DD296083B5 - Verfahren zur Herstellung von iodierten Peptiden und Polypeptiden - Google Patents

Description

H₂N-AS₁ AS_n-B Il

A-HN-AS₁ AS_x AS_n-B III

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung von Peptiden/ Polypeptiden, die oxydationsempfindliche Aminosäuren im Verband enthalten, mit dem Ester der Formel I erfolgt.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von iodierten Peptiden und Polypeptiden, wobei die zu iodierenden Peptidketten freie Aminogruppen am N-Terminus oder in der Seitenkette besitzen. Die Anwendungsgebiete der Erfindung sind die pharmazeutische Industrie und die medizinische Diagnostik.

Während der üblichen direkten lodierung von Peptiden und Polypeptiden z. B. mit lodmonochlorid (Mc Farlane, A. S. Nature, 190 53 [1987]), Chloramin T (Greenwood, F. C, Hunter, W. M., Biochem. J. 89 114 [1963]), Natriumhypochlorid (Redshaw, M. R., Lynch. S. 5 BBRC 65 413 [1975]), der lodo-gen-Methode (Traker, P. J., Speck, J. C, BBRC 80 849 [1978]) und auch bei der lodierung mit Lactoperoxidase/H₂O₂ (Brundish, D. E., Martin, J. R., J. ehem. Soc. Perkin I, 1976, 2182) werden die Aminosäuren starken Oxydationsmitteln ausgesetzt. Trotz kurzer Reaktionszeiten treten bei Peptiden mit oxydationsempfindlichen Aminosäuren wie Methionin, Tryptophan, Cystein u. a. zahlreiche Nebenprodukte auf. Das iodierte Peptid wird nach aufwendigen Reinigungsoperationen vom Ausgangsprodukt und den Nebenprodukten abgetrennt und nur in geringer Ausbeute isoliert. Für die lodierung von synthetischen Peptiden ist der Einsatz von iodierten Aminosäuren denkbar (z. B. lodtyrosin, Brundish, D. E., Wade, U., Biochem. J. 165, 169 [1977]). Der Nachteil dieser Synthesen besteht jedoch im hohen Synthese- und Reinigungsaufwand.

Durch das Verknüpfen der 4-Hydroxy-5-iod-phenylpropionsäure über den N-Hydroxysuccinimidester mit der freien Aminosäure eines Peptides läßt sich Iod nachträglich gut in Peptide einführen (Bolton, A. E., Hunter, W. M., Biochem. J. 133 529 [1973]). Das iodierte Peptid ist durch Säulenchromatographie von den Ausgangsprodukten abtrennbar.

Nachteilig für die Anwendung dieses Verfahrens ist vor allem die geringe Stabilität des Hydrosuccinimidesters der p-Hydroxyphenylpropionsäure.

In der DE-OS 2 832 090 wurde über die Reaktion von N(4-Hydroxy-phenylethylcarbonyloxy)-norbom-5-en-2,3-dicarboximid mit Peptiden und die lodierung von Acylpeptiden mit Chloramin-T und Kaliumiodid berichtet.

Die Umsetzung von N(4-Hydroxy-5-iod-phenyl-ethylcarbonyloxy)-norborn-5-en-2,3-dicarboximid mit Peptiden ist bisher nicht beschrieben worden.

Es ist das Ziel der Erfindung, der pharmazeutischen Industrie und der medizinischen Diagnostik iodierte Peptide und Polypeptide zur Verfügung zu stellen, die sich nach einem vorteilhaften Verfahren herstellen lassen.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu entwickeln, nach dem sich Peptide und Polypeptide in ihre lodderivate überführen lassen. Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, daß freie Aminogruppen enthaltende Peptide oder Polypeptide der allgemeinen Formeln Il oder III mit N(4-Hydroxy-5-iod-phenyl-ethycarbonyloxy)-norbom-5-en-2,3-dicarboximid der Formel I, in der I auch für Iod¹²⁵ steht, umgesetzt oder mit N(4-Hydroxy-phenyl-ethylcarbonyloxy)-norborn-5-en-2,3-dicarboximid der Formel IV acyliert und die Acylpeptide bzw. polypeptide anschließend iodiert werden.

A-HhMS₁ - -A V...

Die zu iodierenden Peptidketten können aus beliebigen Aminosäureresten bestehen und die zu acylierenden Aminogruppen am N-Terminus oder in der Seitenkette stehen. In den Verbindungen der allgemeinen Formeln Il oder III können die Aminosäurereste AS₁ bis AS_n beliebige Reste und AS_x eine Aminosäure mit einer NH₂-Gruppe in der Seitenkette (z. B. Lysin) sowie A und B in der Peptidchemie übliche Schutzgruppen oder auch andere organische Reste sein. Die Peptidketten können auch Cystein, Tyrosin, Methionin, Histidin und auch Tryptophan enthalten.

Zur Acylierung der Aminogruppen wurde ein aktivierter Ester der p-Hydroxyphenylpropionsäure hergestellt, der ohne großen Aufwand in guter Ausbeute und großer Reinheit anfällt, lagerstabil ist und sich in guten Ausbeuten während derAcylierungsreaktion umsetzen läßt (Formel IV). Für die nachträgliche lodierung von Peptiden mit oxydationsempfindlichen Aminosäuren im Peptidverband (z. B. Methionin, Tryptophan und Cystein) wird IV vor der Anknüpfung an die freie Aminogruppe des Peptides mit Chloramin T und Kaliumiodid zum Monoiodderivat I umgewandelt, chromatographisch über HPLC an RP 18 von dem als Nebenprodukt entstehenden Diiodprodukt abgetrennt und mit dem Peptid zum lodderivat quantitativ im 2- bis 3fachen Überschuß umgesetzt. Durch diese Verfahrensweise tritt kaum Verlust an Peptid auf.

Überraschenderweise wurden folgende Effekte festgestellt: Die entsprechenden ONB-Ester sind in wässriger Lösung stabiler als die Hydroxysuccinimidester und liefern weniger Nebenprodukte. Die Hydrolysestabilität der ONB-Ester ist im Vergleich zu den bekannten Hydroxysuccinimidestern um den Faktor 10 erhöht. Darüber hinaus sind sie im Gegensatz zu den Hydroxysuccinimidestern bei Raumtemperatur unbegrenzt haltbar.

Sind im Peptidverband keine oxydationsempfindlichen Aminosäuren vorhanden, so kann das Peptid erst mit dem N-Hydroxy-norborn-S-en^S-dicarboximidester der Hydroxyphenylpropionsäure-Formel IV nach o. g. Verfahrensweise acyliert und anschließend mit Chloramin T und Kaliumiodid bzw. K¹²⁵ zum lodderivat modifiziert werden. Die Abtrennung des als Nebenprodukt entstehenden Diiodderivates gelingt ohne Probleme über die Endreinigung durch die HPLC an RP 18.

Anwendungsbeispiele

Beispiel 1: N(4-Hydroxy-phenyl-ethylcarbonyloxy)-norborn-5-en-2,3-dicarboximid III 1,66 g (10 mMol) Hydroxyphenylpropionsäure und 1,79 g (10 mMol) N-Hydroxy-norborn-S-en^.S-dicarboximid (HON) werden in ml Tetrahydrofuran (THF) gelöst, auf 0 "C gekühlt, mit 2,475 g (12 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid versetzt und über Macht in den Kühlschrank gestellt. Der Ansatz wird mit 2 Tropfen verdünnter Essigsäure versetzt und 30 Min. bei Raumtemperatur gerührt. Der ausgefallene Harnstoff wird abgetrennt und mit 2 ml Portionen THF zweimal gewaschen. Die gereinigten Filtrate werden eingeengt.

Dabei anfallender Harnstoff wird vorher abgetrennt. Das resultierende Öl wird mit Ether versetzt, nochmals eingeengt und der entstandene Feststoff aus Ethanol umkristallisiert.

Ausbeute: 2,9 g 88,6 %

weiße Kristalle Fp.: 141-142°

M^-C₁₈H₁₇NO₅ 327,1108 Charakterisierung der Substanz durch den Molekülionenpeak in der Massespektroskopie

Beispiel 2: N(4-Hydroxy-5-iod-phenyl-ethylcarbonyloxy)-norbom-5-en-2,3-dicarboximid IV Zu 32 mg (97,8 μΜοί) N(4-Hydroxy-phenylethylcarbonyloxy)-norborn-5-en-2,3-dicarboximid III in 500 μΐ Dioxan werden 9 mg (54 μΜοί) Kaliumiodid in 200 μΙ Natriumacetatpuffer pH 7,5 (0,25 molar) gegeben, mit 11 mg (48,9 μΜοί) Chloramin T in 500 μΐ Ammoniumacetatpuffer versetzt und 30 see gerührt. Die Reaktion wird mit 3,7 g (24 μΜοί) Dithioerithritol gestoppt, die klare Reaktionslösung in die HPLC injiziert und die entsprechende Fraktion nach Chromatographie an Vydac RP 18 abgetrennt.

Ausbeute: 10 mg 46 % (nach zweimaliger Lyophilisation)

M*.C₈H₁₆NO₅ 453,0079 Charakterisierung durch die Massespektroskopie

Beispiel 3:4-Hydroxy-5-iod-Phenyl-ethylcarbonyl-Asp-Tyr(SO3Na) -Met-Gly-Trp-Met-at-Asp-PheNH., 10 mg (22 μΜοί) N(4-Hydroxy-5-iod-phenyl-ethylcarbonyloxy)-norborn-5-en-2,3-dicarboximid werden zu 10 mg (8,58 μΜοί) Asp-Tyr(SO₃Na)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH₂ in 100 μΙ DMF und 100 μΙ Pyridin in Gegenwart von 2 μΙ Hünig-Base (N₁N'-Diisopropylethylamin) gegeben und 8 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, der Ansatz in die HPLC injiziert, die entsprechende Fraktion abgetrennt und zweimal lyophilisiert

Ausbeute: 9 mg 77,5 %

Molmasse: 1 415

Aminosäureanalyse: Asp 2,0 (2,0), Туг 0,8(1)

Met 1,95 (2), GIy 1 (1), Trp 0,85 (1), Phe 0,94 (1)

Die Anwesenheit des 4-Hydroxy-5-iod-phenyi-ethylcarbonyl-Restes konnte durch die Massespektroskopie bewiesen werden: Sequention: C₉H₇O₂J 273,9495

C₈H₇OJ 245,9742

Beispiel 4:4-Hydroxy-phenyl-ethylcarbonyl-Asp-Tyr(S0₃Na)-Nle-Gly-Trp-Nle-Asp-Phe-NH2 20 mg (17,7 μΜοί) H-Asp-Tyr(SO₃Na)-Nle-Gly-Trp-Nle-Asp-Phe-NH₂ werden in 200 μΙ Pyridin und 100 μΙ DMF gelöst, mit 6 μΙ (35 μΜ) Hünig-Base versetzt und mit 11,8 mg (36 μΜοΙ) N(p-Hydroxy-phenyl-ethylcarbonyloxy)-norborn-5-en-2,3-dicarboximid addiert.

Nach acht Stunden Reaktionszeit wird der Ansatz in die HPCL injiziert, die entsprechende Fraktion abgetrennt, anschließend eingeengt, mit wenig Wasser aufgenommen und lyophilisiert.

Ausbeute: 17 mg (69 %) nach zweimaligem Lyophilisieren.

Aminosäureanalyse:

Asp 1,8 (2) Туг 0,8 (1) Nie 2,2 (2) GIy 0,85 (1) Trp 0,75 (1) Phe 0,94 (1)

Die Anwesenheit des p-Hydroxy-phenylpropionyl-Restes wurde durch die Massespektroskopie nachgewiesen (siehe Beispiel 1).

HPLC-Bedingungen:

Die Substanzen werden über Vydac RP 18 (15-20 m) in einer Säule (20 mm i. D. χ 250 mm) in folgenden Elutionsmitteln gereinigt:

Beispiel 1 und 2:

Fluß: 20 ml/min, UV-Detektion: 220 nm

Laufmittel:

- Beispiel 1: A = 2 000 ml 0,025 M Ammoniumacetat pH 6

B = Methanol

Gradient: 25 % B während 8 min auf 26 % Retentionszeit: 14,5-20,5 min gesammelt

- Beispiel 2: A:B, 50:50 Retentionszeit: 8,3-15,6 min gesammelt Analytik: Laufmittel siehe Beispiele 1 und 2

- Beispiel 3: R₁ = 8,2 min einheitlich

- Beispiel 4: R₁ = 16,6 min einheitlich Säulendimension: 4,6 mm i. D. χ 250 mm, Vydac RP 18 (15-20 m)

Claims (1)

1. Verfahren zur Herstellung von iodierten Peptiden und Polypeptiden, dadurch gekennzeichnet, daß freie Aminogruppen enthaltene Peptide oder Polypeptide der allgemeinen Formel Il oder IM, in denen AS₁ bis As_n beliebige Aminosäurereste und As_x eine Aminosäure mit einer H₂N-Gruppe in der Seitenkette sowie A und B in der Peptidchemie übliche Schutzgruppen oder andere organische Reste bedeuten, mit N^-Hydroxy-S-iod-phenyl-ethylcarbonyloxyJ-norborn-S-en^S-dicarboximid der Formel I, in der * für Iod¹²⁵ steht, umgesetzt werden.

CH₂-CH₂-C-O-N