JP5992836B2 - ペプチドを精製するための分取rp−hplc法 - Google Patents
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- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
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Description
a.対象のポリペプチドを含む混合物をRP-HPLCシステムに導入するステップであり、その混合物が移動相中に溶解されており、その移動相が対象のポリペプチドのpI値から少なくとも1単位離れたpH値を有するステップと、
b.移動相のpHを対象のポリペプチドのpI値から1単位未満離れたpH値へ調整するステップであり、pH調整を段階操作またはpH勾配で行うステップと、
c.対象のポリペプチドを溶出して、精製されたその組成物を得るステップとを含む。
a.対象のポリペプチドを含む混合物をRP-HPLCシステムに導入するステップであり、その混合物が移動相中に溶解されており、その移動相が対象のポリペプチドのpI値から少なくとも1単位離れたpH値を有するステップと、
b.RP-HPLCシステムのpHを対象のポリペプチドのpI値から1単位未満離れたpH値へ調整するステップであり、pH調整を段階操作またはpH勾配で行うステップと、
c.対象のポリペプチドを溶出して、精製されたその組成物を得るステップとを含む。
(a)N末端アミノ酸のα-炭素に結合したアミノ基、
(b)C末端アミノ酸のα-炭素に結合したカルボキシ基、
(c)任意のLys残基のε-アミノ基、
(d)任意のAspおよびGlu残基のR基のカルボキシ基、
(e)任意のTyr、SerおよびThr残基のR基の水酸基、
(f)任意のTrp、Asn、Gln、ArgおよびHis残基のR基のアミノ基、または
(g)任意のCys残基のR基のチオール基。
1.RP-HPLCシステム上にて対象のポリペプチドを液体混合物中の少なくとも1つの不要な成分から分離する方法であって、
a.対象のポリペプチドを含む混合物をRP-HPLCシステムに導入するステップであり、その混合物が移動相中に溶解されており、その移動相が対象のポリペプチドのpI値から少なくとも1単位離れたpH値を有するステップと、
b.移動相のpHを対象のポリペプチドのpI値から1単位未満離れたpH値へ調整するステップであり、pH調整を段階操作またはpH勾配で行うステップと、
c.対象のポリペプチドを溶出して、精製されたその組成物を得るステップとを含む方法。
2.ステップbとステップcの間にステップを追加し、精製しようとするペプチドまたはタンパク質のpI値から少なくとも1単位離れたpH値へpHを再調整し、前記調整を段階操作またはpH勾配で行う、態様1に記載の方法
3.ステップa.におけるpH値が、精製しようとするペプチドまたはタンパク質のpI値から少なくとも1.5単位である、態様1または2に記載の方法
4.ステップa.におけるpH値が、精製しようとするペプチドまたはタンパク質のpI値から少なくとも2単位である、上記態様のいずれか1つに記載の方法
5.ステップa.におけるpH値が、精製しようとするペプチドまたはタンパク質のpI値から少なくとも2.5単位である、上記態様のいずれか1つに記載の方法
6.ステップa.におけるpH値が、精製しようとするペプチドまたはタンパク質のpI値より高い、上記態様のいずれか1つに記載の方法
7.ステップa.におけるpH値が5.5〜9.0の間である、上記態様のいずれか1つに記載の方法
8.ステップa.におけるpH値が6.0〜8.5の間である、上記態様のいずれか1つに記載の方法
9.ステップa.におけるpH値が7.0〜8.0の間である、上記態様のいずれか1つに記載の方法
10.ステップa.におけるpH値が7.0〜9.0の間である、上記態様のいずれか1つに記載の方法
11.ステップa.におけるpH値がおよそ8.0である、上記態様のいずれか1つに記載の方法
12.ステップa.におけるpH値が2.5〜5.0の間である、上記態様のいずれか1つに記載の方法
13.ステップa.におけるpH値が2.5〜4.0の間である、上記態様のいずれか1つに記載の方法
14.ステップa.におけるpH値が2.5〜3.5の間である、上記態様のいずれか1つに記載の方法
15.ステップbにおけるpH値が、精製しようとするペプチドまたはタンパク質のpI値から0.8単位未満である、上記態様のいずれか1つに記載の方法
16.ステップbにおけるpH値が、精製しようとするペプチドまたはタンパク質のpI値から0.6単位未満である、上記態様のいずれか1つに記載の方法
17.ステップbにおけるpH値が、精製しようとするペプチドまたはタンパク質のpI値から0.5単位未満である、上記態様のいずれか1つに記載の方法
18.ステップbにおけるpH値が、精製しようとするペプチドまたはタンパク質のpI値より高い、上記態様のいずれか1つに記載の方法
19.ステップbにおけるpH値が3.5〜5.5の間である、上記態様のいずれか1つに記載の方法
20.ステップbにおけるpH値が4.0〜5.5の間である、上記態様のいずれか1つに記載の方法
21.ステップbにおけるpH値が4.5〜5.2の間である、上記態様のいずれか1つに記載の方法
22.ステップbにおけるpH値が4.5〜7.0の間である、上記態様のいずれか1つに記載の方法
23.ステップbにおけるpH値が4.8〜6.5の間である、上記態様のいずれか1つに記載の方法
24.ステップbにおけるpH値が5.0〜6.0の間である、上記態様のいずれか1つに記載の方法
25.ステップbにおける移動相のpHをpH勾配で調整する、上記態様のいずれか1つに記載の方法
26.ステップbと同時に有機変性剤の勾配を適用して標的のペプチドをRP-HPLCシステム上に保持したまま不要な不純物を除去するステップを含む、上記態様のいずれか1つに記載の方法
27.ステップbにおける有機変性剤の勾配が約25%〜約48%であり、そのpH勾配がpH7.4〜4.5である、態様26に記載の方法
28.ステップb)におけるpH勾配が約7.4〜約4.5である、上記態様のいずれか1つに記載の方法
29.RPゲルの温度が高温である、上記態様のいずれか1つに記載の方法
30.RPゲルの温度が摂氏20〜70度の間である、態様1〜28のいずれか1つに記載の方法。
31.RPゲルの温度が摂氏40〜60度の間の高温である、上記態様のいずれか1つに記載の方法
32.RPゲルの温度が約摂氏50度の高温である、上記態様のいずれか1つに記載の方法
33.RPゲルの温度が約室温である、態様1〜28のいずれか1つに記載の方法
34.RP-HPLCシステムにおいて使用される吸着剤がC-4シリカ、C-6シリカ、C-12シリカ、C-18シリカおよびフェニル系シリカなどの置換シリカ、ポリスチレンなどのポリマー材料、膜、モノリス材料ならびに濾材から成る群から選択される、上記態様のいずれか1つに記載の方法
35.RP-HPLCシステムにおいて使用される吸着剤が、C18(オクタデシル-ジメチルシリル)リガンドにより置換され、約15μmおよび孔径約100Åの粒子を有するゲルである、上記態様のいずれか1つに記載の方法
36.ペプチドまたはタンパク質が、GLP-1ペプチド、エキセンディンペプチドまたはGLP-1誘導体から成る群から選択される、上記態様のいずれか1つに記載の方法。
37.有機変性剤がエタノール、メタノール、プロパノールおよびアセトニトリルから成る群から選択される、態様26または27に記載の方法。
38.対象のポリペプチドが糖尿病の治療に適切なポリペプチドである、上記態様のいずれか1つに記載の方法
39.対象のポリペプチドがグルカゴン様ペプチドまたはGLP-1作動薬である、上記態様のいずれか1つに記載の方法。
40.対象のポリペプチドがGLP-1(1〜37)またはその類似体もしくは誘導体である、上記態様のいずれか1つに記載の方法。
41.GLP-1(1〜37)またはその類似体もしくは誘導体を組換えによって得る、上記態様のいずれか1つに記載の方法。
42.前記少なくとも1つの不要な成分が、前記ポリペプチドのグリコシル化形態、脱アミド化形態、または酸化形態などの前記ポリペプチドの別の形態である、上記態様のいずれか1つに記載の方法。
43.対象のポリペプチドと前記少なくとも1つの不要な成分との関係が、少なくとも4:1である、上記態様のいずれかに記載の方法。
44.対象のポリペプチドと前記少なくとも1つの不要な成分との関係が、少なくとも10:1である、上記態様のいずれかに記載の方法。
45.対象のポリペプチドと前記少なくとも1つの不要な成分との関係が、少なくとも20:1である、上記態様のいずれかに記載の方法。
46.対象のポリペプチドと前記少なくとも1つの不要な成分との関係が、少なくとも50:1である、上記態様のいずれかに記載の方法。
47.対象のポリペプチドと前記少なくとも1つの不要な成分との関係が、少なくとも80:1である、上記態様のいずれかに記載の方法。
(実施例1)
N-ε26-[2-(-2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)-4(S)-カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル][AIB8,ARG34]GLP-1(7〜37)ペプチドのRP-HPLC精製
N-ε26-[2-(-2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)-4(S)-カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34]GLP-1(7〜37)ペプチドを合成によって産生した。アシル化された混合物をまず従来の陰イオン交換によって精製し、次いで、N-ε26-[2-(-2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)-4(S)-カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34]GLP-1(7〜37)ペプチドおよび関連不純物を含有する得られたプールを水で希釈した。約120mlの10mmol/kgクエン酸緩衝液、50mmol/kg NaCl、25%(w/w)エタノール、pH4.5で平衡化した20mlのC18-置換(オクタデシル-ジメチルシリル)シリカ樹脂(粒径:15μm)上へ、10mLの液体混合物(4.5mg/mL)を添加した。カラムを60mlの平衡化溶液で洗浄し、400mlに対して41〜46%(w/w)エタノール(10mmol/kgクエン酸緩衝液、50mmol/kg NaCl)の直線勾配によって溶出を実施した。クロマトグラフィー温度は50℃に維持した。
N-ε26-[2-(-2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)-4(S)-カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル][AIB8,ARG34]GLP-1(7〜37)ペプチドのRP-HPLC精製
N-ε26-[2-(-2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)-4(S)-カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34]GLP-1(7〜37)ペプチドを合成によって産生した。アシル化された混合物をまず従来の陰イオン交換によって精製し、次いで、N-ε26-[2-(-2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)-4(S)-カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34]GLP-1(7〜37)ペプチドおよび関連不純物を含有する得られたプールを水で希釈した。約120mlの10mmol/kgクエン酸緩衝液、50mmol/kg NaCl、25%(w/w)エタノール、pH5.2で平衡化した20mlのC18-置換(オクタデシル-ジメチルシリル)シリカ樹脂(粒径:15μm)上へ、10mlの液体混合物(4.5mg/ml)を添加した。カラムを60mlの平衡化溶液で洗浄し、400mlに対して39〜44%(w/w)エタノール(10mmol/kgクエン酸緩衝液、50mmol/kg NaCl)の直線勾配によって溶出を実施した。クロマトグラフィー温度は50℃に維持した。
N-ε26-[2-(-2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)-4(S)-カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル][AIB8,ARG34]GLP-1(7〜37)ペプチドのRP-HPLC精製
N-ε26-[2-(-2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)-4(S)-カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34]GLP-1(7〜37)ペプチドを合成によって産生した。アシル化された混合物をまず従来の陰イオン交換によって精製し、次いで、N-ε26-[2-(-2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)-4(S)-カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34]GLP-1(7〜37)ペプチドおよび関連不純物を含有する得られたプールを水で希釈した。約120mlの10mmol/kgクエン酸緩衝液、50mmol/kg NaCl、25%(w/w)エタノール、pH5.5で平衡化した20mlのC18-置換(オクタデシル-ジメチルシリル)シリカ樹脂(粒径:15μm)上へ、10mlの液体混合物(4.5mg/ml)を添加した。カラムを60mlの平衡化溶液で洗浄し、400mlに対して38〜43%(w/w)エタノール(10mmol/kgクエン酸緩衝液、50mmol/kg NaCl)の直線勾配によって溶出を実施した。クロマトグラフィー温度は50℃に維持した。
N-ε26-[2-(-2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)-4(S)-カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル][AIB8,ARG34]GLP-1(7〜37)ペプチドのRP-HPLC精製
N-ε26-[2-(-2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)-4(S)-カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34]GLP-1(7〜37)ペプチドを合成によって産生した。アシル化された混合物をまず従来の陰イオン交換によって精製し、次いで、N-ε26-[2-(-2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)-4(S)-カルボキシブチリルアミノ]エトキシ)エトキシ]アセチルアミノ)エトキシ]エトキシ)アセチル][Aib8,Arg34]GLP-1(7〜37)ペプチドおよび関連不純物を含有する得られたプールを水で希釈した。約40mlの10mmol/kgクエン酸緩衝液、125mmol/kg NaCl、25%(w/w)エタノール、pH7.4で平衡化した20mlのC18-置換(ジメチルシリル)シリカ樹脂(粒径:15μm)上へ、10mlの液体混合物(4.5mg/ml)を添加した。カラムを60mlに対して25〜48%(w/w)エタノール(10mmol/kgクエン酸緩衝液、125mmol/kg NaCl、pH4.5)の直線勾配によって洗浄し、次いで40mlに対して48%(w/w) EtOHおよびpH4.5(10mmol/kgクエン酸緩衝液、50mmol/kg NaCl、pH4.5)での定組成洗浄によって洗浄した。次いで300mlに対するpH4.5〜7.4(10mmol/kgクエン酸緩衝液、125mmol/kg NaCl、EtOH 48%w/w)の直線pH勾配溶出によって標的のポリペプチドを溶出した。クロマトグラフィー温度は50℃に維持した。
インスリンアスパルトのRP-HPLC精製
ヒトインスリンアスパルトdesB30はヒトインスリンアスパルト前駆体のALP切断により産生され、その前駆体は酵母発酵から産生された。インスリンアスパルトdesB30および関連不純物を含有する0.52gの結晶を、40mlの20mmol/kgクエン酸緩衝液、16%(w/w)エタノール、pH4.0中に溶解し、pHを約3.7へ調整してdesB30を可溶化した。約60mlの20mmol/kgクエン酸緩衝液、16%(w/w)エタノール、pH4.0で平衡化した20mlのC18-置換(オクタデシル-ジメチルシリル)シリカ樹脂(粒径:15μm)上へ、20mlの液体混合物(11mg/ml)を添加した。カラムを20mlの平衡化溶液で洗浄し、200mlに対して16〜29%(w/w)エタノール(20mmol/kgクエン酸緩衝液、pH5.8)の直線勾配によって、次いで、40mlに対して29%(w/w) EtOHおよびpH5.8(20mmol/kgクエン酸緩衝液、pH5.8)での定組成洗浄によって溶出を実施した。次いで200mlに対するpH5.8〜8.0(20mmol/kgトリス緩衝液、EtOH 29% w/w、pH8.0)の直線pH勾配溶出によって標的のヒトインスリンdesB30を溶出した。クロマトグラフィーは室温で実施した。
パルミトイル-γ-GLU-LYS26-ARG34GLP-1(7〜37)ペプチドのRP-HPLC精製
パルミトイル-γ-Glu-Lys26-Arg34GLP-1(7〜37)ペプチドは、酵母発酵から産生された。パルミトイル-γ-Glu-Lys26-Arg34GLP-1(7〜37)ペプチドおよび関連不純物を含有するアシル化混合物を水で希釈した。約60mlの20mmol/kgトリス緩衝液、20%(w/w)エタノール、pH7.5で平衡化した20mlのC18-置換(オクタデシル-ジメチルシリル)シリカ樹脂(粒径:15μm)上へ、36mlの液体混合物(4mg/ml)を添加した。カラムを20mlの平衡化溶液で洗浄し、200mlに対して20〜50%(w/w)エタノール(20mmol/kgクエン酸緩衝液、pH5.1)の直線勾配によって、次いで、40mlに対して50%(w/w) EtOHおよびpH5.1 (20mmol/kgクエン酸緩衝液、pH5.1)での定組成洗浄によって溶出を実施した。次いで200mlに対するpH5.1〜4.0(20mmol/kgクエン酸緩衝液、EtOH 50% w/w、pH4.0)の直線pH勾配溶出によって標的パルミトイル-γ-Glu-Lys26-Arg34GLP-1(7〜37)ペプチドを溶出した。クロマトグラフィー温度は60℃に維持した。
Claims (14)
- 分取RP-HPLCシステム上にて対象のポリペプチドを液体混合物中の少なくとも1つの不要な成分から分離する方法であって、
a.対象のポリペプチドを含む混合物を分取RP-HPLCシステムに導入するステップであって、混合物が移動相中に溶解されており、移動相が対象のポリペプチドのpI値から少なくとも1単位離れたpH値を有するステップと、
b.移動相のpHを対象のポリペプチドのpI値から1単位未満離れたpH値へ調整するステップであり、pH調整を段階操作またはpH勾配で行うステップと、
c.対象のポリペプチドを溶出して、精製されたその組成物を得るステップとを含み、
対象のポリペプチドが、グルカゴン様ペプチドまたはGLP-1アゴニストである、方法。 - ステップbとステップcの間にステップを追加し、精製しようとするペプチドまたはタンパク質のpI値から少なくとも1単位離れたpH値へpHを再調整し、前記調整を段階操作またはpH勾配で行う、請求項1に記載の方法。
- ステップaにおけるpH値が、精製しようとするペプチドまたはタンパク質のpI値より高い、請求項1または2に記載の方法。
- ステップaにおけるpH値が5.5〜9.0の間である、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- ステップbにおけるpH値が3.5〜5.5の間である、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- ステップb.における移動相のpHをpH勾配で調整する、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- ステップbと同時に有機変性剤の勾配を適用して、標的のペプチドを分取RP-HPLCシステム上に保持したまま不要な不純物を除去するステップを含む、請求項1から6のいずれかに記載の方法。
- ステップbにおける有機変性剤の勾配が25%から48%までであり、移動相のpHをpH7.4から4.5までのpH勾配で調整する、請求項7に記載の方法。
- ステップb.における移動相のpHを7.4から4.5へ調整する、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
- RPゲルの温度が摂氏20〜70度の間である、請求項1から9のいずれかに記載の方法。
- RP-HPLCシステムにおいて使用される吸着剤が、置換シリカ、ポリマー材料、膜、モノリス材料ならびに濾材から成る群から選択される、請求項1から10のいずれかに記載の方法。
- 有機変性剤が、エタノール、メタノール、プロパノールおよびアセトニトリルから成る群から選択される、請求項7から11のいずれか一項に記載の方法。
- 対象のポリペプチドが、糖尿病の治療に適切なポリペプチドである、請求項1から12のいずれかに記載の方法。
- 前記少なくとも1つの不要な成分が、前記ポリペプチドの別の形態である、請求項1から13のいずれかに記載の方法。
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