 0,1 M glysii- ni, 0,025 M natriumasetaatti, pH 5,5, 5 % n-propanolia;

Puskuri B: 0,05 M ammoniumsulfaatti, 0,1 M glysii-ni, 0,025 M natriumasetaatti, pH 5,5, vesi/n-propanoli suhteessa 1:1.

15 Sorbenssi: Kromasil C8, 13 pm, huokoskoko 100 Ä, valmistaja EKA Nobel.

Pylvään mitat: 6 cm x 25 cm.

Pylväs puhdistetaan käyttäen liuosta, joka sisältää 10 g reaktioseosta, joka on ihmisinsuliini-B30-di-tert.bu- 20 tyylitreoniiniesteri/eetterin trifluorietikkahappolohkai-

susta ja jonka proteiiniosuus on 79 %, esimerkissä 4 kuvatulla tavalla. Sen jälkeen saostetaan kuten esimerkissä 3 insuliinipitoisten fraktioiden väkevöimiseksi ja liuote-: " taan seokseen, joka sisältää 200 ml 0,1 M glysiiniä, 0,1 M

: 25 NaCl, 32 tilavuusprosenttia asetonia, pH 3,5, ja pylväs täytetään sillä. Ihmis insuliini liuoksen pylvääseen lisää-: misen jälkeen pestään pylvästilavuudella liuotuspuskuria.

Sen jälkeen eluointi suoritetaan käyttäen gradienttia 17 % - 19 % puskuria B 45 min:n aikana. Kaikki muut olo- 30 suhteet ovat esimerkin 4 mukaisia.

Tryptinen aktiivisuus on pienempi kuin 0,05 : mAU/min.

Esimerkki 7 _ Kromatografointi suoritetaan kuten esimerkissä 6.

35 Pylvään mitat ovat 30 cm x 30 cm. Tryptinen aktiivisuus on pienempi kuin 0,05 mAU/min.

108644 16

Sekvenssiprotokolla SEQ ID NO: 1 5 Sekvenssin laatu: aminohappo (AS)

Sekvenssin pituus: 20 AS

Gly ILE Vai Glu Gin Cys Cys Thr Ser ILE Cys Ser Leu 1 5 10 10

Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys 15 20 . K SEQ ID NO: 2 Id

Sekvenssin laatu: AS Sekvenssin pituus: 29 AS

Phe Vai Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Vai Glu 20 1 5 10 ‘ Ala Leu Tyr Leu Vai Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr ' 15 20 25 : 25 ;· ; Thr Pro Lys

Claims

108644 π i ! Patent: ti vaatimukset

1. Menetelmä sellaisen insuliinin valmistamiseksi, joka on lähes vapaa proteaaseista ja/tai asemaan A9 asety- 5 loidusta insuliinista, jolloin proteaasiaktiivisuus on 0 -4 mAU/min, edullisesti 0,01 - 1 mAU/min, erityisesti 0,02 -0,08 mAU/min ja A9-asemaan asetyloidun insuliinin pitoisuus on pienempi kuin 0,5 %, edullisesti pienempi kuin 0,2 %, erityisesti pienempi kuin 0,1 %, käyttäen kromatografointia 10 vesipitoisissa, puskuroiduissa eluenteissa, jotka sisältävät veteen sekoittuvia, orgaanisia liuottimia, lipofiili-sesti modifioidun silikageelin avulla, tunnettu siitä, että IA) proteaaseista ja/tai asemaan A9 asetyloidusta 15 insuliinista ja insuliinista muodostuva seos liuotetaan puskuriin, IB) suoritetaan eluointi puskuroidulla eluentilla, joka sisältää kahtaisioneja ja joka on mahdollisesti säädetty pH-arvoon, joka on lähellä puhdistettavan insuliinin 20 isoelektristä pistettä, saadut insuliinifraktiot mahdollisesti väkevöidään ja sen jälkeen saadut insuliinifraktiot : 2A) liuotetaan liuotuspuskuriin, joka sisältää ase- töniä tai asetonitriiliä, ··. 25 2B) saatu liuos siirretään pylvääseen, \ . 2C) pylvästä huuhdellaan liuotuspuskurilla ja ··' · 2D) puhdistettavaa insuliinia eluoidaan puskuroidul- la eluentilla, joka sisältää kahtaisioneja ja jonka pH on : mahdollisesti säädetty arvoon, joka on lähellä puhdistetta- 30 van insuliinin isoelektristä pistettä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että menetelmävaiheita 2A - 2D käy- » tetään sellaisen insuliinin saamiseksi, joka on lähes vapaa ; asemaan A9 asetyloidusta insuliinista, insuliinia, prote- • 35 aaseja ja asemaan A9 asetyloitua insuliinia sisältävistä » 108644 seoksista tai insuliinia ja asemaan A9 asetyloitua insuliinia sisältävistä seoksista.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että liuotuspuskuri sisältää 5-50 5 tilavuusprosenttia, erityisesti 10 - 40 tilavuusprosenttia asetonia.

4. Yhden tai useamman patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että liuotuspus-kurin pH-arvo on 2 - 5, erityisesti 3-4.

5. Yhden tai useamman patenttivaatimuksen 1-4 mu kainen menetelmä, tunnettu siitä, että saadaan insuliinia, jolla on kaava I S-S A 2 0 _1_1_

15 H-- A-ketju Cys - Z-OH L-)-1-J SS ( I ) I I S S B 2 . I B29 V_' I I_p30 Y

20 Y— Voi B-ket^u Ly s R xn jossa : R30 tarkoittaa geneettisesti koodattavissa olevan ....j L-aminohapon ryhmää, ··. 25 X tarkoittaa hydroksyyliryhmää, fysiologisesti vaa- • · · . ratonta orgaanista emäksisen luonteen omaavaa ryhmää, jossa * * * * on korkeintaan 50 C-atomia, geneettisesti koodattavissa *i olevaa L-aminohappoa ja joiden mahdollisesti pääteryhmänä II» V · mukana oleva karboksyyliryhmä voi olla vapaa, esteriryhmä- 30 nä, amidiryhmänä, laktonina tai ryhmäksi CH20H pelkistynee-.. ..I nä, n tarkoittaa kokonaislukua 0 - 10, Y on vety tai L-fenyylialaniini ja Z on geneettisesti koodattavissa oleva, amidiryhmiä :"! 35 sisältämätön L-aminohappo i » 108644 ja A- ja B-ketjulla on eläin- tai ihmisinsuliinin sekvenssit.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että saadaan insuliinijohdosta, 5 jolla on kaava I, jossa R30 tarkoittaa L-alaniinia tai i L-treoniinia ja X tarkoittaa yhtä tai useampaa L- aminohappoa ryhmästä L-arginiini, L-lysiini tai L-fenyylialaniini, Z tarkoittaa L-glysiiniä, L-alaniinia, L-seriiniä, L-treoniinia, L-asparagiinihappoa tai L- 10 glutamiinihappoa ja AI -A20 tai B2 - B29 tarkoittavat ihmis-, sika- tai nautainsuliinin aminohapposekvenssiä.

7. Yhden tai useamman patenttivaatimuksen 1-6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että saadaan ih-misinsuliinia.

8. Yhden tai useamman patenttivaatimuksen 1-7 mu kainen menetelmä, tunnettu siitä, että proteaasina erotetaan trypsiiniä.

9. Yhden tai useamman patenttivaatimuksen 1-8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään 20 preparatiivista korkeapainenestekromatografialaitteistoa. • 1 · • » · • 1 • 1 » • » · * » # 1 · 108644