DE2038997A1 - Cyclopeptides derived from polymyxins and their preparation - Google Patents

Cyclopeptides derived from polymyxins and their preparation

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DE2038997A1 DE19702038997 DE2038997A DE2038997A1 DE 2038997 A1 DE2038997 A1 DE 2038997A1 DE 19702038997 DE19702038997 DE 19702038997 DE 2038997 A DE2038997 A DE 2038997A DE 2038997 A1 DE2038997 A1 DE 2038997A1
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Description

Dr RK«f.„lUTtein Μη· * Dr· E- A""«"in or.R.Koenig»berger - Dipl.Phys.R. HolzhauerDr RK «f. L U T tein Μη · * Dr · E - A """"in or.R.Koenig» berger - Dipl.Phys.R. Holzhauer

9 München 2, Bräuhautsfrafi· 4/||| 9 Munich 2, Bräuhautsfrafi · 4 / |||

SO 3587SO 3587

RHOHE-POULENC S.A., Paris/FrankreichRHOHE-POULENC S.A., Paris / France

Von Polymyxinen abgeleitete Cyclopeptide und ihre HerstellungCyclopeptides derived from polymyxins and their preparation

Die vorliegende Erfindting "betrifft von Polymyxinen abgeleitete cyclische Polypeptide der allgemeinen FormelThe present invention relates to those derived from polymyxins cyclic polypeptides of the general formula

(oo) Hab Dab -— Y Z Dab Dab Ihr —(oo) Got Dab - Y Z Dab Dab you -

() ■ (I)() ■ (I)

(D(D

und ihre Herstellung· ■and their manufacture · ■

In der allgemeinen Formel I haben die verschiedenen Sym- ä bole die folgenden Bedeutungen :In general formula I the various symmetry have ä bole the following meanings:

Y-Z stellt eine der Verkettungen D-Leu - ihr, D-Phe Leu, D-Leu - Leu und D-Leu - HeuY-Z represents one of the chains D-Leu - you, D-Phe Leu, D-Leu - Leu and D-Leu - Hay

G stellt einen Rest der allgemeinen FormelG represents a residue of the general formula

(II)(II)

Py - CH - 0 CO -Py - CH - 0 CO -

10 98 08/227410 98 08/2274

dar, in der das Symbol Py einen unsubstituierten oder durch einen Methylrest substituierten Pyridyl- oder Pyridyl-N-oxydrest bedeutet, und R stellt ein Wasserstoffatom, einen geradkettigen oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen oder einen Phenylrest dar.represents, in which the symbol Py is an unsubstituted or substituted by a methyl radical pyridyl or pyridyl-N-oxide radical and R represents a hydrogen atom, a straight-chain or branched alkyl radical having 1 to 5 carbon atoms or a phenyl radical.

Im vorstehenden und folgenden sind die zur Bezeichnung der Aminosäuren verwendeten Abkürzungen diejenigen der Union Internationale de Chimie Pure et Appliqu6e, und das Symbol Dab bedeutet Λ,^-Diaminobuttersäure, wobei auch bemerkt sei, dass ohne gegenteilige Angabe die Aminosäuren die !-Konfiguration haben·In the foregoing and in the following are those for designation of the amino acids used abbreviations those of the Union Internationale de Chimie Pure et Appliqu6e, and the symbol Dab means Λ, ^ - diaminobutyric acid, where It should also be noted that, unless otherwise stated, the amino acids have the! -configuration

Die cyclischen Peptide der allgemeinen Formel I sind neue Produkte, die als Ausgangs- bzw. Zwischenprodukte bei der Synthese von semisynthetischen Produkten brauchbar sind, die von Polymyxinen durch Modifikation der Seitenkette abgeleitet sind und sich durch eine gute Wirksamkeit gegen Mikroben, insbesondere gegen Gramnegative Mikroorganismen, wie beispielsweise E. CoIi und Pseudomonas aeruginosa, auazeiehiien und eine geringere Toxizität gegenüber derjenigen der bisher aus durch Fermentation erhaltenen Gemischen isolierten Polymyxine aufweisen.The cyclic peptides of the general formula I are new products that are used as starting materials or intermediates useful in the synthesis of semi-synthetic products are those of polymyxins by modification of the Side chain are derived and are characterized by a good effectiveness against microbes, in particular against gram-negative microorganisms, such as E. Coli and Pseudomonas aeruginosa, auazeiehiien and a lesser one Toxicity to that of the polymyxins previously isolated from mixtures obtained by fermentation exhibit.

Die Produkte der allgemeinen Formel I ermöglichen den Zugang zu semisynthetischen Polymyxinen auf Grund der Tatsache, dass sie nur eine einzige freie, durch die üblichen Methoden der Peptidchemie substituierbare Amino~ funktion aufweisen·The products of the general formula I enable access to semisynthetic polymyxins due to the fact that they have only a single free amino function that can be substituted by the usual methods of peptide chemistry.

Es ist bekannt, dass die durch Fermentation erhaltenen Polymyxine verschiedene Typen sind, die üblicherweise mit den Buchstaben A, B, D, E und M bezeichnet werden,It is known that the polymyxins obtained by fermentation are various types that are commonly used are designated with the letters A, B, D, E and M,

109808/227Λ109808 / 227Λ

und dans diese Polymyxine durch die allgemeine Formeland dans these polymyxins by the general formula

— Dab — Thr — X — Dab — Dab —-Y—2—Dab—Dab—Thr-- Dab - Thr - X - Dab - Dab —-Y — 2 — Dab — Dab — Thr-

(III)(III)

dargestellt werden können, in der K einen n-Octanoyl-, L-6-Hethyl-Dctanoyl- oder 6-Methylheptanoylrest bedeutet und gleichseitig Y-Z D-Leu-Thr darstellt und X D-Dab oder D-Ser darstellt oder gleichseitig Y-Z D-Phe-Leu oder I>~Leu-Leu darstellt und X Dab darstellt oder K einen L-6-Methyloctanoyl- oder 6-Methylkeptanoylrest bedeutet und gleichzeitig Y-Z D-Leu-Ileu darstellt und " X Dab bedeutet· "can be represented in which K is an n-octanoyl, L-6-methyl-octanoyl or 6-methylheptanoyl radical means and at the same time represents Y-Z D-Leu-Thr and X D-Dab or D-Ser or equilaterally Y-Z D-Phe-Leu or I> ~ represents Leu-Leu and X represents Dab or K an L-6-methyloctanoyl or 6-methylkeptanoyl radical means and at the same time represents Y-Z D-Leu-Ileu and " X Dab means "

la ist auch bekannt, dass die Seitenkette der Polymyxine durch selektive Spaltung der Peptidbindung, die diese Kette mit dem Polypeptidring verbindet, ohne Spaltung der Peptidtoindungen dieses Rings entfernt werden kann· Eine solche Spaltung w»r?je auf enzymatischem Ή<ζβ im Falle von Polymyxin E von Susüuki m. Mir-trb«r £*£ioohesä» (Japan), 54, 412 (1963) durchgeführt« Die durch solche Spaltungen der Peptidfciadung epischer der Seitenkette und dem Polypeptidriaig erhaltenen Produkte sind für die Herstellung von seaisynthetischen Derivaten nicht ver*- ä wendbar, da sie ausser der durch die encymatische Wirkung freigesetEten Amisofunktlon eine gewisse Anzahl von Aminofunkt ionen in dem Ring infolge des Vorhandenseins von ά»9$ -Diaminobutt er säureketten in diesem Ring aufweisen. Is ist unmöglich« die durch die enzymatische Wirkung in Freiheit gesetzte Amiaofimktion selektiv zur Reaktion, zu bringen·la is also known that the side chain of the polymyxins can be removed by selective cleavage of the peptide bond that connects these chain with the Polypeptidring without splitting the Peptidtoindungen this ring · Such a split w "r? depending on enzymatic Ή <ζβ in the case of Polymyxin E carried out by Susüuki m. Mir-trb " r £ * £ ioohesä" (Japan), 54, 412 (1963) ver * - uh reversible because it except the free sailed therefrom by the encymatische effect Amisofunktlon a certain number of Aminofunkt ion in the ring due to the presence of ά »9 $ -Diaminobutt he acid chains in this ring have. It is impossible to selectively react the amiaofimction set free by the enzymatic effect.

ErfindungsgeiBäss kürnien die Aminofunkt» ionen des loly» peptidrtngs der Polymyxine der allgemeinen Formel IIIAccording to the invention, the amino functions of the loly peptide components of the polymyxins of the general formula III

BAD OFMQtNAL 1098Ö8/2274 BAD OFMQtNAL 1098Ö8 / 2274

mit Schutzgruppen der allgemeinen Formel II blockiert werden. Solche Schutzgruppen weisen nicht nur den Vorteil auf, dass sie mit guten Ausbeuten an den zu schützenden Aminogruppen gebunden werden können, sondern auch den Vorteil, dass Polymyxine, deren zu Beginn freien Aminof unkt ionen blockiert sind, erhalten v/erden, die in wässrigem Medium löslich sind, was ermöglicht, sie enzymatisehen Reaktionen unter solchen Bedingungen bezüglich pH-Wert, Temperatur und Dauer zu unterziehen, dass die Aktivität der verwendeten Enzyme zu einer spezifischen Spaltung der Peptidbindung zwischen der Seitenkette und dem Polypeptidring der Polymyxine ohne Beeinflussung des letzteren führt.are blocked with protective groups of the general formula II. Such protecting groups not only have the advantage on that they can be bound to the amino groups to be protected with good yields, but also the advantage that polymyxins, whose initially free amino functions are blocked, get the are soluble in aqueous medium, which enables them to be enzymatic reactions under such conditions pH, temperature and duration are subject to that the activity of the enzymes used to a specific one Cleavage of the peptide bond between the side chain and the polypeptide ring of the polymyxins without interference the latter leads.

AuBserdem können solche Schutzgruppen anschliessend leicht ohne Spaltung deo Polypeptidrings, beispielsweise durch Hydrogenolyset entfernt werden, Schliesslich stören solche Schutzgruppen trotz der Modifikationen, die sie an dem Ring hervorrufen, die Enzymwirkung nicht.AuBserdem such protecting groups can then easily without cleavage deo Polypeptidrings, for example by hydrogenolysis t be removed Finally, do not disturb such protective groups despite the modifications that give rise to the ring, the enzyme action.

Erfindungsgemäss können die Produkte der allgemeinen Formel I aus Produkten der allgemeinen FormelAccording to the invention, the products of the general Formula I from products of the general formula

K—Dab-—ihr—χ—Dab—Dab—Υ—-Ζ—-Dab—Dab—Ihr-K — Dab —— you — χ — Dab — Dab — Υ —- Ζ —- Dab — Dab — Your-

in der die Symbole G-, K, X und Y-Z die oben angegebenen Bedeutungen besitzen, wobei die durch das Symbol X dargestellte Aminosäure gegeber^nl'alls eine durch das Symbol. G dargestellte Schutzgj uppe tragen kann.; wenn X diein which the symbols G-, K, X and Y-Z are those given above Have meanings, where the amino acid represented by the symbol X is given by the symbol. G can wear the protective jacket shown .; if X the

Bedeutung c£-,;f--Diaffiinobutte_·: ätire hat, durch selektive Hydrolyse der Feptiilaniiin;:,. die die lineare SeitenketteMeaning c £ - ,; f - Diaffiinobutte_ ·: ätire hat, by selective Hydrolysis of feptilaniiin;:,. which is the linear side chain

mit dem Polypeptidring verbii ;det, hergestellt werden,,connected to the polypeptide ring,

Bieee Hydrolyse wird auf enzymatisch·*!* leg -outer geeigneten Bedingungen bezüglich. Dauer f Temperatur und pH WertBieee hydrolysis is based on enzymatically · *! * Leg -outer suitable conditions. Duration f temperature and pH value

durchgeführt .carried out .

103808/2274 BAD ORIGINAL103808/2274 ORIGINAL BATHROOM

Verschiedene proteolytische Enzyme sind zur Durchführung dieser selektiven Hydrolyse befähigt, insbesondere die durch verschiedene Stämme von Bacillus subtilis gebildeten exocellularen Proteasen, wie beispielsweise das Subtilisin, die Nagarse, Pronase, Colistinase, Alkalase, oder auch die von B, subtilis GLAXO 417, B. subtilis A.T.C.C. 9524 oder Bacillus THE 4 gebildeten Proteasen.Various proteolytic enzymes are capable of performing this selective hydrolysis, particularly the exocellular proteases produced by various strains of Bacillus subtilis, such as the Subtilisin, the Nagarse, Pronase, Colistinase, Alkalase, or also those of B, subtilis GLAXO 417, B. subtilis A.T.C.C. 9524 or Bacillus THE 4 proteases formed.

Je nach dem verwendeten Enzym ist es vorteilhaft, "bei Temperaturen zwischen. 20 und 70 0G in einem auf einen pH-Wert zwischen 5 und 9 gepufferten Medium zu arbeiten.Depending on the enzyme used, it is advantageous to work at temperatures between 20 and 70 ° C. in a medium buffered to a pH between 5 and 9.

Die Produkte der allgemeinen Formel IV, in der die Symbole G-, K, X und Y-Z die oben angegebenen Bedeutungen besitzen, können aus Polymyxinen der allgemeinen Formel III durch Anwendung der üblicherweise in der Peptidchemie zur Blockierung von Aminofunktionen angewendeten Methoden erhalten werden. Es ist "besonders vorteilhaft, ein gemischtes Carbonat der allgemeinen FormelThe products of the general formula IV, in which the symbols G-, K, X and Y-Z have the meanings given above can be made from polymyxins of the general formula III by applying the methods customarily used in peptide chemistry used to block amino functions Methods are obtained. It is particularly advantageous to have a mixed carbonate of the general formula

Py-CH-O-CO-O-TPy-CH-O-CO-O-T

I (V)I (V)

in der die Symbole Py und R die oben angegebene Bedeutung besitzen und T einen Phenyl- oder substituierten Phenylrest, wie beispielsweise p-Nitrophenyl oder 2,4,5-Trichlorphenyl, oder einen von einem Heterocyclus abgeleiteten Rest, wie beispielsweise einen Chinolyl-(8)- oder 2,5-Dioxopyrrolidinyl-(i)~Rest, darstellt, zur Umsetzung zu bringen. Die Reaktion wird vorteilhafterweise in Dimethylformamid bei einer Temperatur zwischen 15 und 60 0C durchgeführt.in which the symbols Py and R have the meaning given above and T is a phenyl or substituted phenyl radical, such as p-nitrophenyl or 2,4,5-trichlorophenyl, or a radical derived from a heterocycle, such as a quinolyl- (8 ) - or 2,5-Dioxopyrrolidinyl- (i) ~ radical, to bring to the reaction. The reaction is advantageously carried out in dimethylformamide at a temperature between 15 and 60 0 C.

Die gemischten Carbonate der allgemeinen Formel V können durch Umsetzung eines Chlorformiats der allgemeinenThe mixed carbonates of the general formula V can be obtained by reacting a chloroformate of the general formula

109808/2274109808/2274

Formelformula

Cl-CO-O-T (VI)Cl-CO-O-T (VI)

in der T die oben angegebene Bedeutung besitzt, mit einem Alkohol der allgemeinen Formelin which T has the meaning given above, with an alcohol of the general formula

Py - CH - OHPy - CH - OH

i (VII)i (VII)

in der Py und R die oben angegebenen Bedeutungen besitzen, hergestellt werden. Diese Reaktion wird vorteilhafterweise in Pyridin bei etwa O 0G oder in einem Gemisch von Pyridin und Methylenchlorid bei einer Temporatur zwischen 0 und 20 0C durchgeführt.in which Py and R have the meanings given above, are prepared. This reaction is advantageously carried out in pyridine at about 0 ° G or in a mixture of pyridine and methylene chloride at a Temporatur between 0 and 20 0 C.

Die Peptide der allgemeinen Formel IV, die gemischten Carbonate der allgemeinen Formel V und die Alkohole der allgemeinen Fornei VII1 für welche das Symbol Py einen Pyridyl-N-oxydrest darstellt, können aus den entsprechenden nichtoxydierten Produkten durch Einwirkung eines geeigneten^ Peroxydationsmittels, wie beispielsweise p-Nitroperbenzoesäure, erhalten v/er den· Man arbeitet üblicherweise in einem inerten organischen Lösungsmittel, das ein Alkohol, wie beispielsweise Methanol, ein chloriertes Lösungsmittel, wie beispielsweise Chloroform, oder ein Ester, wie beispielsweise Äthylacetat, sein kann,und bei einer Temperatur zwischen 0 und 25 0C,The peptides of the general formula IV, the mixed carbonates of the general formula V and the alcohols of the general formula VII 1 for which the symbol Py represents a pyridyl-N-oxide radical can be obtained from the corresponding non-oxidized products by the action of a suitable peroxidizing agent, such as p-Nitroperbenzoic acid, obtained from the one usually works in an inert organic solvent, which can be an alcohol such as methanol, a chlorinated solvent such as chloroform, or an ester such as ethyl acetate, and at a temperature between 0 and 25 0 C,

Die Produkte der allgemeinen Formel I können gegebenenfalls nach physikalischen Methoden, wie beispielsweise durch Umkristallisation, Chromatographie oder Gegenstromverteilung, oder nach chemischen Methoden, wie beispielsweise durch Überführung in Additionssalze mit Säuren, anschliessende Umkristallisation derselben aus einem geeigneten Lösungsmittel und deren Zersetzung in alkalischem Medium, gereinigt werden· Bei diesen Arbeits-The products of the general formula I can optionally by physical methods, such as, for example by recrystallization, chromatography or countercurrent distribution, or by chemical methods, such as by conversion into addition salts with acids, subsequent recrystallization of the same from a suitable one Solvents and their decomposition in an alkaline medium.

109808/2274109808/2274

non spielt die Art des Anions des Salzes keine Rolle.The type of anion of the salt does not play a role Role.

Me folgenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung der Erfindung·The following examples are provided for further explanation the invention·

Beippiei 1Beippiei 1

Zu einer auf O 0C abgekühlten Lösung von 109»1 βTo a solution, cooled to 0 ° C., of 109 »1 β

3
3-Hyuroxyiaethylpyridin in 500 cm Fyridin setzt man in kleinen Anteilen innerhalb von etwa 1 1/4 Stunden3
3-Hyuroxyiaethylpyridin in 500 cm fyridine is put in small portions within about 1 1/4 hours

201,54 β p-Kitrophenylelilorformiat zu. Man setzt das |201.54 β p-nitrophenyleliloroformate to. You put the |

Rühren des? Reaktionsgemisches eine Stunde bei 0 °C fort, läsot die Temperatur auf 20 0G ansteigen und setzt da3 Rühren noch 16 Stunden bei dieser Temperatur fort.Stirring the? Reaction mixture for one hour at 0 ° C continued läsot the temperature to 20 0 G rise and sets da3 stirring for a further 16 hours at this temperature continued.

Man ßitot dann 1,6 Liter fiethylenchlorid zu und wäscht dreimal mit Js 500 cm destilliertem Wasser und dann mit 500 cm einer gesättigten Hatriuntchloridlösung· Die organische Lösung wird über natriumsulfat getrocknet1.6 liters of diethylene chloride are then added and washed three times with Js 500 cm of distilled water and then with 500 cm of a saturated solution of Hatriunt's chloride The organic solution is dried over sodium sulfate

und dann unter vexnindertem Brück (20 mn Hg/ feel 50 C zur Trockne eingeengt· Bas erhalcertd öl Mixtl ia 1S§ Lit ex» Äthanol gelöst, und die Lösung wird 16 Stunden bei O0C stehen gelassen· Der erhaltene Niederschlag wirä abfiltriert, rait 100 cm Äthanol gewaschen und unter vermindertem Brück (Ο«3 EiB Hg) getrocknet· Man erhält 128 g * Pyridyl-(3)-methyl-p-nltrophenyl-carbonat vom F « 93 0C (augenblicklicher SciiMelspunkt, Kofier),and then vexnindertem bridge (20 mn Hg / feel 50 C to dryness · Bas erhalcertd oil Mixtl ia 1 S § Lit ex »ethanol dissolved, and the solution is filtered for 16 hours at 0 ° C allowed to stand · The resulting precipitate wirä, washed Rait 100 cm of ethanol and under reduced bridge (Ο "3 EiB Hg) to give 128 g · * pyridyl (3) -methyl-p-nltrophenyl carbonate from F« 93 0 C (instantaneous SciiMelspunkt, Kofler)

Rf = 0,73 /gilieagelf Möthanol-Ija-Dichloräthan (2 ί 8Rf = 0.73 / gilieagelf Möthanol-Ija-dichloroethane (2 ί 8

Analyses berechnet5 G » 56,94 i = 3,67 H ~ 10,21 ?δ gefuoäeiis 57,58 3,86 9,89 Jt.Analyzes calculated 5 G »56.94 i = 3.67 H ~ 10.21? Δ gefuoäeiis 57.58 3.86 9.89 Jt.

BAO ORIGINALBAO ORIGINAL

109808/2274109808/2274

Beispiel 2Example 2

Zu einer Lösung von 3,51 g Colistin in 140 cm Dimethylformamid setzt man 16,5 g Pyridyl-(3)-mothyl-p-nitrophenyl-carbonat zu. Nach 48-stündigem Rühren bei etwa 20 0C wird das 'unlösliche Material durch Filtrieren abgetrennt und das Filtrat unter vermindertem Oruck (0,3 mm Hg) bei 55 0C zur Trockne eingeengt;. Der glasige Rückstand16.5 g of pyridyl (3) methyl p-nitrophenyl carbonate are added to a solution of 3.51 g of colistin in 140 cm of dimethylformamide. After 48 hours of stirring at about 20 0 C is separated, the 'insoluble material by filtration and the filtrate was concentrated under reduced Oruck (0.3 mm Hg) at 55 0 C to dryness ;. The glassy residue

wird in 180 cm siedendem Hitroraethan gelöst. Eine geringe Menge an unlöslichem Material wird durch Filtrieren abgetrennt· Das Filtrat v/ird anschliesoend zweieinhalb Stunden bei 0 0C gehalten· Dann v/ird der gebildete Niederschlag abfiltriert, mit 10 cm eiskaltem ™ Nitromethon gewaschen und dann unter vermindertem Druck (0,3 mm Hg) bei 50 0C während 16 Stunden getrocknet. Man erhält so 3*85 g Penta-N-[pyridyl-(j5) -methyloxycarbonylj-colistin. is dissolved in 180 cm boiling Hitroraethane. A small amount of insoluble material is separated off by filtration. The filtrate is then kept for two and a half hours at 0 ° C. The precipitate formed is then filtered off, washed with 10 cm of ice-cold nitromethone and then under reduced pressure (0.3 mm Hg) at 50 ° C. for 16 hours. This gives 3 * 85 g of penta-N- [pyridyl- (j5) -methyloxycarbonyl-colistin.

Rf = 0,74 /Silicagel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasaer (50 t 20 : 6 : 24 VoluminaJ/Rf = 0.74 / silica gel; n-butanol-pyridine-acetic acid water (50 t 20: 6: 24 volumesJ /

Analyse: -berechnet: G = 57,28 H = 6,82 N = 15,94 $> gefunden: 57,70 6,67 15,78 % Analysis: - calculated: G = 57.28 H = 6.82 N = 15.94 $> found: 57.70 6.67 15.78 %

Beispiel 3Example 3

Zu einer Lösung von 1,3 g Penta-N-[pyridyl-(2)-methyl- ^ oxycarbonyl !-colistin in 150 cnr Methanol setzt man 1,3 ß p-Kitroperbenzoesäure zu. Das Reaktionsgemisch wird bei etwa 20 0C 16 Stunden gerührt und dann unter vermindertem Druck (20 mm Hg) bei 50 0C zur Trockne eingeengt. Der feste Rückstand wird dreimal mit je 20 cm' Aceton von 200C und dann dreimal mit je 20 car Aceton von 50 0C gewaschen« 1.3 g of p-nitroperbenzoic acid are added to a solution of 1.3 g of penta-N- [pyridyl- (2) -methyl- ^ oxycarbonyl] -colistin in 150 cnr methanol. The reaction mixture is stirred for 16 hours at about 20 0 C and then under reduced pressure (20 mm Hg) at 50 0 C and concentrated to dryness. The solid residue is washed three times with 20 cm 'acetone of 20 0 C and then washed three times with 20 of acetone car 50 0 C'

Hach Trocknen unter vermindertem Druck (0,3 mm Hg) bei 20 0C erhält man 959 mg Penta-N-^fT-oXopyridyl-(3)-methyloxycarbonyl^-colistin.Hach drying under reduced pressure (0.3 mm Hg) at 20 0 C to obtain 959 mg of penta-N ^ f-oXopyridyl- (3) -methyloxycarbonyl ^ -colistin.

109808/2274109808/2274

BAD ORIGINALBATH ORIGINAL

Rf = 0,32 /Silicagelj n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (50 : 20 : 6 : 24 VoluminaJ7Rf = 0.32 / silica gel / n-butanol-pyridine-acetic acid-water (50: 20: 6: 24 volumesJ7

Beispiel 4Example 4

Zu einer auf 0 0C abgekühlten Lösung von 10,9 g 3-Hydroxymethyl-pyridin in 200 cm Äthylacetat setzt man 21,96 g p~Nitroperbenzoesäure zu· Nach 15-minütigem Rühren bei 0 0O und anschliessendem fortschreitenden Erwärmen des Reaktionsgemische auf etwa 20 0C wird der erhaltene Niederschlag abfiltriert, mit 100 cm Äthylacetat gewaschen und unter vermindertem Druck (0,3 mm Hg) ύ "bei etwa 20 0C getrocknet. Das erhaltene Produkt wirdTo a cooled to 0 0 C solution of 10.9 g of 3-hydroxymethyl-pyridine in 200 cm of ethyl acetate Substituting 21,96 gp ~ nitroperbenzoic to · After 15 minutes of stirring at 0 0 O and subsequent progressive heating of the reaction mixture to about 20 0 C, the resulting precipitate was filtered, washed with 100 cm of ethyl acetate and dried under reduced pressure (0.3 mm Hg) ύ "at about 20 0 C. the resulting product is

■5 ■
dann in 200 cm destilliertem Wasser suspendiert. Zu■ 5 ■
then suspended in 200 cm of distilled water. to

3 dieser Suspension setzt man 90 cm Harz Amberlite IRA in Carbonatformzu und rührt das Gemisch 25 Minuten bei etwa 20 0C. Das Harz wird abfiltriert und zweimal mit je 100 cm destilliertem Wasser gewaschen. Das Filtrat und die Waschflüssigkeiten werden vereinigt und unter vermindertem Druck (20 mm Hg) bei 55 0C zur Trockne eingeengt. Das erhaltene Öl wird in 80 cm siedendem Äthylacetat gelöst. Nach fortschreitender Abkühlung auf 20 0C und 15-minütigem Halten bei dieser Temperatur wird der gebildete Niederschlag abfiltriert und mit 50 cm Äthylacetat gewaschen. " ■ ™3 of this suspension is to 90 cm resin Amberlite IRA in Carbonatformzu and the mixture is stirred for 25 minutes at about 20 0 C. The resin is filtered off and washed twice with 100 cm of distilled water. The filtrate and washings are combined and concentrated under reduced pressure (20 mm Hg) at 55 0 C and concentrated to dryness. The oil obtained is dissolved in 80 cm boiling ethyl acetate. By progressive cooling to 20 0 C and 15 minutes, holding at this temperature, the precipitate formed is filtered off and washed with 50 cm of ethyl acetate. "■ ™

Nach Trocknen unter vermindertem Druck (0,3 mm Hg) bei 20 0C erhält man 11,6 g 3-Hydroxymethylpyridin-N-oxyd vom ϊ1 = 90 0C (augenblicklicher Schmelzpunkt, Kofier).After drying under reduced pressure (0.3 mm Hg) at 20 0 C to obtain 11.6 g of 3-hydroxymethylpyridine-N-oxide from ϊ 1 = 90 0 C (instantaneous melting point Kofler).

Analyse: berechnet: N —^ 0 23,98 $> gefunden: 23,70 i» Analysis: calculated: N - ^ 0 $ 23.98> found: 23.70 i »

Beispiel 5Example 5

Zu einer auf 0 0C abgekühlten Lösung von 1 g 3-Hydroxy-To a cooled to 0 0 C solution of 1 g of 3-hydroxy

109808/2274109808/2274

methylpyridin-N-o::yd in i4 enr Pyridin setzt man in kleinen Anteilen innerhalb von 30 Minuten 1,61 g p-Nitrophunylchlorforraiat zu. Man hält das Rühren des Reaktionsgemisches 17 Stunden bei etwa 20 0C aufrecht. Der gebildete Niederachlag wird abfiltriert, zweimal mit je 4 cm^ Pyridin gewaschen und unter vermindertem Druck (0,3 mm Hg) bei 20 0C getrocknet. Man erhält so 1,2 g ll-Oxopyridyl-(3)-methyl-p-nitrophenyl-carbonat vom P = 160 0C (augenblicklicher Schmelzpunkt, Kofier).methylpyridine-No :: yd in 14 enr pyridine is added in small portions within 30 minutes to 1.61 g of p-nitrophunylchloroformate. The reaction mixture is kept stirring at about 20 ° C. for 17 hours. The lower deposit formed is filtered off, washed twice with 4 cm ^ pyridine each time and dried at 20 ° C. under reduced pressure (0.3 mm Hg). Are thus obtained 1.2 g of ll-Oxopyridyl- (3) -methyl-p-nitrophenyl carbonate from P = 160 0 C (instantaneous melting point Kofler).

Beispiel 6Example 6

Zu einer Lösung von 15,1 g Pyridyl-(3)-methyl-p-nitrophenyl-carbonat in 400 cm Chloroform setzt man 12,1 g p-Nitroperbenzoesäure zu. Nach 16-stündigem Rühren bei 20 0C wird der gebildete Niederschlag abfiltriert und12.1 g of p-nitroperbenzoic acid are added to a solution of 15.1 g of pyridyl (3) methyl p-nitrophenyl carbonate in 400 cm of chloroform. After 16 hours of stirring at 20 ° C., the precipitate formed is filtered off and

3
zweimal mit je 100 cm Chloroform gewaschen. Das Piltrat und die Waschflüssigkeiten v/erden vereinigt und unter vermindertem Druck (17 mm Hg) bei 30 0C zur Trockne eingeengt. 3
washed twice with 100 cm chloroform each time. The Piltrat and the washings combined v / ground and (17 mm Hg) at 30 0 C and concentrated under reduced pressure to dryness.

Der feste Rückstand wird in 600 cm Äther suspendiert, und die Suspension wird 10 Minuten kräftig gerührt.The solid residue is suspended in 600 cm of ether, and the suspension is vigorously stirred for 10 minutes.

Das unlösliche Material wird abfiltriert und erneut inThe insoluble material is filtered off and reintroduced into

3
600 cm Äther suspendiert. Nach 10-minütigem Rühren wird das unlösliche Material abfiltriert, mit 100 cnr Äther gewaschen und unter vermindertem Druck (0,3 mm Hg) bei 20 0C getrocknet. Man erhält so 14,9 g N-Oxopyridyl-(3)-methyl-p-nitrophenyl-carbonat· 3
600 cm of ether suspended. After 10 minutes of stirring, the insoluble material is filtered off, washed with ether and 100 cnr under reduced pressure (0.3 mm Hg) at 20 0 C dried. 14.9 g of N-oxopyridyl- (3) -methyl-p-nitrophenyl carbonate are obtained in this way.

Rf = 0,4 /S"ilicagel; Methanol-1,2 —Dichloräthan (2:8 VoluminaJ7. Rf = 0.4 / S "ilicagel; methanol-1,2-dichloroethane (2: 8 volumesJ7.

109808/2274 »AD109808/2274 »AD

Beispiel 7Example 7

3 Zu einer Suspension von 12 g Colistin in 900 cm Dimethylformamid fügt man 30 β N-0xopyridyl~(3)-methyl-p-nitrophenyl-carbonat zu· Nach 64-stündigem Rühren liei 20 °0 wird da3 unlösliche Material durch Filtrieren abgetrennt· Das Piltrat wird auf 2/3 seines Volumen« unter vermindertem Druck (0,3 mm Hg) bei 50 C eingeengt. Zu dem Konzentrat setzt man 500 cm Äther zu· Es scheidet sich ein Öl ab, das man abtrennt und in 500 cm Methanol löst. Zu der erhaltenen Lösung setzt nan 500 cn' Äther zu· Es scheidet sich ein öl ab, daß dann kriatallioiert· Nach 15-stündigem Stehenlassen bei | 20 0C werden die Kristalle abfiltriert, mit 100 cnT Äther gewaschen und unter vermindertem Druck (0,3 mm Hg) bei 20 0C getrocknet· Man erhält so 16,8 g Penta-H-^TT-oxopyridyl-(3)-methyloxycarbonyl7-colistin· 3 30 β N-oxopyridyl ~ (3) -methyl-p-nitrophenyl carbonate are added to a suspension of 12 g colistin in 900 cm dimethylformamide.After 64 hours of stirring at 20 ° 0, the insoluble material is separated off by filtration. The piltrate is concentrated to 2/3 of its volume under reduced pressure (0.3 mm Hg) at 50.degree. 500 cm of ether are added to the concentrate. An oil separates out, which is separated off and dissolved in 500 cm of methanol. 500 cn of ether is added to the solution obtained. · An oil separates out, which then crystallizes · After standing for 15 hours at | 20 0 C, the crystals are filtered off, washed with ether and CNT 100 under reduced pressure (0.3 mm Hg) at 20 0 C dried · are thus obtained 16.8 g of penta-H- ^ TT-oxopyridyl- (3) - methyloxycarbonyl7-colistin

Rf = 0,32 ^jSilicage.l; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Waaser (50 t 2.0 t 6 t 24 Volumina}7Rf = 0.32 ^ siliconage.l; n-Butanol-Pyridine-Acetic Acid-Waaser (50 t 2.0 t 6 t 24 volumes} 7

Analyse: -berechnet: If -—*.0 7,79 l· gefunden: 7,60 #«Analysis: -calculated: If -— *. 0 7.79 l · found: 7.60 # «

Beiapiel 8Example 8

Zu einer Suspension von 2,17 g Polymyxin B in 145 cm g Dimethylformamid setzt man 3,18 g H-0xopyridyl-(3)-methyl-p-nitrophenylcarbonat zu· Nach 24-sttindigem Rühren liei 60 0C und 65-stündigem Rühren bei 20 0C wird das unlösliche Material durch Filtrieren abgetrennt· Das FiItrat wird unter vermindertem Druck (0,3 mm Hg) bei 60 °0 sur Trockne eingeengt. Der Rückstand wird in 7 cm** Methanol gelöst und die Lösung an einer Säule mit Sephadex LH 20 (Durchmesser der Säulet 38 mmj Höhet 1,80 m) chroaatographiert· Man eluiert mit Methanol und It Fraktionen von 7 cm . Die Fraktionen 130 bisG To a suspension of 2.17 g of polymyxin B in 145 cm dimethyl formamide is 3.18 g H-0xopyridyl- (3) methyl p-nitrophenyl carbonate to · After 24 sttindigem stirring liei 60 0 C and 65 hours stirring at 20 0 C, the insoluble material is separated by filtration · the FiItrat (0.3 mm Hg) and concentrated under reduced pressure at 60 ° 0 sur dryness. The residue is dissolved in 7 cm ** methanol and the solution chromatographed on a column with Sephadex LH 20 (diameter of the column 38 mmj height 1.80 m). Fractions of 7 cm are eluted with methanol and It. The fractions 130 bis

109808/2274109808/2274

170 werden vereinigt und unter vermindertem Druck (20 IMi Hg) bei 50 0G zur Trockne eingeengt. Man erhält so 3,2 g Penta-lJ-/N-oxopyridyl-(3)~methyloxycarbonyl7~ polymyxin B.170 are combined and concentrated under reduced pressure (20 IMi Hg) at 50 0 G to dryness. This gives 3.2 g of penta-lJ- / N-oxopyridyl- (3) -methyloxycarbonyl7-polymyxin B.

Rf = 0,50 /Silicagel; n-Butanol-Pyr.idin-Essigsäure~ V/asser (50 : 20 : 6 : 24 VoluminaJ7·Rf = 0.50 / silica gel; n-butanol-pyr.idin-acetic acid ~ V / ater (50: 20: 6: 24 volumesJ7

Beispiel 9Example 9

Zu einer Lösung von 5,45 g 3-Hydroxymethyl-pyridin inTo a solution of 5.45 g of 3-hydroxymethyl-pyridine in

3 einem Gemisch von 3,95 g Pyridin und 45 cm Methylenehlorid setzt man tropfenweise innerhalb 20 Minuten unter Halten des Reaktionsgemische bei einer Temperatur unter 35 0C eine Lösung von 13 g 2,4,5-Trichlorphenyl-3 a mixture of 3.95 g of pyridine and 45 cm of methylene chloride is added dropwise within 20 minutes while maintaining the reaction mixture at a temperature below 35 0 C a solution of 13 g of 2,4,5-trichlorophenyl

•3
chlorformiat in 20 cm Methylenchlorid zu. Einige Minuten nach beendeter Zugabe des Chlorformiatα tritt ein gelbor Niederschlag auf. Man setzt das Rühren des Reaktionsgemischs 20 Stunden bei 20 0G fort. Dann gibt man 20 cm destilliertes Wasser zu. Der Niederschlag löst sich. Die organische Phase wird abgetrennt und zweimal mit je 25 cm destilliertem Wasser, 25 cm einer 5 °I°~ igen (Gewicht je Volumen) Natriumbicarbonatlösung und• 3
chloroformate in 20 cm of methylene chloride. A yellowish precipitate appears a few minutes after the addition of the chloroformate has ended. The stirring of the reaction mixture continued for 20 hours at 20 0 G. Then 20 cm of distilled water are added. The precipitate dissolves. The organic phase is separated off and washed twice with 25 cm each of distilled water, 25 cm of a 5 ° I ° ~ strength (weight per volume) sodium bicarbonate solution and

3
25 cm einer gesättigten Natriumchloridlösung gewaschen. Die organische Lösung wird über Natriumsulfat getrocknet und dann unter vermindertem Druck (20 mm Hg) bei 50 0C zur Trockne eingeengt. Der erhaltene feste Rückstand wird in der minimalen Menge siedendem Methanol (30 cm ) gelöst, und die Lösung wird eine Stunde bei 20 0C stehengelassen. Der gebildete Niederschlag wird3
Washed 25 cm of a saturated sodium chloride solution. The organic solution is (20 mm Hg) at 50 0 C over sodium sulfate, concentrated and then dried under reduced pressure to dryness. The solid residue obtained is dissolved in the minimum amount of boiling methanol (30 cm), and the solution is left to stand at 20 ° C. for one hour. The precipitate formed will

3
abfiltriert, mit 30 cm Methanol gewaschen und unter vermindertem Druck (0,3 mm Hg) "bei 20 0C getrocknet. Man erhält 7,8 g Pyridyl~(3)-methyl-2,4,5-trichlorphenylcarbonat vom F = 95 0C (augenblicklicher Schmelzpunkt, Kofier)·3
filtered, washed with 30 cm of methanol, and under reduced pressure (0.3 mm Hg) "dried at 20 0 C., giving 7.8 g of pyridyl ~ (3) -methyl-2,4,5-trichlorophenylcarbonate of F = 95 0 C (instantaneous melting point, Kofier)

Analyse: berechnet: C sr 46,95 H = 2,42 I = 4,21 Cl =Analysis: Calculated: C sr 46.95 H = 2.42 I = 4.21 Cl =

319 gefunden: 47,69 2,8 4,11 J>l 319 found: 47.69 2.8 4.11 J> l

109808/2274 BAD ORIGINAL109808/2274 ORIGINAL BATHROOM

Beispiel 10Example 10

Zu einer Lösung von 5 g Pyridyl-(3)-methyl-2,4,5-trichlorphenyl-carbonat (hergestellt gemäss Beispiel 9) in 80 cm Chloroform setzt man 3,3 g p-Nitroperbenzoesäure zu. Nach 16-stündigem Rühren bei 20 0G wird der gebilde-3.3 g of p-nitroperbenzoic acid are added to a solution of 5 g of pyridyl (3) methyl-2,4,5-trichlorophenyl carbonate (prepared according to Example 9) in 80 cm of chloroform. After 16 hours of stirring at 20 0 G, the formed

te niederschlag durch Filtrieren abgetrennt und mit 20 era Ohloroform gewaschen. Die vereinigten organischen Lösungen werden unter vermindertem Druck (13 mm Hg) bei 50 0O auf 50 cm eingeengt. Das Konzentrat wird 10 Minuten mit einer wässrigen 15 $-igen (Gewicht/Volumen) Natriumcarbonatlösung gerührt. Die wässrige Phase wird abgetrennt und mit 20 cm Chloroform gewaschen. Die organischen PhasenThe precipitate was separated off by filtration and washed with 20 era Ohloroform. The combined organic solutions are concentrated cm under reduced pressure (13 mm Hg) at 50 0 O on 50th The concentrate is stirred for 10 minutes with an aqueous 15% (weight / volume) sodium carbonate solution. The aqueous phase is separated off and washed with 20 cm of chloroform. The organic phases

werden vereinigt und nacheinander mit 20 cm einer wässrigen 15 $-igen (Gewicht/Volumen) Natriumcarbonatlösung,are combined and successively with 20 cm of an aqueous $ 15 (weight / volume) sodium carbonate solution,

3 33 3

20 cm destilliertem Wasser und 20 cm einer gesättigten Natriumchloridlösung gewaschen. Die organische Lösung wird über Natriumsulfat getrocknet und dann unter vermindertem Druck (13 mm Hg) bei 50 0C zur Trockne eingeengt. Man erhält so 4,2 g N-0xopyridyl-(3)-methyl-2,4,5-trichlorphenyl-carbonat vom F = 169 0C (augenblicklicher Schmelzpunkt, Kofier).. Eine aus Methanol umkristalüsierte Probe schmilzt bei 171 0C (augenblicklicher Schmelzpunkt, Kofier).Washed 20 cm of distilled water and 20 cm of a saturated sodium chloride solution. The organic solution is concentrated dried over sodium sulfate, and then under reduced pressure (13 mm Hg) at 50 0 C to dryness. Are thus obtained 4.2 g of N-0xopyridyl- (3) -methyl-2,4,5-trichlorophenyl carbonate from F = 169 0 C (instantaneous melting point Kofler) .. A sample umkristalüsierte from methanol melted at 171 0 C (instantaneous melting point, Kofier).

Analyse: berechnet: C = 44,79 H = 2,31 N= 4,02 C1=3O,51# gefunden: 44,9 2,6 3,75 30,6#Analysis: calculated: C = 44.79 H = 2.31 N = 4.02 C1 = 3O, 51 # found: 44.9 2.6 3.75 30.6 #

Beispiel 11Example 11

Zu einer Suspension von 1,169 g Colistin in 80 cm Dimethylformamid setzt man 2,1 g N-0xopyridyl-(3)-methyl-2,4,5-trichlorphenyl-carbonat zu. Nach 44-stündigem Rühren bei 50 0C wird das unlösliche Material durch Filtrieren abgetrennt. Das FiItrat wird unter vermindertem Druck (0,3 mm Hg) bei 60 0C zur Trockne eingeengt. Zu dem er-2.1 g of N-oxopyridyl- (3) -methyl-2,4,5-trichlorophenyl carbonate are added to a suspension of 1.169 g of colistin in 80 cm of dimethylformamide. After stirring for 44 hours at 50 ° C., the insoluble material is separated off by filtration. The FiItrat (0.3 mm Hg) at 60 0 C and concentrated under reduced pressure to dryness. To the

Ϊ09'808/22Ϊ09'808 / 22

haltenen öligen Rückstand setzt man 60 cm Äther zu. Es scheidet sich ein kristallisiertes Produkt ab, das man abfiltriert, mit 20 cm Äther wäscht und unter ver mindertem Druck (0,3 min Hg) bei 20 0C trocknet. Man er hält so 1,5 β Penta-IJ-^T-oxopyridyl-(3)-methyloxycarbonyl7-colistin, das mit dem Produkt von Beispiel 7 identisch ist,The oily residue held is added to 60 cm of ether. A crystallized product separates out, which is filtered off, washed with 20 cm of ether and dried at 20 ° C. under reduced pressure (0.3 min Hg). So he holds 1.5 β penta-IJ- ^ T-oxopyridyl- (3) -methyloxycarbonyl7-colistin, which is identical to the product of Example 7,

Rf = 0,32 ^Silicagel; n-Butanol-Pyridin-Essigüäure-V/asser (50 : 20 ; 6 : 24 Volumina_)7·Rf = 0.32 ^ silica gel; n-butanol-pyridine-acetic acid water / water (50:20; 6:24 volumes_) 7 ·

Analyse: berechnet: C=54,9O H= 6,54 11=15,28 # gefunden: 55,31 6,8 14,90 cß> Analysis: calculated: C = 54.9 O H = 6.54 11 = 15.28 # found: 55.31 6.8 14.90 c β>

Beispiel 12Example 12

Zu 4,36 g 4-Hydroxymethyl-pyridin in einem Gemisch von 3,16 g Pyridin und 35 cm Methylenchlorid fügt man trope To 4.36 g of 4-hydroxymethyl-pyridine in a mixture of 3.16 g of pyridine and 35 cm of methylene chloride are added trope

fenweise unter Halten des Reaktionsgemische cci 0 0C eine Lösung von 8,06 g p-Nitrophenyl-chlorformiat in 40 era Methylenchlorid zu. Nach beendeter Zugabe rührt man das Reaktionsgemisch noch 18 Stunden bei 0 C weiter. Dasfenweise while maintaining the reaction mixtures cci 0 0 C a solution of 8.06 g of p-nitrophenyl chloroformate in 40 era of methylene chloride. After the addition has ended, the reaction mixture is stirred at 0 ° C. for a further 18 hours. That

Reaktionsßemisch wird zweimal mit je 20 cm Waoser, zweimal mit je 20 cm einer wässrigen 5 $-igen (Gewicht/Volumen) Natriumbicarbonatlösung und zweimal mit je 20 cm einer wässrigen gesättigten Hatriumchloridlösung gewa-P sehen. Die organische Lösung wird unter vermindertem Druck (15 mm Hg) bei 30 0G zur Trockne eingeengt. Das erhaltene zurückbleibende Öl wird in 600 cm Äther aufge-' nommen. Der unlösliche Bestandteil wird durch Filtrieren entfernt. Nach Einengen des PiItrats unter vermindertem Druck (30 mm Hg) bei 20 0C zur Trockne erhält man 4,1 g Pyridyl-(4)-methyl-p-nitrophenyl-carbonat vom P = 83 (augenblicklicher Schmelzpunkt, Kofier).The reaction mixture is seen twice with 20 cm Waoser each, twice with 20 cm each of an aqueous 5% (weight / volume) sodium bicarbonate solution and twice with 20 cm each of an aqueous saturated sodium chloride solution. The organic solution is concentrated under reduced pressure (15 mm Hg) at 30 0 G to dryness. The remaining oil obtained is taken up in 600 cm of ether. The insoluble component is removed by filtration. After concentration of the PiItrats under reduced pressure (30 mm Hg) is obtained at 20 0 C to dryness, 4.1 g pyridyl- (4) -methyl-p-nitrophenyl carbonate from P = 83 (instantaneous melting point Kofler).

Rf = 0,61 /S*ilicagel; Methanol-1,2-Dichloräthan (5 : 95 VoluminaJ7· Rf = 0.61 / S * ilicagel; Methanol-1,2-dichloroethane (5:95 volumesJ7

109808/2274109808/2274

Durch Arbeit en In der gleicheii Weiac, ausgehend von 2,46 r. 2-Hydraxyrjethyl-6-insthylpyrirtin und 4,03 g p-Hitrophenyl-chlorformiat erhält man 1,50 g 6-Methylpyridy 1 -(2)-niethyl-p-nitropkenyl-carbonat·By working in the same Weiac, starting from 2.46 r. 2-hydraxyrjethyl-6-insthylpyrirtine and 4.03 g p-nitrophenyl chloroformate gives 1.50 g of 6-methylpyridy 1 - (2) -niethyl-p-nitropkenyl carbonate

Rf - 0, H;> £7>±l ic ate 1; Butylmetliylketon-Aceton-Kssigsiiure-Pyridin-Cyciohexan (5:115:5:10:15 Volumina.)/·Rf - 0, H;> £ 7> ± l ic ate 1; Butylmetliylketon-Aceton-Kssigsiiure-Pyridine-Cyciohexane (5: 115: 5: 10: 15 volumes.) / ·

1313th

Zu ο in or üut?per.:-ion von 280 mg Colistin in 15 cm DimethylformaKid fügt man 450 mg 6-liethylpyridyl-(2)-metiiy]-r-nitrophc-nyl-carbojiat zu. gTo ο in or üut? Per .: - ion of 280 mg colistin in 15 cm DimethylformaKid is added to 450 mg of 6-diethylpyridyl- (2) -metiiy] -r-nitrophc-nylcarbojiate to. G

Nach 64-r.tündit-:e!ii Rühren bei 20 0C wird die Lösung unter vermindertem Druck (0,3 mm Hg) bei 55 0C zur Trockne eingeengt.After 64-r.tündi t! -: e ii stirring at 20 0 C, the solution is (0.3 mm Hg) at 55 0 C and concentrated under reduced pressure to dryness.

Zu dem glaaigen Rückstand oetzt man 10 cm jitner zu. Es treten Kristalle auf, die man abfiltriert und dreimal mit je 20 cm Äther viäscht.10 cm jitter is added to the glacial residue. Crystals appear, which are filtered off and washed three times with 20 cm of ether each time.

Man erhält so 92 mg Penta-N-^5-ir.eUiylpyridyl-(2)-niethyloxycarbonyl7-coliatin. 92 mg of penta-N- ^ 5-ir.eUiylpyridyl- (2) -niethyloxycarbonyl7-coliatin are obtained in this way.

Rf = 0,91 ^ilicagelj n-Butanol-Pyridin-EssigsUure-Rf = 0.91 ^ ilicagelj n-butanol-pyridine-acetic acid

Wasser (50:20:6s24 VoluminaJ7« i Water (50: 20: 6s24 volumesJ7 « i

Beispiel 14, Example 14 ,

Zu einer Suspension von 400 mg Colistin in 25 cm5 Dimethylformamid setzt man 900 mg Pyridyl-(4)-methylp-nitrophenyl-carbonat zu· Nach 64-stündigem Rühren bei 20 0C wird die Lösung unter vermindertem Druck (0,3 mn Hg) bei 55 0G zur Trockne eingeengt. Zu dem glasigen Rückstand setzt man 20 cm Äther zu. Es treten Kristalle auf, die man abfiltriert, dann dreimal mit je 20 cm ÄtherTo a suspension of 400 mg Colistin 5 in 25 cm of dimethylformamide is pyridyl 900 mg (4) -methylp-nitrophenyl carbonate to · After stirring for 64 hours at 20 0 C, the solution under reduced pressure (0.3 mn Hg ) at 55 0 G concentrated to dryness. 20 cm of ether are added to the glassy residue. Crystals appear, which are filtered off, then three times with 20 cm of ether each time

BAD ORIGINAL 109808/2274 BATH ORIGINAL 109808/2274

wäscht und unter vermindertem Druck (0,3 nun Hg) bei 2.0 C trocknet.washes and dried under reduced pressure (0.3 now Hg) at 2.0 C.

Man erhält so 620 mg Penta-li-u/p/2'idyl-(4)-KH.'thyloxycarbonyl7-coli;jtin» 620 mg of penta-li- u / p/2'idyl-(4 )-KH.'thyloxycarbonyl7-coli;jtin »are obtained in this way.

Rf = 0,74 /üilicagel; n-ISutanol-Pyridiri-Esüigsäure·- WacBer (50:20:6:24 VoluminaJ7·Rf = 0.74 / silica gel; n-ISutanol-Pyridiri-Esüigsäure · - WacBer (50: 20: 6: 24 volumesJ7 ·

Peinpiej 15Peinpiej 15

Zu einer auf 0 C abgekühlten Lösung von 1,25 g 4-HydroxyriethyJ-pyridin-l]-oxyd in 20 cm Pyridin setzt man 2,02 β p-liitrophenyi-chlorfonniat zu. Nach beendete^ Zugabe rührt man da» Reaktionngemisch noch 17 Stunde:η bei etwa 20 C weiter. Der gebildete Niederschlag wird abf:i ltriort, zweimal mit je 4 cm Pyridin gev/aoehen und unter vermindertem Druck (0,3 nun Hg) bei 20 0C getrocknet. Man erhält so 0,67 g lJ-0xopyridyl-(4)-methyl-p-nitrophenyl-carbonat· To a solution, cooled to 0 C, of 1.25 g of 4-hydroxyriethyJ-pyridine-1] oxide in 20 cm of pyridine, 2.02 β-p-nitrophenyl-chlorofonniate is added. When the addition is complete, the reaction mixture is stirred for a further 17 hours at about 20 ° C. The precipitate formed is abf: i ltriort, aoehen twice with 4 cm pyridine GeV / and under reduced pressure (0.3 mm Hg) and dried at 20 0 C. This gives 0.67 g of lJ-oxopyridyl- (4) -methyl-p-nitrophenyl carbonate.

Analyse: berechnet: C = 53,80 H = 3,47 N - 9,65 % gefunden: 52,90 3,70 9,68 #Analysis: calculated: C = 53.80 H = 3.47 N - 9.65% found: 52.90 3.70 9.68 #

Das Aucgaiigsprodukt wird durch Arbeiten v/ie in Beispiel 4» jedoch ausgehend von 2,72 g 4-Hydroxymethylpyridin und 5,49 g p-Nitroperbenzoesäure hergestellt. Man erhält so 1,74 g 4-IIydroxyinethyl-pyridin-lI-oxyd vom F= 125 0C (augenblicklicher Schmelzpunkt, Kofier).The Aucgaiigsprodukt is prepared by working as in Example 4, but starting from 2.72 g of 4-hydroxymethylpyridine and 5.49 g of p-nitroperbenzoic acid. Are thus obtained 1.74 g of 4-IIydroxyinethyl-pyridin-lI-oxide of F = 125 0 C (instantaneous melting point Kofler).

Analyse: berechnet: Ii ·—-> 0 12,8 $ gefunden; 13,0 $,Analysis: calculated: Ii · ---> 0 found $ 12.8; $ 13.0,

Beispiel 16Example 16

Zu einer Suspension von 200 mg Colistin in 10 cm Dimethylformamid setzt man 400 mg N-Oxopyridyl-(A)-methyl-p-nitrophenyl-carbonat zu. 400 mg of N-oxopyridyl (A) methyl-p-nitrophenyl carbonate are added to a suspension of 200 mg of colistin in 10 cm of dimethylformamide.

109808/22109808/22

Wach 64-stündigem Rühren bei etwa 20 0C wird die Lösung unter vermindertem Druck (0,3 mm Hg) bei 55 0C eingeengt.After stirring for 64 hours at about 20 ° C., the solution is concentrated at 55 ° C. under reduced pressure (0.3 mm Hg).

3 ··3 ··

Zu dem glasigen Rückstand setzt man 10 cm Äther zu. Es treten Kristalle auf, die man abfiltriert, zweimal mit je 3 cm Äther wäscht und unter 0,3 mm Hg bei 20 0O trocknet.10 cm of ether are added to the glassy residue. It occur crystals which are filtered off, washed twice with 3 cm of ether, and dried under 0.3 mm Hg at 20 0 O.

Man erhält so 250 mg Penta-N-^-exopyridyl-(4)-methyloxycarbonylT-colistin, This gives 250 mg of penta-N - ^ - exopyridyl- (4) -methyloxycarbonylT-colistin,

Rf s= 0,29 /Silicagel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Rf s = 0.29 / silica gel; n-butanol-pyridine-acetic acid

Wasser (5Ο:2Οί6:24 VoluminaJ7· g Water (5Ο: 2Οί6: 24 volumesJ7 g

Beispiel 17 ■ Example 17 ■

Zu einer Lösung von 1,5 g Penta-N~/S-6xopyridyl-(3)-methyloxycarbonyl7-colistin in 230 cm einer auf pH 7>5 gepufferten und auf 37 0C erwärmten Lösung setzt man 50 mg Subtilisin zu und rührt das Reaktionsgemisch Minuten bei 37 0C, Gleich danach wird das Reaktionsgemisch auf -70 0C abgekühlt. To a solution of 1.5 g of penta-N ~ / S-6xopyridyl- (3) -methyloxycarbonyl7-colistin in 230 cm buffered to pH 7> 5 and heated at 37 0 C solution are added to 50 mg of subtilisin and stir the reaction mixture 37 minutes at 0 C, Immediately after the reaction mixture is cooled to -70 0 C.

Die Lyophilisation der so erhaltenen Lösung liefert ein cremefarbenes Pulver, das in 10 cm der schweren Phase eines Lösungsmittelsystems der folgenden Zusammensetzung a gelöst wird :Lyophilization of the solution thus obtained gives a cream-colored powder which is dissolved in 10 cm of the heavy phase of a solvent system of the following composition a :

n-Butanol Pyridin Essigsäure Wassern-butanol pyridine acetic acid water

Diese Lösung wird einer Gegenstromverteilung in einer Apparatur von 60 Rohren, die jeweils 10 cm schwere Phase und 10 cnr leichte Phase enthalten können, unterzogen. Am Ende der Gegenstromverteilung wird der Inhalt eines je~ den Rohres unter vermindertem Druck (25 mm Hg) bei 60 0CThis solution is subjected to countercurrent distribution in an apparatus of 60 tubes, each of which can contain 10 cm heavy phase and 10 cm light phase. At the end of the counter current distribution, the content of each ~ the tube under reduced pressure (25 mm Hg) at 60 0 C.

800800 cmcm 200200 cmcm 100100 cmcm 900900 cmcm

ORIGINALORIGINAL

109808/22 74109808/22 74

zur Trockne eingeengt« Die Rückstände aus den Rohren 25 bis 31 werden in insgesamt 20 cm V/aoocr gelöst, und die so erhaltene Lösung wird lyophilisierfc. Man erhält so 246 mg Cyclo-ßi-^-L-cx, ^- diaminobutyryl-N-tf— /N-oxopyridyl-( 5) methyloxycarbonylT'-L-ui »i -äiaminobutyryl-D -leucyl-L-leucyl-H-jf -^Ji-oxopyridyl-(3 )-methyloxycarbonyl7-Iroc rfdiaminobutyryl-N-^ -^!T-oxopyridyl~(3 )-methyloxycarbonyl7-Irot, ^-diaminobutyryl-L-threonylj »concentrated to dryness. The residues from tubes 25 to 31 are dissolved in a total of 20 cm V / aoocr, and the solution thus obtained is lyophilized. This gives 246 mg of cyclo-βi - ^ - L-cx, ^ - diaminobutyryl-N-tf- / N-oxopyridyl- (5) methyloxycarbonylT'-L-ui »i -äiaminobutyryl-D -leucyl-L-leucyl- H-jf - ^ Ji-oxopyridyl- (3) -methyloxycarbonyl7-Iroc rf diaminobutyryl-N- ^ - ^! T-oxopyridyl ~ (3) -methyloxycarbonyl7-Irot, ^ -diaminobutyryl-L-threonylj »

Rf = 0,27 /Silicagel; n-Butanol-Pyridin~Essigsäure-Wacser (50:20:6:24 VolxuninaJ7#Rf = 0.27 / silica gel; n-Butanol-Pyridine ~ Acetic Acid Wacser (50: 20: 6: 24 VolxuninaJ7 #

Nach vollständiger Hydrolyse ergibt die Analyse mit einem Technicon-Autoanalysator das Vorhandensein der folgenden Aminosäuren ίAfter complete hydrolysis, the analysis with a Technicon auto analyzer the presence of the following amino acids ί

Dab = 4,07 (Theorie = 4) Leu = 2,00 (Theorie = 2)Dab = 4.07 (theory = 4) Leu = 2.00 (theory = 2)

Thr ~ 0,98 .(Theorie = 1)Thr ~ 0.98. (Theory = 1)

Man arbeitet in analoger V/eise; ersetzt jedoch das Subtilisin durch Nagarse, Pronaas, Colißtinase» Alkalase oder durch B. subtilis GLAXO 417, B. subtili3 A.T.G.C, 9524 und Bacillus THE 4 gebildete Proteasen und erhält ebenfalls das oben beschriebeiie cyclische Polypeptid, das durch Chromatographie an Silicagel (Rf = 0,27) in dem System n-Butanol-Pyridin-Essigsaure'-Wasaer (50;20:6:24 Vo lumina) identifiziert v#ird.One works in an analogous way ; however, replaces the subtilisin with Nagarse, Pronaas, Colissinase alkalase or with B. subtilis GLAXO 417, B. subtilis ATGC, 9524 and Bacillus THE 4 proteases and also receives the above-described cyclic polypeptide, which is obtained by chromatography on silica gel (Rf = 0 , 27) in the system n-butanol-pyridine-acetic acid'-Wasaer (50; 20: 6: 24 Volumes) identified v # ird.

Die zum Lösen des -Peiita-M-^-oxqpyridyl-l^i-methyloxycarbony].7-colistins verwendete } auf pH 7»5 gepufferte Lösung kann durch Einstellen einer Lösung von 34 cm Essigsäure in 70ö cja" destilliertem tfasssr auf pH 7»5 (Bestimmung mit einem pH-Messgerät) durch Zugabe von 5n—Ammoniak und anschliessendes Auffüllen auf 10(50 cm durch Zugabe von destilliertem Wasser erhalten werden»The for releasing the -Peiita-M - ^ - oxqpyridyl-l ^ i-methyloxycarbony] .7-colistin used} buffered to pH 7 »5 solution by adjusting a solution of acetic acid 34 cm in 70ö cja" distilled tfasssr to pH 7 »5 (determined with a pH meter) by adding 5N ammonia and then making up to 10 (50 cm can be obtained by adding distilled water»

1 0 3 δ 0 S / 2 2 Ο* 1 0 3 δ 0 S / 2 2 Ο *

Beispiel 18Example 18

Zu einer Lösung von 5 β Penta-II-^Ji-oxopyridyl-(3)-methyloxycarbonylj-colistin in 1 Liter einer auf pH 6 gepufferten Lösung seti.t n,an 500 mg von B. subtilis gebildeter alkalischer Protease (Gehalt 9,5 Einheiten je rag) zu und rührt das Roaktionüf.emisch bei 21 0C 3 Stunden. Sogleich danach {stellt man'das Reaktionsraedium durch Zugabe von 1n-Salzsäure atif pH 3 ein.To a solution of 5 β penta-II- ^ j-oxopyridyl- (3) -methyloxycarbonyl-colistin in 1 liter of a pH 6 buffered solution add 500 mg of alkaline protease formed by B. subtilis (content 9.5 Units per rag) and stir the Roaktionüf.emisch at 21 0 C for 3 hours. Immediately thereafter, the reaction medium is adjusted by adding 1N hydrochloric acid at pH 3.

Die Lyophilination der so erhaltenen Löcung ergibt ein cremefarbenes Pulver, das in 80 cn Methanol aufgenommen ä wird. Man filtriert das unlösliche Material ab und engt daa Piltrat dann unter vermindertem Druck (20 mm Hg) bei 50 0C zur Trockne ein. Der erhaltene feste Rückstand (5,9 g) wird in 30 cnr einer Äthanol-ilethanol-Lösung (75 i 25 Volumina) gelöst, und die Lösung wird an einer Säule von 320 g neutralem Aluminiumoxyd (Höhe der Säule:The Lyophilination the Löcung thus obtained gives a cream-colored powder which is taken up in 80 ä cn methanol. The insoluble material is filtered off and then concentrated daa Piltrat under reduced pressure (20 mm Hg) at 50 0 C to dryness. The solid residue obtained (5.9 g) is dissolved in 30 cnr of an ethanol-ilethanol solution (75 i 25 volumes), and the solution is poured onto a column of 320 g of neutral aluminum oxide (height of the column:

70 cm, Durchmesser: 2,8 cm) chromatographiert.70 cm, diameter: 2.8 cm) chromatographed.

Man eluiert nacheinander mit :One elutes successively with:

1 Liter Äthanol-Hethanol-Gemisch (75:25 Volumina)1 liter of ethanol-ethanol mixture (75:25 volumes)

4,5 Liter Äthanol-Methanol-Gemiöcn (50:50 Volumina)4.5 liters of ethanol-methanol mixture (50:50 volumes)

3 Liter Äthanol-Hethanol-Gemisch (25:75 Volumina) 3,5 Liter Methanol ^ 3 liters of ethanol-ethanol mixture (25:75 volumes) 3.5 liters of methanol ^

Man sammelt Fraktionen von 500 cm · Die Fraktionen 10 bis 21 werden vereinigt und unter vermindertem Druck (20 mm Hg) bei 50 0C zur Trockne eingeengt. Man erhält so 1,55 g Cyclo-^lJ-l-L-^.f-diaminobutyryl-li^-^-oxopyridyl-( 3) -methyl oxycarbonyl7-Ii-eu ,1 -diaminobutyryl-D-leucyl-L-leucyl-N-f -^T-oxopyridyl- ( 3) -methyloxycarbonylj-lrrt, 9$ diaminobutyryl-N-j? -^-oxopyridyl-(3 )~methyloxycarbonyl7~Collecting fractions of 500 cm x Fractions 10 to 21 are combined and concentrated under reduced pressure (20 mm Hg) at 50 0 C and concentrated to dryness. This gives 1.55 g of cyclo- ^ lJ-lL - ^. F-diaminobutyryl-li ^ - ^ - oxopyridyl- (3) -methyl oxycarbonyl7-Ii-eu , 1 -diaminobutyryl-D-leucyl-L-leucyl- Nf - ^ T-oxopyridyl- (3) -methyloxycarbonylj-irrt, 9 $ diaminobutyryl-Nj? - ^ - oxopyridyl- (3) ~ methyloxycarbonyl7 ~

Die zum Lösen des Penta-N-^'-oxopyridyl-(3)-methyloxycarbonylj-colistins verwendete^auf pH 6 gepufferte LösungThe one used to dissolve the penta-N - ^ '- oxopyridyl- (3) -methyloxycarbonylj-colistins used ^ solution buffered to pH 6

109 8 08/2274109 8 08/2274

kann durch Einstellen einer Lösung von 454 mg Monokaliumphosphat in 1 Liter destilliertem Wasser auf pH 6 (Bestimmung mit einem pH-Mesngerät) durch Zugabe einer Lösung von 1,2 g Dinatriuiaphosphat-Dodecahydrat in 1 Liter destilliertfim V/asser erhalten v/erden.can be made by adjusting a solution of 454 mg of monopotassium phosphate in 1 liter of distilled water to pH 6 (determination with a pH meter) by adding a Solution of 1.2 g of dinatrium phosphate dodecahydrate in 1 liter of distilled water is obtained.

Die Einheit von Enzym ist die Enzymmenge, die bei pH 9,5 und 50 0C innerhalb von einer Minute eine ausreichende Menge Casein aus in Trichloressigaäure löslichem Peptid freisetzt, um eine Erhöhung der optischen Pichte von 1,00 bei 200 mn zu beobachter.. Der Enzyintiter (Einheiten je mg) i3t daher die Anzahl an Einheiten je mg i3ub- Wk stanz. Diese Beotimmungnmethode der enzymatisch en Aktivität iat der von M. Kunitz, J. Gen. Physiol., 3jO, 291 (1947) beschriebenen ähnlich.The unit of enzyme is the amount of enzyme which, at pH 9.5 and 50 0 C, releases a sufficient amount of casein from peptide soluble in trichloroacetic acid within one minute to observe an increase in the optical density of 1.00 at 200 nm. The enzyme titer (units per mg) is therefore the number of units per mg i3ub- Wk . This method of determining the enzymatic activity is similar to that described by M. Kunitz, J. Gen. Physiol., 30, 291 (1947).

Beispiel 19Example 19

Zu einer Lösung von 10 g Penta-N-^N-oxopyridyl-(3)-methyloxycarbonyl/-colistin in 2 Liter einer auf pH 6 gepufferten Lösung setzt man 3 g von B. subtiliß gebildeter alkalischer Protease (Gehalt 9,5 Einhoiten/mg) zu und rührt das Pujaktionnnedium bei 21 0C 3 Stunden. Gleich anschliessend stellt man das Reaktionsinedium durch Zugabe von 1n-Salzcäure auf pH 3 ein und trennt den unlöslichen £ Bestandteil durch Filtrieren ab.3 g of B. subtly formed alkaline protease (content 9.5 units / mg) and stir the Pujaktionnnedium at 21 0 C for 3 hours. Immediately thereafter, the reaction medium is adjusted to pH 3 by adding 1N hydrochloric acid and the insoluble constituent is separated off by filtration.

Die Lyophilisation der so erhaltenen Lösung ergibt einLyophilization of the solution thus obtained gives a

■2■ 2

cremefarbenes Pulver (14,6 g), das in 200 cm destillier-cream-colored powder (14.6 g), which is distilled in 200 cm

tem Wasser gelöst wird» Zu der Lösung setzt man 200 cm Harz DOWEX 1 χ 2 (OH") zu. Han hält das Gemisch 1 Stunde in Bewegung, filtriert, wäscht das Harz mit 600 cm destilliertem Wasser und lyophilisiert die wässrige Phase. Man erhält ein cremefarbenes Pulver (8,5 g), das man in 150 cm Methanol aufnimmt· Man rührt 1/2 Stunde. Man trennt das unlösliche Material durch Filtrieren ab und wäscht es dreimal mit je 50 cm Methanol. Man engt dasis dissolved in water. »Add 200 cm to the solution Resin DOWEX 1 χ 2 (OH ") to. Han keeps the mixture in motion for 1 hour, filtered, washed the resin with 600 cm of distilled Water and lyophilizes the aqueous phase. A cream-colored powder (8.5 g) is obtained, which is in 150 cm of methanol is taken up · The mixture is stirred for 1/2 hour. Man separates the insoluble material by filtering and washing it three times with 50 cm of methanol each time. You narrow it down

BAD ORiGlNAl. 109808/2274 BAD ORiGlNAl. 109808/2274

PiItrat unter vermindertem Druck (20 mm Hg) "bei 50 0C zur Trockne ein. Der erhaltene feste Rückstand (8,1 gj wird in 20 ein einer Metiianol-Dioxan-Lösiing (95:5 Volumina) gelöst, und die lösung wird an einer Kolonne von 138 g KiGsel£5äure (Höhe der Säule: 75 cm, Durchmesser: 2,2 cm) chromatographiert.. PiItrat (20 mm Hg) "at 50 0 C to dryness The solid residue obtained (8.1 gj under reduced pressure in 20 a a Metiianol-dioxane Lösiing (95: dissolved 5 volumes) and the solution is applied to a column of 138 g of KiGsel £ 5 acid (height of the column: 75 cm, diameter: 2.2 cm) was chromatographed.

Man eluiert mit einem Methanol-Dioxan-Gemisch (95:5 Vo-It is eluted with a methanol-dioxane mixture (95: 5 vol.

lurnina) lind sammelt Fraktionen von 50 cm ·lurnina) lind collects fractions of 50 cm

Die Fraktionen 22-bis 60 werden vereinigt und unter vermindertem Druck (20 mm Hg) "bei 50 0O zur Trockne eingeengt. Man erhält so 3,25 gCyclo- ■/li-^-L-c^,j)-diaminol5utyryl-l^)^-oxopyridyl-(3)-methyl oxycarhonynj^-lr^j^-diaiaino butyryl-D-lQucyl-L-leucyl-N-^-^%-oxopyridyl-(3)-methyl-Fractions 22 to 60 are combined and concentrated at 50 0 O to dryness under reduced pressure (20 mm Hg) "thus obtained 3.25 gCyclo- ■ / li -. ^ - ^ Lc, j) -diaminol5utyryl-l ^ ) ^ - oxopyridyl- (3) -methyl oxycarhonynj ^ -lr ^ j ^ -diaiaino butyryl-D-lQucyl-L-leucyl-N - ^ - ^% - oxopyridyl- (3) -methyl-

methyloxycarbony]^-L-ut,^-diamino"butyryl-L-threonylV .methyloxycarbony] ^ - L-ut, ^ - diamino "butyryl-L-threonylV.

Die in diesem Beispiel verwendete, auf pH 6 gepufferte Lösung wird wie in Beispiel 18 angegeben hergestellt, und die Definition des Enzymtiters ist die gleiche, wie sie in Beispiel 18 angegeben ist·The solution used in this example, buffered to pH 6, is prepared as indicated in Example 18, and the definition of the enzyme titer is the same as it is given in example 18

Beispiel 20Example 20

Zu einer lösung von 3,17 g Penta-N-(/F-oxopyriäyl-(3)-methyloxycarbonylT"-polymyxin B in 634 cm einer aitf pH 6 gepufferten lösung set ist man 1,02 g von B. subtilis gebildeter alkalischer Protease (Gehalt 9,5 Einheiten/mg) zu und rührt das Eeaktionsgemisch 3 Stunden bei 22 0C, Sogleich anschliessend stellt man das Reaktionsmedium durch Zugabe von 1n-Salzsäure auf pH 3 ein. Man trennt das unlösliche Material durch Filtrieren ab und engt das Filtrat dann unter vermindertem Druck (20 mm Hg) bei 50 0C aur Trockne ein· Man erhält ein cremefarbenesTo a solution of 3.17 g of penta-N- ( / F-oxopyriayl- (3) -methyloxycarbonylT "-polymyxin B in 634 cm of a pH 6 buffered solution set is 1.02 g of alkaline protease formed by B. subtilis (content 9.5 units / mg) and stir the Eeaktionsgemisch 3 hours at 22 0 C, then immediately trips, the reaction medium by the addition of 1N hydrochloric acid to pH 3 a., the insoluble material is separated by filtration, and the filtrate concentrated then under reduced pressure (20 mm Hg) at 50 0 C aur · dryness to give a cream-colored

10981)8/227410981) 8/2274

Pulver, das in 60 cm destilliertem Wasoer gelöst wird. Zv. der Lösung setzt man 60 cm^ Amberlite IRA 400 (Form: OH ) zu. Man hält dao Gemisch 1 Stunde in Bewegung, filtriert, wäscht das Harz mit 200 cn destilliertem V/asser und lyophilisiert die v/ässrige Phase. Man erhält eine Festsubstanz, die man in 50 cm Methanol aufnimmt. Man rührt 1/2 Stunde. Man trennt das unlösliche Material durch Filtrieren ab und wäscht es dreimal mit je 15 cm Methanol. Man engt dao FiItrat unter vermindertem Druck (20 mm Hg) bei 50 0C zur Trockne ein. Der erhaltene feste Rückstand wird in 5 cm einer Methanol-Dioxan-Lösung (95i5 Volumina.) gelöst, und die Lösung wird an einer Säule von Kieselsäure (Höhe: 70 am, Durchmesser: 1,8 cm) Chromatographie rt , Man eluiert mit einem Methanol~Dioxan-Gemisch (95s5 Volumina) und sammelt Fraktionen von 25 cm Man erhält so Cyclo- |n-"6-L- ^,^-diaminobutyryl-N-j'-^foxopyridyl-(3 J-methyü nxycar bonylT-L-öf.^ ~diaminobutyryl-D~Powder to be dissolved in 60 cm of distilled water. Zv. 60 cm ^ Amberlite IRA 400 (form: OH) is added to the solution. The mixture is kept in motion for 1 hour, filtered, the resin is washed with 200 cn of distilled water and the aqueous phase is lyophilized. A solid is obtained which is taken up in 50 cm of methanol. The mixture is stirred for 1/2 hour. The insoluble material is separated off by filtration and washed three times with 15 cm of methanol each time. The mixture is concentrated dao FiItrat under reduced pressure (20 mm Hg) at 50 0 C to dryness. The solid residue obtained is dissolved in 5 cm of a methanol-dioxane solution (95.5 volumes.), And the solution is chromatographed on a column of silica (height: 70 am, diameter: 1.8 cm), eluting with a Methanol ~ dioxane mixture (95-5 volumes) and collects fractions of 25 cm. This gives cyclo- | n- "6-L- ^, ^ - diaminobutyryl-N-j '- ^ foxopyridyl- (3 J-methyü nxycar bonylT- L-öf. ^ ~ Diaminobutyryl-D ~

]-/Έ~ού, opyridyl- (3) -methyloxy- tl-f ~^F~oxopyridyl~( 3 )- ] - / Έ ~ ού, opyridyl- (3) -methyloxy- tl-f ~ ^ F ~ oxopyridyl ~ (3) -

methyloxycarbonylT'-Irot, $-diaminobutyryl-L-threonyli ·methyloxycarbonylT'-Irot, $ -diaminobutyryl-L-threonyli

Hf = 0,27 ^ilicagelj n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (50:20:6:24 VoluminaJ7·Hf = 0.27 ^ ilicagelj n-butanol-pyridine-acetic acid-water (50: 20: 6: 24 volumesJ7 ·

Die in diesem Beispiel verwendete, auf pH 6 gepufferte Lösung wird wie in Beispiel 18 hergestellt, und die Definition des Enzymtiters ist die gleiche, wie sie in Beispiel 18 angegeben ist·The one used in this example, buffered to pH 6 Solution is prepared as in Example 18 and the definition of the enzyme titer is the same as that in Example 18 is specified

Beispiel 21Example 21

Zu einer Lösung von 55 mg Penta-K-^-oxopyridyl-(4)-methyloxycarbonylT-colistin,» hergestellt wie in Beispiel 16, in 12 enr einer auf pH 6 gepufferten Lösung (hergestellt wie in Beispiel 18), setzt man 12 mg von B« sub- tilie TEE H gebildete Protease zu und rührt das Beak-To a solution of 55 mg of penta-K - ^ - oxopyridyl- (4) -methyloxycarbonylT-colistin, »prepared as in Example 16, in 12 mg of a solution buffered to pH 6 (prepared as in Example 18), 12 mg are added Protease formed by B «sub- tile TEE H and stirs the Beak-

BAD ORIGINALBATH ORIGINAL

10 9 8 0 8 / :> 2 " : i10 9 8 0 8 /:> 2 " : i

■ : - - 23 - ι;-' ■■■■."■: - - 23 - ι; - '■■■■. "

tionsgeniiBchbei 20 0C 2 1 /2 Stunden. Sogleich anschlies cend bricht man die Reaktion ab, indem man die Lösung durch Zugabe von In-SaIzsäure auf pH 3 bringt. Das auf -70 0C abgekühlte Reaktionsgemisch wird lyophilisiert.tionsgeniiBchbei 20 0 C for 2 1/2 hours. Immediately afterwards, the reaction is terminated by bringing the solution to pH 3 by adding in hydrochloric acid. The cooled to -70 0 C the reaction mixture is lyophilized.

·'-'■■ 3 Der erhaltene feste Rückstand wird in 4 cm Methanol gel tint und an einer Säule, die 5 g Silicagel in ihrem unteren Teil und 5 g Aluniniumoxyd in ihrem oberen Teil enthält (DurchmeuBer der Säule: 10 mm, Höhe: 30 cm), chrociatoßraphiert. Man eluiert mit einem Gemisch Methanol-Dioxan (95s5 Volumina), wobei man Fraktionen von 4 car5 Banuaelt. Die Fraktionen 8 bis 11 werden vereinigt und dann unter vermindertem Druck (15 mm Hg) bei 50 0C zur Troclme eingeengt.· '-' ■■ 3 The solid residue obtained is gel tinted in 4 cm of methanol and applied to a column containing 5 g of silica gel in its lower part and 5 g of aluminum oxide in its upper part (diameter of the column: 10 mm, height: 30 cm), chrociatus-graphic. It is eluted with a methanol-dioxane mixture (95-5 volumes), fractions of 4 car 5 Banuaelt. Fractions 8 to 11 are combined and then under reduced pressure (15 mm Hg) at 50 0 C evaporated to Troclme.

Man erhält so 10 nig Cyclo-This gives 10 nig of cyclo-

i-^-oxopyridyl- (4) -nethyloxycarbonyl^-^jP-diaminobut yryl-P-leucyl-L-leucyl-ii-i-^iT-oxopyridyl-(4 )-methy loxycarbonylj L-oi,J-diarainobutyryl-H-/-<JT-oxopyridyl-(4)-methyloxycarbonyl7-L-ei,g-diaminobutyryl-L-threonyl| ·i - ^ - oxopyridyl- (4) -nethyloxycarbonyl ^ - ^ jP-diaminobut yryl-P-leucyl-L-leucyl-ii-i- ^ iT-oxopyridyl- (4) -methy loxycarbonylj L-oi, J-diarainobutyryl- H - / - < JT-oxopyridyl- (4) -methyloxycarbonyl7-L-ei, g-diaminobutyryl-L-threonyl | ·

Rf = 0,24 ^ilicagel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (50:20:6:24 VoluninaJ/·Rf = 0.24 ^ ilicagel; n-butanol-pyridine-acetic acid-water (50: 20: 6: 24 VoluninaJ / ·

Die Struktur der Produkte der allgemeinen Formel I, sowie gleichzeitig die Wirksamkeit dee Verfahrens wurden nachgewiesen, indem aus Produkten der allgemeinen Formel I bereits bekannte und bisher durch Fermentation erhaltene Polymyxine synthetisiert wurden»The structure of the products of the general formula I, as well as the effectiveness of the process have been proven, by already known from products of the general formula I and obtained so far by fermentation Polymyxins were synthesized »

Man stellt beispielsweise das Polymyxin E-, das auch Colistin genannt wird, durch Umsetzung des Produkts der allgemeinen Formel I, für welche die Symbole Y und Z j D-Leucin bzw· L-Leucin bedeuten und das Symbol G einen N-0xopyridyl-(3)*-methyloxycarbonylrest darstellt7For example, one puts the polymyxin E-, that too Colistin is called by reacting the product of general formula I, for which the symbols Y and Z j mean D-leucine or L-leucine and the symbol G represents an N-oxopyridyl- (3) * - methyloxycarbonyl radical7

109808/2274109808/2274

mit einem Produkt der allgemeinen Formelwith a product of the general formula

NHR1 CH5 NHR1 NHR 1 CH 5 NHR 1

CH5 (CH2)2 CHOH (CH2 )g CH 5 (CH 2 ) 2 CHOH (CH 2 ) g

C9Hp-CH -(ClI9)^-CO-IIK- CH - CO-IIH- CH - CO-NH-CH -CO-RpC 9 Hp-CH - (ClI 9 ) ^ - CO-IIK- CH - CO-IIH- CH - CO-NH-CH -CO-Rp

in welcher das Symbol R1 eine nydrogeriolyseempfindliohe Schutzgruppe der Aniinofunktionen, wie beispielsweise eine Benzyloxycarbonylgruppe oder eine Gruppe der allgemeinen Formel II, bedeutet und R9 eine in der Peptidchemie übliche Aktivierungsnruppe für die Carbonylfunktion, wie beispielsweise eine Azidogruppe, die aus dem entsprechenden Hydrazid durch Einwirlrung von salpetriger Säure erhalten ist, darstellt, her. Nach Entfernung der Schutzgruppen erhält man ein Produkt, das mit dem durch Fermentation erhaltenen Polymyxin E1 identisch ist.in which the symbol R 1 denotes a hydrogeriolysis-sensitive protective group of the amino functions, such as a benzyloxycarbonyl group or a group of the general formula II, and R 9 denotes an activation group for the carbonyl function that is customary in peptide chemistry, such as an azido group, which is obtained from the corresponding hydrazide by induction is obtained from nitrous acid. After removing the protective groups, a product is obtained which is identical to the polymyxin E 1 obtained by fermentation.

Beispiel 22Example 22

Zu einer Lösung von 63 mg ίϊ-^.-6-Methyloctanoyl-N-^-benzyloxycarbonyl-L-oC, ^-diaminobutyryl-L-threonyl-N-j' -benzyl oxycarbonyl-L-^-jtf-diaminobutyrylhydrazid /nergestellt nach der Methode von K. Vogler u. Mitarb., HeIv, Chim. Acta 40, 1161 (1965J7 in einem Gemisch von 1,6 cm Essigsäure und 0,178 cm5 1n-Salzcäure, die auf 0 0C abgekühlt ist, setzt man 6,2 mg Natriumnitrat in Lösung in 0,1 cm destilliertem Wasser zu, Nach 20-minütigem Rühren bei O0C wird das Reaktionsgemisch in 20 cm eiskaltes destilliertes Wasser gegossen. Es tritt ein weisser Niederschlag auf, den man bei 0 0C abfiltriert und mit 20 cnr eiskaltem destilliertem Wasser wäscht. Dieser Niederschlag v/ird zu einer eiskalten Lösung von 100 mg Cyclo-JH-^-L~c^,3-diaminobutyryl-N-^-^-oxopyridyl-(3 )-methyloxycarbonyl/r-3rüt,^ -diaminobutyryl-D-leucyl-L-leucyl-N-^-/N-oxopyridyl-(3)-methyloxycarbonylJ-L-o^g'-diaminobutyryl-N-^-^f-oxopyridyl-(3 )-methyloxycarbonylT'-lio-y -diaminobutyryl-L-threonyl J-To a solution of 63 mg ίϊ - ^ .- 6-methyloctanoyl-N - ^ - benzyloxycarbonyl-L-oC, ^ -diaminobutyryl-L-threonyl-Nj '-benzyl oxycarbonyl-L - ^ - jtf-diaminobutyrylhydrazide / n prepared according to the Method by K. Vogler and colleagues, HeIv, Chim. Acta 40, 1161 (cm 1965J7 in a mixture of 1.6 acetic acid and 0.178 cm 5 1n-Salzcäure which is cooled to 0 0 C, it is 6.2 mg of sodium nitrate in solution in 0.1 cm of distilled water is added, After stirring for 20 minutes at 0 ° C is poured the reaction mixture into 20 cm of ice-cold distilled water. It occurs a white precipitate, which was filtered off at 0 0 C and washed with 20 cnr ice-cold distilled water This precipitate v / ith ice-cold to a. Solution of 100 mg cyclo-JH - ^ - L ~ c ^, 3-diaminobutyryl-N - ^ - ^ - oxopyridyl- (3) -methyloxycarbonyl / r -3rüt, ^ -diaminobutyryl-D-leucyl-L-leucyl-N - ^ - / N-oxopyridyl- (3) -methyloxycarbonylJ-Lo ^ g'-diaminobutyryl-N - ^ - ^ f-oxopyridyl- (3) -methyloxycarbonylT'-lio-y -diaminobutyryl-L-threonyl J-

109808/2274109808/2274

BAD ORIGINALBATH ORIGINAL

(erhalten wie in Beispiel 17) in 5 cm Dimethylformamid zugegeben. Nach 20 Stunden Stehenlassen bei 2 G wird das Reaktionsgemisch unter vermindertem Druck (0,3 mm Hg) bei 60 0C zur Trockne eingeengt. Man nimmt das erhaltene 01 in 20 cm Äther auf« Es bildet sich ein Niederschlag,(obtained as in Example 17) was added in 5 cm of dimethylformamide. After 20 hours standing at 2 G, the reaction mixture (0.3 mm Hg) at 60 0 C and concentrated under reduced pressure to dryness. The 01 obtained is taken up in 20 cm of ether. "A precipitate is formed,

■-■'■■■■■■' ' 3■ - ■ '■■■■■■' '3

den man abfiltriert und zweimal mit je 10 cm V/asser wäscht.which is filtered off and twice with 10 cm V / water each washes.

Nach Trocknen unter vermindertem Druck (0,3 mm Hg) bei 20 0C erhält man 106 mg Cyclo- ί 3J-^-(N-ot-6-methyl-After drying under reduced pressure (0.3 mm Hg) at 20 0 C, 106 mg of cyclo- 3J - ^ - (N-ot-6-methyl-

0 c t anoy 1 -N-^-benzyl oxyc ar b onyl-L-oZ-, $-d i aminobut yryl-I-threonyl-H-2 -benzyloxycarbonyl-L-^j^-diäminobutyryl )-N- $-L-Φ^ -diaminobutyryl-N-^-^-oxopyridyl- (3 J-methj'ioxycarbonyl7~I'- ϋ-, ϊ -diaminobut yryi-D-leucyl-L-l.eucyl-H-f-{N-oxopyridyl-(3 )-methyloxycarbonyl7-L·-öi, ^-diaminobutyryl-N-i- ^-oxopyr idyl-(3 )-methyloxycarbonyl7-Ii-<*, if-diaminobutyryl-L-threonylj· 0 ct anoy 1 -N - ^ - benzyl oxycar b onyl-L-oZ-, $ -di aminobut yryl-I-threonyl-H-2 -benzyloxycarbonyl-L- ^ j ^ -diäminobutyryl) -N- $ -L -Φ ^ -diaminobutyryl-N - ^ - ^ - oxopyridyl- (3 J-methj'ioxycarbonyl7 ~ I'- ϋ -, ϊ -diaminobut yryi-D-leucyl-Ll.eucyl-Hf- {N-oxopyridyl- (3 ) -methyloxycarbonyl7-L · -öi, ^ -diaminobutyryl-Ni- ^ -oxopyridyl- (3) -methyloxycarbonyl7-Ii - <*, if-diaminobutyryl-L-threonylj ·

Ef = 0,51 ^/Silicagel; n-Butanol-Pyridin-Esslgsäure-Wasaer (50:20:6:24 VoluminaJ/·Ef = 0.51 ^ / silica gel; n-Butanol-Pyridine-Acid-Wasaer (50: 20: 6: 24 volumesJ / ·

Beispiel 23Example 23

Zu einer Lösung von 90 mg Cyclo- -[N~oir-(N-ot-6-methyloctanoyl-N-^-benzyloxycarbonyl-1-Qi·,^-diamino butyryl-L-threonyl-N-i-benzyloxycarbonyl-L-^j^-diaminobutyryl)-l- ^-L-oi,^-diaminobut yryl-N-^-^¥-oxo pyridyl-(3)-methyl oxycarbonyl7'-L-o(,g -diaminobutyryl-D-leucyl-L-leucyl-N- ^-/iN'-oxopyridyl-CJj-methyloxycarbonylJ-L-0^ ^-diaminobut yryl-N-^-^-oxopyridyl- (3) -methyl oxycarbonyl^ L-oo,y-diaminobutyryl-L-threonylf in 7 cm Methanol undTo a solution of 90 mg of cyclo- [N ~ oir- (N-ot-6-methyloctanoyl-N - ^ - benzyloxycarbonyl-1-Qi ·, ^ - diamino butyryl-L-threonyl-Ni-benzyloxycarbonyl-L- ^ j ^ -diaminobutyryl) -l- ^ -L-oi, ^ - diaminobut yryl-N - ^ - ^ ¥ -oxo pyridyl- (3) -methyl oxycarbonyl7'-Lo (, g -diaminobutyryl-D-leucyl-L- leucyl-N- ^ - / iN'-oxopyridyl-CJj-methyloxycarbonylJ-L- 0 ^ ^ -diaminobut yryl-N - ^ - ^ - oxopyridyl- (3) -methyl oxycarbonyl ^ L-oo, y-diaminobutyryl-L- threonylf in 7 cm of methanol and

1 cm 1n~Salzsäure setzt man 100 mg Palladium-Kohle (mit 3,15 $ Pd) zu und leitet einen schwachen Wasserst off strom 16 Stunden ein. Nach !Filtrieren und Einengen des FiItrats zur Trockne unter vermindertem Druck (25 mm Hg) bei 50 0C wird der erhaltene feste Rückstand100 mg of palladium-carbon (with $ 3.15 Pd) are added to 1 cm of 1N hydrochloric acid and a weak hydrogen stream is introduced for 16 hours. After! Filtration and concentration of the FiItrats to dryness under reduced pressure (25 mm Hg) at 50 0 C, the solid residue obtained

10 9808/227410 9808/2274

in * enr Methanol gelost, und die Lösung wird an einer Säule von 40 g Sephadex IJI 20 (Durchmesser der Säule: 14 mm, Höhe« 1,7 ra) chroraatographiert· Kan eluiert mitdissolved in methanol, and the solution is attached to a Column of 40 g Sephadex IJI 20 (diameter of the column: 14 mm, height «1.7 ra) chroraatographed · Kan elutes with

4« 34 «3

3 Methanol, wobei man Praktionen von 3 ein sammelt· Die Fraktionen 33 bis 35 werden vereinigt und mit 10 cm' destilliertem Wasser verdünnt. Die erhaltene Lösung wird lyophilisiert. Man erhält so 32 mg Colistin-pentahydrochlörid. 3 methanol, whereby one collects practicals of 3 a · The Fractions 33 to 35 are combined and with 10 cm ' diluted distilled water. The solution obtained is lyophilized. This gives 32 mg of colistin pentahydrochloride.

Ef = 0,29 /^ilicagel; n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (50:20:6s24 YoluminaJJ.Ef = 0.29 / ^ ilicagel; n-butanol-pyridine-acetic acid-water (50: 20: 6s24 YoluminaJJ.

Das so regenerierte Colistin ist mit natürlichem Colistin identisch,The colistin regenerated in this way is natural Colistin identical,

Beispiel example 2k2k

Zu einer Suspension von 200 mg Colistin in 10 owr* Dimethylformamid setzt man 400 mg geniäss Beispiel 6 hergestelltes N-Oxo-6-methyl-pyridyl-(2)-met ihyl-p-nitrophenyl-carbonat zu.400 mg of N-oxo-6-methyl-pyridyl- (2) -methyl-p-nitrophenyl carbonate prepared according to Example 6 are added to a suspension of 200 mg of colistin in 10 % dimethylformamide.

Nach 48-stündigem Rühren bei 200C wird die Lösung unter vermindertem Druck (0,3 ron Hg) bei 500C zur Trockne eingeengt. Der glasige Rückstand kristallisiert bei Zugabe von 10 en? Äther. Die Kristalle werden abfiltriert und dann zweimal mit je 3 em*' Äther gewaschen.After 48 hours of stirring at 20 0 C, the solution (0.3 ron Hg) at 50 0 C and concentrated under reduced pressure to dryness. The glassy residue crystallizes on addition of 10 en? Ether. The crystals are filtered off and then washed twice with 3 em * 'ether each time.

Nach Trocknen unter vermindertem Brack (0,3 mm Hg) bei 20°C erhält man 220 mg Penta~H~/N»o.xo»6-niethyl-pyridyl-(2)-methyloxycarbonylZ-col stm.After drying under reduced brackets (0.3 mm Hg) at At 20 ° C., 220 mg of penta ~ H ~ / N »o.xo» 6-niethyl-pyridyl- (2) -methyloxycarbonylZ-col are obtained stm.

Rf = 0,53 /Silicagelj n-Butanol-Fyridin-Essigsäure-Wasser (50 \ 20 : 6 s 2h Vclumina][7·Rf = 0.53 / silica gelj n-butanol-fyridine-acetic acid-water (50 \ 20: 6 s 2h Vclumina] [7 ·

109808/2274109808/2274

Claims (2)

PatentansprücheClaims Y-Z eine der Verkettungen D-Leu-Thr, D-Phe-Leti, D-Löu-I«euUnd D-Leu~Ileu bedeutet undY-Z one of the links D-Leu-Thr, D-Phe-Leti, D-Löu-I «euAnd D-Leu ~ Ileu means and G einen Rest der allgemeinen FormelG is a radical of the general formula _ CH - O CO -_ CH - O CO - darstellt, in der Py einen unsubstituierten oder durch einen Methylreet subQtituierten Pyridyl- oder Pyridyl-H-oxyd-Rest bedeutet und R ein V/asserstoffatom, einen geradkettigen oder verzweigten Alkyl rest mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen oder einen Phenyl rest darstellt, wobei ohne gegenteilige Angabe die Aminosäuren in der !-Konfiguration vorliegen«represents, in which Py is an unsubstituted or by a methylreet substituted pyridyl or Pyridyl-H-oxide radical and R is a hydrogen atom, a straight or branched chain alkyl remainder with 1 to 5 carbon atoms or a phenyl represents the rest, whereby the amino acids are in the! configuration unless otherwise stated « 2. Verfahren zur Herstellung der Produkte nach Anspruch j], dadurch gekennseichnet, dass man ein Polymyxin der allgemeinen Formel 2. Process for the preparation of the products according to claim j] , characterized in that a polymyxin of the general formula is used K-Dab - Ihr - X - Dab - Dab - Y -K-Dab - Your - X - Dab - Dab - Y - Ui)Ui) Z - Dab - Dab - Thr ί Z - Dab - Dab - Thr ί in der K einen n-Octanoyl-, L-6-Methyloctanoyl- oder 6-Met%ylheptanoylrest bedeutet und gleichzeitigin the K is an n-octanoyl, L-6-methyloctanoyl or 6-Met% ylheptanoyl radical means and at the same time 109808/2274109808/2274 Y-Z D-Leu-Thr und X D-Dab oder D-Ser darstellen oder gleichzeitig Y-Z D-Phe-Leu oder D-\Leu-Leu und X Dab darstellen oder K einen L-6-Methyloctanoyl- oder 6-Methylheptanoylrest "bedeutet und gleichzeitig Y-Z D-leu-Ileu und X Dab darstellen, wobei das Symbol G- die oben angegebene Bedeutung besitzt, und, falls das Symbol X Dab darstellt, die S-Aminogruppe dieser Aminosäure durch einen Rest G substituiert ist, einer selektiven enzymatisehen Hydrolyse mit einem Enzym aus der Gruppe der durch die Stämme B.subtilis gebildeten exocellularen Proteasen, wie Subtilisin, Nargase, Pronase, Colistinase oder Alkalase, und der von B.subtilis G-LAXO 417, B. subtilis A*T,C.C. 9524 oder B. subtilis THE 4 gebildeten Proteasen unterzieht·YZ represent D-Leu-Thr and X D-Dab or D-Ser or at the same time represent YZ D-Phe-Leu or D- \ Leu-Leu and X Dab or K represents an L-6-methyloctanoyl or 6-methylheptanoyl radical " and at the same time represent YZ D-leu-Ileu and X Dab , where the symbol G- has the meaning given above, and, if the symbol X represents Dab, the S -amino group of this amino acid is substituted by a radical G, a selective enzymatic hydrolysis with an enzyme from the group of exocellular proteases formed by the B.subtilis strains, such as subtilisin, nargase, pronase, colistinase or alkalase, and that of B.subtilis G-LAXO 417, B. subtilis A * T, CC 9524 or B. . subtilis subjects THE 4 formed proteases 109808/2274109808/2274
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