JP2736214B2 - インシュリン含有溶液の取得法 - Google Patents
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Description
および/またはA9位アセチル化インシュリンを含まな
いインシュリンを得る方法に関する。
でのインシュリンまたはインシュリン誘導体の精製は、
分析的分離法で既知であり、長期にわたって高圧液体ク
ロマトグラフィー(HPLC)において用いられ成功してき
た(WS Welinderら、 J.Chrom.,361,(1986)357〜367)。
分析スケールでは、μgの範囲の蛋白を改変シリカゲル
を充填したスチール、ガラスまたはプラスチックのカラ
ムに添加し、続いて混合液(一定濃度のまたは濃度を変
えた有機溶媒を含む主に酸性、水性緩衝液)を流して溶
出させる。このタイプの分離では、負荷する蛋白は、実
質的にカラム容積の1ml当たり30μgより少ない。
断または酵素的ペプチド転移反応および結晶化による精
製で得られるインシュリンは、通常同様な特性を有する
付随物質を含んでいる。電荷の適切な差異が存在する場
合は、それらは、特定のpHを選んでイオン交換クロマ
トグラフィーによって精製することができる(米国特許
第4,129,560号)。この方法の欠点は希釈の影
響、およびその結果、重要な物質が比較的長時間に及ぶ
沈殿物の操作中に上清中に失われ、全体的な回収が減少
し、したがって収量が減少するという事実にある。
ン調製物には、しばしばインシュリンの作用時間を延長
させるプロタミンが含まれている。プロタミンは、魚類
の精子から得られる、アルギニンに富む蛋白である。持
続性インシュリン調製物の品質試験では、調製物をしば
らく貯蔵した後、説明のつかない持続性の消失が通常認
められた。そのようなインシュリンの使用は容易にイン
シュリン過剰投与につながり、それは場合によっては、
低血糖ショックに続いて患者の死亡に結び付くので、そ
のようなインシュリン調製物は患者にとって全く不適切
なものである。
究したところ、当該持続性の消失は、痕跡量のプロテア
ーゼによりプロタミンが徐々に分解されて起こることが
示された。さらに、これらの調製物中のプロテアーゼの
大半は、ブタインシュリンをヒトインシュリンエステル
/エーテルとするための酵素的ペプチド転移、またはイ
ンシュリン様前駆物質の開裂のための蛋白分解反応に起
因することが分かった。殆どのプロテアーゼ、例えばト
リプシンは、慣用的に用いられるクロマトグラフィー工
程によって分離除去されるが、残余量のプロテアーゼが
インシュリン調製物中に残留し、持続特性の消失につな
がることは明白である。
は、インシュリンのA9位に位置するセリンも、副産物
として微生物によってアセチル化されており、セリンヒ
ドロキシル基がアセチル化されているインシュリン誘導
体が形成される。このインシュリン誘導体は、したがっ
てこれまでのところ大腸菌(Escherichia coli)を用い
た遺伝子工学によるインシュリン調製物においてのみ認
められる。 このアセチル化インシュリン誘導体のヒトイ
ンシュリンからの完全な分離は、欧州特許出願(公告番
号第474,213号)に記載された方法を用いた場
合、これまでのところ、ヒトインシュリンの収量の低下
という犠牲を払って初めて達成できる。さらに、この方
法では、アセチル化インシュリンの濃度が5%を越える
場合は、分離を行うことができないことが明白である。
のみならず、この方法を用いて実質的にプロテアーゼを
含まないインシュリンを得ることは現実的に不可能であ
る。
衝溶出液で、親油性に改変したシリカゲル上でクロマト
グラフィーを行うことにより、プロテアーゼおよび/ま
たはA9位アセチル化インシュリンを実質的に含有しな
いインシュリンを得る方法が見いだされた。この方法
は、 1A) プロテアーゼおよび/またはA9位アセチル化
インシュリン並びにインシュリンの混合物を緩衝液に溶
かし、 1B) 双性イオンを含み、場合によってを精製しよう
とするインシュリンの等電点付近にpH調整した、緩衝
溶出液で溶出を行い、得られたインシュリン分画を必要
に応じて濃縮し、続いて得られたインシュリン分画を、 2A) アセトンまたはアセトニトリルを含む溶解緩衝
液に溶かし、 2B) 得られた溶液をカラムに加え、 2C) 該カラムを溶解緩衝液で洗浄し、 2D) 精製しようとするインシュリンを、双性イオン
を含み、場合によってpHを精製しようとするインシュ
リンの等電点付近に調整した、緩衝溶出液で溶出する。
緩衝液にアセトンまたはアセトニトリルが存在すること
によって、インシュリンからのプロテアーゼまたはA9
位アセチル化インシュリンの分離が顕著に改善され、し
たがって、プロタミン含有インシュリン製剤について述
べたような問題はもはや起こり得ない。
ル化インシュリン並びにインシュリンから成る、精製す
べき混合物は、多数の酵素的な過程、例えばプレプロイ
ンシュリン(preproinsulins)のプレシーケンス(pre-se
quences)および/またはプロシーケンス(prosequences)
の蛋白分解反応による除去、インシュリンのC末端もし
くはN末端アミノ酸の除去またはブタインシュリンをヒ
トインシュリンもしくはヒトインシュリン誘導体とする
ペプチド転移反応から生じる。さらに、精製すべき混合
物に含まれるA9位アセチル化インシュリンは、遺伝子
工学の手法によって発現させた多数のインシュリン構成
物から生じる。
ゼは、例えばトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、
カルボキシペプチダーゼA、クロストリパイン(clostr
ipain)またはアクロモバクター(achromobacter)プロテ
アーゼである。 好ましいものはトリプシンである。
ュリンと見做される。すなわち動物もしくはヒト由来イ
ンシュリン(例えばヒトインシュリンまたはブタインシ
ュリン)、インシュリン前駆体(例えばプロインシュリ
ンまたはプレプロインシュリン)、または遺伝的に改変
された微生物によって発現された組み換えインシュリン
もしくはインシュリン誘導体である。さらに、インシュ
リン誘導体では、例えば化学的または酵素的な誘導反応
によって調製されたもの(例:des−Phe−B1−
インシュリン、インシュリン−β−ケテンスルホネー
ト、ジアルギニンインシュリン(B31, B32)、モノ
アルギニンインシュリン、ジフェニルアラニンインシュ
リン(B31, B32)(米国特許第4,601,852
号)またはGlyA21−ArgB31−ArgB32−ヒトイン
シュリン(欧州特許出願公告公報第368,187号)も
用いられる。
ンが好ましくは用いられる:
基であり、Xは、ヒドロキシル基、炭素数が50までの
塩基性特性を有する有機性の基、その末端カルボキシル
基(それが存在する場合は)がフリーの状態で、エステ
ル官能基として、アミド官能基として、ラクトンとして
またはCH2OHに還元されて存在する遺伝的にコード
可能なL−アミノ酸であり、nは、0から10までの整
数であり、Yは、水素またはL−フェニルアラニンであ
り、Zは、遺伝的にコード可能なL−アミノ酸であり、
AおよびB鎖は動物またはヒトインシュリンのシーケン
スを有する)。
有するもので、式中、R30は、L−アラニンまたはL−
スレオニンであり、Xは、L−アルギニン、L−リジン
またはL−フェニルアラニンから成る群からの一つまた
は二つ以上のL−アミノ酸であり、Zは、L−グリシ
ン、L−アラニン、L−セリン、L−スレオニン、L−
アスパラギン酸またはL−グルタミン酸で、A1からA
20まで、またはB2からB29までは、ヒトインシュ
リン、ブタインシュリンまたはウシインシュリンのアミ
ノ酸シーケンスである。
アミノ酸配列は: Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Le
u Tyr Gln Leu Glu AsnTyr Cys (配列番号(SEQ ID N
o):1) B1からB29までのヒトインシュリンのアミノ酸配列
は: Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Gl
u Ala Leu Tyr Leu ValCys Gly Glu Arg Gly Phe Phe T
yr Thr Pro Lys (配列番号:2)
工程2Aから2Dは、インシュリン及びA9位アセチル
化インシュリンを含むインシュリン混合物だけでなく、
インシュリン、A9位アセチル化インシュリンおよびプ
ロテアーゼを含むインシュリン混合物からインシュリン
を得るために、工程1Aおよび1Bを除いてもそれらだ
けで真に適切な方法であることが分かった。
発明の方法で分離除去されるインシュリンは、例えばA
9位アセチル化ヒトインシュリン、またはR30、X、
n、YおよびZが上記に限定された通りである式IのA
9位アセチル化インシュリンである。
は、A9位でアセチル化された式Iのインシュリンから
分離される。特にA9位アセチル化ヒトインシュリンが
ヒトインシュリンから効果的に分離される。
は、比較的不純物を含む状態でも、予め精製された(例
えばゲルクロマトグラフィーにより)形でもいずれでも
用いることができる。反復結晶化の後およびゲルクロマ
トグラフィーの後でも、適切に選択したpHでは互い
に、かつインシュリンとは異なる電荷を有するが、イン
シュリンと複合体を形成する、非常に類似した分子量を
有するインシュリン様の付随物質がなお夾雑している
(米国特許第4,129,560号)。このような物質
は、例えばデアミドインシュリン、アルギニンインシュ
リンおよびジアルギニンインシュリン並びにインシュリ
ンエチルエステルである。
対して疎水性マトリクスが付加されたものである。疎水
性マトリクスの例は、3から20、特に8から18の炭
素原子を有する鎖の長さをもつアルカンである。さら
に、粒子サイズは、例えば5から60μm、特に10か
ら50μmの範囲内で変えることができる。細孔幅も、
好ましくは50から300Å、特に100から200Å
の範囲内で変えることができる。親油性改変シリカゲル
物質の例は: −(R)Nucleosil(Macherey & Nagel GmbH + Co.KG,Du
eren, ドイツ) 45μmまでの種々の粒子サイズ、細孔幅100Å、C
8またはC18改変の球形および非球形物質。 −(R)LiChroprep(E. Merck Co., Darmstadt, ドイツ) 40μmまでの種々の粒子サイズ、細孔幅60−250
Å、C8またはC18改変の非球形および球形物質。 −(R)LiChrospher Select B,(E. Merck Co., Darmstad
t, ドイツ) 粒子サイズが25μmまでの球形物質、C8改変。 −(R)Waters Prep,(Millipore GmbH, Eschborn, ドイ
ツ) C18改変、50−105μm、非球形、細孔幅100
Å。 −(R)Zorbax Pro10(DuPont de Nemours (Germany) G
mbH, Bad Homburg, ドイツ) C8改変、 10μm、球形、細孔幅100Å。 −(R)Kromasil(EKA Nobel Co., Nobel Industries, ス
ウェーデン) C4、C8およびC18改変、20μmまで、球形、細
孔幅100、150または200Å。
を失うことができる化合物である。すなわち酸性溶液中
で陽イオンを形成し、アルカリ溶液中で陰イオンを形成
するもので、例えばα−アミノ酸、ベタインまたはベタ
イン誘導体である。好ましい双性イオンはグリシン、グ
ルタミンまたはベタイン(N−トリメチル−グリシン)
である。グリシンが特に好ましい。
等電点(IEP)は、溶解したインシュリンの陽イオン
電荷と陰イオン電荷の総和が等しいかまたはゼロとなる
pHである。例えば、ブタインシュリンの等電点は、p
H5.3から5.4の範囲にある。“等電点付近”という
語は、精製しようとするインシュリンのIEPのおよそ
1pH単位大きいかまたは小さい範囲内のpH値を指
す。特に好ましいpH値はIEPから上下0.5pH単
位内にある。
リン”という語は、プロテアーゼ活性が0から4mAU
/分、好ましくは0.01から1mAU/分、特に0.0
2から0.08mAU/分である、インシュリンおよび
プロテアーゼ混合物を指す。
シ−Val−Gly−Arg−4−ニトロアニリドアセ
テート(Chromozym-Try;発注番号378488 Boehringer M
annheim)から発色団(4−ニトロアニリド)が除去さ
れるキネティクスを求めることにより決定する。除去反
応は、波長405nmで60分にわたって分光光度計で
測定する。このような条件下では、測定される吸収の増
加は、生成物中のトリプシン活性に直接比例する。吸収
線の勾配の単位は1分当たりのミリ吸収(milliabsorpt
ion)単位(mAU/分)である。
含まないインシュリン”という語は、A9位アセチル化
インシュリンの含有量が0.5%以下、好ましくは0.2
%以下、特に0.1%以下であるインシュリン調製物を
指す。
質を含んでいる。適切な緩衝物質は文献において既知
で、例えば、リン酸塩、アルカリ金属もしくはアルカリ
土類金属塩(例えばクエン酸ナトリウムもしくは酢酸カ
リウム)、クエン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、
硫酸アンモニウムまたは塩化アンモニウムである。さら
に溶出液は、水に混合できる有機溶媒、例えばアルコー
ル、ケトン、酢酸メチル、ジオキサンまたはアセトニト
リルを含む。n−もしくはiso−プロパノール、メタ
ノール、エタノールのようなアルコール類または酢酸メ
チルが好ましい。
1Aおよび1B)のための水に混和性の有機溶媒の濃度
は1から70%、好ましくは10から50%、特に好ま
しくは10から35%である。緩衝物質の濃度は、溶媒
としての水を基準としておよそ1mmol/lから14
0mmol/l、好ましくは2mmol/lから120
mmol/lである。双性イオンの濃度は広範囲にわた
って変えることができる。都合のよい量は、溶媒として
の水を基準として1mmol/lから140mmol/
l、好ましくは10mmol/lから110mmol/
lである。
50℃、好ましくは15から30℃、特に好ましくは1
5から20℃である。クロマトグラフィー中の操作圧は
実質的に一定である。クロマトグラフィーは、種々の圧
力下で実施することができ、例えば5から400バー
ル、特に20から100バールの圧力下で実施すること
ができる。
インシュリン誘導体の溶出は、既知の慣用的手技に従っ
て実施する。精製しようとするインシュリン溶液をカラ
ムに負荷するには、好ましくは水性−アルコール性また
は完全に水性緩衝液で行う。インシュリン溶液はおよそ
1から10%、好ましくは3%の蛋白濃度を有する。
一定にして(isocratically)または該緩衝液中の水に
混合性の溶媒の比率を変えながら、本発明の方法によっ
て実施する。有機溶媒の比率は、用いる有機溶媒の濃度
が溶出液容積の関数として、特に好ましくは直線関数と
して増加するように変化させる。
ンシュリンの濃縮は、亜鉛による沈殿または結晶化によ
って実施する。これについては、該溶液は、必要な場合
には予め真空蒸留により溶媒を実質的に含まない状態と
するか、またはその濃度を水で希釈することによって減
少させることができる。いずれの場合でも、上清中の蛋
白濃度を50mg/lより少なくするために、沈殿また
は結晶化前の溶媒の濃度は10%以下とすべきである。
生じたインシュリン沈殿物は、デカントすることによ
り、または遠心分離もしくは濾過により分離でき、さら
に乾燥させることができる。
2Aから2B)では、水に混合性の有機溶媒の濃度は1
から90%、好ましくは10から60%、特に好ましく
は10から35%である。緩衝物質の濃度は溶媒として
の水を基準にしておよそ1mmol/lから2mol/
l、好ましくは25mmol/lから1mol/lであ
る。双極イオンの濃度は広範囲にわたって変えることが
できる。都合のよい量は溶媒としての水を基準にして1
0mmol/lから1mol/l、好ましくは20mm
ol/lから500mmol/lである。
0℃、好ましくは15から30℃、特に好ましくは15
から20℃である。クロマトグラフィー中の操作圧は実
質的に一定である。クロマトグラフィーは種々の圧力下
で、例えば5から400バール、特に20から100バ
ールの圧力下で実施することができる。カラムへのロー
ディング、クロマトグラフィー並びにインシュリンおよ
びインシュリン誘導体の溶出は、既知の慣用的技術的方
法によって実施できる。精製しようとするインシュリン
および/またはインシュリン誘導体をカラムに負荷する
には、アセトンまたはアセトニトリルを含有する溶解緩
衝液を用いて行う。適切な緩衝物質は文献において既知
で、例えば、燐酸塩、アルカリ金属もしくはアルカリ土
類金属の塩(例えばクエン酸ナトリウムもしくは酢酸カ
リウム)、クエン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、
硫酸アンモニウムまたは塩化アンモニウムである。さら
に双性イオンも溶解緩衝液に加えることができる。アセ
トンまたはアセトニトリルの濃度は広範囲で変えること
ができる。アセトンまたはアセトニトリルの量は5容積
%から50容積%が有利であることが分かった。アセト
ニトリルまたはアセトンの量は10から40容積%が好
ましく、特に25から35容積%が好ましい。溶解緩衝
液のpHはおよそpH1から6で、好ましくはpH2か
ら5、特にpH3から4が好ましい。カラムを溶解緩衝
液で1回から5回、好ましくは1回から3回、特に1回
洗浄する。インシュリン溶液の蛋白濃度は1から10
%、好ましくは3%である。
緩衝物質が一定濃度でさらに水に混合性の有機溶媒が一
定濃度(isocratically)で行うか、または水に混合性
の有機溶媒の緩衝液に対する比率を変えることによって
行う。有機溶媒の比率の変更は、用いる有機溶媒の濃度
が溶出容積の関数として、特に好ましくは直線関数とし
て増加するように行う。
インシュリンの分離は、亜鉛を用いた沈殿または結晶化
により行う。これについては、必要な場合には溶出液か
ら、予め真空蒸留によって実質的に溶媒を除去すること
ができ、また水で希釈することによりその濃度を減少さ
せることもできる。いずれの場合でも、上清中の蛋白濃
度を50mg/lより少なくするために、沈殿または結
晶化の前に溶媒の濃度は10%以下であるべきである。
生じた純粋なインシュリン沈殿物は、デカント、遠心沈
殿または濾過により分離でき、さらに乾燥させることが
できる。
のためだけでなく、調製用クロマトグラフィー、特に本
発明の方法が調製用HPLC装置で実施される場合にも
適切である。“調製用クロマトグラフィー”という語
は、単なる分析だけでなく純粋な生成物を得る目的の精
製方法を指す。純粋な生成物の量は狭い範囲に限定され
ず、例えば1mgから50kg、好ましくは50mgか
ら15kgの範囲で変えることができる。
る。特にことわらない限り、百分率は重量%である。実施例1 緩衝液A:0.1M硫酸アンモニウム、0.1Mグリシン 0.025M酢酸ナトリウム、pH5.5 5%プロパノール 緩衝液B:0.1M硫酸アンモニウム、0.1Mグリシン 0.025M酢酸ナトリウム、pH5.5 1:1の水/n−プロパノール 吸着剤:(R)Kromasil C8,13μm,細孔幅100
Å カラム寸法:2cm×25cm 遺伝子工学的に調製し、2.5%のアセチル化ヒトイン
シュリンを含む粗ヒトインシュリンの0.5gを25m
lの溶解緩衝液(0.1M グリシン、0.1MNaC
l、アセトン32重量%含有、pH3.5)に溶かした
溶液をカラムに負荷した。カラムにヒトインシュリン溶
液を負荷した後、カラム容積量の溶解緩衝液で洗浄し
た。流速9ml/分で、プロパノール濃度を14%から
25%に上昇させながら、個々の蛋白成分を90分以内
で別々に溶出させた。結晶化または沈殿させ、さらに乾
燥させた後、98%より高い純度で、用いたインシュリ
ンを基にした収量86.2%で、ヒトインシュリンを主
分画として得た。A9位アセチル化ヒトインシュリンの
濃度の測定は以下の通りに行った。分析には、(R)Nucle
osil C18,120Å,5μmを充填した4mm×2
50mmのHPLCカラム(Machery & Co., Dueren)
を用いた。 緩衝液A:35mMリン酸ナトリウム 300mM塩化ナトリウム 25%アセトニトリル 75%水 pH3.0 緩衝液B:35mMリン酸ナトリウム 50mM塩化ナトリウム 65%アセトニトリル 35%水 pH3.0 カラム温度40℃、流速1ml/分、25分以内の緩衝
液Bの12%から21%の勾配で、アセチル化誘導体
が、ヒトインシュリンピークの後保持時間6分の差異で
カラムから溶出した。この分析方法を用いて、インシュ
リン誘導体を、非常に満足のいく程度までヒトインシュ
リンから分離、同定さらに定量できる。精製後、A9位
アセチル化ヒトインシュリンの濃度は0.1%より少な
かった。
Cl(pH2.8)のみを含むという点を除き、クロマ
トグラフィーは実施例1の通りに行った。収量:58%
(98%より高い純度)。A9位アセチル化ヒトインシ
ュリンの濃度は0.2%であった。
シン、0.025M酢酸ナトリウム、pH5.5、5%n
−プロパノール 緩衝液B:0.15M硫酸アンモニウム、0.15Mグリ
シン、0.025M酢酸ナトリウム、pH5.5、1:1
の水/n−プロパノール 吸着剤:Kromasil C8,13μm,細孔幅100Å(E
KA Nobel社製) カラム寸法:6cm×25cm トリプシンを用いたブタインシュリンのトランスアミデ
ーション反応からの反応混合物の10gを200mlの
グリシン/HCl緩衝液(pH2.8)に溶かした溶液
をカラムに負荷した。トリプシン活性は10000mA
U/分より高かった。流速40ml/分でプロパノール
濃度を14から30%に上昇させながら、個々の蛋白成
分を120分以内で溶出させた。結晶化または沈殿さ
せ、さらに乾燥させた後、ヒトインシュリン−B30ジ
−tert−ブチルスレオニンエステル/エーテルが、
97%より高い純度で、用いたインシュリンを基にした
場合93%の収量で、主分画として得られた。プロテア
ーゼ活性の測定は以下の通りに行った。この試験では、
基質カルボベンゾキシ−Val−Gly−Arg−4−
ニトロアニリドアセテート(Chromozym-Try; 発注番号3
78488 Boehringer Mannheim)からの発色団の除去キネテ
ィクスを求めた。 除去反応の進行は、分光光度計で波長
405nmで60分に亙って測定した。このような条件
下では、測定される吸収増加は、生成物中のトリプシン
活性に直接比例する。吸収線の勾配を求め(単位:ミリ
吸収単位(milliabsorption units)/分(mAU/
分))、これをプロテアーゼ濃度の測定値そのものとし
た。試験は以下のように行った。7.5mgのヒトイン
シュリンを、撹拌しながら30分以内で1mlの溶解緩
衝液に溶かした。 溶解緩衝液:200mM TRIS,pH8.0,1mM
EDTA 基質Chromozymを1mg/mlの濃度で水に溶かした。
反応は、200μlの基質溶液を1mlのサンプル溶液
に37℃で添加して開始した。その後直ちに405nm
で分光光度計で測定した。この波長における反応溶液の
吸収を60分間連続的に記録した。トリプシン活性の確
認のために、吸収線の勾配を求めた。測定されたトリプ
シン活性は250mAU/分であった。
うにクロマトグラフィーを実施した。 0.1Mグリシン、0.05M硫酸アンモニウム、 カラム寸法:6cm×25cm 5から10mAU/分のトリプシン活性が測定された。
4に記載した通りにクロマトグラフィーを行った。20
から25mAU/分のトリプシン活性が測定された。
ン 0.025M酢酸ナトリウム、pH5.5、5%プロパノ
ール 緩衝液B:0.05M硫酸アンモニウム、0.1Mグリシ
ン 0.025M酢酸ナトリウム、pH5.5、1:1の水/
n−プロパノール 吸着剤:Kromasil C8,13μm,細孔幅100Å
(EKA Nobel社製) カラム寸法:6cm×25cm 蛋白含有量79%のヒトインシュリン−B30ジ−te
rt−ブチルスレオニンエステル/エーテルをトリフル
オロ酢酸で切断して得た反応混合物10gの溶液を、実
施例4に記載したようにカラムで精製した。続いて実施
例3のように沈殿を行い、インシュリン含有分画を濃縮
した。その後沈殿を、0.1Mグリシン、0.1MNaC
lおよび32容積%のアセトン(pH3.5)の混合物
200mlに溶かし、この溶液をカラムに負荷した。こ
のヒトインシュリン溶液をカラムに負荷した後、カラム
容積量の溶解緩衝液で洗浄した。続いて緩衝液Bの17
%から19%の勾配により45分以内で溶出を行った。
他の条件は全て実施例4と同一であった。トリプシン活
性は、0.05mAU/分より低かった。
寸法は30cm×30cmであった。トリプシン活性は
0.05mAU/分より低かった。
Claims (9)
- 【請求項1】 1A) プロテアーゼおよび/またはA
9位アセチル化インシュリン並びにインシュリンの混合
物を緩衝液に溶かし、 1B) 双性イオンを含み、場合によってはpHを精製
しようとするインシュリンの等電点付近に調整した緩衝
溶出液で溶出を行い、得られたインシュリン分画を必要
に応じて濃縮し、続いて該インシュリン分画を、 2A) アセトンまたはアセトニトリルを含む溶解緩衝
液に溶かし、 2B) 得られた溶液をカラムに加え、 2C) 該カラムを溶解緩衝液で洗浄し、 2D) 双性イオンを含み、場合によってpHを精製し
ようとするインシュリンの等電点付近に調整した緩衝溶
出液で、精製しようとするインシュリンを溶出させる、
水に混和性の有機溶媒を含む水性、緩衝性溶出液で、親
油性に改変したシリカゲル上でクロマトグラフィーを行
うことによって、実質的にプロテアーゼおよび/または
A9位でアセチル化されたインシュリンを含まないイン
シュリンを得る方法。 - 【請求項2】 インシュリン、プロテアーゼおよびA9
位アセチル化インシュリンを含む混合物、またはインシ
ュリンおよびA9位アセチル化インシュリンを含む混合
物から、実質的にA9位アセチル化インシュリンを含ま
ないインシュリンを得るために、工程2Aから2Dを用
いる、請求項1に記載の方法。 - 【請求項3】 溶解緩衝液が5から50容積%、特に1
0から40容積%のアセトンを含む、請求項1または2
に記載の方法。 - 【請求項4】 溶解緩衝液のpHが2から5、特に3か
ら4である、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。 - 【請求項5】 次の式I 【化1】 (式中R30は、遺伝的にコード可能なL−アミノ酸残基
であり、Xは、ヒドロキシル基、炭素原子数が50まで
の塩基的特性をもつ生理学的に許容できる有機性の基、
そのカルボキシル末端(それが存在する場合には)がフ
リーの状態で、エステル官能基として、アミド官能基と
して、ラクトンとして、またはCH2OHに還元されて
存在する、遺伝的にコード可能なL−アミノ酸であり、
nは、0から10までの整数であり、Yは、水素または
L−フェニルアラニンであり、Zは、遺伝的にコード可
能なL−アミノ酸であり、AおよびB鎖は動物またはヒ
トのインシュリンシーケンスを有する)のインシュリン
が得られる、請求項1から4の一つまたは二つ以上に記
載の方法。 - 【請求項6】 R30がL−アラニンまたはL−スレオニ
ンで、XがL−アルギニン、L−リジンまたはL−フェ
ニルアラニンから成る群からの一つまたは二つ以上のL
−アミノ酸で、ZがL−グリシン、L−アラニン、L−
セリン、L−スレオニン、L−アスパラギン酸またはL
−グルタミン酸で、さらにA1からA20までまたはB
2からB29までがヒトインシュリン、ブタインシュリ
ンまたはウシインシュリンのシーケンスである、式Iの
インシュリン誘導体が得られる、請求項5に記載の方
法。 - 【請求項7】 ヒトインシュリンが得られる、請求項1
〜6のいずれかに記載の方法。 - 【請求項8】 除去されるプロテアーゼがトリプシンで
ある、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。 - 【請求項9】 調製用高圧液体クロマトグラフィー装置
を用いる、請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
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