JP2002539219A - Ｇｌｐ−１及び近縁ペプチドのイオン交換クロマトグラフィー分離 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明はＧＬＰ−１及び近縁の不純物を含む混合物からＧＬＰ−１又はその類似体もしくは誘導体を精製するためのイオン交換クロマトグラフィー方法、並びにかかるイオン交換クロマトグラフィー方法を含む工業的方法に関連する。溶離工程は有機改質剤、例えばアルコール、アルカン酸、尿素、グアニジン、ポリアルコール等を含んで成る溶液で実施される。水性溶離媒質のpHは、不純物の正味の電荷とは異なるタンパク質又はペプチド上の正味の電荷の分布を支持する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の分野 本発明はＧＬＰ−１及び近縁の不純物を含む混合物からＧＬＰ−１又はその類
似体もしくは誘導体を精製するためのイオン交換クロマトグラフィー方法、並び
にかかるイオン交換クロマトグラフィー方法を含む工業的方法に関連する。

【０００２】 背景 タンパク質及びペプチドの精製及び分析のためにクロマトグラフィーはよく知
られ且つ幅広く利用されている方法である。多種多様なクロマトグラフィー原理
、とりわけイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）の原理が応用されている。
ＩＥＣ原理には、イオン交換樹脂上のリガンドの電荷に従って陰イオン交換と陽
イオン交換といった二通りのアプローチが含まれる。慣用のＩＥＣ精製工程は通
常１又は複数回の平衡化段階、適用又は装填段階、洗浄段階、溶出段階及び再生
段階から成る（Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, ed., Mack Pu
blishing Co., Easton, PA, 1990又はRemington : The Science and Practice o
f Pharmacy, 19th Edition (1995) 参照のこと）。

【０００３】 工業的精製方法におけるＩＥＣの溶離の主たる原理は一定のpHでの水性緩衝溶
液内での階段又は線形勾配のいずれかでの塩成分勾配である（S. Bjorn and L.
Thim, Activation of Coagulation Factor VII to VIIa, Res. Discl. No. 269,
564-565, 1986参照のこと）。イソクラティック溶離も考えられているが、めっ
たに利用されていない。有機溶媒又は改質剤がタンパク質又はペプチドを所望の
形態又は単に溶液状に保つために溶液によく添加されている（K.H. Jorgensen,
Process for Purifying Insulin, US Patent No. 3,907,676, Sept. 23, 1975 ;
及びJ. Brange, O. Hallund and E. Sorensen, Chemical Stability of Insuli
n 5. Isolation, Characterisation and Identification of Insulin Transform
ation Products, Acta Pharm. Nord. 4 (4), 223-232, 1992参照）。

【０００４】 グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）（Schmidtら、Diabetologia 28 704
-707, 1985）並びにその類似体及び誘導体はＷＯ９８／０８８７１に開示のよう
に糖尿病の処置に利用されうる。ＧＬＰ−１ペプチド及び近縁の類似体は水性溶
媒の中に容易に溶解し、そして単量体で保たれる。しかしながら、水性溶媒中で
の塩勾配によるＧＬＰ−１の伝統的なＩＥＣ精製は、ＧＬＰ−１標的成分と近縁
の不純物との間での選択性の欠如を理由に困難な場合がある。

【０００５】 ＷＯ８７／０６９４１号（The General Hospital Corporation）はＧＬＰ−１
（７−３７）及びその機能性誘導体を含むペプチドフラグメント、並びに向イン
スリン薬としてのその利用を開示する。

【０００６】 ＷＯ９０／１１２９６号（The General Hospital Corporation）は、ＧＬＰ−
１（７−３６）及びその機能性誘導体を含んで成り、且つＧＬＰ−１（１−３６
）又はＧＬＰ−１（１−３７）の向インスリン活性を超える向インスリン活性を
有するペプチドフラグメント、並びに向インスリン薬としてのその利用を開示す
る。

【０００７】 ＷＯ９１／１１４５７号（Buckleyら）は活性ＧＬＰ−１ペプチド７−３４、
７−３５、７−３６及び７−３７の類似体を開示する。

【０００８】 ＷＯ９８／０８８７１号は少なくとも１個のアミノ酸残基に親油性置換基の結
合してＧＬＰ−１誘導体を開示する。その親油性置換基は詳しくは、例えば１２
〜２４個の炭素原子を含む長鎖基である。

【０００９】 ＷＯ９８／０８８７２号は少なくとも１個のアミノ酸残基に親油性置換基の結
合したＧＬＰ−２誘導体を開示する。この親油性置換基は詳しくは、例えば１２
〜２４個の炭素原子を含む長鎖基である。

【００１０】 ＷＯ９６／３２４１４号はＧＬＰ−２類似体を開示する。

【００１１】 ＥＰ ０６９９６８６−Ａ２（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ＆ Ｃｏ．）は生物学的
に活性であると報告されているＧＬＰ−１の所定のＮ末端切頭型フラグメントを
開示する。

【００１２】 ＥＰ ０７０８１７９−Ａ２（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ＆ Ｃｏ．）はＮ末端イ
ミダゾール基及び任意的に３４位のリジン残基に結合した枝分れしていないＣ₆
−Ｃ₁₀アシル基を含むＧＬＰ−１類似体及び誘導体を開示する。

【００１３】 発明の説明 １又は複数回の平衡化段階、適用又は装填段階、洗浄段階、溶離段階及び再生
段階から成る任意のタンパク質又はペプチドの精製のための上記のＩＥＣ技術と
は対照的に、本発明はＩＥＣによるＧＬＰ−１ペプチド及び全ての近縁の類似体
の精製のための有機改質剤の利用に関連する。ＩＥＣ精製工程の溶離段階への有
機改質剤の添加により、陰イオン及び陽イオン交換クロマトグラフィーの双方で
、水性緩衝剤で行った場合と比べ、選択性及び効率性の上昇が図られる。平衡用
の溶液及び適用サンプルは有機改質剤を含んでも含まなくてもよい。有機改質剤
の利用には、水性クロマトグラフィーシステムと比べ、特に陽イオン交換クロマ
トグラフィーに関し、溶離のために塩が必要でない又は極めて低い濃度で十分と
いった更なる利点がある。

【００１４】 広い観点において、本発明はペプチド及び近縁の不純物を含んで成る混合物か
ら前記ペプチドを精製するための陽イオン交換クロマトグラフィー方法であって
、下記の工程： 前記混合物の前記ペプチドと前記近縁の不純物とを、有機改質剤、水、任意的
に塩成分、及び任意的に緩衝剤を含んで成る溶液内での線形もしくは階段式勾配
の塩成分又はイクソクラティック式塩成分及び／あるいは線形もしくは階段式pH
勾配又は一定のpH値による溶離により分割させることを含んで成り、ここで当該
pH勾配又はpH値は、前記ペプチドが前記近縁の不純物の局部又は総合的な正の正
味の電荷とは異なる正の局部又は総合的な正味の電荷を有することで当該近縁の
不純物が除去されるといったpH範囲内にあるべきである、方法に関連する。

【００１５】 別の広い観点において、本発明はペプチド及び近縁の不純物を含んで成る混合
物から前記ペプチドを精製するための陽イオン交換クロマトグラフィー方法であ
って、下記の工程： 前記混合物の前記ペプチドと前記近縁の不純物とを、有機改質剤、水、任意的
に塩成分、及び任意的に緩衝剤から本質的に成る溶液内での線形もしくは階段式
勾配の塩成分又はイクソクラティック式塩成分及び／あるいは線形もしくは階段
式pH勾配又は一定のpH値による溶離により分割させることを含んで成り、ここで
当該pH勾配又はpH値は、前記ペプチドが前記近縁の不純物の局部又は総合的な正
の正味の電荷とは異なる正の局部又は総合的な正味の電荷を有することで当該近
縁の不純物が除去されるといったpH範囲内にあるべきである、方法に関連する。

【００１６】 別の広い観点において、本発明はペプチド及び近縁の不純物を含んで成る混合
物から前記ペプチドを精製するための陰イオン交換クロマトグラフィー方法であ
って、下記の工程： 前記混合物の前記ペプチドと前記近縁の不純物とを、有機改質剤、水、任意的
に塩成分、及び任意的に緩衝剤を含んで成る溶液内での線形もしくは階段式勾配
の塩成分又はイクソクラティック式塩成分及び／あるいは線形もしくは階段式pH
勾配又は一定のpH値による溶離により分割させることを含んで成り、ここで当該
pH勾配又はpH値は、前記ペプチドが前記近縁の不純物の局部又は総合的な負の正
味の電荷とは異なる負の局部又は総合的な正味の電荷を有することで当該近縁の
不純物が除去されるといったpH範囲内にあるべきである、方法に関連する。

【００１７】 別の広い観点において、本発明はペプチド及び近縁の不純物を含んで成る混合
物から前記ペプチドを精製するための陰イオン交換クロマトグラフィー方法であ
って、下記の工程： 前記混合物の前記ペプチドと前記近縁の不純物とを、有機改質剤、水、任意的
に塩成分、及び任意的に緩衝剤から本質的に成る溶液内での線形もしくは階段式
勾配の塩成分又はイクソクラティック式塩成分及び／あるいは線形もしくは階段
式pH勾配又は一定のpH値による溶離により分割させることを含んで成り、ここで
当該pH勾配又はpH値は、前記ペプチドが前記近縁の不純物の局部又は総合的な負
の正味の電荷とは異なる負の局部又は総合的な正味の電荷を有することで当該近
縁の不純物が除去されるといったpH範囲内にあるべきである、方法に関連する。

【００１８】 本発明の態様において、精製すべきペプチドはポリペプチド、オリゴペプチド
、タンパク質、レセプター、ビラ（ｖｉｒａ）、並びにその相同体、類似体及び
誘導体、好ましくはグルカゴン、ｈＧＨ、インスリン、アプロチニン、第VII 因
子、ＴＰＡ、第VIIａ 因子（Novo Seven（登録商標）、Novo Nordisk A/S, Bags
vaerd, Denmarkより入手可能）、第VIIａｉ 因子、ＦＦＲ−第VIIａ 因子、ヘパ
リナーゼ、ＡＣＴＨ、ヘパリン結合性タンパク質、副腎皮質刺激ホルモン放出因
子、アンギオテンシン、カルシトニン、インスリン、グルカゴン様ペプチド−１
（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）、インスリン様成長
因子−１、インスリン様成長因子−２、線維芽細胞成長因子、ガストリックイン
ヒビターペプチド、成長ホルモン放出因子、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化
性ペプチド、セクレチニン、エンテロガストリン、ソマトスタチン、ソマトトロ
ピン、ソマトメジン、副甲状腺ホルモン、トロンボポイエチン、エリトロポイエ
チン、視床下部ホルモン放出因子、プロラクチン、甲状腺刺激ホルモン、エンド
ルフィン、エンケファリン、バソプレシン、オキシトシン、オピオド、ＤＰＰＩ
Ｖ、インターロイキン、イムノグロブリン、補因子インヒビター、セルピンプロ
テアーゼインヒビター、サイトカイン、サイトカインレセプター、ＰＤＧＦ、腫
瘍壊死因子、腫瘍壊死因子レセプター、成長因子並びにそれらの類似体及び誘導
体、より好ましくはグルカゴン、ｈＧＨ、インスリン、アプロチニン、第VII 因
子、第VIIａ 因子、ＦＦＲ−第VIIａ 因子、ヘパリナーゼ、グルカゴン様ペプチ
ド−１、グルカゴン様ペプチド−２並びにその類似体及び誘導体、例えばＡｒｇ³⁴ ＧＬＰ−１_(7-37) 、ヒトインスリン及びＢ２８ＩｓｏＡｓｐインスリンから
選ばれる。各ペプチドは本発明の択一的な態様を構成する。

【００１９】 従って、本発明の一の観点はＧＬＰ−１ペプチド及び近縁の不純物を含んで成
る混合物から前記ペプチドを精製するための陽イオン交換クロマトグラフィー方
法であって、下記の工程： 前記混合物の前記ＧＬＰ−１ペプチドと前記近縁の不純物とを、有機改質剤、
水、任意的に塩成分、及び任意的に緩衝剤を含んで成る溶液内での線形もしくは
階段式勾配の塩成分又はイクソクラティック式塩成分及び／あるいは線形もしく
は階段式pH勾配又は一定のpH値による溶離により分割させることを含んで成り、
ここで当該pH勾配又はpH値は、前記ペプチドが前記近縁の不純物の局部又は総合
的な正の正味の電荷とは異なる正の局部又は総合的な正味の電荷を有することで
当該近縁の不純物が除去されるといったpH範囲内にあるべきである、方法に関連
する。

【００２０】 本発明の別の観点は、ＧＬＰ−１ペプチド及び近縁の不純物を含んで成る混合
物から前記ペプチドを精製するための陽イオン交換クロマトグラフィー方法であ
って、下記の工程： 前記混合物の前記ＧＬＰ−１ペプチドと前記近縁の不純物とを、有機改質剤、
水、任意的に塩成分、及び任意的に緩衝剤から本質的に成る溶液内での線形もし
くは階段式勾配の塩成分又はイクソクラティック式塩成分及び／あるいは線形も
しくは階段式pH勾配又は一定のpH値による溶離により分割させることを含んで成
り、ここで当該pH勾配又はpH値は、前記ペプチドが前記近縁の不純物の局部又は
総合的な正の正味の電荷とは異なる正の局部又は総合的な正味の電荷を有するこ
とで当該近縁の不純物が除去されるといったpH範囲内にあるべきである、方法に
関連する。

【００２１】 本発明の別の観点はＧＬＰ−１ペプチド及び近縁の不純物を含んで成る混合物
から前記ペプチドを精製するための陰イオン交換クロマトグラフィー方法であっ
て、下記の工程： 前記混合物の前記ＧＬＰ−１ペプチドと前記近縁の不純物とを、有機改質剤、
水、任意的に塩成分、及び任意的に緩衝剤を含んで成る溶液内での線形もしくは
階段式勾配の塩成分又はイクソクラティック式塩成分及び／あるいは線形もしく
は階段式pH勾配又は一定のpH値による溶離により分割させることを含んで成り、
ここで当該pH勾配又はpH値は、前記ペプチドが前記近縁の不純物の局部又は総合
的な負の正味の電荷とは異なる負の局部又は総合的な正味の電荷を有することで
当該近縁の不純物が除去されるといったpH範囲内にあるべきである、方法に関連
する。

【００２２】 本発明の別の観点はＧＬＰ−１ペプチド及び近縁の不純物を含んで成る混合物
から前記ペプチドを精製するための陰イオン交換クロマトグラフィー方法であっ
て、下記の工程： 前記混合物の前記ＧＬＰ−１ペプチドと前記近縁の不純物とを、有機改質剤、
水、任意的に塩成分、及び任意的に緩衝剤から本質的に成る溶液内での線形もし
くは階段式勾配の塩成分又はイクソクラティック式塩成分及び／あるいは線形も
しくは階段式pH勾配又は一定のpH値による溶離により分割させることを含んで成
り、ここで当該pH勾配又はpH値は、前記ペプチドが前記近縁の不純物の局部又は
総合的な負の正味の電荷とは異なる負の局部又は総合的な正味の電荷を有するこ
とで当該近縁の不純物が除去されるといったpH範囲内にあるべきである、方法に
関連する。

【００２３】 上記の観点における溶離は、溶離段階での有機改質剤の含有量を改変すること
により可能でもあり、それは本発明の一の態様として考慮される。

【００２４】 塩成分の線形又は階段式勾配は、双方のＩＥＣモードにおいて、低濃度から高
濃度に至るものであろう。

【００２５】 本方法の上記の観点において、溶離は近縁の不純物の洗浄段階と考えてもよい
。

【００２６】 本発明の一の態様において、有機改質剤、対、水の重量％基準での比は、１：
９９〜９９：１、例えば１：９９〜８０：２０、２０：８０〜８０：２０、３０
：７０〜７０：３０、３５：５０〜５０：３５、又は４０：５０〜５０：４０と
する。これらの比各々は本発明の択一的な態様を構成する。

【００２７】 本発明の別の態様において、有機改質剤はＣ_1-6 アルカノール、Ｃ_1-6 アルケ
ノール又はＣ_1-6 アルキノール、尿素、グアニジン、又はＣ_1-6 アルカン酸、例
えば酢酸、Ｃ_2-6 グリコール、Ｃ_3-7 ポリアルコール、例えば糖、好ましくはＣ_1-6 アルカノール及びＣ_2-6 グリコール、より好ましくはメタノール、エタノー
ル、プロパノール及びブタノール及びヘキシルグリコール、最も好ましくはエタ
ノール及び２−プロパノールから選ばれる。これらの有機改質剤各々は本発明の
択一的な態様を構成する。

【００２８】 本発明の更なる態様において、陰イオン交換クロマトグラフィー方法のための
階段又は線形pH勾配は高いpHから出発して低いpHに至る。

【００２９】 本発明の更なる態様において、陽イオン交換クロマトグラフィー方法のための
階段又は線形pH勾配は低いpHから出発して高いpHに至る。

【００３０】 本発明の更なる態様において、塩成分は任意の有機又は無機塩及びその混合物
、好ましくはＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＮＨ₄ Ｃｌ、ＣａＣｌ₂ 、酢酸ナトリウム、酢
酸カリウム、酢酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、クエ
ン酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、酢酸カ
ルシウム又はその混合物、最も好ましくは酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸
アンモニウム、ＮａＣｌ、ＮＨ₄ Ｃｌ、ＫＣｌから選ばれる。これらの塩成分各
々は本発明の択一的な態様を構成する。

【００３１】 本発明の更なる態様において、塩成分の勾配は塩成分の階段式勾配である。

【００３２】 本発明の更なる態様において、塩成分は０．１mmol／kg〜３０００mmol／kg、
好ましくは１mmol／kg〜１０００mmol／kg、より好ましくは５mmol／kg〜５００
mmol／kg、最も好ましくは２０mmol／kg〜３００mmol／kgの範囲から選ばれる階
段式濃度で存在する。これらの範囲各々は本発明の択一的な態様を構成する。

【００３３】 本発明の更なる態様において、塩成分の勾配は塩成分の線形勾配である。

【００３４】 本発明の更なる態様において、塩成分は０．１mmol／kgから３０００mmol／kg
に至る、好ましくは１mmol／kgから１０００mmol／kgに至る、より好ましくは５
mmol／kgから５００mmol／kgに至る、最も好ましくは２０mmol／kgから３００mm
ol／kgに至るといった範囲から選ばれる線形濃度で存在する。これらの範囲各々
は本発明の択一的な態様を構成する。

【００３５】 本発明の更なる態様において、塩成分は存在しない。

【００３６】 本発明の更なる態様において、緩衝剤はクエン酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、トリ
ス緩衝剤、硼酸緩衝剤、乳酸緩衝剤、グリシルグリシン緩衝剤、アルギニン緩衝
剤、炭酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、グルタミン酸緩衝剤、アンモニウム緩衝剤、グリ
シン緩衝剤、アルキルアミン緩衝剤、アミノエチルアルコール緩衝剤、エチレン
ジアミン緩衝剤、トリエタノールアミン、イミダゾール緩衝剤、ピリジン緩衝剤
及びバルビツール酸緩衝剤及びこれらの混合物、好ましくはクエン酸、クエン酸
ナトリウム、クエン酸カリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸、
グルタミン酸、グルタミン酸ナトリウム、グルタミン酸カリウム、グリシン、炭
酸ナトリウム、トリス−ヒドロキシメチルアミノメタン及び硼酸、並びにこれら
の混合物から選ばれる。これらの緩衝剤各々は本発明の択一的な態様を構成する
。

【００３７】 本発明の更なる態様において、緩衝剤は０．１mmol／kg〜５００mmol／kg、好
ましくは１mmol／kg〜２００mmol／kg、より好ましくは５mmol／kg〜１００mmol
／kg、最も好ましくは１０mmol／kg〜５０mmol／kgの範囲から選ばれる濃度で存
在する。これらの範囲各々は本発明の択一的な態様を構成する。

【００３８】 本発明の更なる態様において、緩衝剤は入っていない。

【００３９】 本発明の更なる態様において、精製すべきＧＬＰ−１ペプチドはＧＬＰ−１（
７−３７）、ＧＬＰ−１（７−３６）アミド、並びにその類似体及び誘導体、特
に限定することなく、下記のヒトグルカゴン様ペプチド−１から選ばれる：

【化１】

【化２】

【化３】

【化４】

【化５】

【化６】

【化７】

【化８】

【化９】

【化１０】

【化１１】

【化１２】

【化１３】

【化１４】

【化１５】

【化１６】

【化１７】

【化１８】

【化１９】 これらのＧＬＰ−１ペプチド各々は本発明の択一的な態様を構成する。

【００４０】 本発明の更なる態様において、除去すべきＧＬＰ−１近縁不純物は限定するこ
となく、切頭型、あらゆる種類の伸長型（追加のアミノ酸、エステル等の様々な
誘導体）、脱アミド型、不適切に折りたたまれた型、シアル化等の所望されない
グリコシル化を有する型から選ばれる。本発明の例示として、ヒスチジンはpH約
６．５未満の主たる正の正味の電荷を有し、それ故陽イオン交換のため、有機溶
媒又は改質剤を含んで成る溶媒によるpH溶離勾配は、ヒスチジンを欠く切頭型を
除くためpH６．５を下まわるpHから始め、そして勾配をpH６．５を上まわるpHで
終らさせ、かくして後に標的ＧＬＰ−１成分が溶離される。他に、有機溶媒を採
用して標的ＧＬＰ−１成分から切頭型を分割する溶離は単に溶離条件での塩成分
（勾配又はイソクラティック式）によりpH６．５を下まわるpHで実施してよい。
更に他に、有機溶媒を採用して標的ＧＬＰ−１成分から切頭型を分割する溶離は
低から高含有量に至る有機改質剤の勾配によりpH６．５を下まわるpHで実施して
よい。第二の例として、Ｃ末端アミノ酸のカルボキシル基はpH約３．１上まわる
主たる負の正味の電荷を有し、それ故陰イオン交換のため、有機改質剤を含んで
成る溶媒によるpH溶離勾配はアミドにまで伸長した型を除去するためにpH３．１
を上まわるpHで始まり、そして勾配をpH３．１を下まわるpHで終わらさせ、かく
して後に標的ＧＬＰ−１成分が溶離する。他に、有機改質剤を採用して標的ＧＬ
Ｐ−１成分からアミド型を分割する溶離は単に溶離条件での塩成分（勾配又はイ
ソクラティック式）を介してpH３．１を上まわるpHで実施してよい。第三の例と
して、アスパラギン酸はpH約４．４を上まわる主たる負の正味の電荷を有し、そ
れ故陰イオン交換のため、有機改質剤を含んで成る溶媒によるpH溶離勾配は、ア
スパラギン酸を欠く切頭型を除去するためpH４．４を上まわるpHで始め、そして
勾配をpH４．４を下まわるpHで終わらさせ、かくして後に標的ＧＬＰ−１成分が
溶離する。他に、有機改質剤を採用して標的ＧＬＰ−１成分から切頭型を分割す
る溶離は、単に溶離条件での塩成分（勾配又はイソクラティック式）を介してpH
４．４を上まわるpHで実施してよい。第四の例として、グルタミン酸はpH約４．
４を上まわる主たる負の正味の電荷を有し、それ故陰イオン交換のため、有機改
質剤を含んで成る溶媒によるpH溶離勾配は、標的ＧＬＰ−１成分を溶離するため
pH４．４を上まわるpHで始め、そして勾配をpH４．４を下まわるpHで終わらさせ
、かくして後に追加のグルタミン酸残基を含んで成る伸長型が除去できる。他に
、有機改質剤を採用して標的ＧＬＰ−１成分から伸長型を分割する溶離は、単に
溶離条件での塩成分（勾配又はイソクラティック式）を介してpH４．４を上まわ
るpHで実施してよい。第五の例として、Ｎ末端アミノ酸のアミノ基はpH約８．０
を下まわる主たる正の正味の電荷を有し、それ故陽イオン交換のため、有機改質
剤を含んで成る溶媒によるpH溶離勾配は、所望されないアシル基で伸長した型を
除去するためpH８．０を下まわるpHで始め、そして勾配をpH８．０を上まわるpH
で終わらさせ、かくして後に標的ＧＬＰ−１成分が溶離する。他に、有機改質剤
を採用して標的ＧＬＰ−１成分からアシル化型を分割する溶離は、単に溶離条件
での塩成分（勾配又はイソクラティック式）を介してpH８．０を下まわるpHで実
施してよい。第六の例として、Ｎ末端アミノ酸のアミノ基はpH約８．０を下まわ
る主たる正の正味の電荷を有し、それ故陽イオン交換のため、有機改質剤を含ん
で成る溶媒によるpH溶離勾配は、所望のアシル基で伸長した標的ＧＬＰ−１成分
を溶離するためpH８．０を下まわるpHで始め、そして勾配をpH８．０を上まわる
pHで終わらさせ、かくして後に所望されない非伸長型が除去される。他に、有機
改質剤を採用して非アシル化型からアシル化標的ＧＬＰ−１成分を分割する溶離
は、単に溶離条件での塩成分（勾配又はイソクラティック式）を介してpH８．０
を下まわるpHで実施してよい。第七の例として、チロシンはpH約１０．０を上ま
わる主たる負の正味の電荷を有し、それ故陰イオン交換のため、有機改質剤を含
んで成る溶媒によるpH溶離勾配は、チロシン残基を欠く切頭型を除去するためpH
１０．０を上まわるpHで始め、そして勾配をpH１０．０を下まわるpHで終わらさ
せ、かくして後に標的ＧＬＰ−１成分が溶離する。他に、有機改質剤を採用して
標的ＧＬＰ−１成分から切頭型を分割する溶離は、単に溶離条件での塩成分（勾
配又はイソクラティック式）を介してpH１０．０を上まわるpHで実施してよい。
第八の例として、リジン酸はpH約１０．０を下まわる主たる正の正味の電荷を有
し、それ故陽イオン交換のため、有機改質剤を含んで成る溶媒によるpH溶離勾配
は、リジン残基の側鎖がアシル化された標的ＧＬＰ−１成分を溶離するためpH１
０．０を下まわるpHで始め、そして勾配をpH１０．０を上まわるpHで終わらさせ
、かくして後に所望されない非アシル化型が除去される。他に、有機改質剤を採
用して非アシル化型からアシル化標的ＧＬＰ−１成分を分割する溶離は、単に溶
離条件での塩成分（勾配又はイソクラティック式）を介してpH１０．０を下まわ
るpHで実施してよい。第九の例として、アルギニンはpH約１２．０を下まわる主
たる正の正味の電荷を有し、それ故陰イオン交換のため、有機改質剤を含んで成
る溶媒によるpH溶離勾配は、標的ＧＬＰ−１成分を溶離するためpH１２．０を下
まわるpHで始め、そして勾配をpH１２．０を上まわるpHで終わらさせ、かくして
後に追加のアルギニン残基を含んで成る所望されない型が除去される。他に、有
機改質剤を採用して追加のアルギニン残基を含んで成る型から標的ＧＬＰ−１成
分を分割する溶離は、単に溶離条件での塩成分（勾配又はイソクラティック式）
を介してpH１２．０を下まわるpHで実施してよい。（これらの例において利用す
るpK_A 値はL. Stryer. Biochemistry, 第３版、W.H. Freeman and Company, New
York, Table 2-1, 第21頁を参照のこと）。

【００４１】 本発明の更なる態様において、除去すべき不純物はＧＬＰ−１に近縁でないも
のである。

【００４２】 上記の方法の特異的なＧＬＰ−１ペプチドの例は、塩及び／又はpH勾配を採用
しての、陽イオン交換クロマトグラフィーによるＡｒｇ³⁴ＧＬＰ−１（７−３７
）及びＡｒｇ³⁴ＧＬＰ−１（９−３７）、陰イオン交換クロマトグラフィーによ
るＧＬＰ−１（７−３７）及びＧＬＰ−１（７−３６）アミド、陰イオン交換ク
ロマトグラフィーによるＧＬＰ−１（１５−３７）及びＧＬＰ−１（１６−３７
）、陰イオン交換クロマトグラフィーによるＡｒｇ³⁴ＧＬＰ−１（７−３７）及
びＡｒｇ³⁴Ｌｙｓ²⁶（Ｎ^ε−Ｇｌｕ）ＧＬＰ−１（７−３７）、陽イオン交換ク
ロマトグラフィーによるＡｒｇ³⁴Ｌｙｓ²⁶（Ｎ^ε−（γ−Ｇｌｕ−（Ｎ^α−テト
ラデカノイル）））ＧＬＰ−１（７−３７）及びＡｒｇ³⁴Ｌｙｓ²⁶（Ｎ^ε−（γ
−Ｇｌｕ−（Ｎ^α−テトラデカノイル）））Ｇｌｙ³⁷（Ｎ^α−（γ−Ｇｌｕ−（
Ｎ^α−テトラデカノイル）））ＧＬＰ−１（７−３７）、陽イオン交換クロマト
グラフィーによるＧｌｙ³⁷（Ｎ^α−（γ−Ｇｌｕ−（Ｎ^α−テトラデカノイル）
））ＧＬＰ−１（７−３７）及びＧＬＰ−１（７−３７）、陰イオン交換クロマ
トグラフィーによるＧＬＰ−１（１９−３７）及びＧＬＰ−１（２０−３７）、
陽イオン交換クロマトグラフィーによるＡｒｇ³⁴Ｌｙｓ²⁶（Ｎ^ε−（γ−Ｇｌｕ
−（Ｎ^α−テトラデカノイル）））ＧＬＰ−１（７−３７）及びＡｒｇ³⁴ＧＬＰ
−１（７−３７）、並びに陽イオン交換クロマトグラフィーによるＧＬＰ−１（
７−３７）及びＡｒｇ³⁴ＧＬＰ−１（７−３７）の分割である。

【００４３】 本発明の更なる態様において、精製すべきペプチドはＧＬＰ−２ペプチドであ
る。

【００４４】 本発明の更なる態様において、精製すべきペプチドは以下から選ばれる： ＧＬＰ−２（１−３４）、ＧＬＰ−２（１−３３）並びにその類似体及び誘導
体、特に限定することなく、ヒトグルカゴン様ペプチド−２（ｈＧＬＰ−２）、
ＧＬＰ−２（１−３０）；ＧＬＰ−２（１−３１）；ＧＬＰ−２（１−３２）；
ＧＬＰ−２（１−３３）；ＧＬＰ−２（１−３４）；ＧＬＰ−２（１−３５）、
Ｌｙｓ²⁰ＧＬＰ−２（１−３３）、Ｌｙｓ²⁰Ａｒｇ³⁰ＧＬＰ−２（１−３３）、
Ａｒｇ³⁰Ｌｙｓ³⁴ＧＬＰ−２（１−３４）、Ａｒｇ³⁰Ｌｙｓ³⁵ＧＬＰ−２（１−
３５）、Ａｒｇ^30,35 Ｌｙｓ²⁰ＧＬＰ−２（１−３５）、Ａｒｇ³⁵ＧＬＰ−２（
１−３５）、Ｌｙｓ²⁰（Ｎ^ε−テトラデカノイル）ＧＬＰ−２（１−３３）；Ｌ
ｙｓ^20,30 −ビス（Ｎ^ε−テトラデカノイル）ＧＬＰ−２（１−３３）；Ｌｙｓ²⁰ （Ｎ^ε−テトラデカノイル）Ａｒｇ³⁰ＧＬＰ−２（１−３３）；Ａｒｇ³⁰Ｌｙ
ｓ³⁵（Ｎ^ε−テトラデカノイル）ＧＬＰ−２（１−３５）；Ａｒｇ^30,35 Ｌｙｓ²⁰ （Ｎ^ε−テトラデカノイル）ＧＬＰ−２（１−３５）；Ａｒｇ³⁵Ｌｙｓ³⁰（Ｎ^ε −テトラデカノイル）ＧＬＰ−２（１−３５）；Ａｒｇ³⁰Ｌｙｓ³⁴（Ｎ^ε−テ
トラデカノイル）ＧＬＰ−２（１−３４）；Ｌｙｓ²⁰（Ｎ^ε−（ω−カルボキシ
ノナデカノイル））ＧＬＰ−２（１−３３）；Ｌｙｓ^20,30 −ビス（Ｎ^ε−（ω
−カルボキシノナデカノイル））ＧＬＰ−２（１−３３）；Ｌｙｓ²⁰（Ｎ^ε−（
ω−カルボキシノナデカノイル））Ａｒｇ³⁰ＧＬＰ−２（１−３３）；Ａｒｇ³⁰ Ｌｙｓ³⁵（Ｎ^ε−（ω−カルボキシノナデカノイル））ＧＬＰ−２（１−３５）
；Ｌｙｓ³⁰（Ｎ^ε−（γ−グルタミル（Ｎ^α−テトラデカノイル）））ｈＧＬＰ
−２、Ａｒｇ^30,35 Ｌｙｓ²⁰（Ｎ^ε−（ω−カルボキシノナデカノイル））ＧＬ
Ｐ−２（１−３５）；Ａｒｇ³⁵Ｌｙｓ³⁰（Ｎ^ε−（ω−カルボキシノナデカノイ
ル））ＧＬＰ−２（１−３５）；及びＡｒｇ³⁰Ｌｙｓ³⁴（Ｎ^ε−（ω−カルボキ
シノナデカノイル））ＧＬＰ−２（１−３４）。

【００４５】 当該ペプチド又はＧＬＰ−１ペプチドは、当該ペプチド又はＧＬＰ−１ペプチ
ドをコードするＤＮＡ配列を含み、且つ当該ペプチドを発現できる宿主細胞を適
当な栄養培地の中で当該ペプチドが発現される条件下で培養又は発酵させ、しか
る後に得られるペプチド又はＧＬＰ−１ペプチドを培養又は発酵ブロスから回収
することを含んで成る方法により生産できる。以降、培養なる語は、培養、発酵
等の双方を包括して使用する。

【００４６】 前記細胞を培養する培地は、宿主細胞の増殖に適する従来の任意の慣用の培地
、例えば、最小培地又は適当な補充物を含有する複合培地でよい。適当な培地を
、市販品から入手するか、又は公開された配合表(American Type Culture Colle
ction のカタログなど）に従って調製することもできる。細胞によって生産され
たペプチド又はＧＬＰ−１ペプチドを、従来の手順によって培地から回収するこ
とができる。その手順には、例えば、任意的な細胞の溶解、遠心又は濾過による
培地からの細胞の分離、塩、例えば硫酸アンモニウムによる上清又は濾液のタン
パク質成分の沈殿、慣用の精製技術、例えばクロマトグラフィー技術による精製
、必要なら、本発明に従うイオン交換クロマトグラフィーによる精製、しかる後
、分析検査、例えばＰＡＧＥ、ＩＥＦにかけ、必要なら、更なる精製にかけ、必
要なら、更に純粋なペプチド又はＧＬＰ−１ペプチドを単離することが含まれる
。

【００４７】 培養培地から得られるペプチド又はＧＬＰ−１ペプチドの回収の間、しかしな
がら本発明に従うイオン交換クロマトグラフィーによる精製の前に、ペプチド又
はＧＬＰ−１ペプチドと近縁の不純物とを含んで成る混合物は任意的に慣用の技
術、例えばアルキル化、アシル化、エステル形成又はアミド形成等により化学修
飾してよい。

【００４８】 元になるペプチド又はＧＬＰ−１ペプチドをコードするＤＮＡ配列は、ゲノム
又はｃＤＮＡ由来が適当であり、例えば、標準的な方法によって、ゲノムライブ
ラリー又はｃＤＮＡライブラリーを調製後に、合成オリゴヌクレオチドプローブ
を用いたハイブリダイゼーションによって、当該ペプチド又はＧＬＰ−１ペプチ
ドの全部又は部分をコードするＤＮＡ配列をスクリーニングして、これを得る（
Sambrook, J., Fritsch. E.F. and Maniatis, T., Molecular Cloning : A Labo
ratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989）。当
該ペプチド又はＧＬＰ−１ペプチドをコードするＤＮＡ配列を、確立した標準的
な方法、例えばBeaucage and Caruthers, Tetrahedron Letters 22 (1981), 185
9-1869に記載されたホスホアミダイト法、又はMatthes et al., EMBO Journal 3
(1984), 801-805に記載された方法によって、合成的に調製することもできる。
このＤＮＡ配列を、特異的プライマーを用いたＰＣＲ法によって、例えば、ＵＳ
４６８３２０２又はSaiki et al., Science 239 (1988), 487-491 の記載通りに
、調製することもできる。

【００４９】 本ＤＮＡ配列を、組換えＤＮＡ技法で簡便に扱える任意のベクターに挿入する
ことができる。このベクターの選択は、しばしば、導入される宿主細胞に依存す
る。従って、このベクターは、自律複製性のベクター、すなわち染色体外体とし
て存在して、その複製が染色体複製から独立しているベクター、例えばプラスミ
ドであってもよい。あるいは、このベクターは、宿主細胞に導入された場合、そ
の宿主細胞ゲノムに組み込まれ、そして組み込まれた染色体と共に複製するもの
であってもよい。

【００５０】 本ベクターとしては、当該ペプチド又はＧＬＰ−１をコードするＤＮＡ配列が
、このＤＮＡの転写調節に必要な追加領域、例えばプロモーターに作用可能に連
結されている発現ベクターが好ましい。このプロモーターは、選択した宿主細胞
において転写活性を示す任意のＤＮＡ配列であり、そして宿主細胞に固有の、又
は異種性のタンパク質をコードする遺伝子から、これを得ることができる。種々
の宿主細胞において、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写を指令す
るために適したプロモーターの例は、当技術分野で良く知られている（前出のSa
mbrook et al.）。

【００５１】 必要がある場合、当該ペプチド又はＧＬＰ−１をコードするＤＮＡ配列を、適
当なターミネーター、ポリアデニル化シグナル、転写エンハンサー配列、及び翻
訳エンハンサー配列に作用可能に連結することもできる。さらに本発明の組換え
ベクターは、問題の宿主細胞において、本ベクターの複製を可能にするＤＮＡ配
列を含んでもよい。

【００５２】 また、本ベクターは、選択性マーカー、例えば、宿主細胞の欠陥を補完する産
物の遺伝子、あるいは、薬物、例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイ
クリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、ハイグロマイシン又はメトトレ
キセートに対する耐性を付与する遺伝子を含んでもよい。

【００５３】 ペプチド又はＧＬＰ−１ペプチドが宿主細胞の分泌経路に入る様に指示するた
めに、分泌シグナル配列（リーダー配列、プレプロ配列又はプレ配列としても知
られている）が、この組換えベクターに含まれてもよい。この分泌シグナル配列
を、当該ペプチド又はＧＬＰ−１をコードするＤＮＡ配列に、適切な読み枠で連
結する。分泌シグナル配列は、一般に、当該ペプチド又はＧＬＰ−１をコードす
るＤＮＡ配列の５’側に位置する。

【００５４】 この分泌シグナル配列は、当該ペプチド又はＧＬＰ−１に常態で連結している
ものでもよいし、又は他の分泌タンパク質をコードする遺伝子から得てもよい。
当該ペプチド又はＧＬＰ−１をコードするＤＮＡ配列、プロモーター、並びに任
意にはターミネーター及び／又は分泌シグナル配列を各々連結するための手順、
並びに、複製に必要な情報を有する適当なベクターに、それらを挿入するための
手順は、当業者に良く知られている（Sambrook et al. 前出）。

【００５５】 本ＤＮＡ配列又は組換えベクターを導入する宿主細胞は、当該ペプチド又はＧ
ＬＰ−１を生産することができる任意の細胞でよく、そしてこれには細菌、ウィ
ルス、例えばバキュロウィルス、酵母、真菌、昆虫及びより高等な真核細胞が含
まれる。当技術分野で良く知られ、そして使われている適当な宿主細胞の例は、
大腸菌、サッカロミセス・セレビシエ、あるいは哺乳類のＢＨＫ細胞又はＣＨＯ
細胞株であるが、これらに限定されない。

【００５６】 当該ペプチド又はＧＬＰ−１ペプチドの一部は慣用の有機ペプチド合成化学に
従って生産できる。得られる合成混合物は、例えばアルキル化、アシル化、エス
テル形成又はアミド形成等により化学修飾し、そして精製するか、又はそのまま
精製し、次いで上記の通りに化学修飾してよい。

【００５７】第VIIａ 因子の調製 本発明において使用するのに適当なヒト精製第VIIａ 因子は好ましくは例えば
Hagen ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 : 2412-2416, 1986 又はヨーロッパ
特許第２００．４２１（ＺｙｍｏＧｅｎｅｔｉｃｓ）に記載のＤＮＡ組換技術に
より作られる。組換技術により生産された第VIIａ 因子は真正第VIIａ 因子であ
るか、又は真正第VIIａ 因子と同程度の血液凝固生物活性を実質的に有すること
を前提に多かれ少なかれ修飾された第VIIａ 因子であってよい。かかる第VIIａ
因子は第VII 因子をコードする核酸配列を、公知の手段、例えば部位特異的突然
変異誘発を介し、天然ＦVII をコードする核酸内のアミノ酸コドンを改変又はア
ミノ酸コドンの一部を除去することにより修飾することによって生産できうる。

【００５８】 第VII 因子はBroze and Majerus, J. Biol. Chem. 255 (4) : 1242-1247, 198
0 及びHedner and Kisiel, J. Clin. Invest. 71 : 1836-1841, 1983に記載の方
法によっても生産できうる。これらの方法は検出できる量のその他の凝血因子を
伴わずに第VII 因子をもたらす。更に一層精製された第VII 因子調製物は最終精
製段階として追加のゲル濾過等によって得られうる。次に第VII 因子は公知の手
段、例えばいくつかの異なる血漿タンパク質、例えば第XIIａ ，IXａ又はＸａ因
子を介して活性化第VIIａ 因子へと変換される。他方、Bjoernら（Research Dis
clousure, 269 1986年９月、第564-565頁）によると、第VII 因子はイオン交換
クロマトグラフィー、例えばＭｏｎｏ Ｑ（登録商標）（Pharmacia fine Chemi
cals）等に通すことによって活性化させることができうる。

【００５９】修飾又は不活性化第VIIａ（VIIａｉ）因子は下記の方法により生産されうる ： 国際特許出願ＷＯ９２／１５６８６号は修飾第VIIａ 因子、修飾第VIIａ 因子
の生産のためのポリ核酸及び哺乳動物細胞系、並びに凝血を阻害するための修飾
第VIIａ 因子を含んで成る組成物に関連する。

【００６０】 修飾された第VII 因子は、それぞれビタミンＫ−依存性血漿タンパク質のプレ
−プロペプチド及びｇｌａドメイン、並びにｇｌａドメインを欠く第VII 因子タ
ンパク質をコードする２種の作用可能に連結された配列コード領域を含んで成る
ポリヌクレオチド分子によりコードされ得、ここで、発現に際し、前記ポリヌク
レオチドは、血漿第Ｘ又はIX因子を有意に活性化しないが、しかし組織因子を結
合することができる修飾された第VII 因子分子をコードする。

【００６１】 第VIIａ 因子の触媒活性は、触媒中心又はトリアド（ｔｒｉａｄ）の化学的誘
導体化により阻害され得る。誘導体化は、第VII 因子と不可逆的インヒビター、
例えば有機リン化合物、弗化スルホニル、ペプチドハロメチルケトンもしくはア
ザペプチドとの反応により、又はアシル化により達成され得る。好ましいペプチ
ドハロメチルケトンは、ＰＰＡＣＫ（Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇクロロメチル
−ケトン；米国特許第４，３１８，９０４号を参照のこと；引用により本明細書
に組込まれる）、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ及びＰｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇクロ
ロメチルケトン（ＦＦＲ−ｃｍｋ）；並びにＤＥＧＲｃＫ（ダンシル−Ｇｌｕ−
Ｇｌｙ−Ａｒｇクロロメチルケトン）を包含する。

【００６２】 第VIIａ 因子の触媒活性はまた、アミノ酸を置換し、挿入し、又は欠失するこ
とによっても阻害され得る。好ましい態様においては、アミノ酸置換は、第VII
ａ 因子触媒部位に寄与するアミノ酸を含む領域として本明細書において定義さ
れる、第VII 因子触媒トリアドのアミノ酸配列において行なわれる。触媒トリア
ドにおける置換、挿入又は欠失は一般的に、触媒部位を形成するアミノ酸で又は
そのアミノ酸に隣接して存在する。ヒト及びウシ第VII 因子タンパク質において
は、触媒“トリアド”を形成するアミノ酸は、Ｓｅｒ₃₄₄ ，Ａｓｐ₂₄₂ 及びＨｉ
ｓ₁₉₃ （下付きの数字は、配列における位置を示す）である。他の哺乳類種から
の第VII 因子における触媒部位は、現在入手できる技法、例えば中でも、タンパ
ク質単離及びアミノ酸配列分析の技法を用いて決定され得る。触媒部位はまた、
他のセリンプロテアーゼ、特にキモトリプシン（その活性部位はこれまで決定さ
れている）の配列と並べ（Siglerなど., J. Mol. Biol., 35 : 143-164 (1968)
；引用により本明細書に組込まれる）、そして次に、前記の配列の並びから類似
する活性部位残基を決定することによっても決定され得る。

【００６３】 ヒト及びウシ第VII 因子のための好ましい態様においては、活性部位残基Ｓｅ
ｒ₃₄₄ がＧｌｙ，Ｍｅｔ，Ｔｈｒ又はより好ましくはＡｌａにより置換されて修
飾される。かかる置換は単独でも、Ｈｉｓ₁₉₃ 及びＡｓｐ₂₄₂ 等の触媒トリアド
内のその他の部位での置換と組合わせて行ってもよい。

【００６４】 第VII 因子において触媒部位を形成するアミノ酸、例えばヒト及びウシ第VII
因子におけるＳｅｒ₃₄₄ ，Ａｓｐ₂₄₂ 及びＨｉｓ₁₉₃ が、置換され、又は欠失さ
れ得る。本発明においては、単一のアミノ酸のみを変更することが好ましく、従
って、分子の抗原性を高め、又は組織因子と結合する能力を阻害する可能性を最
少にすることが好ましいが、しかしながら、複数のアミノ酸変更（置換、付加又
は欠失）が行なわれ得、そして置換、付加及び欠失の組合せもまた行なわれ得る
。ヒト及びウシ第VII 因子のための好ましい態様においては、Ｓｅｒ₃₄₄ は好ま
しくは、Ａｌａにより置換されるが、しかしＧｌｙ，Ｍｅｔ，Ｔｈｒ又は他のア
ミノ酸によっても置換され得る。ＧｌｕによりＡｓｐを置換し、そしてＬｙｓ又
はＡｒｇによりＨｉｓを置換することが好ましい。一般的に、置換は、できるだ
けタンパク質の三次構造を破壊しないように選択される。引用により本明細書に
組込まれるDayhoffなど.（Atlas of Protein Structure 1978, Nat'l Biomed. R
es. Found., Washington, D.C.）のモデルは、他のアミノ酸置換の選択のガイド
として使用され得る。ヒト、ウシ又は他の種の適切な第VII 因子配列の触媒部位
に上記のような残基変更を導入することができ、そして上記のような触媒活性の
阻害及び得られる抗凝固活性の所望レベルについて得られるタンパク質を試験す
ることができる。修飾された第VII 因子に関しては、触媒活性は、実質的に、そ
の対応する種の野生型第VII 因子の触媒活性の約５％以下、より好ましくは約１
％以下に阻害されるであろう。

【００６５】 修飾された第VII 因子は、組換えＤＮＡ技法の使用を通して生成され得る。

【００６６】 アミノ酸配列の変更は、種々の技法により達成され得る。ＤＮＡ配列の修飾は
、部位特異的突然変異誘発により行なわれ得る。部位特異的突然変異誘発につい
ての技法は、当業界において良く知られており、そして例えば、Zoller and Smi
th(DNA 3 : 479-488, 1984) により記載されている。従って、第VII 因子のヌク
レオチド及びアミノ酸配列を用いて、選択した変更を導入することができる。修
飾第VIIａ 因子は化学的方法によっても生産できる。

【００６７】 ＦＦＲ−ＦVIIａ （即ち、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＦVIIａ ） 例ＦＦＲクロロメチルケトン ＦＦＲクロロメチルケトンによる第VIIａ 活性部位のブロッケージ。 クロロメチルケトンによる活性部位セリン及びヒスチジンのブロッケージはセ
リンプロテアーゼの不可逆的不活性化のために周知の方法である。所定のプロテ
アーゼのブロッケージの最適化を図るため、この活性部位と特異的に且つすばや
く反応するクロロメチルケトン誘導体を選択することは重要である。かかる誘導
体は、注目の特定のセリンプロテアーゼの基質結合ポケットと相互作用するオリ
ゴペプチドのクロロメチルケトン基への結合によって発色しうる。

【００６８】 グルタミル−グリシル−アルギニンクロロメチルケトン（ＥＧＲ−ｃｋ又はそ
のダンシル誘導体、ＤＥＧＲ−ｃｋ）(S. Higashi, H. Nishimura, S. Fujii, K
. Takeda, S. Iwanaga, (1992) J. Biol. Chem. 267, 17990）又はプロリル−フ
ェニル−アルギニンクロロメチルケトン（ＰＦＲ−ｃｋ）（J.H. Lawson, S. Bu
tenas, K. Mann, (1992) J. Biol. Chem. 267, 4834 ; J. Contrino, G.A. Hair
, M.A. Schmeizi, F.R. Rickles, D.L. Kreutzer (1994) Am. J. Pathol. 145,
1315）がＦVIIａ の活性部位阻害剤として利用されている。これらのクロロメチ
ルケトンと比較して、ＦＦＲｃｋの利用は１０〜７０倍の速度の上昇を示す。

【００６９】 ＦVIIａ のＦＦＲ−クロロメチルケトン誘導体との反応の特異性をＨＰＬＣ及
びペプチドマッピングにより検定し、ＦVIIａ がＦＦＲ−クロロメチルケトンと
１：１の比で反応することを示し、かくして＞９８％がヒスチジンで誘導された
期待の生成物として回収できた。

【００７０】 様々なクロロメチルケトンによるＦVIIａ の不活性化 ３μＭのＦVIIａ を５０mMのＴｒｉｓ ＨＣｌ，１００mMのＮａＣｌ，５mMの
ＣａＣｌ₂ ，０．０１％のＴｗｅｅｎ−８０，pH７．４の中で１２μＭのクロロ
メチルケトン誘導体とインキュベーションした。サンプルを表示の様々な時間間
隔で抜き取り、そして１mMのＩｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮＡを含む５０mMのＴ
ｒｉｓ−ＨＣｌ，１００mMのＮａＣｌ，５mMのＣａＣｌ₂ ，０．０１％のＴｗｅ
ｅｎ−８０，pH７．４の中で活性測定用に２０倍希釈した。残留ＦVIIａ 活性を
４５０nmでの吸収の上昇により測定した。

【００７１】 通常、当該ペプチド又はＧＬＰ−１ペプチド及び近縁の不純物を含んで成る本
発明に従うイオン交換クロマトグラフィーにより精製すべき混合物は、組換ＤＮ
Ａ技術及び／又は化学修飾技術を使用しようと、又は有機ペプチド合成化学を使
用しようと、アミノ酸、小ペプチド、大ペプチド、無縁のタンパク質、反応体、
細胞塊、ＨＣＰ、内毒素及び／又はウィルス（ｖｉｒａ）をも含むであろう。

【００７２】 かくして、本発明に係るＩＥＣ方法を含む純粋なペプチド又はＧＬＰ−ペプチ
ドを生産するための任意の方法、例えば工業的方法も本発明の一の観点である。

【００７３】 従って、本発明は更なる観点において、純粋なペプチド又はＧＬＰ−１ペプチ
ドを生産するための、 前記ペプチド又はＧＬＰ−１ペプチド及び近縁の不純物を含んで成る混合物か
ら前記ペプチドを精製するための陽イオン交換クロマトグラフィー方法であって
、下記の工程： 前記混合物の前記ペプチド又はＧＬＰ−１ペプチドと前記近縁の不純物とを、
有機改質剤、水、任意的に塩成分、及び任意的に緩衝剤を含んで成る溶液内での
線形もしくは階段式勾配の塩成分又はイクソクラティック式塩成分及び／あるい
は線形もしくは階段式pH勾配又は一定のpH値による溶離により分割させることを
含んで成り、ここで当該pH勾配又はpH値は、前記ペプチド又はＧＬＰ−１ペプチ
ドが前記近縁の不純物の局部又は総合的な正の正味の電荷とは異なる正の局部又
は総合的な正味の電荷を有することで当該近縁の不純物が除去されるといったpH
範囲内にあるべきである、方法を含む、を含む工業的方法に関連する。

【００７４】 本発明は更なる観点において、ＧＬＰ−１ペプチドを単離するための方法であ
って、陽イオン交換クロマトグラフィーを介して前記ＧＬＰ−１ペプチド及び近
縁の不純物を含んで成る混合物から当該プチドを精製し、ここで当該陽イオン交
換クロマトグラフィー方法は下記の工程： 前記混合物の前記ＧＬＰ−１ペプチドと前記近縁の不純物とを、有機改質剤、
水、任意的に塩成分、及び任意的に緩衝剤を含んで成る溶液内での線形もしくは
階段式勾配の塩成分又はイクソクラティック式塩成分及び／あるいは線形もしく
は階段式pH勾配又は一定のpH値による溶離により分割させることを含んで成り、
ここで当該pH勾配又はpH値は、前記ペプチドが前記近縁の不純物の局部又は総合
的な正の正味の電荷とは異なる正の局部又は総合的な正味の電荷を有することで
当該近縁の不純物が除去されるといったpH範囲内にあるべきであり； しかる後、適宜、分析検査及び／又は更なる精製に委ね、次いで前記ペプチド
を慣用の方法で単離することを含む、方法に関連する。

【００７５】 本発明は更なる観点において、ＧＬＰ−１ペプチドを単離するための方法であ
って、陽イオン交換クロマトグラフィーを介して前記ＧＬＰ−１ペプチド及び近
縁又は無縁の不純物を含んで成る混合物から当該プチドを精製し、ここで当該陽
イオン交換クロマトグラフィー方法は下記の工程： 前記混合物の前記ＧＬＰ−１ペプチドと前記近縁の不純物とを、有機改質剤、
水、任意的に塩成分、及び任意的に緩衝剤から本質的に成る溶液内での線形もし
くは階段式勾配の塩成分又はイクソクラティック式塩成分及び／あるいは線形も
しくは階段式pH勾配又は一定のpH値による溶離により分割させることを含んで成
り、ここで当該pH勾配又はpH値は、前記ペプチドが前記近縁の不純物の局部又は
総合的な正の正味の電荷とは異なる正の局部又は総合的な正味の電荷を有するこ
とで当該近縁の不純物が除去されるといったpH範囲内にあるべきであり； しかる後、適宜、分析検査及び／又は更なる精製に委ね、次いで前記ペプチド
を慣用の方法で単離することを含む、方法に関連する。

【００７６】 本発明は更なる観点において、純粋なペプチド又はＧＬＰ−１ペプチドを生産
するための、 前記ペプチド又はＧＬＰ−１ペプチド及び近縁の不純物を含んで成る混合物か
ら前記ペプチドを精製するための陰イオン交換クロマトグラフィー方法であって
、下記の工程： 前記混合物の前記ペプチド又はＧＬＰ−１ペプチドと前記近縁の不純物とを、
有機改質剤、水、任意的に塩成分、及び任意的に緩衝剤を含んで成る溶液内での
線形もしくは階段式勾配の塩成分又はイクソクラティック式塩成分及び／あるい
は線形もしくは階段式pH勾配又は一定のpH値による溶離により分割させることを
含んで成り、ここで当該pH勾配又はpH値は、前記ペプチド又はＧＬＰ−１ペプチ
ドが前記近縁の不純物の局部又は総合的な負の正味の電荷とは異なる負の局部又
は総合的な正味の電荷を有することで当該近縁の不純物が除去されるといったpH
範囲内にあるべきである、方法を含む、工業的方法に関連する。

【００７７】 本発明は別の観点において、ＧＬＰ−１ペプチドを単離するための方法であっ
て、陰イオン交換クロマトグラフィーを介して前記ＧＬＰ−１ペプチド及び近縁
の不純物を含んで成る混合物から当該ペプチドを精製し、ここで当該陰イオン交
換クロマトグラフィー方法は下記の工程： 前記混合物の前記ＧＬＰ−１ペプチドと前記近縁の不純物とを、有機改質剤、
水、任意的に塩成分、及び任意的に緩衝剤を含んで成る溶液内での線形もしくは
階段式勾配の塩成分又はイクソクラティック式塩成分及び／あるいは線形もしく
は階段式pH勾配又は一定のpH値による溶離により分割させることを含んで成り、
ここで当該pH勾配又はpH値は、前記ペプチド又はＧＬＰ−１ペプチドが前記近縁
の不純物の局部又は総合的な負の正味の電荷とは異なる負の局部又は総合的な正
味の電荷を有することで当該近縁の不純物が除去されるといったpH範囲内にある
べきであり； しかる後、適宜、分析検査及び／又は更なる精製に委ね、次いで前記ペプチド
を慣用の方法で単離することを含む、方法に関連する。

【００７８】 本発明は更なる別の観点において、ＧＬＰ−１ペプチドを単離するための方法
であって、陰イオン交換クロマトグラフィーを介してＧＬＰ−１ペプチド及び近
縁又は無縁の不純物を含んで成る混合物から当該ペプチドを精製し、ここで当該
陰イオン交換クロマトグラフィー方法は下記の工程： 前記混合物の前記ペプチド又はＧＬＰ−１ペプチドと前記近縁の不純物とを、
有機改質剤、水、任意的に塩成分、及び任意的に緩衝剤から本質的に成る溶液内
での線形もしくは階段式勾配の塩成分又はイクソクラティック式塩成分及び／あ
るいは線形もしくは階段式pH勾配又は一定のpH値による溶離により分割させるこ
とを含んで成り、ここで当該pH勾配又はpH値は、前記ペプチドが前記近縁の不純
物の局部又は総合的な負の正味の電荷とは異なる負の局部又は総合的な正味の電
荷を有することで当該近縁の不純物が除去されるといったpH範囲内にあるべきで
あり； しかる後、適宜、分析検査及び／又は更なる精製に委ね、次いで前記ペプチド
を慣用の方法で単離することを含む、方法に関連する。

【００７９】 本明細書に記載の２以上の態様の任意の可能な組合せは本発明の範囲の一部で
ある。

【００８０】 本明細書において使用する「有機改質剤」とは、有機溶媒もしくは水溶性有機
化合物、又はそれらの組合せを含むことを意図しており、かかる改質剤は不要の
近縁不純物及びＧＬＰ−１ペプチドとイオン交換体との間の好適且つ改変された
選択性を誘導する。選定の改質剤がかかる選択性を誘導するか否かは通常近縁不
純物に依存し、そして試行錯誤で試験されうる。かかる有機改質剤には、限定す
ることなく、Ｃ_1-6 アルカノール、Ｃ_1-6 アルケノール又はＣ_1-6 −アルキノー
ル、尿素、グアニジン−ＨＣｌ又はＣ_1-6 アルカン酸、例えば酢酸、Ｃ_2-6 グリ
コール、Ｃ_3-7 ポリアルコール、例えば糖、又はそれらの混合物が挙げられる。

【００８１】 本明細書において使用する「Ｃ_1-6−アルカノール」、「Ｃ_1-6 アルケノール
」又は「Ｃ_1-6 アルキノール」は、単独で、又は組合さって、表示の長さのＣ_{1- 6} アルカン、Ｃ_1-6 アルケン又はＣ_1-6 アルキン基を含むことを意図し、線形、
枝分れ、環状形態のいずれでもよく、それに対してヒドロキシル（−ＯＨ）が結
合している(Morrison & Boyd, Organic Chemistry 第４版参照）。線形アルコー
ルの例はメタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、アリルアルコール、ｎ−
ブタノール、ｎ−ペンタノール及びｎ−ヘキサノールである。枝分れアルコール
の例は２−プロパノール及びｔｅｒｔ−ブチルアルコールである。環状アルコー
ルの例はシクロプロピルアルコール及び２−シクロヘキセン−１−オールである
。

【００８２】 本明細書において使用する「Ｃ_1-6 アルカン酸」とは、式Ｒ’ＣＯＯＨ（式中
、Ｒ’はＨ又はＣ_1-5 アルキルである）の基、例えば酢酸、プロピオン酸、酪酸
、メチル酪酸又は吉草酸を含むことを意図する（Morrison & Boyd, Organic Che
mistry、第４版参照）。

【００８３】 本明細書において使用する「Ｃ_1-5 アルキル」とは、１〜５個の炭素原子を有
する枝分れした又は線形のアルキル基を含むことを意図する。典型的なＣ_1-5 ア
ルキル基には、限定することなく、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロ
ピル、ブチル、イソ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、
イソ−ペンチル等が挙げられる（Morrison & Boyd, Organic Chemistry、第４版
参照）。

【００８４】 本明細書において使用する「Ｃ_2-6 グリコール」とは、隣接していてもしてい
なくてもよい別々の炭素原子上に２個のヒドロキシル基を含むＣ_2-6 アルカンを
含むことを意図とする。典型的なＣ_2-6 グリコールには、限定することなく、１
，２−エタンジオール、１，２−プロパンジオール又は２−メチル−２，４−ペ
ンタンジオールが挙げられる（Morrison & Boyd, Organic Chemistry、第４版参
照）。

【００８５】 本明細書において使用する「Ｃ_2-6 アルカン」とは、２〜６個の炭素原子を有
する枝分れした又は線形のアルカン基を含むことを意図する。典型的なＣ_2-6 ア
ルカンには、限定することなく、エタン、プロパン、イソ−プロパン、ブタン、
イソ−ブタン、ペンタン、ヘキサン等が挙げられる（Morrison & Boyd, Organic
Chemistry、第４版参照）。

【００８６】 本明細書において使用する「Ｃ_3-7 ポリアルコール、例えば糖」とは、式ＨＯ
ＣＨ₂（ＣＨＯＨ）_n ＣＨ₂ＯＨ（式中、ｎは１〜５の整数である）の基、並びに
単糖類、例えばマンノース及びグルコースを含むことを意図する（Morrison & B
oyd, Organic Chemistry、第４版参照）。

【００８７】 本明細書において使用する「ＧＬＰ−１ペプチド」とは、ＧＬＰ−１（７−３
７）、ＧＬＰ−１（７−３６）アミド、並びにその類似体及び誘導体を意味する
ことを意図し、それらは慣用の組換ＤＮＡ技術及び慣用の合成方法により生産で
きる。かかるＧＬＰ−１ペプチドには、限定することなく、天然グルカゴン様ペ
プチド−１、例えばＷＯ８７／０６９４１に開示のＧＬＰ−１（７−３７）及び
その機能性誘導体を含んで成るペプチドフラグメント；ＷＯ９０／１１２９６に
開示のＧＬＰ−１（７−３６）及びその機能性誘導体を含んで成るペプチドフラ
グメント；ＷＯ９１／１１４５７に開示の活性ＧＬＰ−１ペプチド７−３４、７
−３５、７−３６及び７−３７の類似体；ＷＯ９８／０８８７１に開示の親油性
置換基が少なくとも１個のアミノ酸残基に結合したＧＬＰ−１誘導体；ＥＰ ０
６９９６８６−Ａ２に開示のＧＬＰ−１のＮ末端切頭型フラグメント；並びにＥ
Ｐ ０７０８１７９−Ａ２に開示のＮ−末端イミダゾール基を含むＧＬＰ−１類
似体及び誘導体が挙げられる。

【００８８】 本明細書において使用する「ＧＬＰ−２ペプチド」とは、ＧＬＰ−２（１−３
５）、ＧＬＰ−２（１−３４）、ＧＬＰ−２（１−３３）、並びにその類似体及
び誘導体を意味することを意図し、それらは慣用の組換ＤＮＡ技術及び慣用の合
成方法により生産できる。かかるＧＬＰ−２ペプチドには、限定することなく、
天然グルカゴン様ペプチド−２、ＷＯ９８／０８８７２に開示の親油性置換基が
少なくとも１個のアミノ酸残基に結合したＧＬＰ−２誘導体；ヒトグルカゴン様
ペプチド−２（ｈＧＬＰ−２）、ＧＬＰ−２（１−３０）；ＧＬＰ−２（１−３
１）；ＧＬＰ−２（１−３２）；ＧＬＰ−２（１−３３）；ＧＬＰ−２（１−３
４）；ＧＬＰ−２（１−３５）；Ｌｙｓ²⁰ＧＬＰ−２（１−３３）；Ｌｙｓ²⁰Ａ
ｒｇ³⁰ＧＬＰ−２（１−３３）、Ａｒｇ³⁰Ｌｙｓ³⁴ＧＬＰ−２（１−３４）、Ａ
ｒｇ³⁰Ｌｙｓ³⁵ＧＬＰ−２（１−３５）、Ａｒｇ^30,35 Ｌｙｓ²⁰ＧＬＰ−２（１
−３５）、Ａｒｇ³⁵ＧＬＰ−２（１−３５）、Ｌｙｓ²⁰（Ｎ^ε−テトラデカノイ
ル）ＧＬＰ−２（１−３３）；Ｌｙｓ^20,30 −ビス（Ｎ^ε−テトラデカノイル）
ＧＬＰ−２（１−３３）；Ｌｙｓ²⁰（Ｎ^ε−テトラデカノイル）Ａｒｇ³⁰ＧＬＰ
−２（１−３３）；Ａｒｇ³⁰Ｌｙｓ³⁵（Ｎ^ε−テトラデカノイル）ＧＬＰ−２（
１−３５）；Ａｒｇ^30,35 Ｌｙｓ²⁰（Ｎ^ε−テトラデカノイル）ＧＬＰ−２（１
−３５）；Ａｒｇ³⁵Ｌｙｓ³⁰（Ｎ^ε−テトラデカノイル）ＧＬＰ−２（１−３５
）；Ａｒｇ³⁰Ｌｙｓ³⁴（Ｎ^ε−テトラデカノイル）ＧＬＰ−２（１−３４）；Ｌ
ｙｓ²⁰（Ｎ^ε−（ω−カルボキシノナデカノイル））ＧＬＰ−２（１−３３）；
Ｌｙｓ^20,30 −ビス（Ｎ^ε−（ω−カルボキシノナデカノイル））ＧＬＰ−２（
１−３３）；Ｌｙｓ²⁰（Ｎ^ε−（ω−カルボキシノナデカノイル））Ａｒｇ³⁰Ｇ
ＬＰ−２（１−３３）；Ａｒｇ³⁰Ｌｙｓ³⁵（Ｎ^ε−（ω−カルボキシノナデカノ
イル））ＧＬＰ−２（１−３５）；Ｌｙｓ³⁰（Ｎ^ε−（γ−グルタミル（Ｎ^α−
テトラデカノイル）））ｈＧＬＰ−２、Ｌｙｓ³⁰（Ｎ^ε−（γ−グルタミル（Ｎ^α −テトラデカノイル）））ｈＧＬＰ−２、Ａｒｇ^30,35 Ｌｙｓ²⁰（Ｎ^ε−（ω
−カルボキシノナデカノイル））ＧＬＰ−２（１−３５）；Ａｒｇ³⁵Ｌｙｓ³⁰（
Ｎ^ε−（ω−カルボキシノナデカノイル））ＧＬＰ−２（１−３５）；及びＡｒ
ｇ³⁰Ｌｙｓ³⁴（Ｎ^ε−（ω−カルボキシノナデカノイル））ＧＬＰ−２（１−３
４）が挙げられる。

【００８９】 本明細書において使用する「類似体」とは、元のペプチドの１又は複数個のア
ミノ酸残基が別のアミノ酸残基により置換されているペプチド、及び／又は元の
ペプチドに１又は複数個のアミノ酸残基が追加されているペプチドを意味するこ
とを意図する。かかる追加は元のペプチドのＮ末端又はＣ末端のいずれか、又は
双方に施されていてよい。

【００９０】 本明細書において使用する「誘導体」とは、元のペプチドの１又は複数個のア
ミノ酸残基が例えばアルキル化、アシル化、エステル形成又はアミド形成等によ
り化学修飾されているペプチドを意味することを意図している。

【００９１】 本明細書において使用する「塩成分」とは、任意の有機又は無機塩、例えば限
定することなく、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＮＨ₄ Ｃｌ、ＣａＣｌ₂ 、酢酸ナトリウム
、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、
クエン酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、酢
酸カルシウム又はそれらの混合物を含むことを意図とする（Remington's Pharma
ceutical Sciences, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990,
or Remington : The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition (1995)
, 又はAmersham-Pharmacia Biotechからのハンドブック参照）。

【００９２】 本明細書において使用する「緩衝剤」とは、任意の緩衝剤、例えば、限定する
ことなく、クエン酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、トリス緩衝剤、硼酸緩衝剤、乳酸緩
衝剤、グリシルグリシン緩衝剤、アルギニン緩衝剤、炭酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、
グルタミン酸緩衝剤、アンモニウム緩衝剤、グリシン緩衝剤、アルキルアミン緩
衝剤、アミノエチルアルコール緩衝剤、エチレンジアミン緩衝剤、トリエタノー
ルアミン、イミダゾール緩衝剤、ピリジン緩衝剤及びバルビツール酸緩衝剤、並
びにそれらの混合物を含むことを意図とする（Remington's Pharmaceutical Sci
ences, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990, or Remington
: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition (1995), 又はAmersh
am-Pharmacia Biotechからのハンドブック参照）。

【００９３】 出発pH、緩衝剤及びイオン強度の選定は周知の技術、例えば慣用の試験管法に
従って行われる（Amersham Pharmacia Biotechからのハンドブック参照）。クロ
マトグラフィーイオン交換樹脂は精製すべき特定のＧＬＰ−１ペプチド、並びに
採用する条件、例えば当業者に周知のpH、緩衝剤、イオン強度等（即ち、典型的
には、陽イオン交換樹脂の場合、ＧＬＰ−１ペプチドの等電点より低いpH、そし
て陰イオン交換樹脂の場合、ＧＬＰ−１ペプチドのpIより高いpH、所望のpHを維
持するのに十分に強い緩衝剤、及び塩濃度により誘導される可能性のある十分に
低いイオン強度）に応じて選定されるものであり、そして例えばＡｍｅｒｓｈａ
ｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ由来のＳｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂、Ｓｅ
ｐｈａｄｅｘ樹脂、Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ樹脂及びＳｏｕｒｃｅ樹脂、ＢｉｏＳ
ｅｐｒａ由来のＨｙｐｅｒＤ樹脂、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ樹脂及びＳｐｈｅｒｏｓ
ｉｌ樹脂、ＴｏｓｏＨａａｓ由来のＴＳＫｇｅｌ樹脂及びＴｏｙｏｐｅａｒｌ樹
脂、Ｍｅｒｃｋ由来のＦｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ樹脂、Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ由来のＰｏｒｏｓ樹脂、ＢｉｏＲＡＤ由来のＭａｃｒｏ
−Ｐｒｅｐ樹脂、Ｗｈａｔｍａｎ由来のＥｘｐｒｅｓｓ−ｉｏｎ樹脂、等が挙げ
られる。

【００９４】 本明細書で使用する「有機改質剤、水、任意的に塩成分、及び任意的に緩衝剤
から本質的に成る溶液」とは、１又は複数種の有機改質剤、水、１又は複数種の
塩成分（又は塩成分抜き）、１又は複数種の緩衝剤（又は緩衝剤抜き）、並びに
慣用のイオン交換クロマトグラフィー方法に従い当業者が添加を考慮する任意の
１又は複数種の更なる慣用の成分を含む溶液を意味することを意図とする。

【００９５】 本明細書で使用する「近縁の不純物」とは、ＧＬＰ−１ペプチドとは異なる局
部又は総合的な正味の電荷を有する１又は複数種の不純物、例えば切頭型、あら
ゆる種類の伸長型（追加のアミノ酸、エステル等の様々な誘導体）、脱アミド型
、不適切に折りたたまれた型、シアル化等の所望されないグリコシル化を有する
型、他を意味することを意図する。本明細書で使用する「無縁の不純物」とは、
近縁の不純物とは異なる不純物を包括することを意図する。

【００９６】 本明細書で使用する「一定のpH値」とは、例えば緩衝剤の存在下といったpH値
が一定でありうること、又は緩衝剤が存在しないなら一般に３pH単位内で変動し
うることを意味することを意図とする。

【００９７】 本明細書で使用する「線形又は階段式pH勾配」とは、pH値が溶離の最中に低pH
から高pHへと変化すると、又は高pHから低pHへと変化することを意味することを
意図する。かかるpHの変化は通常緩衝剤により、及び／又は無機もしくは有機系
の酸もしくは塩基、例えばＨＣｌ、ＮａＯＨ、Ｈ₂ Ｏ、酢酸、ＮＨ₃ 、ＫＯＨ、
Ｈ₂ ＳＯ₄ 、クエン酸の添加により生ずる。陽イオン交換のためのpH勾配は通常
低pHから高pHであり、陰イオン交換の場合高pHから低pHである。

【００９８】 本明細書で使用する「線形又は階段式勾配の塩成分又はイソクラティック式塩
成分」とは、塩濃度が溶離の最中に低濃度から高濃度へと変化するか、又は一定
であることを意味することを意図する。

【００９９】 本発明は更に下記の観点に関連する。

【０１００】 観点１．ＧＬＰ−１ペプチド及び近縁又は無縁の不純物を含んで成る混合物から
前記ペプチドを精製するための陽イオン交換クロマトグラフィー方法であって、
下記の工程： 前記混合物の前記ＧＬＰ−１ペプチドと前記近縁又は無縁の不純物とを、有機
改質剤、水、任意的に塩成分、及び任意的に緩衝剤から本質的に成る溶液内での
線形もしくは階段式勾配の塩成分又はイクソクラティック式塩成分及び／あるい
は線形もしくは階段式pH勾配又は一定のpH値による溶離により分割させることを
含んで成り、ここで当該pH勾配又はpH値は、前記ペプチドが前記近縁又は無縁の
不純物の局部又は総合的な正の正味の電荷とは異なる正の局部又は総合的な正味
の電荷を有することで当該近縁又は無縁の不純物が除去されるといったpH範囲内
にあるべきである、方法。

【０１０１】 観点２．ＧＬＰ−１ペプチド及び近縁の不純物を含んで成る混合物から前記ペプ
チドを精製するための陽イオン交換クロマトグラフィー方法であって、下記の工
程： 前記混合物の前記ＧＬＰ−１ペプチドと前記近縁の不純物とを、有機改質剤、
水、任意的に塩成分、及び任意的に緩衝剤から本質的に成る溶液内での線形もし
くは階段式勾配の塩成分又はイクソクラティック式塩成分及び／あるいは線形も
しくは階段式pH勾配又は一定のpH値による溶離により分割させることを含んで成
り、ここで当該pH勾配又はpH値は、前記ペプチドが前記近縁の不純物の局部又は
総合的な正の正味の電荷とは異なる正の局部又は総合的な正味の電荷を有するこ
とで当該近縁の不純物が除去されるといったpH範囲内にあるべきである、方法。

【０１０２】 観点３．ＧＬＰ−１ペプチド及び近縁又は無縁の不純物を含んで成る混合物から
前記ペプチドを精製するための陰イオン交換クロマトグラフィー方法であって、
下記の工程： 前記混合物の前記ＧＬＰ−１ペプチドと前記近縁又は無縁の不純物とを、有機
改質剤、水、任意的に塩成分、及び任意的に緩衝剤から本質的に成る溶液内での
線形もしくは階段式勾配の塩成分又はイクソクラティック式塩成分及び／あるい
は線形もしくは階段式pH勾配又は一定のpH値による溶離により分割させることを
含んで成り、ここで当該pH勾配又はpH値は、前記ペプチドが前記近縁又は無縁の
不純物の局部又は総合的な負の正味の電荷とは異なる負の局部又は総合的な正味
の電荷を有することで当該近縁又は無縁の不純物が除去されるといったpH範囲内
にあるべきである、方法。

【０１０３】 観点４．ＧＬＰ−１ペプチド及び近縁の不純物を含んで成る混合物から前記ペプ
チドを精製するための陰イオン交換クロマトグラフィー方法であって、下記の工
程： 前記混合物の前記ＧＬＰ−１ペプチドと前記近縁の不純物とを、有機改質剤、
水、任意的に塩成分、及び任意的に緩衝剤から本質的に成る溶液内での線形もし
くは階段式勾配の塩成分又はイクソクラティック式塩成分及び／あるいは線形も
しくは階段式pH勾配又は一定のpH値による溶離により分割させることを含んで成
り、ここで当該pH勾配又はpH値は、前記ペプチドが前記近縁の不純物の局部又は
総合的な負の正味の電荷とは異なる負の局部又は総合的な正味の電荷を有するこ
とで当該近縁の不純物が除去されるといったpH範囲内にあるべきである、方法。

【０１０４】 観点５．前記有機改質剤、対、水の比が重量パーセント基準で１：９９〜９９：
１である、観点１〜４のいずれかに記載の方法。

【０１０５】 観点６．前記有機改質剤がＣ_1-6 −アルカノール、Ｃ_1-6 アルケノール又はＣ_{1- 6} アルキノール、尿素、グアニジン又はＣ_1-6 アルカン酸、Ｃ_2-6 グリコール又
はＣ_3-7 ポリアルコール、例えば糖から選ばれる、観点１〜５のいずれかに記載
の方法。

【０１０６】 観点７．前記塩成分が任意の有機塩又は無機塩、好ましくはＮａＣｌ、ＫＣｌ、
ＮＨ₄ Ｃｌ、ＣａＣｌ₂ 、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム、
クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、クエン酸アンモニウム、硫酸ナトリウ
ム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、酢酸カルシウム又はそれらの混合物から
選ばれる、観点１〜６のいずれかに記載の方法。

【０１０７】 観点８．塩成分の存在しない、観点１〜６のいずれかに記載の方法。

【０１０８】 観点９．塩成分の勾配が塩成分の階段又は線形勾配である、観点１〜７のいずれ
かに記載の方法。

【０１０９】 観点１０．塩成分が０．１mmol／kg〜３０００mmol／kgの範囲から選ばれる濃度
で存在する、観点９に記載の方法。

【０１１０】 観点１１．前記緩衝剤がクエン酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、トリス緩衝剤、硼酸緩
衝剤、乳酸緩衝剤、グリシルグリシン緩衝剤、アルギニン緩衝剤、炭酸緩衝剤、
酢酸緩衝剤、グルタミン酸緩衝剤、アンモニウム緩衝剤、グリシン緩衝剤、アル
キルアミン緩衝剤、アミノエチルアルコール緩衝剤、エチレンジアミン緩衝剤、
トリエタノールアミン、イミダゾール緩衝剤、ピリジン緩衝剤及びバルビツール
酸緩衝剤、並びにそれらの混合物から選ばれる、観点１〜１０のいずれかに記載
の方法。

【０１１１】 観点１２．緩衝剤が０．１mmol／kg〜５００mmol／kgの範囲から選ばれる濃度で
存在する、観点１〜１１のいずれかに記載の方法。

【０１１２】 観点１３．緩衝剤が存在していない、観点１〜１０のいずれかに記載の方法。

【０１１３】 観点１４．ペプチドを単離するための方法であって、陽イオン交換クロマトグラ
フィーを介してＧＬＰ−１ペプチド及び近縁の不純物を含んで成る混合物から当
該ＧＬＰ−ペプチドを精製し、ここで当該陽イオン交換クロマトグラフィー方法
は下記の工程： 前記混合物の前記ＧＬＰ−１ペプチドと前記近縁の不純物とを、有機改質剤、
水、任意的に塩成分、及び任意的に緩衝剤から本質的に成る溶液内での線形もし
くは階段式勾配の塩成分又はイクソクラティック式塩成分及び／あるいは線形も
しくは階段式pH勾配又は一定のpH値による溶離により分割させることを含んで成
り、ここで当該pH勾配又はpH値は、前記ペプチドが前記近縁の不純物の局部又は
総合的な正の正味の電荷とは異なる正の局部又は総合的な正味の電荷を有するこ
とで当該近縁の不純物が除去されるといったpH範囲内にあるべきであり； しかる後、適宜、分析検査及び／又は更なる精製に委ね、次いで前記ペプチド
を慣用の方法で単離することを含む、方法。

【０１１４】 観点１５．ペプチドを単離するための方法であって、陰イオン交換クロマトグラ
フィーを介してＧＬＰ−１ペプチド及び近縁の不純物を含んで成る混合物から当
該ペプチドを精製し、ここで当該陰イオン交換クロマトグラフィー方法は下記の
工程： 前記混合物の前記ＧＬＰ−１ペプチドと前記近縁の不純物とを、有機改質剤、
水、任意的に塩成分、及び任意的に緩衝剤から本質的に成る溶液内での線形もし
くは階段式勾配の塩成分又はイクソクラティック式塩成分及び／あるいは線形も
しくは階段式pH勾配又は一定のpH値による溶離により分割させることを含んで成
り、ここで当該pH勾配又はpH値は、前記ペプチドが前記近縁の不純物の局部又は
総合的な負の正味の電荷とは異なる負の局部又は総合的な正味の電荷を有するこ
とで当該近縁の不純物が除去されるといったpH範囲内にあるべきであり； しかる後、適宜、分析検査及び／又は更なる精製に委ね、次いで前記ペプチド
を慣用の方法で単離することを含む、方法。

【０１１５】 観点１６．精製すべきペプチドがＧＬＰ−１（７−３７）、ＧＬＰ−１（７−３
６）アミド、並びにその類似体及び誘導体から選ばれる、観点１〜１５のいずれ
かに記載の方法。

【０１１６】 実施例 本発明を下記の実施例により更に説明するが、それらは本発明の範囲を限定す
るものではない。以上の説明及び下記の実施例に開示の特徴は、単独でも組合さ
っても、本発明を様々な形態で具現化するための資料となる。

【０１１７】 実施例１： Ａｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_(7-37)を例えばＷＯ９８／０８８７１に記載の慣用の組換
ＤＮＡ技術により酵母（Ｓａｃｃｈ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の中で発現させた
、Ａｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_(7-37)発酵ブロスを慣用の陽イオン交換クロマトグラフィ
ー捕獲工程により精製した。Ａｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_(7-37)及び不純物としてその切
頭型Ａｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_(9-37)を含むプールをpH３．１に調整し、そして得られ
る溶液１mlを３２．５mlの１．５４％（ｗ／ｗ）のクエン酸三ナトリウム、０．
６％（ｗ／ｗ）のコハク酸、１．０９％（ｗ／ｗ）のリン酸水素二ナトリウム・
二水和物、pH約３．２で平衡にした６．５mlのＣｅｒａｍｉｃ Ｓ Ｈｙｐｅｒ
Ｄ Ｆ（ＢｉｏＳｅｐｒａ Ｓ．Ａ）カラムに載せた。このカラムを６．５mlの
平衡溶液で洗い、そして溶離を３．２から８．０に至る線形pH勾配（１．５４％
（ｗ／ｗ）のクエン酸三ナトリウム、０．６％（ｗ／ｗ）のコハク酸、１．０９
％（ｗ／ｗ）のリン酸水素二ナトリウム・二水和物、pH８．０）、次いでpH８．
０での１３mlのイソクラティック溶離で実施した。切頭型と標的ＧＬＰ−１成分
との間で異なるピーク又は分割は得られなかった。

【０１１８】 実施例２： Ａｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_(7-37)を実施例１に記載の通りにして発現させ、陽イオン
交換により捕獲した。Ａｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_(7-37)及び不純物としてその切頭型Ａ
ｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_(9-37)を含むプールをpH３．１に調整し、そして得られる溶液
１mlを１００mlの１．５４％（ｗ／ｗ）のクエン酸三ナトリウム、０．６％（ｗ
／ｗ）のコハク酸、１．０９％（ｗ／ｗ）のリン酸水素二ナトリウム・二水和物
、pH約３．２で平衡にした２０mlのＳｏｕｒｃｅ ３０Ｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ
Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）カラムに載せた。このカラムを２０mlの
平衡溶液で洗い、そして溶離を３．２から８．０に至る線形pH勾配（１．５４％
（ｗ／ｗ）のクエン酸三ナトリウム、０．６％（ｗ／ｗ）のコハク酸、１．０９
％（ｗ／ｗ）のリン酸水素二ナトリウム・二水和物、pH８．０）、次いでpH８．
０での４０mlのイソクラティック溶離により行った。切頭型と標的ＧＬＰ−１成
分との間で異なるピーク又は分割は得られなかった。

【０１１９】 実施例３： Ａｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_(7-37)を実施例１に記載の通りにして発現させ、陽イオン
交換により捕獲した。Ａｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_(7-37)及び不純物としてその切頭型Ａ
ｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_(9-37)を含むプールをpH３．１に調整し、そして得られる溶液
１mlを１００mlの０．７７％（ｗ／ｗ）のクエン酸三ナトリウム、０．３％（ｗ
／ｗ）のコハク酸、０．５５％（ｗ／ｗ）のリン酸水素二ナトリウム・二水和物
、pH約３．２で平衡にした２０mlのＳｏｕｒｃｅ ３０Ｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ
Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）カラムに載せた。このカラムを２０mlの
平衡溶液で洗った。溶離を３．２から８．０に至る線形pH勾配（０．７７％（ｗ
／ｗ）のクエン酸三ナトリウム、０．３％（ｗ／ｗ）のコハク酸、０．５５％（
ｗ／ｗ）のリン酸水素二ナトリウム・二水和物）、次いでpH８．０での４０mlの
イソクラティック溶離により行った。pH８．０での後半の溶離は０．０から１．
０ＭのＮａＣｌに至る線形塩勾配（０．７７％（ｗ／ｗ）のクエン酸三ナトリウ
ム、０．３％（ｗ／ｗ）のコハク酸、０．５５％（ｗ／ｗ）のリン酸水素二ナト
リウム・二水和物、pH８．０）、次いで１．０ＭのＮａＣｌでの４０mlのイソク
ラティック溶離で行った。切頭型と標的ＧＬＰ−１成分との間で異なるピーク又
は分割は得られなかった。

【０１２０】 実施例４： Ａｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_(7-37)を実施例１に記載の通りにして発現させ、陽イオン
交換により捕獲した。２容量の水をＡｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_(7-37)及び不純物として
その切頭型Ａｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_(9-37)を含むプールに加え、次いでその溶液をpH
３．５に調整した。得られる溶液２５．５mlを１００mlの０．２１％（ｗ／ｗ）
のクエン酸三ナトリウム、０．０８％（ｗ／ｗ）のコハク酸、０．１５％（ｗ／
ｗ）のリン酸水素二ナトリウム・二水和物、４５％（ｗ／ｗ）のエタノール、pH
約３．２で平衡にした２０mlのＳｏｕｒｃｅ ３０Ｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）カラムに載せた。このカラムを２０mlの平衡
溶液で洗い、そして溶離を３．２から８．０に至る線形pH勾配（０．２１％（ｗ
／ｗ）のクエン酸三ナトリウム、０．０８％（ｗ／ｗ）のコハク酸、０．１５％
（ｗ／ｗ）のリン酸水素二ナトリウム・二水和物、４５％のエタノール、pH８．
０）、次いでpH８．０での４０mlのイソクラティック溶離により行った。クロマ
トグラフ図を図２に示す。クロマトグラフィー溶液へのエタノールの添加によっ
ては切頭型と標的ＧＬＰ−１成分との間で異なるピーク又は分割は得られなかっ
た。本例と実施例２との設定の間での有意義でない相違点はバッチが異なる、pH
、適用のためのサンプルの水希釈率、装填量の多さ、及び低い緩衝剤濃度にある
。

【０１２１】 実施例５： Ａｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_(7-37)を実施例１に記載の通りにして発現させ、陽イオン
交換により捕獲した。Ａｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_(7-37)及び不純物としてその切頭型Ａ
ｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_(9-37)を含むプールをpH３．１に調整し、そして得られる溶液
５mlを１００mlの０．８５％（ｗ／ｗ）のクエン酸三ナトリウム、０．３３％（
ｗ／ｗ）のコハク酸、０．６％（ｗ／ｗ）のリン酸水素二ナトリウム・二水和物
、４５％（ｗ／ｗ）のエタノール、pH約３．２で平衡にした２０mlのＳｏｕｒｃ
ｅ ３０Ｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）カラム
に載せた。このカラムを２０mlの平衡溶液で洗い、そして溶離を約３．２から約
５．０に至る線形pH勾配（０．８５％（ｗ／ｗ）のクエン酸三ナトリウム、０．
３３％（ｗ／ｗ）のコハク酸、０．６％（ｗ／ｗ）のリン酸水素二ナトリウム・
二水和物、４５％（ｗ／ｗ）のエタノール）、次いでpH８．０での４０mlのイソ
クラティック溶離（８５％（ｗ／ｗ）のクエン酸三ナトリウム、０．３３％（ｗ
／ｗ）のコハク酸、０．６％（ｗ／ｗ）のリン酸水素二ナトリウム・二水和物、
４５％（ｗ／ｗ）のエタノール、pH８．０）により行った。クロマトグラフ図を
図３に示す。クロマトグラフィー溶液へのエタノールの添加によって切頭型と標
的ＧＬＰ−１成分との間で異なるピーク及び分割が得られた。

【０１２２】 集めたピークの同定／確認のためのＲＰ−ＨＰＬＣ分析を５μｍの粒子の入っ
たＣ₁₈置換化１２０Åシリカ（ＹＭＣ）４．０×２５０mMカラムで実施した。緩
衝液Ａは７．８％（ｗ／ｗ）のアセトニトリルpH２．５中の０．１５Ｍの（ＮＨ₄ ）₂ ＳＯ₄ から成り、そして緩衝液Ｂは６３．４％（ｗ／ｗ）のアセトニトリ
ルを含んだ。１２分間での３７〜４１％のＢ、しかる後の１５分間での４１〜１
００％のＢの線形勾配を１ml／min の流速で流した。クロマトグラフィー温度は
６０℃に保ち、そしてＵＶ検出は２１４nmで行った。分析結果は以下の通りであ
る：

【０１２３】 Arg³⁴GLP-1_(7-37)含有量 Arg³⁴GLP-1_(9-37)含有量 適用サンプル ３６％ １３％ 不純物ピーク ２％ ４５％ メインピーク ５０％ １％

【０１２４】 適用サンプル及び溶離液のクロマトグラフ図を図４及び５にそれぞれ示す。分
析結果は、有機改質剤を採用する陽イオン交換クロマトグラフィーによる切頭型
の選択的な分割及び標的ＧＬＰ−１成分を含むメインピーク内での切頭型の激減
を示す。

【０１２５】 実施例６： Ａｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_(7-37)を実施例１に記載の通りにして発現させ、陽イオン
交換により捕獲した。Ａｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_(7-37)及び不純物としてのその切頭型
Ａｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_(9-37)を含むプールをpH３．１に調整し、そして得られる溶
液１０mlを１００mlの２０mmol／kgのクエン酸、４５％（ｗ／ｗ）のエタノール
、pH３．０で平衡にした２０mlのＳｏｕｒｃｅ ３０Ｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）カラムに載せた。そのカラムを２０mlの平
衡溶液で洗い、そして溶離を０から２５０mmol／kgのＫＣｌに至る線形塩勾配（
２０mmol／kgのクエン酸、４５％（ｗ／ｗ）のエタノール、pH３．０）、次いで
２５０mmol／kgのＫＣｌでの６０mlのイソクラティック溶離により行った。クロ
マトグラフ図を図６に示す。クロマトグラフィー溶液へのエタノールの添加によ
り切頭型と標的ＧＬＰ−１成分との間で異なるピーク及び分割が得られた。

【０１２６】 実施例７： Ａｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_(7-37)を実施例１に記載の通りにして発現させ、陽イオン
交換により捕獲した。Ａｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_(7-37)及び不純物としてのその切頭型
Ａｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_(9-37)を含むプールをpH３．５に調整し、そして得られる溶
液１０mlを１００mlの２０mmol／kgのクエン酸、４５％（ｗ／ｗ）のエタノール
、pH３．５で平衡にした２０mlのＳｏｕｒｃｅ ３０Ｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）カラムに載せた。そのカラムを２０mlの平
衡溶液で洗い、そして溶離を０から２５０mmol／kgのＫＣｌに至る線形塩勾配（
２０mmol／kgのクエン酸、４５％（ｗ／ｗ）のエタノール、pH３．５）、次いで
２５０mmol／kgのＫＣｌでの４０mlのイソクラティック溶離により行った。実施
例６で得られたとの似たように、切頭型と標的ＧＬＰ−１成分との間で異なるピ
ーク及び分割が得られた。

【０１２７】 実施例８： Ａｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_(7-37)発酵ブロスを慣用の陽イオン交換クロマトグラフィ
ー捕獲工程、しかる後の慣用のＲＰ−ＨＰＬＣ精製工程により精製した。６容量
の水をＡｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_(7-37)及び不純物としてのその切頭型Ａｒｇ³⁴ＧＬＰ
−１_(9-37)を含むプールに添加し、そしてその溶液をpH３．５に調整し、そして
得られる溶液１７０mlを１００mlの２０mmol／kgのクエン酸、３７．５mmol／kg
のＫＣｌ、４５％（ｗ／ｗ）のエタノール、pH３．５で平衡にした２０mlのＳｏ
ｕｒｃｅ ３０Ｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）
カラムに載せた。そのカラムを２０mlの平衡溶液で洗い、そして溶離を３７．５
から１６２．５mmol／kgのＫＣｌに至る線形塩勾配（２０mmol／kgのクエン酸、
４５％（ｗ／ｗ）のエタノール、pH３．５）、次いで２５０mmol／kgのＫＣｌで
の２０mlのイソクラティック溶離（２０mmol／kgのクエン酸、４５％（ｗ／ｗ）
のエタノール、pH３．５）により行った。クロマトグラフィー溶液へのエタノー
ルの添加により切頭型と標的ＧＬＰ−１成分との間で異なるピーク及び分割が得
られた。

【０１２８】 実施例９： Ａｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_(7-37)を実施例１に記載の通りにして発現させ、そして陽
イオン交換により捕獲した。Ａｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_(7-37)及び様々な不純物を含む
プール１０mlを１００mlの２０mMのリン酸水素二ナトリウム・二水和物、pH７．
５で平衡にした２０mlのＤＥＡＥ ＨｙｐｅｒＤ ２０（ＢｉｏＳｅｐｒａ Ｓ
．Ａ．）カラムに載せた。そのカラムを２０mlの平衡溶液で洗い、そして溶離を
０から２５０mMのＮａＣｌに至る線形塩勾配（２０mMのリン酸水素二ナトリウム
・二水和物、pH７．５）、次いで１mMのＮａＣｌでの４０mlのイソクラティック
溶離（２０mMのリン酸水素二ナトリウム、pH７．５）により行った。全ピーク領
域の間で標的ＧＬＰ−１成分が溶離する際に異なるピーク又は分割は得られなか
った。

【０１２９】 実施例１０： Ａｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_(7-37)を実施例１に記載の通りにして発現させ、そして陽
イオン交換により捕獲した。Ａｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_(7-37)及び様々な不純物を含む
プールを３容量の水で希釈し、そして得られる溶液４０mlを１００mlの２０mMの
トリス−ヒドロキシメチルアミノメタン、pH８．５で平衡にした２０mlのＳｏｕ
ｒｃｅ １５Ｑ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）カ
ラムに載せた。そのカラムを２０mlの平衡溶液で洗い、そして溶離を０から２５
０mMのＮａＣｌに至る線形塩勾配（２０mMのトリス−ヒドロキシメチルアミノメ
タン、pH８．５）、次いで２５０mMのＮａＣｌでの４０mlのイソクラティック溶
離により行った。クロマトグラフ図を図７に示す。全ピーク領域の間で標的ＧＬ
Ｐ−１成分が溶離する際に異なるピーク又は分割は得られなかった。

【０１３０】 実施例１１： Ａｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_(7-37)を実施例１に記載の通りにして発現させ、そして陽
イオン交換により捕獲した。Ａｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_(7-37)及び様々な不純物を含む
プールを３容量の水で希釈し、そして得られる溶液２０mlを１００mlの２０mmol
／kgのトリス−ヒドロキシメチルアミノメタン、４５％（ｗ／ｗ）のエタノール
、pH８．５で平衡にした２０mlのＳｏｕｒｃｅ １５Ｑ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）カラムに載せた。そのカラムを２０mlの平
衡溶液で洗い、そして溶離を０から２５０mmol／kgのＮａＣｌに至る線形塩勾配
（２０mmol／kgのトリス−ヒドロキシメチルアミノメタン、４５％（ｗ／ｗ）の
エタノール、pH８．５）、次いで２５０mmol／kgのＮａＣｌでの４０mlのイソク
ラティック溶離により行った。クロマトグラフ図を図８に示す。クロマトグラフ
ィー溶液へのエタノールの添加により、様々な不純物と標的ＧＬＰ−１成分との
間で有意なピーク又は分割は得られた。本例と実施例１０との設定における有意
義でない相違点は、異なる装填量及び緩衝液濃度にある。

【０１３１】 実施例１２： Ａｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_(7-37)を実施例１に記載の通りにして発現させ、そして陽
イオン交換により捕獲した。Ａｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_(7-37)及び様々な不純物を含む
プールを１容量の水で希釈し、そして得られる溶液２０mlを１００mlの２０mmol
／kgのトリス−ヒドロキシメチルアミノメタン、４５％（ｗ／ｗ）のエタノール
、pH８．５で平衡にした２０mlのＳｏｕｒｃｅ １５Ｑ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）カラムに載せた。そのカラムを２０mlの平
衡溶液で洗い、そして溶離を０から１００mmol／kgのＮａＣｌに至る線形塩勾配
（２０mmol／kgのトリス−ヒドロキシメチルアミノメタン、４５％（ｗ／ｗ）の
エタノール、pH８．５）、次いで１００mMのＮａＣｌでの４０mlのイソクラティ
ック溶離により行った。クロマトグラフィー溶液へのエタノールの添加により様
々な不純物と標的ＧＬＰ−１成分との間で異なるピーク又は分割は得られた。

【０１３２】 実施例１３： Ａｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_(7-37)を実施例１に記載の通りにして発現させた。Ａｒｇ³⁴ ＧＬＰ−１_(7-37)を慣用の逆相クロマトグラフィー捕獲工程により発酵ブロス
から単離し、次いでＡｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_(7-37)のpI（等電点）にて沈殿させた。
Ａｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_(7-37)及び複数種の不純物としてその切頭型Ａｒｇ³⁴ＧＬＰ
−１_(9-37)を含む沈殿物１０ｇを５００mlの水に懸濁し、そして８．３のpHに調
整することにより溶解してＡｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_(7-37)濃度約１．６mg／mlにした
。得られる溶液５mlをpH３．５に調整し、そして６０mlの０．４２％（ｗ／ｗ）
のクエン酸、pH３．５で平衡にした２０mlのＳｏｕｒｃｅ ３０Ｓ（Ａｍｅｒｓ
ｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に載せた。切頭型は０から２Ｍ
のＮａＣｌに至る線形勾配では溶離／洗浄除去されなかった。標的ペプチドＡｒ
ｇ³⁴ＧＬＰ−１_(7-37)及び不純物Ａｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_(9-37)は４％（ｗ／ｗ）の
ＮａＯＨの再生溶媒４０mlにより単一のピークとして溶離した。クロマトグラフ
図を図９に示す。有機改質剤抜きでは慣用の高塩溶液による低pHでの洗浄段階に
よる切頭型不純物の除去は達成されなかった。

【０１３３】 実施例１４： Ａｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_(7-37)を慣用の逆相クロマトグラフィーにより発酵ブロス
から単離し、そして実施例１３に記載の通りにして沈殿させた。Ａｒｇ³⁴ＧＬＰ
−１_(7-37)及び複数の不純物の一つとしてのその切頭型Ａｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_{(9-3 7)} を含む沈殿物１０ｇを５００mlの水に懸濁し、そしてpHを８．３に調整するこ
とにより溶解させてＡｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_(7-37)濃度約１．６mg／mlにした。得ら
れる溶液５mlをpH３．５に調整し、そして６０mlの０．４２％（ｗ／ｗ）のクエ
ン酸、３４％（ｗ／ｗ）のエタノール、pH３．５で平衡にした２０mlのＳｏｕｒ
ｃｅ ３０Ｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）カラ
ムに載せた。溶離は０から２．２３％（ｗ／ｗ）のＫＣｌに至る線形塩勾配（０
．４２％（ｗ／ｗ）のクエン酸、３４％（ｗ／ｗ）のエタノール、pH３．５）で
実施した。実施例６と似たように、切頭型と標的ＧＬＰ−１成分との間で異なる
ピーク及び分割が得られた。

【０１３４】 実施例１５： Ａｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_(7-37)を慣用の逆相クロマトグラフィーにより発酵ブロス
から単離し、そして実施例１３に記載の通りにして沈殿させた。Ａｒｇ³⁴ＧＬＰ
−１_(7-37)及び複数の不純物の一つとしてのその切頭型Ａｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_{(9-3 7)} を含む沈殿物１０ｇを５００mlの水に懸濁し、そしてpHを８．３に調整するこ
とにより溶解させてＡｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_(7-37)濃度約１．６mg／mlにした。得ら
れる溶液５mlをpH３．５に調整し、そして６０mlの０．４２％（ｗ／ｗ）のクエ
ン酸、２９％（ｗ／ｗ）のエタノール、pH３．５で平衡にした２０mlのＳｏｕｒ
ｃｅ ３０Ｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）カラ
ムに載せた。溶離は０から２．２３％（ｗ／ｗ）のＫＣｌに至る線形塩勾配（０
．４２％（ｗ／ｗ）のクエン酸、２９％（ｗ／ｗ）のエタノール、pH３．５）で
実施した。切頭型と標的ＧＬＰ−１成分との間で分割が得られた。

【０１３５】 実施例１６： Ａｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_(7-37)を慣用の逆相クロマトグラフィーにより発酵ブロス
から単離し、そして実施例１３に記載の通りにして沈殿させた。Ａｒｇ³⁴ＧＬＰ
−１_(7-37)及び複数の不純物の一つとしてのその切頭型Ａｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_{(9-3 7)} を含む沈殿物１０ｇを５００mlの水に懸濁し、そしてpHを８．３に調整するこ
とにより溶解させてＡｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_(7-37)濃度約１．６mg／mlにした。得ら
れる溶液５mlをpH３．５に調整し、そして６０mlの０．４２％（ｗ／ｗ）のクエ
ン酸、５１％（ｗ／ｗ）のエタノール、pH３．５で平衡にした２０mlのＳｏｕｒ
ｃｅ ３０Ｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）カラ
ムに載せた。溶離は０から２．２３％（ｗ／ｗ）のＫＣｌに至る線形塩勾配（０
．４２％（ｗ／ｗ）のクエン酸、５１％（ｗ／ｗ）のエタノール、pH３．５）で
実施した。実施例６と似たように、切頭型と標的ＧＬＰ−１成分との間で異なる
ピーク及び分割が得られた。

【０１３６】 実施例１７： Ａｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_(7-37)を慣用の逆相クロマトグラフィーにより発酵ブロス
から単離し、そして実施例１３に記載の通りにして沈殿させた。Ａｒｇ³⁴ＧＬＰ
−１_(7-37)及び複数の不純物の一つとしてのその切頭型Ａｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_{(9-3 7)} を含む沈殿物１０ｇを５００mlの水に懸濁し、そしてpHを８．３に調整するこ
とにより溶解させてＡｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_(7-37)濃度約１．６mg／mlにした。得ら
れる溶液５mlをpH３．５に調整し、そして６０mlの０．４２％（ｗ／ｗ）のクエ
ン酸、７１％（ｗ／ｗ）のエタノール、pH３．５で平衡にした２０mlのＳｏｕｒ
ｃｅ ３０Ｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）カラ
ムに載せた。溶離は０から１．１２％（ｗ／ｗ）のＫＣｌに至る線形塩勾配（０
．４２％（ｗ／ｗ）のクエン酸、７１％（ｗ／ｗ）のエタノール、pH３．５）で
実施した。クロマトグラフ図を図１０に示す。実施例６と似たように、切頭型と
標的ＧＬＰ−１成分との間で異なるピーク及び分割が得られた。

【０１３７】 実施例１８： Ａｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_(7-37)を慣用の逆相クロマトグラフィーにより発酵ブロス
から単離し、そして実施例１３に記載の通りにして沈殿させた。Ａｒｇ³⁴ＧＬＰ
−１_(7-37)及び複数の不純物の一つとしてのその切頭型Ａｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_{(9-3 7)} を含む沈殿物１０ｇを５００mlの水に懸濁し、そしてpHを８．３に調整するこ
とにより溶解させてＡｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_(7-37)濃度約１．６mg／mlにした。得ら
れる溶液５mlをpH３．５に調整し、そして６０mlの０．４２％（ｗ／ｗ）のクエ
ン酸、４０％（ｗ／ｗ）の２−プロパノール、pH３．５で平衡にした２０mlのＳ
ｏｕｒｃｅ ３０Ｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ
）カラムに載せた。溶離は０から２．２３％（ｗ／ｗ）のＫＣｌに至る線形塩勾
配（０．４２％（ｗ／ｗ）のクエン酸、４０％（ｗ／ｗ）の２−プロパノール、
pH３．５）で実施した。クロマトグラフ図を図１１に示す。切頭型と標的ＧＬＰ
−１成分との間で異なるピーク及び分割が得られた。

【０１３８】 実施例１９： Ａｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_(7-37)を慣用の逆相クロマトグラフィーにより発酵ブロス
から単離し、そして実施例１３に記載の通りにして沈殿させた。Ａｒｇ³⁴ＧＬＰ
−１_(7-37)及び複数の不純物の一つとしてのその切頭型Ａｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_{(9-3 7)} を含む沈殿物１０ｇを５００mlの水に懸濁し、そしてpHを８．３に調整するこ
とにより溶解させてＡｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_(7-37)濃度約１．６mg／mlにした。得ら
れる溶液５mlをpH３．５に調整し、そして２４mlの０．４２％（ｗ／ｗ）のクエ
ン酸、５１％（ｗ／ｗ）のエタノール、pH３．５で平衡にした８mlのＰｏｒｏｓ
５０ＨＳ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）カラムに載せた。溶離は０から２．
２３％（ｗ／ｗ）のＫＣｌに至る線形塩勾配（０．４２％（ｗ／ｗ）のクエン酸
、５１％（ｗ／ｗ）のエタノール、pH３．５）で実施した。クロマトグラフ図を
図１２に示す。切頭型と標的ＧＬＰ−１成分との間で異なるピーク及び分割が得
られた。

【０１３９】 実施例２０： Ａｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_(7-37)を慣用の逆相クロマトグラフィーにより発酵ブロス
から単離し、そして実施例１３に記載の通りにして沈殿させた。Ａｒｇ³⁴ＧＬＰ
−１_(7-37)及び複数の不純物の一つとしてのその切頭型Ａｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_{(9-3 7)} を含む沈殿物１０ｇを５００mlの水に懸濁し、そしてpHを８．３に調整するこ
とにより溶解させてＡｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_(7-37)濃度約１．６mg／mlにした。得ら
れる溶液５mlをpH３．５に調整し、そして２４mlの０．４２％（ｗ／ｗ）のクエ
ン酸、４０％（ｗ／ｗ）の２−プロパノール、pH３．５で平衡にした８mlのＰｏ
ｒｏｓ ５０ＨＳ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）カラムに載せた。溶離は０か
ら２．２３％（ｗ／ｗ）のＫＣｌに至る線形塩勾配（０．４２％（ｗ／ｗ）のク
エン酸、４０％（ｗ／ｗ）の２−プロパノール、pH３．５）で実施した。切頭型
と標的ＧＬＰ−１成分との間で異なるピーク及び分割が得られた。

【０１４０】 実施例２１： Ａｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_(7-37)を慣用の逆相クロマトグラフィーにより発酵ブロス
から単離し、そして実施例１３に記載の通りにして沈殿させた。Ａｒｇ³⁴ＧＬＰ
−１_(7-37)及び複数の不純物の一つとしてのその切頭型Ａｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_{(9-3 7)} を含む沈殿物１０ｇを５００mlの水に懸濁し、そしてpHを８．３に調整するこ
とにより溶解させてＡｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_(7-37)濃度約１．６mg／mlにした。得ら
れる溶液５mlをpH３．５に調整し、そして６０mlの０．４２％（ｗ／ｗ）のクエ
ン酸、４０％（ｗ／ｗ）の２−メチル−２，４−ペンタンジオール、pH３．５で
平衡にした２０mlのＳｏｕｒｃｅ ３０Ｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）カラムに載せた。溶離は０から２．２３％（ｗ／ｗ）の
ＫＣｌに至る線形塩勾配（０．４２％（ｗ／ｗ）のクエン酸、４０％（ｗ／ｗ）
の２−メチル−２，４−ペンタンジオール、pH３．５）で実施した。クロマトグ
ラフ図を図１３に示す。切頭型と標的ＧＬＰ−１成分との間で異なるピーク及び
分割が得られた。

【０１４１】 実施例２２： Ａｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_(7-37)を慣用の逆相クロマトグラフィーにより発酵ブロス
から単離し、そして実施例１３に記載の通りにして沈殿させた。その沈殿物を水
に溶解し、そして有機改質剤を利用する陽イオン交換クロマトグラフィー、しか
る後のエタノールでの慣用の逆相クロマトグラフィーにより精製した。逆相溶離
液から精製Ａｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_(7-37)をＡｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_(7-37)のpIで沈殿さ
せた。Ａｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_(7-37)をＷＯ ９８０８８７１に記載の通りにしてア
シル化した。 ２mg／mlの濃度でモノアシル化Ａｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_(7-37)を、そして不純物と
してＡｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_(7-37)及びジアシル化Ａｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_(7-37)を含む
得られる溶液を３容量の水で希釈した。pH６．９の５mlの希釈溶液を６０mlの０
．４２％（ｗ／ｗ）のクエン酸、６４．５％（ｗ／ｗ）のエタノール、pH３．５
で平衡にした２０mlのＳｏｕｒｃｅ ３０Ｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）カラムに載せた。溶離は、０から１．３０％（ｗ／ｗ
）のＫＣｌに至る線形塩勾配（０．４２％（ｗ／ｗ）のクエン酸、６４．５％（
ｗ／ｗ）のエタノール、pH３．５）で行った。クロマトグラフ図４を図１４に示
す。３つのＧＬＰ−１成分間で異なるピーク及び分割として溶離したＧＬＰ−１
成分が得られた。

【０１４２】 集めたピークの同定／確認のためのＲＰ−ＨＰＬＣ分析を５μｍの粒子の入っ
たジメチル−ブチル−ジメチル−シリル置換化１００Åシリカ（Ｆｕｊｉ−Ｄａ
ｖｉｓｏｎ）４．０×２５０mmカラムで実施した。緩衝液Ａは７．８％（ｗ／ｗ
）のアセトニトリル、pH２．５中の０．１５Ｍの（ＮＨ₄ ）₂ ＳＯ₄ から成り、
そして緩衝液Ｂは６３．４％（ｗ／ｗ）のアセトニトリルを含んだ。１ml／min
の流速での勾配プログラムは下記の通りである：１０分間での３５〜５７．５％
のＢの線形勾配；２２分間での５７．５〜６７．５％のＢの線形勾配；３分間で
の６７．５〜９０％のＢの線形勾配；５分間での９０％のＢのイソクラティック
；２分間での９０〜３５％のＢの線形勾配；及び５分間での３５％のＢのイソク
ラティック。クロマトグラフィー温度は６０℃に保ち、そしてＵＶ検出は２１４
nmで実施した。分析クロマトグラフ図は３つのＧＬＰ−１成分間の分割を確認し
た。

【０１４３】 実施例２３： Ａｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_(7-37)を慣用の逆相クロマトグラフィーにより発酵ブロス
から単離し、そして実施例１３に記載の通りにして沈殿させた。その沈殿物を水
に溶解し、そして有機改質剤を利用する陽イオン交換クロマトグラフィー、しか
る後のエタノールでの慣用の逆相クロマトグラフィーにより精製した。逆相溶離
液から精製Ａｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_(7-37)をＡｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_(7-37)のpIで沈殿さ
せた。Ａｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_(7-37)をＷＯ ９８０８８７１に記載の通りにしてア
シル化した。 ２mg／mlの濃度でモノアシル化Ａｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_(7-37)を、そして不純物と
してＡｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_(7-37)及びジアシル化Ａｒｇ³⁴ＧＬＰ−１_(7-37)を含む
得られる溶液を３容量の水で希釈した。pH６．９の５mlの希釈溶液を６０mlの０
．４２％（ｗ／ｗ）のクエン酸、４０％（ｗ／ｗ）の２−プロパノール、pH３．
５で平衡にした２０mlのＳｏｕｒｃｅ ３０Ｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）カラムに載せた。溶離は、０から２．２３％（ｗ／
ｗ）のＫＣｌに至る線形塩勾配（０．４２％（ｗ／ｗ）のクエン酸、４０％（ｗ
／ｗ）の２−プロパノール、pH３．５）で行った。３つのＧＬＰ−１成分間で異
なるピーク及び分割として溶離したＧＬＰ−１成分が得られた。実施例２２のＲ
Ｐ−ＨＰＬＣ分析方法を集めたピークの同定／確認のために使用した。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１３年３月２７日（２００１．３．２７）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ， ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，Ｋ Ｒ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ペプチド又はＧＬＰ−１ペプチド及び近縁又は無縁の不純物
   を含んで成る混合物から前記ペプチド又はＧＬＰ−１ペプチドを精製するための
   陽イオン交換クロマトグラフィー方法であって、下記の工程： 前記混合物の前記ペプチド又はＧＬＰ−１ペプチドと前記近縁又は無縁の不純
   物とを、有機改質剤、水、任意的に塩成分、及び任意的に緩衝剤を含んで成る溶
   液内での線形もしくは階段式勾配の塩成分又はイクソクラティック式塩成分及び
   ／あるいは線形もしくは階段式pH勾配又は一定のpH値による溶離により分割させ
   ることを含んで成り、ここで当該pH勾配又はpH値は、前記ペプチド又はＧＬＰ−
   １ペプチドが前記近縁又は無縁の不純物の局部又は総合的な正の正味の電荷とは
   異なる正の局部又は総合的な正味の電荷を有することで当該近縁又は無縁の不純
   物が除去されるといったpH範囲内にあるべきである、方法。
2. 【請求項２】 ペプチド又はＧＬＰ−１ペプチド及び近縁の不純物を含んで
   成る混合物から前記ペプチド又はＧＬＰ−１ペプチドを精製するための陽イオン
   交換クロマトグラフィー方法であって、下記の工程： 前記混合物の前記ペプチド又はＧＬＰ−１ペプチドと前記近縁の不純物とを、
   有機改質剤、水、任意的に塩成分、及び任意的に緩衝剤から本質的に成る溶液内
   での線形もしくは階段式勾配の塩成分又はイクソクラティック式塩成分及び／あ
   るいは線形もしくは階段式pH勾配又は一定のpH値による溶離により分割させるこ
   とを含んで成り、ここで当該pH勾配又はpH値は、前記ペプチド又はＧＬＰ−１ペ
   プチドが前記近縁の不純物の局部又は総合的な正の正味の電荷とは異なる正の局
   部又は総合的な正味の電荷を有することで当該近縁の不純物が除去されるといっ
   たpH範囲内にあるべきである、方法。
3. 【請求項３】 ペプチド又はＧＬＰ−１ペプチド及び近縁又は無縁の不純物
   を含んで成る混合物から前記ペプチド又はＧＬＰ−１ペプチドを精製するための
   陰イオン交換クロマトグラフィー方法であって、下記の工程： 前記混合物の前記ペプチド又はＧＬＰ−１ペプチドと前記近縁又は無縁の不純
   物とを、有機改質剤、水、任意的に塩成分、及び任意的に緩衝剤を含んで成る溶
   液内での線形もしくは階段式勾配の塩成分又はイクソクラティック式塩成分及び
   ／あるいは線形もしくは階段式pH勾配又は一定のpH値による溶離により分割させ
   ることを含んで成り、ここで当該pH勾配又はpH値は、前記ペプチド又はＧＬＰ−
   １ペプチドが前記近縁又は無縁の不純物の局部又は総合的な負の正味の電荷とは
   異なる負の局部又は総合的な正味の電荷を有することで当該近縁又は無縁の不純
   物が除去されるといったpH範囲内にあるべきである、方法。
4. 【請求項４】 ペプチド又はＧＬＰ−１ペプチド及び近縁の不純物を含んで
   成る混合物から前記ペプチド又はＧＬＰ−１ペプチドを精製するための陰イオン
   交換クロマトグラフィー方法であって、下記の工程： 前記混合物の前記ペプチド又はＧＬＰ−１ペプチドと前記近縁の不純物とを、
   有機改質剤、水、任意的に塩成分、及び任意的に緩衝剤から本質的に成る溶液内
   での線形もしくは階段式勾配の塩成分又はイクソクラティック式塩成分及び／あ
   るいは線形もしくは階段式pH勾配又は一定のpH値による溶離により分割させるこ
   とを含んで成り、ここで当該pH勾配又はpH値は、前記ペプチド又はＧＬＰ−１ペ
   プチドが前記近縁の不純物の局部又は総合的な負の正味の電荷とは異なる負の局
   部又は総合的な正味の電荷を有することで当該近縁の不純物が除去されるといっ
   たpH範囲内にあるべきである、方法。
5. 【請求項５】 純粋なペプチド又はＧＬＰ−１ペプチドを生産するための、 前記ペプチド又はＧＬＰ−１ペプチド及び近縁の不純物を含んで成る混合物か
   ら前記ペプチドを精製するための陽イオン交換クロマトグラフィー方法であって
   、下記の工程： 前記混合物の前記ペプチド又はＧＬＰ−１ペプチドと前記近縁の不純物とを、
   有機改質剤、水、任意的に塩成分、及び任意的に緩衝剤を含んで成る溶液内での
   線形もしくは階段式勾配の塩成分又はイクソクラティック式塩成分及び／あるい
   は線形もしくは階段式pH勾配又は一定のpH値による溶離により分割させることを
   含んで成り、ここで当該pH勾配又はpH値は、前記ペプチド又はＧＬＰ−１ペプチ
   ドが前記近縁の不純物の局部又は総合的な正の正味の電荷とは異なる正の局部又
   は総合的な正味の電荷を有することで当該近縁の不純物が除去されるといったpH
   範囲内にあるべきである、方法を含む、を含む工業的方法。
6. 【請求項６】 純粋なペプチド又はＧＬＰ−１ペプチドを生産するための、 前記ペプチド又はＧＬＰ−１ペプチド及び近縁の不純物を含んで成る混合物か
   ら前記ペプチドを精製するための陰イオン交換クロマトグラフィー方法であって
   、下記の工程： 前記混合物の前記ペプチド又はＧＬＰ−１ペプチドと前記近縁の不純物とを、
   有機改質剤、水、任意的に塩成分、及び任意的に緩衝剤を含んで成る溶液内での
   線形もしくは階段式勾配の塩成分又はイクソクラティック式塩成分及び／あるい
   は線形もしくは階段式pH勾配又は一定のpH値による溶離により分割させることを
   含んで成り、ここで当該pH勾配又はpH値は、前記ペプチド又はＧＬＰ−１ペプチ
   ドが前記近縁の不純物の局部又は総合的な負の正味の電荷とは異なる負の局部又
   は総合的な正味の電荷を有することで当該近縁の不純物が除去されるといったpH
   範囲内にあるべきである、方法を含む、工業的方法。
7. 【請求項７】 ペプチド又はＧＬＰ−１ペプチドを単離するための方法であ
   って、陽イオン交換クロマトグラフィーを介して前記ペプチド又はＧＬＰ−１ペ
   プチド及び近縁の不純物を含んで成る混合物から当該ペプチド又はＧＬＰ−１ペ
   プチドを精製し、ここで当該陽イオン交換クロマトグラフィー方法は下記の工程
   ： 前記混合物の前記ペプチド又はＧＬＰ−１ペプチドと前記近縁の不純物とを、
   有機改質剤、水、任意的に塩成分、及び任意的に緩衝剤を含んで成る溶液内での
   線形もしくは階段式勾配の塩成分又はイクソクラティック式塩成分及び／あるい
   は線形もしくは階段式pH勾配又は一定のpH値による溶離により分割させることを
   含んで成り、ここで当該pH勾配又はpH値は、前記ペプチド又はＧＬＰ−１ペプチ
   ドが前記近縁の不純物の局部又は総合的な正の正味の電荷とは異なる正の局部又
   は総合的な正味の電荷を有することで当該近縁の不純物が除去されるといったpH
   範囲内にあるべきであり； しかる後、適宜、分析検査及び／又は更なる精製に委ね、次いで前記ペプチド
   又はＧＬＰ−ペプチドを慣用の方法で単離することを含む、方法。
8. 【請求項８】 ペプチド又はＧＬＰ−１ペプチドを単離するための方法であ
   って、陰イオン交換クロマトグラフィーを介して前記ペプチド又はＧＬＰ−１ペ
   プチド及び近縁の不純物を含んで成る混合物から当該ペプチド又はＧＬＰ−ペプ
   チドを精製し、ここで当該陰イオン交換クロマトグラフィー方法は下記の工程： 前記混合物の前記ペプチド又はＧＬＰ−１ペプチドと前記近縁の不純物とを、
   有機改質剤、水、任意的に塩成分、及び任意的に緩衝剤を含んで成る溶液内での
   線形もしくは階段式勾配の塩成分又はイクソクラティック式塩成分及び／あるい
   は線形もしくは階段式pH勾配又は一定のpH値による溶離により分割させることを
   含んで成り、ここで当該pH勾配又はpH値は、前記ペプチド又はＧＬＰ−１ペプチ
   ドが前記近縁の不純物の局部又は総合的な負の正味の電荷とは異なる負の局部又
   は総合的な正味の電荷を有することで当該近縁の不純物が除去されるといったpH
   範囲内にあるべきであり； しかる後、適宜、分析検査及び／又は更なる精製に委ね、次いで前記ペプチド
   又はＧＬＰ−ペプチドを慣用の方法で単離することを含む、方法。
9. 【請求項９】 精製すべき前記ＧＬＰ−１ペプチドがＧＬＰ−１（７−３７
   ）、ＧＬＰ−１（７−３６）アミド並びにその類似体及び誘導体、例えばＡｒｇ³⁴ ＧＬＰ−１（７−３７）；Ａｒｇ²⁶ＧＬＰ−１（７−３７）；Ａｒｇ³⁴Ｌｙｓ²⁶ （Ｎ^ε−（γ−Ｇｌｕ−（Ｎ^α−テトラデカノイル）））ＧＬＰ−１（７−３
   ７）；Ａｒｇ³⁴Ｌｙｓ²⁶（Ｎ^ε−（γ−Ｇｌｕ−（Ｎ^α−ヘキサデカノイル））
   ）ＧＬＰ−１（７−３７）；Ａｒｇ²⁶Ｌｙｓ³⁴（Ｎ^ε−（γ−Ｇｌｕ−（Ｎ^α−
   テトラデカノイル）））ＧＬＰ−１（７−３７）；Ａｒｇ²⁶Ｌｙｓ³⁴（Ｎ^ε−（
   γ−Ｇｌｕ−（Ｎ^α−ヘキサデカノイル）））ＧＬＰ−１（７−３７）；Ｖａｌ⁸ ＧＬＰ−１（７−３７）；Ｔｈｒ⁸ ＧＬＰ−１（７−３７）；Ｍｅｔ⁸ ＧＬＰ
   −１（７−３７）；Ｇｌｙ⁸ ＧＬＰ−１（７−３７）；Ｖａｌ⁸ ＧＬＰ−１（７
   −３６）アミド；Ｔｈｒ⁸ ＧＬＰ−１（７−３６）アミド；Ｍｅｔ⁸ＧＬＰ−１
   （７−３６）アミド；Ｇｌｙ⁸ ＧＬＰ−１（７−３６）アミド から選ばれる、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
10. 【請求項１０】 精製すべき前記ペプチドが第VII 因子、第VIIａ 因子、第
    VIIａｉ 因子及びＦＦＲ−第VIIａ 因子から選ばれる、請求項１〜８のいずれか
    １項記載の方法。
11. 【請求項１１】 精製すべき前記ペプチドがＧＬＰ−２ペプチド並びにその
    類似体及び誘導体から選ばれる、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
12. 【請求項１２】 前記有機改質剤、対、水の比が重量パーセント基準で１：
    ９９〜９９：１である、請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法。
13. 【請求項１３】 前記有機改質剤がＣ_1-6 −アルカノール、Ｃ_1-6 −アルケ
    ノール又はＣ_1-6 −アルキノール、尿素、グアニジン又はＣ_1-6 −アルカン酸、
    Ｃ_2-6 −グリコール又は糖類が含まれるＣ_3-7 −ポリアルコール、から選ばれる
    、請求項１〜１２のいずれか１項記載の方法。