DE4220293C2 - Verfahren zur Reinigung von Insulin und/oder Insulinderivaten - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von Insulin- und/oder Insulinderivaten gemäß den Patentansprüchen.

Aus analytischen Trennverfahren ist die Reinigung von Insulinen oder Insulinderivaten an lipophil modifizierten (reversed phase) Kieselgelen bekannt und wird seit vielen Jahren in der Hockdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) erfolgreich angewendet (WS Welinder et al., J. Chrom., 361, (1986) 357-367). Im analytischen Maßstab werden Proteinmengen im µg-Bereich auf eine mit modifiziertem Kieselgel gefüllte Säule aus Stahl, Glas oder Kunststoff aufgetragen und anschließend durch ein strömendes Flüssigkeitsgemisch (zumeist saure, wäßrige Pufferlösungen mit konstanter oder variabler organischer Lösemittelkonzentration) eluiert. Die Proteinbeladung beträgt hierbei weit weniger als 30 µg/ml Säulenvolumen.

Bisherige Reinigungsverfahren wenden häufig die im Labor genutzten - relativ toxischen - Lösemittel (Acetonitril) und korrosiven, teuren Pufferkomponenten wie Tetraalkylammoniumsalze, Alkylsulfonate, Hexafluoraceton oder Trifluoracetat an (E. P. Kroeff et al., J. Chrom., 461, (1989), 45-61). Diese Laufmittel führen bei stärker mit insulinähnlichen Substanzen verunreinigten Gemischen zu keiner befriedigenden präparativen Trennung im Hinblick auf Qualität oder Ausbeute der Hauptkomponente (J. Rivier, R. McClintock; J. Chrom., 268 (1983) 112-119; Peter et al., J. Chrom. 408 (1987) 43-52).

Bei der gentechnischen Herstellung von Insulin wird als Nebenprodukt auch das an der Position A9 befindliche Serin des Insulins von dem Mikroorganismus acetyliert, so daß ein an der Hydroxylgruppe von Serin acetyliertes Insulinderivat entsteht. Dieses Insulinderivat wird bisher nur bei der gentechnischen Herstellung von Insulin mit Escherichia coli beobachtet. Die vollständige Abtrennung dieses acetylierten Insulinderivats von Humaninsulin gelingt bisher nur auf Kosten einer niedrigen Ausbeute an Humaninsulin, wenn man das in der EP 474 213 A2 beschriebene Verfahren verwendet. Ferner zeigt sich bei diesem Verfahren, daß keine Auftrennung mehr durchführbar ist, wenn die Konzentration von acetyliertem Insulin 5% überschreitet.

Es wurde schon ein Verfahren zur Gewinnung von annähernd proteasefreiem Insulin und/oder Insulinderivaten durch eine zweistufige Chromatographie in wäßrigen, gepufferten Lösungsmitteln, die mit Wasser mischbare, organische Lösungsmittel enthalten, an lipophil modifiziertem Kieselgel vorgeschlagen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man

• 1A) das Gemisch aus Proteasen, Insulin und/oder Insulinderivaten in einem Puffer löst,
• 1B) die Elution mit einem gepufferten Lösungsmittel, das Zwitterionen enthält und gegebenenfalls auf einen pH-Wert in der Nähe des isoelektrischen Punktes des zu reinigenden Insulins und/oder Insulinderivats eingestellt worden ist, durchführt

und anschließend die gewonnenen Insulinfraktionen

• 2A) in einem Auflösepuffer, der Aceton oder Acetonitril enthält, löst,
• 2B) die erhaltene Lösung auf die Säule aufträgt,
• 2C) die Säule mit dem Auflösepuffer nachspült und
• 2D) die zu reinigenden Insuline und/oder Insulinderivate mit einem gepufferten Lösungsmittel, das Zwitterionen enthält und gegebenenfalls auf einen pH- Wert in der Nähe des isoelektrischen Punktes des zu reinigenden Insulins und/oder Insulinderivats eingestellt worden ist, eluiert (DE 41 41 794 A1).

Es wurde nun gefunden, daß sich die zweite Stufe des obengenannten Chromatographieverfahrens auch hervorragend zur Reinigung von Insulingemischen eignet, bei denen auch an der Position A9 acetyliertes Serin- Insulin vorliegt.

Überraschenderweise bewirkt die Anwesenheit von Aceton oder Acetonitril im Auflösepuffer der Chromatographie die deutlich verbesserte Abtrennung des an A9 acetylierten Insulins / der an A9 acetylierten Insulinderivate von dem zu reinigenden Insulin / den zu reinigenden Insulinderivaten.

Die zu reinigenden Gemische, enthaltend A9-acetyliertes Insulin, Insulin und/oder Insulinderivate, können aus einer Vielzahl gentechnisch hergestellter Insulinkonstrukte stammen.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren abtrennbaren an Position A9 acetylierten Insuline/Insulinderivate sind beispielsweise A9-acetyliertes Humaninsulin oder A9- acetylierte Insulinderivate der Formel I

in welcher
R³⁰ für den Rest einer genetisch kodierbaren L-Aminosäure,
X für eine Hydroxygruppe, eine physiologisch unbedenkliche organische Gruppe basischen Charakters mit bis zu 50 C-Atomen, eine genetisch kodierbare L-Aminosäure und deren gegebenenfalls vorhandene endständige Carboxylfunktion frei, als Esterfunktion, als Amidfunktion, als Lacton oder zu CH₂OH reduziert vorliegen kann,
n für eine ganze Zahl von 0 bis 10,
Y für Wasserstoff oder L-Phenylalanin steht
und die A- und B-Kette die Sequenzen tierischen oder menschlichen Insulins haben.

Bevorzugt werden Insulinderivate der Formel I von den an Position A9 acetylierten Insulinderivaten der Formel I abgetrennt.

Besonders bevorzugt werden Insulinderivate der Formel I, in welcher
R³⁰ für L-Alanin oder L-Threonin und
X für eine oder mehrere L-Aminosäuren aus der Gruppe L-Arginin, L-Lysin oder L-Phenylalanin steht,
von den in A9-acetylierten Insulinen der Formel I abgetrennt.

Insbesondere erfolgt eine Abtrennung A9-acetylierten Humaninsulins von Humaninsulin.

Insulin und Insulinderivate können sowohl in verhältnismäßig unreinem Zustand als auch in vorgereinigter Form (z. B. durch Gelchromatographie) eingesetzt werden. Insulin ist nach mehrfacher Kristallisation und auch nach Gelchromatographie noch mit insulinähnlichen Begleitstoffen sehr ähnlichen Molekulargewichts verunreinigt, die sich bei passend gewähltem pH in ihrem Ladungszustand untereinander und vom Insulin unterscheiden, aber mit Insulin Komplexe bilden (US 4 129 560). Beispiele solcher Substanzen sind Desamidoinsuline, Arginin- und Diarginininsulin und Insulinethylester.

Unter lipophil modifiziertem Kieselgel wird ein Kieselgel verstanden, auf das eine hydrophobe Matrix aufgebracht wurde. Beispiele für eine hydrophobe Matrix sind Alkane mit einer Kettenlänge von 3 bis 20 Kohlenstoffatomen, insbesondere 8 bis 18 Kohlenstoffatomen. Ferner kann die Korngröße in einem weiten Bereich schwanken, beispielsweise von 5 bis 60 µm, insbesondere von 10 bis 50 µm. Die Porenweite kann auch in einem weiten Bereich schwanken, günstige Porenweiten liegen bei 50 bis 300 Å, insbesondere 100 bis 200 Å. Beispiele für liphophil modifizierte Kieselgelmaterialien sind:

• - ®Nucleosil, Firma Macherey & Nagel GmbH + Co. KG, Düren, Deutschland
  sphärische und nicht sphärische Materialien verschiedener Korngröße bis zu 45 µm, 100 Å Porenweite, C8- bzw. C18-modifiziert.
• - ®LiChroprep, Firma E. Merck, Darmstadt, Deutschland
  nicht sphärische und sphärische Materialien verschiedener Korngrößen bis 40 µm, 60-250 Å Porenweite, C8- bzw. C18-modifiziert;
• - ®LiChrospher Select B, Firma E. Merck, Darmstadt, Deutschland
  sphärisches Material bis 25 µm Korngröße, C8-modifiziert;
• - ®Waters Prep, Firma Millipore GmbH, Eschborn, Deutschland
  C18-modifiziert, 50-105 µm
  nichtsphärisch, 100 Å Porenweite;
• - ®Zorbax Pro10, Firma DuPont de Nemours (Deutschland) GmbH, Bad Homburg, Deutschland
  C8-modifiziert, 10 µm, sphärisch, 100 Å Porenweite;
• - ®Kromasil, Firma EKA Nobel, Nobel Industries, Schweden
  C4-, C8- und C18-modifiziert, bis 20 µm, sphärisch, 100, 150 oder 200 Å Porenweite.

Zwitterionen sind Verbindungen, die Protonen aufnehmen und auch abspalten können, d. h. in saurer Lösung Kationen und in alkalischer Lösung Anionen bilden, wie beispielsweise α-Aminosäuren, Betain oder Betainderivate. Bevorzugte Zwitterionen sind Glycin, Glutamin oder Betain (N-Trimethyl-glycin). Besonders bevorzugt ist Glycin.

Der isoelektrische Punkt (IEP) eines Insulins oder Insulinderivates ist derjenige pH- Wert, in der die Summe der kationischen Ladungen und anionischen Ladungen des gelösten Insulins gleich Null ist. Beispielsweise liegt der IEP von Schweineinsulin im Bereich von pH 5,3 bis 5,4 (H. Neurath, K. Bailey, Protein Hormones, Vol. II/A, The Proteins, s. 636). Mit dem Begriff "in der Nähe des isoelektrischen Punkts" sind insbesondere pH-Werte gemeint, die um ca. 1 pH-Einheit über oder unter dem IEP des zu reinigenden Insulins liegen. Besonders bevorzugt sind pH-Werte, die bis zu 0,5 pH-Einheiten über oder unter dem IEP liegen.

Die Elutionsmittel enthalten eine Puffersubstanz, die den pH-Wert des Elutionsmittels konstant halten. Geeignete Puffersubstanzen sind in der Literatur bekannt, beispielsweise Phosphate, Alkali- oder Erdalkalimetallsalze wie Natriumcitrat oder Kaliumacetat, Ammoniumcitrat, -acetat, -sulfat oder -chlorid. Ferner enthalten die Elutionsmittel mit Wasser mischbare organische Lösungsmittel wie beispielsweise Alkohole, Ketone, Methylacetat, Dioxan, Dimethylsulfoxid oder Acetonitril. Bevorzugt werden Alkohole wie n- oder iso-Propanol, Methanol, Ethanol oder Methylacetat.

Mit dem Begriff "Insulin und/oder Insulinderivate, das/die annähernd frei ist/sind von in der Position A9 acetyliertem Insulin / acetylierten Insulinderivaten" sind Präparationen gemeint, die einen Gehalt an A9-acetyliertem Insulin/-derivat von weniger als 0,2%, bevorzugt weniger als 0,1%, haben.

Für die Chromatographie beträgt die Konzentration der mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel 1 bis 90%, bevorzugt 10 bis 60%, besonders bevorzugt 10 bis 35%. Die Konzentration der Puffersubstanz beträgt etwa 1 mMol/l bis 2 Mol/l, bezogen auf Wasser als Lösungsmittel, bevorzugt 25 mMol/l bis 1 Mol/l. Die Konzentration der Zwitterionen kann in einem weiten Bereich schwanken. Vorteilhafte Mengen sind 10 mMol/l bis 1 Mol/l, bezogen auf Wasser als Lösungsmittel, bevorzugt 20 mMol/l bis 500 mMol/l.

Die Temperatur während der Chromatographie beträgt 0°C bis 50°C, vorzugsweise 15 bis 30°C, besonders bevorzugt 15 bis 20°C. Der Betriebsdruck während der Chromatographie ist weitgehend konstant. Die Chromatographie kann mit unterschiedlichem Druck durchgeführt werden, z. B. kann die Chromatographie bei einem Druck von 5 bis 400 bar durchgeführt werden, insbesondere bei 20 bis 100 bar.

Die Beladung der Säulen, Chromatographie und Elution der Insuline und Insulinderivate erfolgt nach bekannten, üblichen, technischen Methoden. Die Beladung der Säule mit den zu reinigenden Insulinen und/oder Insulinderivaten erfolgt mit einem Auflösepuffer, der Aceton oder Acetonitril enthält. Geeignete Puffersubstanzen sind in der Literatur bekannt, beispielsweise Phosphate, Alkali- oder Erdalkalimetallsalze wie Natriumcitrat oder Kaliumacetat, Ammoniumcitrat, Ammoniumacetat, -sulfat oder -chlorid. Ferner können im Auflösepuffer auch Zwitterionen anwesend sein. Die Konzentration des Acetons oder Acetonitrils kann in weiten Grenzen schwanken. Als günstig haben sich Acetonmengen oder Acetonitrilmengen von 5 Volumenprozent bis 50 Volumenprozent erwiesen. Bevorzugt sind Acetonitril- oder Acetonkonzentrationen von 10 bis 40 Volumenprozent, insbesondere von 25 bis 35 Volumenprozent.

Der pH-Wert des Auflösepuffers beträgt etwa pH 1 bis 6, bevorzugt pH 2 bis 5, insbesondere pH 3 bis 4.

Die Säule wird ein- bis fünfmal mit dem Auflösepuffer gewaschen, bevorzugt ein- bis dreimal gewaschen, insbesondere einmal gewaschen. Die Insulinlösung hat einen Proteinanteil von etwa 1 bis 10%, bevorzugt 3%.

Die Elution der Insuline erfolgt mit dem erfindungsgemäßen Verfahren bei konstanter Konzentration der Puffersubstanzen und konstanter Konzentration der mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel (isokratisch) oder durch Veränderung des mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittelanteils im Puffer. Die Veränderung des organischen Lösungsmittelanteils erfolgt in der Weise, daß die Konzentration des verwendeten organischen Lösungsmittels in Abhängigkeit vom Elutionsvolumen steigt, und zwar vorzugsweise in linearer Abhängigkeit.

Die Abtrennung des Insulins nach der Chromatographie aus den Eluaten geschieht durch Ausfällung mit Zink oder durch Kristallisation. Dabei kann die Lösung wahlweise vorher mittels Vakuumdestillation weitgehend vom Lösungsmittel befreit oder dessen Konzentration durch Verdünnen mit Wasser reduziert werden. Auf jeden Fall sollte die Lösungsmittelkonzentration vor der Fällung oder Kristallisation bei 10% oder darunter liegen, damit der Proteingehalt im Überstand auf weniger als 50 mg/l gehalten wird. Die entstandenen reinen Insulinniederschläge lassen sich durch Dekantieren, Zentrifugieren oder Filtration isolieren und trocknen.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich nicht nur zur analytischen Chromatographie, sondern auch zur präparativen Chromatographie, insbesondere wenn das erfindungsgemäße Verfahren mit einer präparativen HPLC-Anlage durchgeführt wird.

Unter dem Begriff "präparative Chromatographie" wird ein Reinigungsverfahren verstanden mit dem Ziel, Reinprodukte zu gewinnen und nicht nur zu analysieren.

Die Menge der Reinprodukte kann in weiten Grenzen schwanken, beispielsweise von 1 mg bis 50 kg, bevorzugt von 50 mg bis 15 kg.

In den folgenden Beispielen wird das erfindungsgemäße Verfahren im einzelnen beschrieben. Prozentangaben beziehen sich auf das Gewicht, sofern nicht anders angegeben.

Beispiel 1

Puffer A: 0,1 M Ammoniumsulfat, 0,1 M Glycin, 0,025 M Natriumacetat, pH 5,5, 5% Propanol
Puffer B: 0,1 M Ammoniumsulfat, 0,1 M Glycin, 0,025 M Natriumacetat, pH 5,5, Wasser/n-Propanol im Verhältnis 1 : 1
Sorbens ®Kromasil C8, 13 µm, 100 Å Porenweite
Säulenabmessung: 2 cm × 25 cm.

Die Säule wird mit einer Lösung von 0,5 g rohem Humaninsulin aus der gentechnischen Herstellung mit einem Gehalt von 2,5% acetyliertem H-Insulin in 25 ml eines Auflösepuffers beladen, der 0,1 M Glycin, 0,1 M NaCl, 32 Vol-% Aceton, pH 3,5 enthält.

Nach dem Auftragen der Humaninsulinlösung auf die Säule wird mit einem Säulenvolumen des Lösepuffers nachgewaschen.

Innerhalb von 90 min werden bei einem Fluß von 9 ml/min und Erhöhung der Propanolkonzentration von 14% auf 25% die einzelnen Proteinkomponenten getrennt eluiert. Man erhält nach Kristallisation bzw. Fällung und Trocknung als Hauptfraktion Humaninsulin mit einer Reinheit von mehr als 98% mit einer Ausbeute von 86,2%, bezogen auf das eingesetzte Insulin.

Die Bestimmung der Konzentration an A9-acetyliertem Humaninsulin wird wie folgt durchgeführt:

Für die Analyse werden HPLC-Säulen (4 mm × 250 mm) von Fa. Machery & Nagel, Düren, gefüllt mit ®Nucleosil C18, 120 Å, 5 µm eingesetzt.
Puffer A: 35 mM Natriumphosphat
300 mM Natriumchlorid
25% Acetonitril
75% Wasser pH 3,0
Puffer B: 35 mM Natriumphosphat
50 mM Natriumchlorid
65% Acetonitril
35% Wasser pH 3,0.

Bei einer Säulentemperatur von 40°C, einem Fluß von 1 ml/min und einem Gradienten von 12% Puffer B auf 21% Puffer B innerhalb 25 min wird das acetylierte Derivat mit einer Retentionszeitdifferenz von 6 min nach dem Humaninsulinpeak von der Säule eluiert. Mit dieser Analysenmethode läßt sich das Insulinderivat sehr gut von Humaninsulin abtrennen, identifizieren und quantifizieren.

Der Gehalt an A9-acetyliertem Humaninsulin beträgt nach der Reinigung weniger als 0,1%.

Beispiel 2

In dem folgenden Vergleichsversuch erfolgt die Chromatographie wie im Beispiel 1, wobei jedoch der Auflösepuffer nur 0,1 M Glycin/HCl, pH 2,8 enthält. Ausbeute: 58% mit einer Reinheit von mehr als 98%.

Der Gehalt an A9-acetyliertem Humaninsulin beträgt 0,2%.

Claims (5)

1. Verfahren zur Reinigung von Insulin und/oder Insulinderivaten durch Chromatographie in wäßrigen, gepufferten Lösungsmitteln, die mit Wasser mischbare, organische Lösungsmittel enthalten, an lipophil modifiziertem Kieselgel, dadurch gekennzeichnet, daß man

• A) das zu reinigende Gemisch, enthaltend A9-acetyliertes Insulin, Insulin und/oder Insulinderivate in einem Auflösepuffer, dessen pH-Wert 1 bis 6 beträgt, löst und der 5 bis 50 Volumenprozent Aceton oder Acetonitril enthält,
• B) die erhaltene Lösung auf eine Säule aufträgt,
• C) die Säule mit dem Auflösepuffer nachspült und
• D) die zu reinigenden Insuline und/oder Insulinderivate mit einem gepufferten Lösungsmittel eluiert, das Zwitterionen enthält und gegebenenfalls den pH-Wert der gepufferten Lösungsmittel bis zu 1 pH-Einheit unter oder über dem isoelektrischen Punkt des zu reinigenden Insulins und/oder Insulinderivats einstellt, wobei die Konzentration der Zwitterionen 10 mMol/l bis 1 Mol/l, bezogen auf Wasser als Lösungsmittel, beträgt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Auflösepuffer einsetzt, der 10 bis 40 Volumenprozent Aceton enthält.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Auflösepuffer einsetzt, der 25 bis 35 Volumenprozent Aceton enthält.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Auflösepuffer einsetzt, dessen pH-Wert 2 bis 5 beträgt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Auflösepuffer einsetzt, dessen pH-Wert 3 bis 4 beträgt.