NO180681B

NO180681B - Fremgangsmåte for kromatografisk rensing av insuliner

Info

Publication number: NO180681B
Application number: NO913476A
Authority: NO
Inventors: Rainer Dickhardt; Bernhard Unger; Leonard Haefner
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1990-09-05
Filing date: 1991-09-04
Publication date: 1997-02-17
Also published as: PT98864A; US5245008A; HUT59418A; RU2037500C1; NO913476L; FI98216C; CS271791A3; IE913115A1; NO180681C; AU637255B2; JPH04230699A; LV10105B; CA2050644A1; LT3329B; AU8356891A; PL168114B1; FI914150A; EP0474213A1; GR3017750T3; UA26375A1

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for rensing av insulin og/eller insulinderivater ved kromatografi i vandige, buffrede oppløsningsmidler, som inneholder med vann blandbare organiske oppløsningsmidler, på lipofilt modifisert kiselgel, hvorved dobbeltioner er oppløst i det vandige, buffrede oppløsningsmidlet og/eller pH-verdien for oppløsningsmidler ligger i nærheten av det isoelektriske punktet for Insulinet eller insulinderivatet som skal renses.

Fra analytiske adskillelsesfremgangsmåter er rensingen av insuliner eller insulinderivater på lipofilt modifiserte (reversed phase) kiselgeler kjent og har i mange år vært anvendt med hell innen høytrykksvæskekromatografi (HPLC) (WS Welinder et al., J. Chrom., 361, (1986) 357-367). I analytisk målestokk påføres proteinmengder i jig-område på en med modifisert kiselgel fylt søyle av stål, glass eller kunst-stoff og elueres deretter ved hjelp av en strømmende væskeblanding (for det meste sure, vandige bufferoppløsninger med konstant eller variabel konsentrasjon av organisk oppløsningsmiddel). Proteinmengden utgjør herved langt mindre enn 30 pg/ml søylevolum.

Tidligere rensefremgangsmåter anvender ofte det i laborato-rium benyttede, relativt toksiske oppløsningsmidlet (acetonitril) og korrosive, dyre bufferkomponenter, f.eks. tetra-alkylammoniumsalter, alkylsulfonater, heksafluoraceton, trifluoracetat (E.P. Kroeff et al., J. Chrom. 461, (1989), 45-61). Disse elueringsmidlene fører ved blandinger som er sterkt forurenset med insulinlignende stoffer ikke til tilfredsstillende preparativ adskillelse med henblikk på kvalitet, utbytte av hovedkomponenten og samlet gjenfinning (J. Rivier, R. McClintock; J. Chrom., 268 (1983) 112-119; Peter et al., J. Chrom. 408 (1987) 43-52).

Insuliner fra forutgående kjemiske omvandlinger som eksempelvis fra sterkt sure esterspaltninger eller enzymatiske (trans-)peptideringsprosesser, fra krystallisasjonsrensinger og lignende inneholder for det meste ledsagende stoffer med lignende egenskaper. De lar seg rense ved ionebytterkromato-grafi ved valg av bestemte pH-verdier når det er tilstede tilstrekkelige ladningsforskjeller (US 4 129 560). Ulempen ved denne metoden ligger i fortynningseffekten, og dermed tapet av verdifulle stoffer i supernatantene ved opparbeidelsen av utfellingene, i den relativt lange syklustiden og ved at den samlede gjenfinningen og dermed utbyttet er lavt.

Preparativ adskillelse kan prinsippielt oppnås ved forstørr-else av søyleinnholdet, den påførte mengden og elueringsmid-delgjennomgangen. De for formålet nødvendige mengdene organisk oppløsningsmiddel ligger f.eks. ved søyler med diametere >20 cm i m<3->målestokk. For analytisk HPLC anvendte oppløsningsmidler (f.eks. acetonitril, DMF, metanol, dioksan, osv.) er toksiske, slik at en anvendelse av disse frem-gangsmåtene i preparativ produksjonsmålestokk krever omstendige beskyttelsesforholdsregler.

Oppgaven ved foreliggende oppfinnelse var å utvikle en fremgangsmåte for kromatografisk rensing av insuliner og insulinderivater hvorved den biologiske aktiviteten av insulinene opprettholdes, hvormed det kan oppnås høye renheter med et kromatografitrinn, kort syklustid, søyle-standtider på mer enn 50 kromatografisykluser, regenerering av den stasjonære kiselgelfasen uten tidkrevende pakkingspro-sesser og anvendelsen av utoksiske oppløsningsmidler, slik at en preparativ produksjonsmålestokk muliggjøres.

Det er nå funnet en fremgangsmåte for rensing av insulin og/eller insulinderivater ved kromatografi i vandige buffrede oppløsningsmidler, som inneholder med vann blandbare organiske oppløsningsmidler, på lipofilt modifisert kiselgel, kjennetegnet ved at dobbeltioner er oppløst i det buffrede oppløsningsmidlet eller pH-verdien for oppløsningsmiddelblan-dingen ligger i nærheten av det isoelektriske punktet for insulinet eller insulinderivatet som skal renses og dobbeltioner er tilsted, hvorved dobbeltionene foreligger i konsentrasjonsområdet 10 mmol/1 til 1 mol/l.

Overraskende bevirker nærværet av dobbeltioner eller kromatograflen ved en pH-verdi for oppløsningsmidlet som ligger i nærheten av det isoelektriske punktet for insulinet eller insulinderivatet som skal renses og nærværet av dobbeltioner, ikke bare en god adskillelse av verdifullt produkt og forurensninger, men derimot også en god avløsning av proteinene fra den stasjonære fasen (lipofilt modifisert kiselgel). Den oppnådde adskillelsen gjør det mulig å rense selv sterkt med insulinlignende komponenter forurensede insulinoppløsninger, som f.eks. adskillelsen av A21-desamido-insulin fra insulin og insulinderivater. Videre oppnås ved den gunstige bortløsningen av proteinene fra den faste fasen lange standtider for søylepakningene og en høy total gjenfinnelsesrate ved insuliner.

I fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan alle insuliner anvendes, som f.eks. insuliner fra alle spesies, som er av animalsk eller menneskelig opphav, insulinforløpere, som f.eks. proinsuliner eller preproinsuliner, eller rekombinante insuliner eller insulinderivater, som er uttrykket av genetisk modifiserte mikroorganismer. Videre kan det også anvendes insulinderivater som eksempelvis er fremstilt ved kjemisk eller enzymatisk avledning, f.eks. Des-Phe-Bl-insulin, insulin-e-ketensulfonat, diarginininsulin (B31, B32), monoarginininsulin eller difenylalanininsulin (B31, B32) (US 4 601 852).

Fortrinnsvis anvendes insulinderivater med formel I

hvori

R<30> står for resten av en genetisk kodbar L-aminosyre,

X står for en hydroksygruppe, en fysiologisk godtagbar organisk gruppe av basisk karakter med inntil 50 C-atomer, en genetisk kodbar L-aminosyre og hvis eventuelt tilstedeværende endestående karboksyl-funksjon kan foreligge fri, som esterfunksjon, som

amidfunksjon, som lakton eller redusert til CH2OH,

n står for et helt tall fra 0 til 10,

Y står for hydrogen eller L-fenylalanin

og A- og B-kjeden av sekvensene er animalsk eller menneskelig insulin.

Spesielt foretrukket er anvendelsen av insulinderivater med formel I, hvori

R<30> står for L-alanin eller L-treonin og

X står for en eller flere L-aminosyrer fra gruppen L-arginin, L-lysin eller L-fenylalanin.

Insulinene og insulinderivatene kan anvendes såvel i forholdsvis uren tilstand som også i på forhånd renset form (f.eks. ved gelkromatografi). Insulin er etter flere gangers krystallisasjon, og også etter gelkromatografi, fremdeles forurenset med insulinlignende ledsagende stoffer av meget lignende molekylvekt, som ved passende valgt pE adskiller seg fra hverandre, og også fra insulin, ved deres ladningstil-stand, men som danner komplekser med insulin (US 4 129 560). Eksempler på slike stoffer er: desamidoinsuliner, arginin- og diarginininsulin, insulinetylester og andre.

Under lipofilt modifisert kiselgel forstås en kiselgel hvorpå en hydrofob matriks er påført. Eksempler på en hydrofob matriks er alkaner med en kjedelengde på 3 til 20 karbon-atomer. Spesielt foretrukne lipofilt modifiserte kiselgel-materialer er eksempelvis:

"Nucleosil", firma Macherey & Nagel:

sfæriske og ikke-sfæriske materialer av forskjellige kornstørrelser inntil 45 pm, 100 Å porevidde, C8- hhv. C18-modifisert.

"Lichroprep", firma Merck:

ikke sfæriske og sfæriske materialer av forskjellige kornstørrelser inntil 40 pm, 60-250 Å porevidde, C8-C18-modifisert;

"Lichrospher Select B", firma Merck:

sfærisk materiale inntil 25 pm kornstørrelse, C8-modifisert; - "Waters Prep", C18-modifisert, 50-105 pm ikke sfærisk, 100 Å porevidde;

"Zorbax ProlO", firma DuPont:

C8-modifisert, 10 pm, sfærisk, 100 Å porevidde;

- "Kromasil", firma EKA Nobel:

C4-, C8-C18-modifisert, inntil 16 pm, sfærisk, 100, 150 eller 200 Å porevidde.

Dobbeltioner er forbindelser som kan oppta og også avspalte protoner, dvs. i sur oppløsning danner kationer og i alkalisk oppløsning anioner, som eksempelvis a-aminosyrer, betain eller betainderivater. Foretrukne dobbeltioner er glycin, glutamin eller betain (N-trimetyl-glycin). Spesielt foretrukket er glycin.

Det isoelektriske punktet (IEP) for et insulin eller et insulinderivat er den pH-verdien av en oppløsning av insulinet hvori antallet kationiske ladninger og anioniske ladninger av det oppløste insulinet er lik null. Eksempelvis ligger IEP for svineinsulin mellom pH 5,3 og 5,4 (E. Neurath, K. Bailey, Protein Eormones, Vol. II/A, The Proteins, S. 636). Med begrepet "i nærheten av det isoelektriske punktet" menes spesielt pH-verdier som ligger ca. 1 pE-enhet over eller under IEP for insulinet som skal renses. Spesielt foretrukket er pE-verdier som ligger inntil 0,5 pE-enheter over eller under IEP.

Elueringsmidlet inneholder et bufferstoff for å holde pE-verdien for elueringsmidlet konstant. Egnede bufferstoffer er kjent fra litteraturen, eksempelvis fosfater, alkali- eller jordalkalimetallsalter, som natriumcitrat eller kaliumacetat, ammoniumcitrat, -acetat, -sulfat eller -klorid. Videre inneholder elueringsmidlet med vann blandbare organiske oppløsningsmidler som eksempelvis alkoholer, ketoner, metylacetat, dioksan, dimetylsulfoksid eller acetonitril. Foretrukket er alkoholer som n- eller iso-propanol, metanol, etanol eller metylacetat.

Konsentrasjonen av det med vann blandbare organiske opp-løsningsmidlet ligger mellom 1 og 90$, fortrinnsvis mellom 10 og 60$, spesielt foretrukket mellom 10 og 35$. Konsentrasjonen av bufferstoffet ligger mellom 1 mmol/1 og 2 mol/l, på basis av vann som oppløsningsmiddel, fortrinnsvis mellom 25 mmol/1 og 1 mol/l. Konsentrasjonen av dobbeltionene kan variere innen et vidt område. Fordelaktige mengder ligger mellom 10 mmol/1 og 1 mol/l, på basis av vann som oppløs-ningsmiddel, fortrinnsvis mellom 10 mmol/1 og 500 mmol/1. Temperaturen under kromatograflen ligger mellom 0°C og 50°C, fortrinnsvis mellom 15 og 30°C, spesielt foretrukket mellom 15 og 20°C. Driftstrykket under kromatografien er i det vesentlige konstant. Kromatografien kan gjennomføres med forskjellige trykk, f.eks. kan kromatografien gjennomføres ved et trykk på 5 til 400 bar, spesielt ved 20 til 100 bar.

Stofftilførselen til søylene, kromatografi og eluering av insulinene og insulinderivatene foregår ved kjente vanlige, tekniske fremgangsmåter. Beleggingen av søylen med insulin-oppløsningen som skal renses foregår fortrinnsvis med vandig, alkoholisk eller rent vandig bufferoppløsning. Insulinopp-løsningen har en proteinandel som ligger mellom 1 og 1056, fortrinnsvis ved 3$.

Elueringen av insulinene foregår ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen ved konstant konsentrasjon av bufferstoffene (isokratisk) eller ved forandring av den med vann blandbare organiske oppløsningsmiddelandelen av buffer. Forandringen av den organiske oppløsningsmiddelandelen foregår på den måten at konsentrasjonen av det anvendte organiske oppløsningsmid-let økes avhengig av elueringsvolumet, og fortrinnsvis i lineær avhengighet.

Adskillelsen av insulin etter kromatografien fra eluatene skjer ved utfelling med sink eller ved krystallisasjon. Derved kan oppløsningen valgfritt på forhånd ved hjelp av vakuumdestillasjon være i det vesentlige befridd for opp-løsningsmiddel, eller dets konsentrasjon kan reduseres ved fortynning med vann. I et hvert tilfelle bør oppløsningsmid-delkonsentrasjonen før fellingen eller konsentrasjonen ligge ved 10% eller lavere for å holde proteininnholdet i super-natanten på mindre enn 50 mg/l. De dannede rene insulinbunn-fallene kan isoleres ved dekantering, sentrifugering eller filtrering og tørkes.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen egner seg ikke bare til analytisk kromatografi, men derimot også til preparativ kromatografi, spesielt når fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen gjennomføres med et preparativt HPLC-anlegg.

Under begrepet "preparativ kromatografi" forstås en rense-fremgangsmåte med det formål å utvinne renprotein og ikke bare for analyse. Mengden av rent produkt kan variere innen vide grenser, eksempelvis fra 1 mg til 50 kg, fortrinnsvis mellom 50 mg og 15 kg.

I de følgende eksemplene beskrives fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen mer detaljert. Prosentangivelser er på basis av vekt, med mindre annet er angitt.

Eksempel 1

Buffer A: 0,2 M ammoniumsulf at, 0,1 M glycin, 0,05 M

natriumcitrat, pH 5,5, rent vandig;

Buffer B: 0,1 M ammoniumsulf at, 0,1 M glycin, 0,05 M

natriumcitrat, pH 5,5, vann/n-propanol i forhold 1:1.

Sorbens: "Nucleosil C18", 15-25 pm sfærisk, 100 Å

porevidde, fa. Machery & Nagel, Duren;

Søylemål: 40 mm x 250 mm.

Fyllingen av søylen foregår med 3,5 g humaninsulin (HI) utvunnet fra trifluoreddiksyrespaltning av humaninsulin-B30-di-tert.butyl-ester/eter med en proteinandel på 79,1$. Elueringen av insulin foregår ved at bufferoppløsning A og B blandes med en egnet høytrykkspumpe med blandeinnretning, slik at det oppnås en propanolgradient på 14 til 20$. Elueringen av insulin foregår ved ca. 17,5$ propanol etter 23 minutter når det pumpes ved 46 ml/min.

Etter fraksjonering og isolering av krystallisert humaninsulin (HI) oppnår man et produkt med 9756 protein i 88,5$ utbytte i hovedfraksjonen og 7,5$ utbytte i bifraksjon i 85,756 proteinandel. Den samlede gjenfinningen utgjør følgelig 96,056 av det anvendte insulinet.

Eksempel 2

Buffer A: 0,1 M ammoniumsulfat, 0,1 M glycin, 0,025 M

natriumcitrat, pH 5,5, rent vandig;

Buffer B: 0,05 M ammoniumsulfat, 0,1 M glycin, 0,025 M

natriumcitrat, pH 5,5, vann/n-propanol i forhold 1:1.

Sprbens: "Nucleosil C18-P", 15-25 pm sfærisk, 100 Å

porevidde, fa. Macherey & Nagel;

Søylemål: 40 mm x 25 0 mm.

Søylen fylles med 7,0 g humaninsulin (HI) (86,156 proteinandel) fra en esterspaltning av humaninsulin-di-tert.butyl-ester/eter i form av en 356 oppløsning i 0,1 M glycin/HCl-buffer, pH 2,8, ved hjelp av en høytrykkspumpe. Deretter foregår elueringen med den ovenfor angitte bufferoppløsningen under trykk i n-propanolgradient. I løpet av 60 minutter øker propanolkonsentrasjonen fra 14 til 17,556. Etter fraksjonering og krystallisasjon på ovenfor angitt måte oppnår man et produkt med 98,756 proteinandel. Utbyttet av renset humaninsulin ligger på 9156 av det anvendte insulinet.

Eksempel 3

Buffer A: 0,1 M ammoniumsulfat, 0,1 M glycin, 0,025 M

natriumacetat, pH 5,5, rent vandig;

Buffer B: 0,05 M ammoniumsulfat, 0,1 M glycin, 0,025 M

natriumacetat, pH 5,5, vann/n-propanol i forhold 1:1.

Sorbens: "Lichrospher Select B", C8, 15-25 pm, 60 Å

porevidde, fa. Merck.

Søylemål: 50 mm x 250 mm.

Søylen fylles med en oppløsning av 10 g reaksjonsblanding fra omamideringen av svineinsulin med trypsin, oppløst i 200 ml 0,1 M glycin/HCl-buffer, pH 2,8. I løpet av 120 min. blir ved en strøm på 40 ml/min. og forhøyelse av propanolkonsentrasjonen fra 14 til 30$, de enkelte proteinkomponentene eluert adskilt. Man oppnår etter krystallisasjon hhv. felling og tørking som hovedfraksjon humaninsulin-B30-di-tert.butyltreo-ninester/eter med en renhet på mer enn 9756 med et utbytte på 9356, på basis av det anvendte insulinet.

Eksempel 4

Buffer A: 0,1 M natriumklorid, 0,1 M glycin, 0,025 M

natriumacetat, pH 5,5, rent vandig;

Buffer B: 0,05 M natriumklorid, 0,1 M glycin, 0,025 M

natriumacetat, pH 5,5, vann/n-propanol i forhold 1:1.

Sorbens: "Zorbax ProlO", C8, 10 pm, fa. DuPont.

Søylemål: 5 cm x 25 cm.

7,5 g EI fra trifluoreddiksyrespaltning av humaninsulin-B30-di-tert.butyltreoninester/eter i 100 ml 0,1 M glycin/ECl-oppløsning ble pumpet på søylen og eluert ved en strøm på 80 ml/min. Konsentrasjonen av buffer B steg i løpet av 60 min. fra 18 til 2556 - retensjonstiden (Rt) utgjorde her ca. 37 min. Fra hovedfraksjonen kunne det ved krystallisasjon og tørking isoleres 96 ,856 EI av anvendt mengde med >9756 renhet, bifraksjonen inneholdt 2 ,256 EI med <5056 renhet.

Eksempel 5

Buffer A: 0,2 M natriumsulfat, 0,1 M glycin, 0,03 M

ammoniumacetat, pH 5,5, 1056 metylacetat;

Buffer B: 0,05 M natriumsulfat, 0,1 M glycin, 0,03 M

ammoniumacetat, pE 5 ,5 , 2056 metylacetat.

Sorbens: "Kromasil C8", 13 jjm, 100 Å porevidde, fa. EKA

Nobel.

Søylemål: 5 cm x 25 cm.

8 g okseinsulin pr. liter søylevolum ble ført på søylen ved hjelp av 0,1 M glycin/ECl-buf f er, ekvilibrert ved 3056 buffer B. I løpet av 90 minutter steg B-bufferkonsentrasjonen til 8056 (= 1856 metylacetat); okseinsulin eluerte etter 65 minutter med en renhet på >97 ,556 i hovedfraksjonen (63,556 utbytte) og ble utfelt med sinkklorid etter fortynning med vann. Total gjenvinning utgjorde 92 ,556.

Eksempel 6

Buffer A: 0,1 M ammoniumsulfat, 0,1 M glycin, 0,025 M

natriumacetat, pE 5 ,5, 556 n-propanol;

Buffer B: 0,05 M ammoniumsulfat, 0,1 M glycin, 0,025 M

natriumacetat, pE 5,5 vann/n-propanol i forhold 1:1.

Sorbens: "Kromasil C8", 13 pm, 100 Å porevidde, fa. EKA

Nobel.

Søylemål: 5 cm x 25 cm.

Påfyllingen på søylen utgjorde 4 g (= 8 g/l) humaninsulin fra trifluoreddiksyrespaltning av humaninsulin-B30-di-tert.butyl-treoninester/eter med en renhet på ca. 9256. I en gradient på 18 til 2556 buffer B i løpet av 90 minutter eluerte man humaninsulin etter 45 minutter med en renhet på > 9796 i hovedf raks j onen (utbytte 91,856) og 80 ,556 i bifraksjonen (utbytte 4 ,756 ).

Eksempel 7

Buffer A: 0,1 M ammoniumsulfat, 0,1 M glycin, 0,026 M

natriumacetat, pH 5,5, 1056 n-propanol;

Buffer B: 0,05 M ammoniumsulfat, 0,1 M glycin, 0,025 M

natriumacetat, pH 5,5, vann/n-propanol i forhold 1:1.

Sorbens: "Kromasil C8", 13 pm, 100 Å porevidde, fa. EKA

Nobel.

Søylemål: 10 cm x 40 cm.

På søylen ble det anbragt 18 g svineinsulin i 1,8 1 0,1 M glycin/ECl-buf fer, pH 3,0, med 556 n-propanol. Gradienten forløp fra 956 buffer B (= 13 ,656 n-propanol) til 1156 buffer B (= 14,456 n-propanol) i 70 minutter. Svineinsulin eluerte man etter 50 minutter med et innhold av protein >9856 i hovedfraksjonen (8956 utbytte). Totalgjenvinningen utgjorde 96,856 av utgangsmaterialet.

Eksempel 8

Buffer A: 0,2 M ammoniumklorid, 0,1 M glycin, 0,025 M

natriumcitrat, 556 n-propanol, pH 5,5;

Buffer B: som buffer A, med en tilsats av 5056 n-propanol.

Sorbens: "Kromasil C8", 13 pm, 100 Å porevidde, fa. EKA

Nobel, Sverige.

Søylemål: 50 mm x 250 mm.

4 g genteknisk fremstilt humaninsulin (89 ,556 proteinandel) oppløses i 0,1 M glycinbuffer, pH 3,0, som 256 proteinoppløs-ning og pumpes ved hjelp av en høytrykkspumpe på søylen. Elueringen foregår gjennom en lineær gradient fra 1356 til 1656 n-propanol i løpet av 70 minutter ved en strøm på 80 ml/min. Etter fraksjonering og krystallisasjon oppnår man i hovedfraksjonen et humaninsulin med et proteininnhold på 98% med et utbytte på 93%. Totalgjenvinningen ligger ved 98% på basis av startmaterialet.

Eksempel 9

Buffer A: 0,2 M ammoniumsulfat, 0,1 M glycin, 0,025 M

ammoniumcitrat, 5% etanol, pH 5,5;

Buffer B: som buffer A, med en tilsats av 50% etanol.

Sorbens: "Kromasil C8", 10 pm, 100 Å porevidde, fa. EKA

Nobel, Sverige.

Søylemål: 50 mm x 250 mm.

I 250 ml glycinbuf f er, pH 3,0 oppløses 4,5 g genteknisk fremstilt humaninsulin (86,2% proteinandel) og pumpes så på søylen. For kromatograf! av proteinet oppnås ved to høy-trykkspumper en lineær gradient av de to bufferne A og B. Elueringen foregår etter 100 minutter ved en etanolkon-sentrasjon på 33% og en konstant strøm på 80 ml/min. Etter fraksjonering og krystallisasjon oppnår man i hovedfraksjonen et humaninsulin med et proteininnhold på 96% ved en samlet gjenvinningsrate på 93%, på basis av startproduktet.

Eksempel 10

Buffer A: 0,2 M ammoniumklorid, 0,1 M glycin, 0,025 M

natriumcitrat, 10% metylacetat, pH 5,5;

Buffer B: samme saltkonsentrasjon som i buffer A, men 20%

metylacetat.

Sorbens: "Kromasil C8", 10 pm, 100 Å porevidde, fa. EKA

Nobel, Sverige.

For kromatografien oppløses 4,6 g rått humaninsulin som stammer fra opparbeidelsen av genteknisk fremstilt insulin, i 200 ml vandig glycinbuffer og pumpes så på en 50 x 250 mm HPLC-søyle. Søylematerialet ekvilibreres på forhånd ved sammenblanding av buffer A og B ved hjelp av to høytrykks-pumper til en metylacetatkonsentrasjon på 13% metylacetat. Etter påføringen foregår eluering av humaninsulin gjennom en lineær gradient på 13% til 17% metylacetat i løpet av 90 minutter. Isoleringen av hovedproduktet foregår ved krystallisasjon fra elueringsoppløsningen. Derved oppnår man 3,8 g humaninsulin med en proteinandel på 96%. Den totale gjenvin-ningsraten, på basis av utgangsmaterialet, utgjør derved 90%.

Eksempel 11

Buffer A: 0,1 M ammoniumsulfat, 0,1 M betain, 0,05 M

sitronsyre, pH 5,5 med natronlut (rent vandig); Buffer B: 0,1 M ammoniumsulfat, 0,1 M betain, 0,05 M

sitronsyre, pH 5,5 med natronlut (vann/isopropa-nol, forhold 1:1).

Sorbens: "Nucleosil C18", 15-25 pm sfærisk, 100 Å;

Søyle: 40 mm x 250 mm.

Strøm: 45 ml/min.

Søylen fylles med 3 g (79% proteinandel) humaninsulin fra en esterspaltning av humaninsulin-di-tert.butyl-ester/eter i form av en 3% oppløsning i 0,1 M betain/HCl-buf f er, pH 3,0, ved hjelp av en høytrykkspumpe. Deretter ble det eluert isokratisk med det ovenfor angitte buffersystemet med 44% buffer B. Retensjonstiden utgjorde ca. 35 minutter. Etter fraksjonering ble det i hovedfraksjonen oppnådd 98,1% humaninsulin med 80,5% utbytte. Den totale gjenvinningen utgjorde 90,5%.

Eksempel 12

Buffer A: 0,1 M ammoniumsulfat, 0,1 M glutaminsyre, 0,05 M

sitronsyre, pH 5,45 med natronlut (rent vandig); Buffer B: 0,1 M ammoniumsulfat, 0,1 M glutaminsyre, 0,05 M

sitronsyre, pH 5,5 med natronlut (vann/n-propanol: 1:1).

Sorbens: "Nucleosil C18-P", 15-25 pm sfærisk, 100 Å.

Søyle: 50 mm x 250 mm.

Strøm: 60 ml/min.

Søylen ble fylt med 6 g (73% proteinandel) humaninsulin fra en esterspaltning av humaninsulin-di-tert.butyl-ester/eter i form av en 3% oppløsning i 0,1 M eddiksyre, pH 3,0, ved hjelp av en høytrykkspumpe. Deretter ble det eluert med det ovenfor angitte buffersystemet ved 25%-28% buffer B i gradienten. Retensjonstiden utgjorde ca. 25 minutter. Etter fraksjonering ble det i hovedfraksjonen oppnådd 98,6% humaninsulin med 65% utbytte. Den totale gjenvinningen utgjorde 88,5%.

Eksempel 13

Buffer A: 0,15 M ammoniumsulfat, 0,10 M trietylamin, pH

6,5 med svovelsyre (rent vandig);

Buffer B: 0,08 M ammoniumsulfat, 0,05 M trietylamin, pH

6,5 med svovelsyre (vann/2-propanol: 1:1).

Sorbens: "Nucleosil C18-P", 15-25 pm sfærisk, 100 Å.

Søyle: 50 mm x 250 mm.

Strøm: 60 ml/min.

Etter fylling av søylen med 5 g humaninsulin fra trifluoreddiksyrespaltning av humaninsulin-di-tert.butyl-treonin-ester/eter i en 3% oppløsning ble det eluert mellom 32 og 42% buffer B. Retensjonstiden utgjorde 40 minutter. Etter fraksjonering og krystallisasjon ble det oppnådd 72% i hovedfraksjonen med en renhet på 92,7%. Totalgjenvinningen lå på 76% av den anvendte mengden.

Eksempel 14

Buffer A: 0,1 M sitronsyre, 0,2 M ammoniumsulfat, pH 2,5

med saltsyre, rent vandig;

Buffer B: 0,1 M sitronsyre, 0,1 M ammoniumsulfat, pH 2,5

med saltsyre, vann/n-propanol: 1:1.

Sorbens: "Nucleosil C18", fa. Macherey & Nagel.

Søyle: 40 x 250 mm.

Strøm: 45 ml/min.

Etter fyllingen av søylen med 3 g humaninsulin fra trifluoreddiksyrespaltning av humaninsulin-di-tert.butyltreonin-ester/eter i form av en 3% oppløsning i 0,1 M glycinbuffer pE 3,0 ble det eluert mellom 34 og 35% buffer B. Retensjonstiden utgjorde 45 minutter. Etter fraksjonering, krystallisasjon og tørking ble det isolert 57% av den anvendte mengden i hovedfraksjonen med en renhet på 94,8% og 16% i bifraksjonen (renhet 84%).

Eksempel 15

Buffer A: 0,1 M sitronsyre, 0,2 M ammoniumsulfat, pH 3,5

med saltsyre, rent vandig;

Buffer B: 0,1 M sitronsyre, 0,1 M ammoniumsulfat, pE 3,5

med saltsyre, vann/n-propanol: 1:1.

Sorbens: "Nucleosil C18", fa. Macherey & Nagel.

Søyle: 40 x 250 mm.

Strøm: 45 ml/min.

Søylefylling foregikk som i eksempel 14. Retensjonstiden utgjorde ca. 40 minutter. Etter fraksjonering, krystallisasjon og tørking ble det funnet 51% anvendt humaninsulin med en renhet på 97,5% i hovedfraksjonen og 4% i bifraksjonen (68% renhet).

Eksempel 16

Buffer A: 0,1 M tris, 0,1 M glycin, 0,1 M ammoniumklorid,

pH 8,5 med saltsyre, rent vandig;

Buffer B: 0,1 M tris, 0,1 M glycin, 0,1 M ammoniumklorid,

pH 8,5 med saltsyre, vann/n-propanol: 1:1.

Sorbens: "Kromasil C8", 13 pm, 100 Å.

Søyle: 50 mm x 250 mm.

Strøm: 60 ml/min.

Den på 33% buffer B ekvilibrerte søylen ble fylt med 6 g humaninsulin fra trifluoreddiksyrespaltning (se eksempel 14) i form av en 3% oppløsning i 0,1 M trisbuffer, pH 8,5. Eluering foregikk etter ca. 35 minutter. Etter fraksjonering og krystallisasjon inneholdt hovedfraksjonen 96,6% humaninsulin med et utbytte på 86%. Den totale gjenvinningen lå ved 95%.

Eksempel 17

Buffer A: 0,1 M ammoniumklorid, 0,025 M sitronsyre, pE 5,5

med ammoniakk, 5 volum-% n-propanol;

Buffer B: 0,1 M ammoniumklorid, 0,025 M sitronsyre, pE 5,5

med ammoniakk, 50 volum-% n-propanol.

Sorbens: "Kromasil C8", 13 pm, 100 Å.

Søyle: 50 mm x 250 mm.

Strøm: 60 ml/min.

Søylen ble som allerede beskrevet fylt med 6 g humaninsulin fra trifluoreddiksyrespaltning (se eksempel 14). Innenfor en gradient fra 21% til 25% buffer B i 60 minutter ble det eluert insulin med en retensjonstid på 40 minutter. Hovedfraksjonen inneholdt 91% av det anvendte produktet med en renhet på 97,5%. Den totale gjenvinningen lå ved 96%.

Eksempel 18

Buffer A: 0,1 M kaliumklorid, 0,025 M sitronsyre, pH 5,5

med kalilut, 5 volum-% n-propanol;

Buffer B: 0,1 M kaliumklorid, 0,025 M sitronsyre, pH 5,5

med kalilut, 50 volum-% n-propanol.

Sorbens: "Kromasil C8", 13 pm, 100 Å.

Søyle: 50 mm x 250 mm.

Strøm: 60 ml/min.

Fylling og gradient som i eksempel 17. Eluering foregikk etter 35 minutter. Hovedfraksjonen inneholdt 90% av den anvendte mengden humaninsulin med en renhet på 96,5%. Den samlede gjenvinningen lå ved 93%.

Eksempler 19 til 24

I eksemplene 19 til 24 ble kromatografien gjennomført under de samme betingelsene som i eksempel 14. Bare bufferen hhv. dobbeltionene ble forandret.

Eksempel 19:

Buffer A: 0,15 M ammoniumsulfat, 0,1 M trietylamin, pH 7,0

med svovelsyre;

Buffer B: 0,08 M ammoniumsulfat, 0,05 M trietylamin, pH

7,0 med svovelsyre.

Resultat: 95,2% renhet for hovedfraksjonen; 67% utbytte i hovedfraksjonen.

Eksempel 20

Buffer som i eksempel 16, med uten 0,1 M glycin.

Resultat: 96,1% renhet i hovedfraksjonen; 65% utbytte i

hovedfraksjonen og 25% i bifraksjonen.

Eksemel 21

Buffer som i eksempel 15 med tilsats av 0,1 M glycin.

Resultat: 96% renhet i hovedfraksjonen; 66% utbytte i

hovedfraksjonen og 6% i bifraksjonen.

Eksempel 22

Buffer A: 0,1 M ammoniumklorid, 0,025 M sitronsyre, pH 4,5

med ammoniakk, 5 volum-% n-propanol, 0,1 M

glycinbetain;

Buffer B: som buffer A, men i tillegg 50% n-propanol.

Resultat: 98,1% renhet i hovedfraksjonen; 88% utbytte i

hovedfraksjonen og 6% i bifraksjonen.

Eksempel 23:

Buffer som i eksempel 22, men pH 5,4 og 0,1 M glycin i steden for glycinbetain.

Resultat: 97,9% renhet i hovedfraksjon; 92% utbytte i

hovedfraksjonen og 8% i bifraksjonen.

Eksempel 24

Buffer som i eksempel 13, men pE 6,0 og i tillegg 0,1 M glycin.

Resultat: 94,3% renhet i hovedfraksjonen; 77% utbytte i hovedfraksjonen og 13% i bifraksjonen.

Eksempel 25

Tabell 1 gir en oversikt over utbytte og renhet av insuliner avhengig av pH-verdi og/eller dobbeltion i elueringsmidlet.

Claims

1. Fremgangsmåte for rensing av insulin og/eller insulinderivater ved kromatografi i vandige buffrede oppløsningsmidler, som inneholder med vann blandbare organiske oppløsningsmid-ler, på lipofilt modifisert kiselgel, karakterisert ved at dobbeltioner er oppløst i det buffrede oppløsningsmidlet eller pH-verdien for oppløsningsmiddelblan-dingen ligger i nærheten av det isoelektriske punktet for insulinet eller insulinderivatet som skal renses og dobbeltioner er tilsted, hvorved dobbeltionene foreligger i konsentrasjonsområdet 10 mmol/1 til 1 mol/l.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at pH-verdien for oppløsningsmiddelblandingen ligger inntil en pH-enhet under eller over det isoelektriske punktet for insulinet eller insulinderivatet som skal renses.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at pH-verdien for oppløsningsmiddelblandingen ligger inntil 0,5 pE-enheter under eller over det isoelektriske punktet.

4. Fremgangsmåte ifølge et eller flere av kravene 1 til 3, karakterisert ved at det som dobbeltioner anvendes ot-aminosyrer eller betainer.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at det som dobbeltion anvendes glycin, glutaminsyre eller glycinbetain.

6. Fremgangsmåte ifølge et eller flere av kravene 1 til 5, karakterisert ved at det anvendes insulinderivater med formel I hvori R<30> står for resten av en genetisk kodbar L-aminosyre, X står for en hydroksygruppe, en fysiologisk godtagbar organisk gruppe av basisk karakter med inntil 50 C-atomer, en genetisk kodbar L-aminosyre og deres eventuelt tilstedeværende endestående karboksyl-funksjon kan foreligge fri, som esterfunksjon, som amidfunksjon, som lakton eller redusert til CEtøOH, n står for et helt tall fra 0 til 10, Y står for hydrogen eller L-fenylalanin og A- og B-kjedene er sekvenser av animalsk eller menneskelig insulin.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at det anvendes insulinderivat med formel I, hvor R<30> står for L-alanin eller L-treonin og X står for en eller flere L-aminosyrer fra gruppen L- arginin, L-lysin eller L-fenylalanin.

8. Fremgangsmåte ifølge et eller flere av kravene 1 til 7, karakterisert ved at det anvendes et preparativt høytrykks væskekromatografisk anlegg.