WO1989001484A1 - Process for intramolecular oxidation of two -sh groups in a peptide compound to a disulphide bridge, and peptide so obtained - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to a method for the intramolecular oxidation of two -SH groups in a peptide compound to form a disulfide bridge.
- the invention further relates to peptides produced by such a method.
- Bodanszky the principle of peptide synthesis in the liquid phase.
- Dimers will form under the oxidation conditions described in DE-OS 2,723,453 and DE-PS 1,643,273, i.e. intermolecular S-S bridges are formed.
- the object on which the invention is based is to provide a process with which the process can be selected with comparatively small amounts of solvent in such a way that undesired competitive reactions are avoided.
- the process according to the invention for the intramolecular oxidation of two -SH groups in a peptide compound to form a disulfide bridge is characterized in that at least one oxidizing agent which is covalently or electrostatically bound to a solid phase and which is capable of oxidizing -SH groups to form disulfide bridges in water with stirring, then slowly adding an aqueous solution of the peptide compound to be oxidized in such a way that the concentration of the peptide to be oxidized is so low that the probability of an intermolecular reaction of the peptide molecules is negligibly small, and the reactants react with one another with intensive stirring, and then the crude one, which has a disulfide bridge Peptide compound worked up.
- the peptide compound to be oxidized can contain any number of -SH groups, but only two may react with one another in the oxidation according to the invention; the remaining -SH groups must be protected in a suitable manner.
- the oxidizing agent used in the method according to the invention can also have the function of an oxygen transmitter.
- the procedure according to the invention is such that the aqueous solution of the peptide compound to be oxidized is added dropwise, sprayed in or slowly allowed to flow in.
- Peptide compound to the oxidizing agent initially depends on the concentration of the oxidizing agent and its reactivity, further on the concentration of the peptide compound to be oxidized and its reactivity, further on the temperature, and finally on the air pressure
- the rate of addition should be chosen such that 5 g of peptide compound are oxidized within two hours.
- reaction is believed to be instantaneous, it is preferred to allow the reactants to react with each other for an extended period of time, for example 30 minutes. Further preferred embodiments of the method according to the invention are defined in the dependent method claims.
- the crude peptide produced by the process according to the invention can be purified in any way, for example by means of ion exchange columns, gel chromatography by molecular weight, Craig distribution or, preferably, using a new method for purifying a crude peptide by means of preparative medium pressure liquid chromatography.
- This method consists in applying the peptide to be purified in the most concentrated form possible to a chromatography column which contains alkylated, highly condensed polysilicic acid with a particle size of 20 to 90 micrometers and with a pore size of 60 to 300 angstroms as the stationary phase, and that then at a pressure below 40 bar with a mobile phase with the addition of at least one chelating agent and at least one strongly polar organic Compound eluted in low concentration and so the mixture is separated and the eluate obtained is fractionated.
- peptide compounds can be used which are both by means of solid phase synthesis according to Merrifield ("Angewandte Chemie", Volume 97 (1985), pages 810 to 812) and in
- peptides can in particular be produced with the method according to the invention: terlipressin of the formula Gly-Gly-Gly- ⁇ Tyr-f -Gln- sr ⁇ ,
- Vasopressin and its derivatives, calcitonin and somatostatin are structurally similar to Vasopressin and its derivatives, calcitonin and somatostatin.
- 2,5-Dihydroxy-l, 4-benzoquinone, covalently bound to styrene resin which was prepared as follows: a) 100 g of aminomethyl polystyrene resin (0.2 mM / g) are suspended in 500 ml of 5N hydrochloric acid. Add while cooling (below 5 ° C) and stirring
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Abstract
In the process described, at least one oxidant bound to a solid phase and capable of oxidizing -SH groups to disulphide bridges is added to water with stirring, an aqueous solution of the peptide compound to be oxidized is added drop by drop, the reactants are allowed to react while stirring, and the raw peptide compound containing a sulphide bridge is processed. Surprisingly, practically none of the products obtained by this process would suggest that an intermolecular reaction is involved.
Description
Verfahren zur intramolekularen Oxidation von zwei -SH Gruppen in einer Peptidverbindung zu einer Disulfidbrücke und mit dem Verfahren hergestellte Peptide Process for the intramolecular oxidation of two -SH groups in a peptide compound to a disulfide bridge and peptides produced by the process
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur intramolekularen Oxidation von zwei -SH Gruppen in einer Peptidverbindung zu einer Disulfidbrücke. Weiters bezieht sich die Erfindung auf mit einem solchen Verfahren hergestellte Peptide.The present invention relates to a method for the intramolecular oxidation of two -SH groups in a peptide compound to form a disulfide bridge. The invention further relates to peptides produced by such a method.
Das Prinzip der Festphasensynthese von Peptiden ist von R.B. Marrifield zum Beispiel in "Angewandte Chemie", Band 97, (1985), SeitenThe principle of solid phase synthesis of peptides has been developed by R.B. Marrifield, for example, in "Angewandte Chemie", Volume 97, (1985), pages
801 bis 812, beschrieben. Im "International Journal of Peptide and801 to 812. In the "International Journal of Peptide and
Protein Research", Band 25, (1985), Seiten 449 bis 474 beschreibt M.Protein Research ", volume 25, (1985), pages 449 to 474 describes M.
Bodanszky das Prinzip der Peptidsynthese in Flüssigphase.Bodanszky the principle of peptide synthesis in the liquid phase.
Im Europäischen Patent Nr. 38 516 wird eine Festphaseπsynthese eines Vasopressinderivates nach Marrifield beschrieben, und in dem die Seiten 7 und 8 überbrückenden Abschnitt wird eine Oxidation erwähnt, bei dem das Oxidationsmittel zur Peptidverbindung hinzugegeben wird. Eine ähnliche Oxidation wird auch in der US-PS 4 148 787 und in "Coϊlection Czechoslov.Chem.Comm.", Vol.31, (1966), Seiten 4581 bis 4591, beschrieben.In European Patent No. 38 516 a solid phase synthesis of a vasopressin derivative according to Marrifield is described, and in the section bridging pages 7 and 8 an oxidation is mentioned in which the oxidizing agent is added to the peptide compound. A similar oxidation is also described in US Pat. No. 4,148,787 and in "Coϊlection Czechoslov.Chem.Comm.", Vol.31, (1966), pages 4581 to 4591.
In der US-PS 4,093.610 wird bei einer Flüssigphasensyπthese eine Oxidation mit Jod in einem niedrigen Alkanol oder in Essigsäure beschrieben.In US Pat. No. 4,093,610, oxidation with iodine in a low alkanol or in acetic acid is described in a liquid phase synthesis.
Unter den in der DE-OS 2,723.453 und DE-PS 1,643.273 beschriebenen Bedingungen einer Oxidation werden Dimere entstehen, d.h. es bilden sich intermolekulare S-S-Brücken.Dimers will form under the oxidation conditions described in DE-OS 2,723,453 and DE-PS 1,643,273, i.e. intermolecular S-S bridges are formed.
Auf die Problematik der intermolekularen Nebenreaktion ist auch von G.Flouret et al. im "Int.J.Peptide Protein Res.",13 (1979), Seiten 137 bis 141, hingewiesen worden. Im übrigen sei auch auf folgende, zum Stand der Technik gehörende Literaturstellen verwiesen:The problem of the intermolecular side reaction is also from G.Flouret et al. in "Int.J. Peptide Protein Res.", 13 (1979), pages 137 to 141. For the rest, reference is also made to the following literature references belonging to the prior art:
K.Noda in "Int.J.Peptide Protein Res.", 19, (1982) .Seiten 413 - 419; "Collection of Czechoslov.Chem.Comm.", Vol.32, (1967) .Seiten 1250 bis 1257; Europäische Patentanmeldung Nr. 112 809, insbesondere Beispiel 1; US-PS 4,495.097;K.Noda in "Int.J. Peptide Protein Res.", 19, (1982). Pages 413-419; "Collection of Czechoslov.Chem.Comm.", Vol.32, (1967). Pages 1250 to 1257; European Patent Application No. 112 809, especially Example 1; U.S. Patent 4,495,097;
V.du Vigneaud et al.,(1960), J.Biol.Chem. , ol.235,Nr.12,Seiten 64 bis 66; Journal of the American Chemical Socie y,90:10,May 8,1968,Seiten 2577 - 2681;
Von Friedrich Weygand et al., Z.Naturforschg. 176 Seiten 807 bis 810V.du Vigneaud et al., (1960) J.Biol.Chem. , ol.235, no.12, pages 64 to 66; Journal of the American Chemical Socie y, 90:10, May 8, 1968, pages 2577-2681; By Friedrich Weygand et al., Z.Naturforschg. 176 pages 807 to 810
B.Kamber et al..Helvetica Chimica Acta, ol.83,Fase.4(1980) Seiten 900 bis 915;B.Kamber et al .. Helvetica Chimica Acta, ol.83, Fase. 4 (1980) pages 900 to 915;
Aus den oben erwähnten Literaturstelleπ folgt, daß es bekannt ist, daß intramolekulare Reaktionen in der Regel von intermolekularen Reaktionen konkurrenziert werden, was jeweils zu normalerweise unbrauchbaren dimeren, trimeren usw., also polymeren Nebenprodukten führt. Dies ist umso ärgerlicher, wenn solche Nebenprodukte in einem fortgeschrittenen Stadium einer Synthese anfallen, denn so geht wertvolles, teures, veredeltes Material unnütz verloren.From the literature references mentioned above it follows that it is known that intramolecular reactions are generally competed by intermolecular reactions, which in each case leads to normally unusable dimeric, trimeric, etc., ie polymeric by-products. This is all the more annoying when such by-products occur in an advanced stage of a synthesis, because valuable, expensive, refined material is thus uselessly lost.
Bislang hat man versucht, die intermolekulare Konkurrenzreaktion zu unterdrücken, indem man mit stark verdünnten Lösungen gearbeitet hat. Dies ist aber wirtschaftlich nicht vertretbar, weil große Mengen an Lösungsmittel benötigt werden und weil diese Lösungsmittel auch wieder abgedampft werden müssen, was mit einem hohen unwirtschaftlichen Zeit- und Energieaufwand verbunden ist. Bis jetzt ist kein Verfahren zur intramolekularen Oxidation von zwei -SH Gruppen in einer Peptidverbindung bekannt, bei dem die Konzentration und das Volumen des Lösungsmittels in einem vernünftigen ökonomischen Verhältnis zur zu oxidierenden Peptidverbindung stehen. Anhand der bekannten Literatur mußte man annehmen, daß ein oben diskutiertes Verfahren überhaupt nicht möglich ist. Völlig überraschend wurde nun doch ein solches Verfahren gefunden.So far, attempts have been made to suppress the intermolecular competition by working with highly diluted solutions. However, this is not economically justifiable because large amounts of solvent are required and because these solvents also have to be evaporated off again, which is associated with a high uneconomical expenditure of time and energy. So far, no method for intramolecular oxidation of two -SH groups in a peptide compound is known in which the concentration and the volume of the solvent are in a reasonable economic relationship to the peptide compound to be oxidized. Based on the known literature, one had to assume that a method discussed above is not possible at all. Such a method has now been found completely surprisingly.
Die Aufgabe, welche der Erfindung zugrundeliegt, besteht darin, ein Verfahren zu schaffen, mit welchem mit vergleichsweise geringen Mengen an Lösungsmittel die Verfahrensführung so gewählt werden kann, daß unerwünschte Konkurrenzreaktionen unterbleiben.The object on which the invention is based is to provide a process with which the process can be selected with comparatively small amounts of solvent in such a way that undesired competitive reactions are avoided.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur intramolekularen Oxidation von zwei -SH Gruppen in einer Peptidverbindung zu einer Disulfidbrücke ist dadurch gekennzeichnet, daß man wenigstens ein Oxidationsmittel, welches kovalent oder elektrostatisch an eine feste Phase gebunden ist, und welches -SH Gruppen zu Disulfidbrücken oxidieren vermag, in Wasser unter Rühren vorlegt, dann eine wässrige Lösung der zu oxidierenden Peptidverbindung langsam dosiert derart zugibt, daß die Konzentration des zu oxidierenden Peptids so gering ist, daß die Wahrscheinlichkeit einer intermolekularen Reaktion der Peptidmoleküle vernachlässigbar klein ist, und die Reaktionsteilnehmer miteinander unter intensivem Rühren reagieren läßt, und anschließend die rohe, eine Disulfidbrücke aufweisende
Peptidverbindung aufarbeitet.The process according to the invention for the intramolecular oxidation of two -SH groups in a peptide compound to form a disulfide bridge is characterized in that at least one oxidizing agent which is covalently or electrostatically bound to a solid phase and which is capable of oxidizing -SH groups to form disulfide bridges in water with stirring, then slowly adding an aqueous solution of the peptide compound to be oxidized in such a way that the concentration of the peptide to be oxidized is so low that the probability of an intermolecular reaction of the peptide molecules is negligibly small, and the reactants react with one another with intensive stirring, and then the crude one, which has a disulfide bridge Peptide compound worked up.
Die zu oxidierende Peptidverbindung kann beliebig viele -SH Gruppen enthalten, doch dürfen bei der erfindungsgemäßen Oxidation nur zwei miteinander reagieren; die restlichen -SH Gruppen müssen auf geeignete Art geschützt sein.The peptide compound to be oxidized can contain any number of -SH groups, but only two may react with one another in the oxidation according to the invention; the remaining -SH groups must be protected in a suitable manner.
Das im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Oxidationsmittel kann auch die Funktion eines Sauerstoff-Überträgers haben.The oxidizing agent used in the method according to the invention can also have the function of an oxygen transmitter.
Vorzugsweise wird im Rahmen des erfinduπgsgemäßen Verfahrens so vorgegangen, daß die wässrige Lösung der zu oxidierenden Peptidverbindung hiπzugetropft, eingesprüht oder langsam einfließen gelassen wird. DiesePreferably, the procedure according to the invention is such that the aqueous solution of the peptide compound to be oxidized is added dropwise, sprayed in or slowly allowed to flow in. This
Zugabegeschwindigkeit, insbesondere der Zutropfung, der zu oxidierendenRate of addition, especially the dropping, of the oxidized
Peptidverbindung zum vorgelegten Oxidationsmittel hängt ab zunächst von der Konzentration des Oxidationsmittels und dessen Reaktivität, weiters von der Konzentration der zu oxidierenden Peptidverbindung und von deren Reaktivität, ferner von der Temperatur, und schließlich vom LuftdruckPeptide compound to the oxidizing agent initially depends on the concentration of the oxidizing agent and its reactivity, further on the concentration of the peptide compound to be oxidized and its reactivity, further on the temperature, and finally on the air pressure
(wegen Sauerstoffangebot) . Die Zugabegeschwindigkeit kann vom Fachmann leicht mittels Vorversuchen ermittelt werden. Beispielsweise kann die(due to oxygen supply). The rate of addition can easily be determined by a person skilled in the art by means of preliminary tests. For example, the
Zugabegeschwindigkeit derart gewählt werden, daß 5 g Peptidverbindung innerhalb von zwei Stunden oxidiert werden. Erstaunlicherweise entstehen mit dem erfindungsgemäßenThe rate of addition should be chosen such that 5 g of peptide compound are oxidized within two hours. Surprisingly arise with the invention
Verfahren praktisch keine Produkte, die auf eine intermolekulare Reaktion schließen lassen würden. Es wurden weder Dimere noch Tri ere usw. gefunden. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren werden deshalb entsprechend hohe Ausbeuten erzielt, welche in der Regel über 95 %, meistens 99 %, der Theorie betragen.Process practically no products that would suggest an intermolecular reaction. Neither dimers, tri etc. were found. Correspondingly high yields are therefore achieved with the process according to the invention, which are generally above 95%, usually 99%, of theory.
Obwohl anzunehmen ist, daß die Reaktion augenblicklich erfolgt, ist es bevorzugt, die Reaktionsteilnehmer während längerer Zeit, beispielsweise 30 Minuten, miteinander reagieren zu lassen. Weitere bevorzugte Ausführuπgsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind in den abhängigen Verfahrensansprüchen definiert.Although the reaction is believed to be instantaneous, it is preferred to allow the reactants to react with each other for an extended period of time, for example 30 minutes. Further preferred embodiments of the method according to the invention are defined in the dependent method claims.
Das mit dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Rohpeptid kann auf irgendeine Art und Weise gereinigt werden, z.B. mittels Ionenaustauscher-Säulen, Gel-Chromatographie nach Molekulargewicht, Craig-Verteilung oder vorzugsweise mit einer neuen Methode zur Reinigung eines Rohpeptids .mittels präparativer Mitteldruckflüssigkeitschromato- graphie. Diese, in der österreichischen Patentanmeldung A 1380/88 be¬ schriebene, Methode besteht darin, daß man das zu reinigende Peptid in möglichst konzentrierter Form auf eine Chromatographie-Säule aufträgt,die
alkylierte hochkondensierte Polykieselsäure mit einer Korngröße von 20 bis 90 Mikrometer und mit einer Porengröße von 60 bis 300 Angström als stationäre Phase enthält, und daß man dann bei einem Druck unter 40 bar mit einer mobilen Phase unter Zusatz zumindest eines Chelierungsmittels und zumindest einer stark polaren organischen Verbindung in geringer Konzentration eluiert und so das Gemisch auftrennt und das erhaltene Eluat fraktioniert.The crude peptide produced by the process according to the invention can be purified in any way, for example by means of ion exchange columns, gel chromatography by molecular weight, Craig distribution or, preferably, using a new method for purifying a crude peptide by means of preparative medium pressure liquid chromatography. This method, described in the Austrian patent application A 1380/88, consists in applying the peptide to be purified in the most concentrated form possible to a chromatography column which contains alkylated, highly condensed polysilicic acid with a particle size of 20 to 90 micrometers and with a pore size of 60 to 300 angstroms as the stationary phase, and that then at a pressure below 40 bar with a mobile phase with the addition of at least one chelating agent and at least one strongly polar organic Compound eluted in low concentration and so the mixture is separated and the eluate obtained is fractionated.
Für das erfiπdungsgemäße Verfahren können Peptidverbindungeπ verwendet werden, die sowohl mittels Festphasensynthese nach Merrifield ("Angewandte Chemie", Band 97 (1985), Seiten 810 bis 812) als auch in derFor the process according to the invention, peptide compounds can be used which are both by means of solid phase synthesis according to Merrifield ("Angewandte Chemie", Volume 97 (1985), pages 810 to 812) and in
Flüssigphasensynthese ("Int. J. Peptide Protein Res." 25, (1985), SeitenLiquid phase synthesis ("Int. J. Peptide Protein Res." 25, (1985), pages
449 bis 474) synthetisiert werden.449 to 474) can be synthesized.
Mit dem erfiπdungsgemäßen Verfahren können insbesondere folgende Peptide hergestellt werden: Terlipressin der Fαrmel Gly-Gly-Gly- ^Tyr-f -Gln- sr ^^ ,The following peptides can in particular be produced with the method according to the invention: terlipressin of the formula Gly-Gly-Gly- ^ Tyr-f -Gln- sr ^^,
Vasopressin und seine Derivate, Calcitonin sowie Somatostatin.Vasopressin and its derivatives, calcitonin and somatostatin.
Es ist bevorzugt, mit dem erfindungsgemäßen Verfahren Terlipressin herzustellen.It is preferred to produce terlipressin using the method according to the invention.
Entsprechende Strukturformeln sind beschrieben in: "Handbook of Biochemistry" C-164 bis C-188Corresponding structural formulas are described in: "Handbook of Biochemistry" C-164 to C-188
A ino Acid Sequences of Proteins, C-265, Handbook of Biochemistry selected date for Molecular Biology, 2nd edition (1970), Editor: Herbert A.S0BER, PhD, published by: The Chemical Rubber Co., Cleveland, Ohio, 44 128, und "Int. J. Peptide Protein Res." 15, (1980), Seiten 342 bis 354.A ino Acid Sequences of Proteins, C-265, Handbook of Biochemistry selected date for Molecular Biology, 2nd edition (1970), Editor: Herbert A.S0BER, PhD, published by: The Chemical Rubber Co., Cleveland, Ohio, 44 128 , and "Int. J. Peptide Protein Res." 15, (1980), pages 342 to 354.
Die nachfolgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung erläutern.The following examples are intended to illustrate the present invention.
Beispiel 1example 1
3,5 g deblockiertes Peptid (hergestellt mittels Festphasensynthese) der3.5 g of deblocked peptide (produced by solid phase synthesis)
Formel Gly-Gly-Gly-Cys-Tyr-Phe-Asn-Cys-Pro-Lys-Gly-NH , gelöst in 2,5 1 destilliertem Wasser, wurden mit 400 ml 3M NH.0H unter Stickstoff auf pHFormula Gly-Gly-Gly-Cys-Tyr-Phe-Asn-Cys-Pro-Lys-Gly-NH, dissolved in 2.5 l of distilled water, was adjusted to pH with 400 ml of 3M NH.0H under nitrogen
7,5 titriert. Diese Lösung wurde zu einer Suspension von 1 Liter von wässeriger 1,8 mM K- (Fe(NC)R), elektrostatisch gebunden an 80 g AG3 - X4A Ionenaustauscher Harz in seiner Chlorid-Form, pH 7,5, unter stetigem7.5 titrated. This solution became a suspension of 1 liter of aqueous 1.8 mM K- (Fe (NC) R ), electrostatically bound to 80 g AG3 - X4A ion exchanger resin in its chloride form, pH 7.5, with constant
Rühren in einer Geschwindigkeit von 20 ml pro Minute zugetropft. Nach vollständiger Zugebe wurde die Reaktion noch 30 Min. reagieren gelassen.Stir added dropwise at a rate of 20 ml per minute. After the addition was complete, the reaction was left to react for a further 30 min.
Anschließend wurde die Suspension mit 50%iger Essigsäure auf pH 5
titriert. Ausbeute an Terlipressin der FormelThe suspension was then adjusted to pH 5 with 50% acetic acid titrated. Yield of terlipressin of the formula
Gly-Gly-Gly-Qys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cvs-Pro-Lvs-Gly-NH»: 99,6 % d.Th. Mittels HPLC-Analyse wurde festgestellt, daß das so hergestellte Produkt weder Dimere noch Trimere enthielt. Wird dieses Produkt mit der 10-fachen Menge Mannit versetzt und lyophilisiert, so wurden in dieser galenischen Formulierung beim Wiederauflösen in Wasser keine Aggregate erhalten.Gly-Gly-Gly-Qys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cvs-Pro-Lvs-Gly-NH »: 99.6% of theory It was determined by HPLC analysis that the product thus produced contained neither dimers nor trimers. If 10 times the amount of mannitol is added to this product and lyophilized, no aggregates were obtained in this pharmaceutical formulation when redissolved in water.
Beispiel 2Example 2
9ϊϊ^2ϊi20_?yE_bSΞ§5Sϊϊy S.ϊ2D_y2S°B£555iD Nach dem Verfahren gemäß Beispiel 1 wurden 1 M deblockiertes9ϊϊ ^ 2ϊi20_? YE_bSΞ§5Sϊϊy S.ϊ2D_y2S ° B £ 555iD According to the procedure in Example 1, 1 M was unblocked
Peptid (hergestellt mittels Festphasensynthese) der Formel Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly-NHp, welches die Struktur von Vasopressin hatte, aber noch 2 -SH Gruppen anstelle der Disulfidbrücke aufwies, mi2,0 mM K3 (Fe(CN)ß), elektrostatisch gebunden an 90 g AG3 - X4A Ionenaustauscher Harz in seiner Chloridform, oxidiert. Ausbeute von Vasopressin: 99,6 & d.Th. Beispiel 3
Peptide (produced by means of solid phase synthesis) of the formula Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly-NHp, which had the structure of vasopressin but still had 2 -SH groups instead of the disulfide bridge, mi2.0 mM K 3 (Fe (CN) ß ), electrostatically bound to 90 g AG3 - X4A ion exchanger resin in its chloride form, oxidized. Yield of vasopressin: 99.6% of theory Example 3
Nach dem Verfahren gemäß Beispiel 1 wurden 1 mM deblockiertes Peptid, welches die Struktur von Calcitonin hatte, aber noch 2 -SHAccording to the procedure according to Example 1, 1 mM deblocked peptide, which had the structure of calcitonin, but still 2 -SH
Gruppen anstelle der Disulfidbrücke aufwies, mit 3,0 mMGroups instead of the disulfide bridge, with 3.0 mM
2,5-Dihydroxy-l,4-benzochinon, kovalent an Styrolharz gebunden oxidiert, welches wie folgt hergestellt wurde: a) 100 g Aminomethyl-Polystyrolharz (0,2 mM/g) werden in 500 ml 5N Salzsäure suspendiert. Unter Kühlen (unter 5°C) und Rühren addiert man2,5-Dihydroxy-l, 4-benzoquinone, covalently bound to styrene resin, which was prepared as follows: a) 100 g of aminomethyl polystyrene resin (0.2 mM / g) are suspended in 500 ml of 5N hydrochloric acid. Add while cooling (below 5 ° C) and stirring
20 mMol Natriumnitrit (2,5 molare Lsg). Nach 10 Minuten bei 0-5°C wird abfiltriert und das Harz zuerst mit IN NaHC03-Lsg, dann mit H O bis zur Neutralität gewaschen. b) 100 g diazotiertes (a) Aminomethyl-Polystyrolharz werden zu 20 mMol 2,5-Dihydroxy-l,4-beπzochinon in 500 ml 2N NaOH unter Rühren bei20 mmol sodium nitrite (2.5 molar solution). After 10 minutes at 0-5 ° C is filtered off and the resin is washed first with IN NaHC0 3 solution, then with HO until neutral. b) 100 g of diazotized (a) aminomethyl polystyrene resin are added to 20 mmol of 2,5-dihydroxy-1,4-benzinquinone in 500 ml of 2N NaOH with stirring
5-10°C zugegeben. Nach 5 Minuten wird abfiltriert und mit Wasser, dann mit Ethanol gewaschen.5-10 ° C added. After 5 minutes it is filtered off and washed with water, then with ethanol.
Die Zutropfgeschwindigkeit betrug nur 10 ml/min. Ausbeute an Calcitonin: 99,6 % d.Th. Beispiel 4The dropping rate was only 10 ml / min. Yield of calcitonin: 99.6% of theory Example 4
Gxidation zur Herstellung von SomatostatinOxidation for the production of somatostatin
Nach dem Verfahren gemäß Beispiel 1 wurden 1 mM deblockiertes Peptid, welches die Struktur von Somatostatin hatte, aber noch 2 -SH
Gruppen anstelle der Disulfidbrücke aufwies, mit 3,1 mM 2,5 Dihydroxy-l,4-benzochinon, kovalent an Styrolharz gebunden oxidiert, welches wie in Beispiel 3 beschrieben hergestellt wurde. Ausbeute an Somatostatin: 99.5 % d.Th.
According to the procedure according to Example 1, 1 mM deblocked peptide, which had the structure of somatostatin, but still 2 -SH Has groups instead of the disulfide bridge, oxidized with 3.1 mM 2.5 dihydroxy-l, 4-benzoquinone, covalently bound to styrene resin, which was prepared as described in Example 3. Yield of somatostatin: 99.5% of theory
Claims
1. Verfahren zur intramolekularen Oxidation von zwei -SH Gruppen in einer Peptidverbindung zu einer Disulfidbrücke, dadurch gekennzeichnet, daß man wenigstens ein Oxidationsmittel, welches kovalent oder elektrostatisch an eine feste Phase gebunden ist, und welches -SH Gruppen zu Disulfidbrücken oxidieren vermag, in Wasser unter Rühren vorlegt, dann eine wässerige Lösung der zu oxidierenden Peptidverbindung langsam dosiert derart zugibt, daß die Konzentration des zu oxidierenden Peptids so gering ist, daß die Wahrscheinlichkeit einer intermolekularen Reaktion der Peptidmoleküle vernachlässigbar klein ist, und die Reaktionsteilnehmer miteinander unter intensivem Rühren reagieren läßt, und anschließend die rohe, eine Disulfidbrücke aufweisende Peptidverbindung aufarbeitet. 1. A process for the intramolecular oxidation of two -SH groups in a peptide compound to form a disulfide bridge, characterized in that at least one oxidizing agent which is covalently or electrostatically bound to a solid phase and which is capable of oxidizing -SH groups to disulfide bridges in water with stirring, then slowly adding an aqueous solution of the peptide compound to be oxidized in such a way that the concentration of the peptide to be oxidized is so low that the probability of an intermolecular reaction of the peptide molecules is negligibly small and the reactants react with one another with intensive stirring, and then working up the crude disulfide bridge peptide compound.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die wässrige Lösung der zu oxidierenden Peptidverbindung hinzugetropft, eingesprüht oder langsam einfließen gelassen wird.2. The method according to claim 1, characterized in that the aqueous solution of the peptide compound to be oxidized is added dropwise, sprayed in or slowly allowed to flow in.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Oxidationsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Benzochinonen, K~Fe(CN)R, Jod und Sauerstoff.3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the oxidizing agent is selected from the group consisting of benzoquinones, K ~ Fe (CN) R , iodine and oxygen.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion bei einem pH-Wert von 5 bis 10, insbesondere 6,5 bis 8, durchgeführt wird.4. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the reaction is carried out at a pH of 5 to 10, in particular 6.5 to 8.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion bei einer Temperatur von 1 bis 40°C, insbesondere bei Raumtemperatur, vorzugsweise von 20 bis 25°C, durchgeführt wird.5. The method according to any one of claims 1 to 4, characterized in that the reaction is carried out at a temperature of 1 to 40 ° C, in particular at room temperature, preferably from 20 to 25 ° C.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß durch intensives Rühren die "zu oxidierende Peptidverbindung augenblicklich verteilt wird.6. The method according to any one of claims 1 to 5, characterized in that the " peptide compound to be oxidized" is immediately distributed by intensive stirring.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die wässrige Lösung der zu oxidierenden Peptidverbindung auf die ein Rotationsparaboloid beschreibende Flüssigkeitsoberfläche der gerührten, das Oxidationsmittel enthaltenden, wässrigen Lösung tropfen gelassen wird.7. The method according to any one of claims 1 to 6, characterized in that the aqueous solution of the peptide compound to be oxidized is allowed to drip onto the liquid surface describing a paraboloid of revolution of the stirred aqueous solution containing the oxidizing agent.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die anfängliche Konzentration des Oxidationsmittels dem doppelten stöchiometrischen Überschuß der zu oxidierenden -SH Gruppen entspricht.8. The method according to any one of claims 1 to 7, characterized in that the initial concentration of the oxidizing agent is twice the stoichiometric excess of the -SH groups to be oxidized equivalent.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die wässrige Lösung der zu oxidierenden Peptidverbindung eine Konzentration von 1 bis 100 mg, insbesondere von 1 bis 10 mg, Peptid pro ml Wasser hat.9. The method according to any one of claims 1 to 8, characterized in that the aqueous solution of the peptide compound to be oxidized has a concentration of 1 to 100 mg, in particular of 1 to 10 mg, of peptide per ml of water.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man die zu oxidierende Peptidverbindung in einer Geschwindigkeit von 10 bis 30 ml/Minute, insbesondere 20 ml/Minute, zum Oxidationsmittel hinzutropft. 10. The method according to any one of claims 1 to 9, characterized in that the peptide compound to be oxidized is added dropwise to the oxidizing agent at a rate of 10 to 30 ml / minute, in particular 20 ml / minute.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß man die vermischten Reaktionsteilnehmer bis zu 30 Minuten miteinander reagieren läßt.11. The method according to any one of claims 1 to 10, characterized in that the mixed reactants are allowed to react with one another for up to 30 minutes.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß man vor der Aufarbeitung allenfalls vorhandene Salze entfernt, vorzugsweise mittels Ionenaustauschern, welche beispielsweise in Chromatographiesäulen gefüllt sind.12. The method according to any one of claims 1 to 11, characterized in that any salts present are removed before working up, preferably by means of ion exchangers which are filled, for example, in chromatography columns.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die oxidierte Peptidverbindung einer Reinigung mittels präparativer Mitteldruckflüssigkeitschromatographie dadurch unterworfen wird, daß man das zu reinigende Peptid in möglichst konzentrierter Form auf eine Chromatographie-Säule aufträgt, die alkylierte hochkondensierte Polykieselsäure mit einer Korngröße von 20 bis 90 Mikrometer und mit einer Porengröße von 60 bis 300 Angström als stationäre Phase enthält, daß man dann bei einem Druck von unter 40 bar mit einer mobilen Phase unter Zusatz zumindest eines Chelierungs ittels und zumindest einer stark polaren organischen Verbindung in geringer Konzentration eluiert und so das Gemisch auftrennt und das erhaltene Eluat fraktioniert.13. The method according to any one of claims 1 to 12, characterized in that the oxidized peptide compound is subjected to purification by means of preparative medium pressure liquid chromatography in that the peptide to be purified is applied in the most concentrated form possible to a chromatography column which contains the alkylated, highly condensed polysilicic acid Grain size of 20 to 90 microns and with a pore size of 60 to 300 angstroms as the stationary phase contains that then at a pressure of less than 40 bar with a mobile phase with the addition of at least one chelating agent and at least one strongly polar organic compound in a low concentration eluted and so the mixture separated and the eluate obtained fractionated.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Aufarbeitung eine Lyophilisation umfaßt.14. The method according to any one of claims 1 to 13, characterized in that the working up comprises a lyophilization.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Peptid, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Terlipressin oder Formel Gly-Gly-Gly-Cys-Tyr-Phe-Glr Asn-Cys ^ro-Lys-Gly-lH?, und Vasopressin und deren Derivate, Calcitonin und Somatostatin herstellt. 15. The method according to any one of claims 1 to 14, characterized in that a peptide selected from the group consisting of terlipressin or formula Gly-Gly-Gly-Cys-Tyr-Phe-Glr Asn-Cys ^ ro-Lys- Gly-lH ? , and vasopressin and its derivatives, calcitonin and somatostatin.
16. Peptidverbindung, insbesondere Terlipressin der Formel16. Peptide compound, in particular terlipressin of the formula
Gly-Gly-Gly-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Lys-Gly-NH?, Vasopressin und deren Derivate, Calcitonin und Somatostatin, hergestellt gemäß dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15. Gly-Gly-Gly-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Lys-Gly-NH ? , Vasopressin and its derivatives, calcitonin and somatostatin, prepared according to the method according to any one of claims 1 to 15.
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