JP2007526235A - グルカゴン様ペプチドの精製 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、タンパク質精製の分野に関する。特に、本発明はグルカゴン様ペプチド、および少なくとも1の関連する不純物を含む組成物からグルカゴン様ペプチドを、逆相高速液体クロマトグラフィにより精製する方法に関する。
タンパク質とペプチド(ポリペプチド)の精製と分析のために、クロマトグラフィは周知であり広く使われている方法である。これらの逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)の中で、多くの異なるクロマトグラフィ原理が適用される。RP-HPLC分離原理は、ポリペプチド溶質とクロマトグラフィ用樹脂面の上での疎水性結合との間の疎水性関係に基づく。RP-HPLC精製は、通常、以下の1以上の部分からなる:平衡、添加(load)、洗浄、溶出および再生。
以下は、本明細書で使用される用語の詳細な定義である。
1 5 10 15 20 25 30 35
GLP-1 HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK EFIAW LVKGR G
GLP-2 HADGS FSDEM NTILD NLAAR DFINW LIQTK ITD
エキセンジン-4 HGEGT FTSDL SKQME EEAVR LFIEW LKNGG PSSGA PPPS-NH2
エキセンジン-3 HSDGT FTSDL SKQME EEAVR LFIEW LKNGG PSSGA PPPS-NH2
OXM HSQGT FTSDY SKYLD SRRAQ DFVQW LMDTK RNKNN IA
ペプチドに関してここで使用される「類似体」の語は、修飾されたペプチドであって、当該ペプチドの1以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基により置換されている、および/または当該ペプチドから1以上のアミノ酸が欠失している、および/または当該ペプチドから1以上のアミノ酸が欠失している、および/または当該ペプチドに対して1以上のアミノ酸残基が付加しているペプチドを意味する。そのようなアミノ酸残基の付加または欠失は、当該ペプチドのN末端および/またはC末端で起こり得る。2つの異なる単純な系が、多くの場合使用され、類似体が記述される:例えば、Arg34-GLP-1(7-37)またはK34R-GLP-1(7-37)は、GLP-1類似体であって、34位に天然に生じるリジンがアルギニンで置換されているものを呼ぶ(IUPAC-IUB命名法に従って使用されるアミノ酸の標準的な一文字略号)。
第1の側面において、本発明は、前記グルカゴン様ペプチドおよび少なくとも1の関連する不純物を含む組成からグルカゴン様ペプチドを精製する方法に関し、当該方法は、逆相高速液体クロマトグラフィプロセスであり、ここで、溶出に使用される溶媒は、約pH4〜約pH10の範囲でpH緩衝化されており、且つ前記溶媒は、アルコールを約10%w/w〜約80%w/wの濃度で含有する方法である。
Arg34、Lys26(Nε-(γ-Glu(Nα-ヘキサデカノイル)))-GLP-1(7-37)である。
本発明の更なる態様において、当該親油性置換記は、8〜40の炭素原子、好ましくは8〜24の炭素原子、例えば、12〜18の炭素原子を有する。
D3E/D8K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/E9K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/M10K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/N11K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/T12K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/I13K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/L14K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/D15K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/N16K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/L17K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/A18K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/D21K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/N24K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/Q28K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); および
その誘導体。
S5K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)-GLP-2(1-33);
S7K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)-GLP-2(1-33);
D8K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)-GLP-2(1-33);
E9K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)-GLP-2(1-33);
M10K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)-GLP-2(1-33);
N11K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)-GLP-2(1-33);
T12K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)-GLP-2(1-33);
I13K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)-GLP-2(1-33);
L14K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)-GLP-2(1-33);
D15K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)-GLP-2(1-33);
N16K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)-GLP-2(1-33);
L17K(3-(オクタノイルアミノ)プロピオニル)-GLP-2(1-33);
L17K(3-(ノナノイルアミノ)プロピオニル)-GLP-2(1-33);
L17K(3-(デカノイルアミノ)プロピオニル)-GLP-2(1-33);
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D3E/L17K(4-(デカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(4-(ウンデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(4-(ドデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(4-(トリデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(4-(テトラデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(4-(ペンタデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(4-(ヘキサデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(4-(ヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(4-(オクタデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(4-(ノナデカノイルアミノ)ブタノイル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(4-(エイコサノイルアミノ)ブタノイル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/A18K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/D21K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/N24K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);および
D3E/Q28K(3-(ヘキサデカノイルアミノ)プロピオニル)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)。
更に、本発明の発明において、当該グルカゴン様ペプチドは、エキセンジン-4の誘導体であり、ここで、当該導入された置換基は、アミド、炭水化物、アルキル基、エステルおよび親油性置換基から選択される。エキセンジン-4(1-39)のインスリン分泌性誘導体およびその類似体の例はTyr31-エキセンジン-4(1-31)-アミドである。
例1
分析用のRP-HPLC。収集されたピークの同定/検証のためのRP-HPLC分析は、ウォーターズシンメトリーRP-18、3.5 μm、100Å、4.6 x 150 mm カラムにおいて実行した。緩衝液Aは、7.8 % (w/w)アセトニトリル中の0.15Mの(NH4)2SO4 を含み、pH 2.5であり、緩衝液Bは、63.4 %(w/w)のアセトニトリルを含む。リニアなグラジエント、即ち、37〜44.1%のBで15分間、続いて、44.1〜100%のBで10 分間を、流速を1ml/minで流した。当該クロマトグラフィ温度は、60℃に維持し、UV 検出は214nmで行った。
Arg34GLP-1(7-37) を通常の組み替えDNA技術、即ち、WO 98/08871に記載の方法によって、酵母(S. cerevisiae)に発現させた。発酵浴中のArg34GLP-1(7-37) を、次に、通常の逆相クロマトグラフィにより精製し、引き続いて当該ペプチドの等電点のpH、即ち、pH 5.4で沈殿した。当該沈殿物を遠心分離で単離した。
Arg34GLP-1(7-37)は、酵母において発現され、RP-LCにより捕捉され、例2に記載された通りに沈殿した。
Arg34GLP-1(7-37) は、酵母(S. cerevisiae)に通常の組み替えDNA技術、例えば、WO 98/08871に記載の方法などによって発現された。発酵ブロスフリーの細胞におけるArg34GLP-1(7-37)は、陽イオン交換クロマトグラフィにより精製され、Arg34GLP-1(7-37)を含む得られたプールのpHはpH9.0に調整した。
Arg34GLP-1(7-37)は、通常の組み替えDNA技術、例えば WO 98/08871に記載さえる通りの技術などにより酵母(S. cerevisiae)において発現された。Arg34GLP-1(7-37) は、陽イオン交換クロマトグラフィにより例4に記載された通りの方法により捕獲された。
Arg34GLP-1(7-37)が酵母において発現され、例4で示された通りに陽イオン交換クロマトグラフィで捕獲された。
Arg34GLP-1(7-37)を酵母で発現させ、例4に記載した通りの陽イオン交換クロマトグラフィにより捕獲した。
Arg34GLP-1(7-37)が酵母において発現され、例4に記載された通りの陽イオン交換クロマトグラフィにより捕獲された。
例4で述べられたように、Arg34GLP-1(7-37)は酵母で発現され、陽イオン交換クロマトグラフィによって捕獲された。
例4で述べられたように、Arg34GLP-1(7-37)は酵母で発現され、陽イオン交換クロマトグラフィによって捕獲された。
例2で述べられるように、Arg34GLP-1(7-37)は酵母で発現され、RP-LCで捕えられて、沈殿された。
Arg34GLP-1(7-37)は、他で記載されたような従来の組み替え技術、例えば、WO 98/08871の技術によって酵母(S.cerevisiae)で発現された。発酵ブロス中のArg34GLP-1(7-37)は、次に、pH 9.0でグリシン・バッファでの溶出による逆相クロマトグラフィによって精製された。
Arg34GLP-1(7-37)は、他で記載される従来の組み替え技術、例えば、WO 98/08871に記載の技術によって酵母(S.cerevisiae)で発現された。発酵ブロスでのArg34GLP-1(7-37)は、次にpH 9.0でグリシン・バッファでの溶出により逆相クロマトグラフィによって精製された。
Arg34GLP-1(7-37)は、他で記載される従来の組み替え技術、例えば、WO 98/08871に記載の技術によって酵母(S.cerevisiae)において発現された。発酵ブロスにおけるArg34GLP-1(7-37)は、従来の逆相クロマトグラフィによって精製され、続いて、ペプチドの等電pH、すなわちpH 5.4で沈殿された。当該沈殿物は、遠心分離によって単離された。
Arg34Lys26Nε(γ-Glu(Nα-ヘキサデカノイル))GLP-1(7-37)は、WO 00/55119で述べられるようなアシル化により、親ペプチドArg34GLP-1(7-37)から製造された。
Lys17Arg30GLP-2(1-33)は、従来の組み換えDNA技術によって、例えば、WO 98/08871で述べられるように酵母(S.cerevisiae)において発現された。Lys17Arg30GLP-2(1-33)は、RP-LCで捕捉され、Lys17Arg30GLP-2(1-33)(pH 4.0)の等電pHで沈殿した。当該ペプチドは、更にヒドロキシアパタイトカラムの上で精製されて、100mmol/kgのカリウム水素リン酸塩(pH 7.8)で溶出された。捕獲物のプールは、pH 8で陰イオン交換クロマトグラフィによって精製された。
Arg30Lys17Nε(β-Ala(Nα-ヘキサデカノイル))GLP-2(1-33)は、WO 00/55119で述べられるようなアシル化によって親ペプチド、Lys17Arg30GLP-2(1-33)から製造された。
エキセンジン-4(1-39)(アミノ酸配列HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSを有する)とエキセンジン-4(2-39)(アミノ酸配列GEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSを有する)は、Fmoc化学を使用する標準的固相合成方法によって合成された。
エキセンジン-4(1-39)とエキセンジン-4(2-39)は、Fmoc化学を使用する標準の固相合成方法によって合成された。
L-His1エキセンジン-4(1-39)とD-His1エキセンジン-4(1-39)(アミノ酸配列HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSを有する)は、Fmoc化学を使用する標準の固相合成方法によって総合された。
L-His1エキセンジン-4(1-39)とD-His1エキセンジン-4(1-39)は、Fmoc化学を使用する標準の固相合成方法によって合成された。
Claims (41)
- グルカゴン様ペプチドを、グルカゴン様ペプチドおよび少なくとも1の関連する不純物を含む組成から精製するための逆相高速液体クロマトグラフィプロセスである方法であって、溶出に使用される溶媒が、約pH4〜約pH10の範囲にpH緩衝化され、前記溶媒がアルコールを約10%w/w〜約80%w/wの濃度で含む、グルカゴン様ペプチドを精製する方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記溶媒が、約pH5〜約pH9の範囲にpH緩衝化される方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記溶媒が、前記グルカゴン様ペプチドの等電点よりも高いpHでpH緩衝化される方法。
- 請求項1〜3の何れか1項に記載の方法であって、前記溶媒が、pHの可動域が、当該溶出工程の間中、設定値から+/-1.0pH単位よりも大きくなるのを防ぐようにpH緩衝化された溶媒である方法。
- 請求項1〜4の何れか1項に記載の方法であって、前記溶媒が、pHの可動域が、当該溶出工程の間中、設定値から+/-0.5pH単位よりも大きくなるのを防ぐようにpH緩衝かされた溶媒である方法。
- 請求項1〜5の何れか1項に記載の方法であって、前記アルコールがエタノールである方法。
- 請求項1〜6の何れか1項に記載の方法であって、前記アルコールが2-プロパノールである方法。
- 請求項1〜7の何れか1項に記載の方法であって、前記アルコールがメタノール、1-プロパノールおよびヘキシレングリコールからなる群より選択される方法。
- 請求項1〜8の何れか1項に記載の方法であって、前記逆相高速液体クロマトグラフィプロセスが、シリカベースのクロマトグラフィ用樹脂を使用して実施される方法。
- 請求項8に記載の方法であって、前記樹脂が置換されたシリカゲルであり、例えば、C4-、C6-、C8-、C12-、C16-、C18-、C20-、フェニル-またはベンゼン-などで置換されたシリカゲルである方法。
- 請求項1〜8の何れか1項に記載の方法であって、前記逆相高速液体クロマトグラフィプロセスが、ポリマーベースの物質であるクロマトグラフィ用樹脂を使用して行われる方法。
- 請求項1〜11の何れか1項に記載の方法であって、前記関連不純物が、前記グルカゴン様ペプチドの切断型である方法。
- 請求項1〜12の何れか1項に記載の方法であって、前記関連不純物が、前記グルカゴン様ペプチドがグリコシル化された形態である方法。
- 請求項1〜13の何れか1項に記載の方法であって、前記溶媒が、アルコールを約20%w/w〜約60%w/wの濃度で含む方法。
- 請求項1〜14の何れか1項に記載の方法であって、前記溶媒が、アルコールを約20%w/w〜約40%w/wの濃度で含む方法。
- 請求項1〜15の何れか1項に記載の方法であって、前記グルカゴン様ペプチドがGLP-1、GLP-1類似体、GLP-1の誘導体またはGLP-1類似体の誘導体である方法。
- 請求項16に記載の方法であって、前記GLP-1類似体が以下からなる群より選択される方法;Arg34-GLP-1(7-37)、Gly8-GLP-1(7-36)-アミド、Gly8-GLP-1(7-37)、Val8-GLP-1(7-36)-アミド、Val8-GLP-1(7-37)、Val8Asp22-GLP-1(7-36)-アミド、Val8Asp22-GLP-1(7-37) 、Val8Glu22-GLP-1(7-36)-アミド 、Val8Glu22-GLP-1(7-37)、Val8Lys22-GLP-1(7-36)-アミド、Val8Lys22-GLP-1(7-37)、Val8Arg22-GLP-1(7-36)-アミド、Val8Arg22-GLP-1(7-37)、Val8His22-GLP-1(7-36)-アミド、Val8His22-GLP-1(7-37)、Val8Trp19Glu22-GLP-1(7-37)、Val8Glu22Val25-GLP-1(7-37)、Val8Tyr16Glu22-GLP-1(7-37)、Val8Trp16Glu22-GLP-1(7-37)、Val8Leu16Glu22-GLP-1(7-37)、Val8Tyr18Glu22-GLP-1(7-37)、Val8Glu22His37-GLP-1(7-37)、Val8Glu22Ile33-GLP-1(7-37)、Val8Trp16Glu22Val25Ile33-GLP-1(7-37)、Val8Trp16Glu22Ile33-GLP-1(7-37)、Val8Glu22Val25Ile33-GLP-1(7-37)、Val8Trp16Glu22Val25-GLP-1(7-37)、その類似体およびこれらの何れかの誘導体。
- 請求項16に記載の方法であって、前記GLP-1の誘導体またはGLP-1類似体の誘導体が、リジン残基、例えば、1のリジン、を有する誘導体であり、親油性の置換基が任意にスペーサ-を介して前記リジンのイプシロンアミノ基に結合している方法。
- 請求項18に記載の方法であって、前記親油性の置換基が8〜40の炭素原子、好ましくは8〜24の炭素原子、例えば12〜18の炭素原子を有する方法。
- 請求項18〜19の何れか1項に記載の方法であって、前記スペーサ-が存在し、アミノ酸、例えば、ベータ-Ala、L-Glu、またはアミノブチロイルから選択される方法。
- 請求項1から20の何れか1項に記載の方法であって、前記グルカゴン様ペプチドが、DPPIV保護グルカゴン様ペプチドである方法。
- 請求項1から21の何れか1項に記載の方法であって、前記グルカゴン様ペプチドが血漿安定性グルカゴン様ペプチドである方法。
- 請求項16に記載の方法であって、前記GLP-1類似体の誘導体が、Arg34、Lys26(Nε-(γ-Glu(Nα-ヘキサデカノイル)))-GLP-1(7-37).
- 請求項16〜23の何れか1項に記載の方法であって、前記グルカゴン様ペプチドが、
25〜37のアミノ酸残基、好ましくは27〜35のアミノ残基、更により好ましくは29〜33アミノ酸残基を有する方法。 - 請求項1〜15の何れか1項に記載の方法であって、前記グルカゴン様ペプチドがGLP-2、GLP-2類似体,GLP-2の誘導体またはGLP-2類似体の誘導体である方法。
- 請求項25に記載の方法であって、前記GLP-2の誘導体またはGLP-2類似体の誘導体が、リジン残基、例えば、1のリジンであり、親油性置換基が任意にスペーサを介して前記リジンのイプシロンアミノ基に結合する方法。
- 請求項26に記載の方法であって、前記親油性置換基が、8〜40の炭素原子、好ましくは8〜24の炭素原子、例えば、12〜18の炭素原子を有する方法。
- 請求項26〜27の何れか1項に記載の方法であって、前記スペーサが存在し、アミノ酸、例えばベータ-Ala、L-Glu、アミノブチロイルから選択される方法。
- 請求項25〜28の何れか1項に記載の方法であって、前記グルカゴン様ペプチドが27〜39アミノ酸残基、好ましくは29〜37アミノ酸残基、更に好ましくは31〜35アミノ酸残基を有する方法。
- 請求項25に記載の方法であって、前記グルカゴン様ペプチドがGly2-GLP-2(1-33)である方法。
- 請求項1〜15の何れか1項に記載の方法であって、前記グルカゴン様ペプチドがエキセンジン-4、エキセンジン-4 類似体、エキセンジン-4の誘導体、またはエキセンジン-4 類似体の誘導体である方法。
- 請求項31に記載の方法であって、前記グルカゴン様ペプチドがエキセンジン-4である方法。
- 請求項31に記載の方法であって、前記グルカゴン様ペプチドがZP-10、即ち、HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPSKKKKKK-NH2である方法。
- 請求項31に記載の方法であって、前記エキセンジン-4の誘導体またはエキセンジン-4類似体の誘導体がアシル化またはペグ化されている方法。
- 請求項31に記載の方法であって、前記エキセンジン-4の誘導体、またはエキセンジン-4 類似体の誘導体が、リジン残基、例えば、1のリジンを有し、前記リジンが、親油性置換基が任意にスペーサを介して前記リジンのエプシロンアミノ基に結合するようなリジンである方法。
- 請求項35に記載の方法であって、前記親油性置換基が8〜40の炭素原子、好ましくは8〜24の炭素原子、例えば、12〜18の炭素原子を有する方法。
- 請求項35〜36の何れか1項に記載の方法であって、前記スペーサが存在し、アミノ酸、例えば、ベータ-Ala、L-Glu、またはアミノブチロイルから選択される方法。
- 以下の工程を具備するプロセスにより製造されるグルカゴン様ペプチド生成物;
a)グルカゴン様ペプチドを請求項1〜37の何れか1項に記載の方法を使用して精製すること、および
b)前記グルカゴン様ペプチドを単離し、得られるポリペプチド生成物を与えること。 - 以下の工程を具備するプロセスにより製造される医薬組成物;
a)第1に、グルカゴン様ペプチドまたはその前駆体を請求項1〜37の何れか1項に記載の方法を使用して精製すること;
b)次に、前記グルカゴン様ペプチドを乾燥すること;および
c)最後に、薬学的に許容される賦形剤と混合すること。 - 請求項39に記載の医薬組成物の有効量を非経口投与することを具備する高血糖の治療方法であって、前記グルカゴン様ペプチドがGLP-1ペプチドである方法。
- 請求項39に記載の医薬組成物の有効量を非経口投与することを具備する短腸症候群の治療方法であって、前記グルカゴン様ペプチドがGLP-2ペプチドである方法。
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