JP2012510981A

JP2012510981A - ポリペプチドの向流精製

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Publication number: JP2012510981A
Application number: JP2011539054A
Authority: JP
Inventors: セーレン・センダーガード・フレデリクセン
Original assignee: ノヴォ・ノルディスク・アー／エス
Priority date: 2008-12-08
Filing date: 2009-12-08
Publication date: 2012-05-17
Anticipated expiration: 2029-12-08
Also published as: WO2010066734A1; JP5756407B2; US9441028B2; CN102271775A; EP2373391A1; US20120041174A1

Abstract

本発明は、向流クロマトグラフィーを使用するポリペプチドの精製方法に関する。特に本発明は、組換えＧＬＰ−１の精製のための向流クロマトグラフィーの使用に関する

Description

本発明は、向流クロマトグラフィーを使用するタンパク質またはペプチドの精製方法に関する。特に本発明は、半組換えまたは組換えポリペプチド、例えば組換えＧＬＰ−１を含むタンパク質またはペプチドの精製のための向流クロマトグラフィーの使用に関する。

向流精製システムは、固相が流体の流れの向きに反対に物理的に移動する、またはシステムの異なる分離ビーズの配置の変化によって流体の流れに対して反対向きにこの移動をなすように模擬される精製システムである。向流精製システムは、例えば模擬移動床クロマトグラフィー（Simulated Moving Bed chromatography；ＳＭＢ）及びマルチカラム向流溶媒勾配精製（Multicolumn Counter Current Solvent Gradient purification；ＭＣＳＧＰ）を含む。

模擬移動床クロマトグラフィー（ＳＭＢ）は、最初にUS 2,985,589に記載された。この明細書は、固相クロマトグラフィー溶媒を含む個々に内部連結した数多くの分離床に分割された分離塔を開示している。塔の底部で直列のポンプが底部から上部に流体を連結し、それによって連続的なループを提供する。供給原料（Ｆ）と脱着剤（Ｄ）のための注入ポート及び不溶解物（Ｒ）と抽出物（Ｅ）のための排出ポートが、一連の分離ビーズ内の特定の位置で配置されている。規定された間隔で、床の位置は流体と反対の向きに切り替えられ、流体の流れに対して固相床の向流移動が生成する。第一の床に導入された供給原料（Ｆ）は、そこに含まれる各種の成分への分離を開始し、維持されにくい分子は、流体のフローの向きに移動し、不溶解物ポートで回収される。維持されやすい分子は、固相と好ましくは会合して維持され、排出ポートで回収される。切り替え時間とＦ、Ｄ、Ｒ、及びＥの流速を調節することにより、サイクルの定常時間が確立され、システムからの精製生成物の連続的なフローを可能にする。

より最近では、ＭＢは糖異性体、炭化水素、溶媒の分離、及び他の産業上の応用に適用されている。これらの産業上の装置の多くは、元のUS 2,985,589の装置と同様に、カラムの切り替えに作用する機械的なロータリーバルブの変形を使用している。このバルブ成分を並べて、いずれかの所定のバルブ位置で、複数の注入及び排出フローが所定のカラムに向けられ、各ローテーション工程と対応して一つの位置で進行する。そのようなロータリーバルブは、US 6,719,001、US 4,574,840、及びUS 4,614,205に開示されている。これらの装置のいくつかの企図されたスケールを強調するために、６４平方フィートの領域を占め、１０トンの重量を有するバルブを記載するUS 3,040,777を参照。

他のＳＭＢシステムは、US 4,434,051及びUS 5,635,072に開示されている。別の特許、US 6,544,413は、各クロマトグラフィー床に隣接した注入／排出の制御のための四つのバルブのクラスター化バルブアセンブリーを有する複数バルブ装置を開示している。それは、小さいスケールのＳＭＢシステムのために液体の体積を減少する利点を有する。US 6,979,402は、ロータリーバルブボディの上部と底部のプレートに切断され、カラムポートに整列したチャンネルを連結することによって、交差した管を完全に置換してＳＭＢ流体ループを作製し、それによって無駄な体積を減少する装置を開示している。

製薬学的に活性なジアステレオマー及びエナンチオマーの精製に対するＳＭＢのいくつかの最近の応用がUS 6,462,221、US 6,461,858、US 6,458,995、及びUS 6,455,736に開示されている。そのような分子の二成分分離のためのＳＭＢにおける新規なキラル樹脂の使用は一般的になりつつある。ＳＭＢは更に、複雑な混合物からの生体分子の精製のためにも考慮されている。例えば、ＳＭＢを使用するモノクローナル抗体の精製が、Gottschlich等(J. Chromatogr. A, 765 (1997) 201)によって報告され、WO 2004/024284に開示されている。WO 2001/087924に開示されたように、インスリン精製のためのＳＭＢ精製は以前に出版されている。WO 2008/048395は、小さなスケールの模擬移動床クロマトグラフィーを開示している。

グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）は、血中糖濃度が低い場合に放出されるホルモンである。ＧＬＰ−１はインスリン生産を増大し、それによって血中等濃度を低下する。ＧＬＰ−１及びＧＬＰ−１アナログは２型糖尿病の治療で使用されている。

一つ以上の不純物と、ＧＬＰ−１ペプチドのような興味あるタンパク質またはペプチドとを含み、不純物の濃度が興味あるタンパク質またはペプチドの濃度よりずっと小さい流体混合物を精製するための精製システムに対して必要性が未だ存在している。

US 2,985,589 US 6,719,001 US 4,574,840 US 4,614,205 US 3,040,777 US 4,434,051 US 5,635,072 US 6,462,221 US 6,461,858 US 6,458,995 US 6,455,736 WO 2004/024284 WO 2001/087924 WO 2008/048395

本発明が解決しようとする課題は、合成的、半合成的、または組換え的に生産されたポリペプチド、例えば組換えＧＬＰ−１を含むポリペプチドの精製のための改良された方法を提供することである。組換えタンパク質、特にＧＬＰ−１の精製に特に適している向流精製システム、例えばＳＭＢが、本発明者により示されている。

向流クロマトグラフィーは、合成的、半合成的、または組換え的に生産されたタンパク質またはペプチド、例えばＧＬＰ−１ペプチドを含むタンパク質またはペプチドの精製に特に適していることが本発明者らにより見出された。治療上のタンパク質のより純粋で均一な調製に対する公衆及び薬剤承認当局からの増大した需要が存在している。更にコストは低くなければならない。したがって生産コストは、これらの期待に適合するために産業上の方法で最適化されなければならない関心事である。

かくして、第一の広範な特徴点では、本発明は、向流クロマトグラフィーによりペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の精製方法に関する。

別の特徴点では、本発明は、
ａ）少なくとも一つの固相と第一の脱着剤流を含む、流体連結中の複数のセクションを含む向流精製システムを準備する工程；
ｂ）前記向流精製システム内に供給流として、向流態様で固相と接触する流体混合物を導入する工程；
ｃ）供給流中の少なくとも一つの調節剤の濃度を調節することにより、等温線の初期傾斜Ａが、Ｑ^Ｆまたはαの関数としてｍ^ＩＩＩ及びＡのプロットを作製した際、動作線の傾斜とほぼ平行となるように等温線を制御する工程；
ｄ）少なくとも一つの更なる成分から興味あるポリペプチドの分離を実施する工程；及び
ｅ）興味あるポリペプチドを回収し、その精製組成物を得る工程
を含む、流体混合物中の少なくとも一つの更なる成分からの興味あるポリペプチドのクロマトグラフィー分離のための方法に関する。

図１は、生成物（点線）と不純物（一点鎖線）のクロマトグラムを示すグラフである。この図に見られるように、二つのピークの間には大きなオーバーラップが存在する。妥協がなされるべきである。２ＣＶからの生成物回収は大きな収率を与えるであろうが純度は低く、２．５ＣＶからの生成物回収は大きな純度を与えるであろうが収率は低い。図２は、純粋な弱く結合する成分の等温線（一点鎖線）、純粋な強く結合する成分の等温線（点線）、及び二つの等温線の初期傾斜を示すグラフである。流れが８ｇ／ｌの強い成分（生成物）を含み、弱く結合する不純物がこの５％であるならば、それは０．４ｇ／ｌに対応する。この図は、初期傾斜が低濃度での不純物の等温線に対して合理的な推定である一方、これは強く結合する成分については当てはまらないことを示す。図３は、リサイクルを有するＳＭＢプラントの概略図である。ＳＭＢはそれぞれ二つのカラムを有する四つのセクションＩ−ＩＶからなる。脱着剤ポンプの後のセクションはセクションＩと称される。セクションＩＶからの排出物はセクションＩにリサイクルされる。液体フローは右方向であり、カラムの移動は左方向である。図４は、トゥルームービングベッド（ＴＭＢ）中の定常状態の濃度プロフィールを示すグラフである。より強く結合する成分は、抽出物ポートに向かう樹脂の向きで移動し、より弱く結合する成分は、不溶解物ポートに向かう溶出液とともに移動する。全ての流れは図３に示されたＴＭＢに入って出る。図５は、八個のカラムを有するオープンループＳＭＢプラントのレイアウト、再生、及び平衡化を示す概略図である。カラムはＳＭＢプラント（Abel 2004）において再生され平衡化できる。不溶解物の流れは弱く結合する成分のみを含むため、セクションＩＩＩからの排出は、平衡化カラムに対する流入として代わりに使用できる。図６は、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）における直線等温線の塩依存性を示すグラフである。理論的な滞留は、Ｉｎ（Ｃ_ｓ）の関数としてのＶ_Ｒ−Ｖ_ＮＲの二重の対数のプロットにおいて直線となるであろう。より弱く結合する成分についての実験データは（＋）によって示され、より強く結合する成分は（○）で示されている。実験データにフィットした線は、より弱く結合したものについて一点鎖線、より強く結合したものについて点線で存在する。図７は、逆相クロマトグラフィー（ＲＰ）における直線等温線のＥｔＯＨ依存性を示すグラフである。理論的な滞留は、有機相の濃度、Ｃ_ｍの関数としてのＶ_Ｒ−Ｖ_ＮＲの半対数のプロットにおいて直線となるであろう。より弱く結合する成分は点線、より強く結合する成分は一点鎖線である。図８は、定組成溶液を示すグラフである。より強く結合する成分の吸着、Ａ_Ａ、より弱く結合する成分の吸着、Ａ_Ｂ、セクションＩＩＩでの無次元流速、ｍ^ＩＩＩが示されている。定組成溶液では、供給フロー中の調節剤の濃度は、セクションＩＩにおける濃度と同一であろう。その結果、セクションＩＩＩにおける濃度はこれらと同一であり、供給フローに依存しないであろう（水平線）。それ故、より弱く及びより強く結合する成分の等温線の初期傾斜は一定であろう。それ故、５から７．５分の間の供給フローのみが、より強く結合する成分を保持し、より弱く結合する成分を溶出するための条件を満たすであろう。図９は、勾配溶液を示すグラフである。ＳＭＢプラントにおける勾配の使用は、調節剤濃度に依存して、等温線の初期傾斜の変化を導くであろう（もはや水平な直線ではない、図８参照）。しかしながら勾配の使用は、調節剤の無次元の流速、ｍ^ＩＩＩが、より弱く及びより強く結合する成分の初期傾斜の間に存在することを常に確保するわけではないであろう。図１０は、共給及び排出における調節剤濃度の魅力的な組み合わせを示すグラフである。全ての供給フローについて、動作線ｍ^ＩＩＩが、より弱く及びより強く結合する成分の初期傾斜の間に存在することが観察される。図１１は、パルス実験のvan Deemterプロットを示すグラフである。Van Deemterプロットは、流速の関数としての減少した平板高さを示す。図１２は、直線等温線についての完全な分離領域を示すグラフである。最適な動作点は、ｍ^ＩＩの最小値とｍ^ＩＩＩの最大値であり、点Ｗに対応する。図１３は、定組成条件化での非直線等温線についての完全な分離領域を示すグラフである。点Ｗは下方に移動し、生産性はプラントにおいて減少する。図１４は、塩／有機溶媒及びｐＨの勾配での完全な分離領域を示すグラフである。最適な動作点Ｗは勾配により上方に移動することが観察される。これはより高い供給フローを可能にし、それ故より高い生産性を可能にする。脱着剤Ｉ及び脱着剤ＩＩの試験を示すグラフであり、ＳＭＢ実験ＩＩについて図１８を参照。滞留体積はＥＭＧ関数に対するフィットから計算できる。指数改変ガウス（Exponentially Modified Gaussian；ＥＭＧ）関数の記載はJeansonne (1991)に見出すことができる。図１６は、供給フローにおける最適な塩濃度での等温線の計算された初期傾斜、Ａ、及びセクションＩＩＩにおける無次元フロー、ｍを示すグラフである。無次元フローは、より弱く結合する成分、Ａ_Ｂの傾斜と同じ傾斜を有する。図１７は、供給フローにおける実際の塩濃度での等温線の計算された初期傾斜、Ａ、及びセクションＩＩＩにおける無次元フロー、ｍを示すグラフである。無次元フローは、より弱く結合する成分、Ａ_Ｂの傾斜より低い傾斜を有する。図１８は、ＳＭＢ実験ＩＩについてのプラントのセットアップを示す概略図である。セクションＩとセクションＩＩの間の連結は、二つのセクションにおける二つの異なる塩濃度を使用することができるように切断された（比較のため図５も参照）。図１９は、実験ＩＩ由来の抽出物の流れのＵＶシグナルを示すグラフである。サイクルが定常状態に達するまで、供給フローは１／２ｍｌ／分に最初に設定された。分析のためサンプルを採取し、フローを１／２ｍｌ／分まで増大し、新たなサイクルは定常状態に達した。図２０は、サイクルの定常状態を得た後の２ｍｌ／分の供給フローでの実験ＩＩから得た不溶解物ポートのＵＶシグナルを示すグラフである。再生及び平衡化ゾーンを通過した後に、カラムをゾーンＩＩに移動し、それ故ＵＶシグナルは最初にゼロである。成分が溶出されるとＵＶシグナルが増大する。ＵＶシグナルが再び増大を始める前にプラトーが観察される。図２１は、実験ＩＩＩから得た、動作線（実線）及び動作点（黒丸）と共にゾーンＩＩＩにおける弱く結合する成分（一転鎖線）及び強く結合する成分（点線）についての計算された初期傾斜、Ａを示すグラフである。動作線は、より弱く結合する成分についての無限の希釈での等温線の初期傾斜とほぼ同じ傾斜を有することが観察される。図２２は、サイクルの定常状態が得られた後の２ｍｌ／分の供給フローでの実験ＩＩＩから得た不溶解物ポートのＵＶシグナルを示すグラフである。再生及び平衡化ゾーンを通過した後に、カラムをゾーンＩＩに移動し、それ故ＵＶシグナルは最初にゼロである。成分が溶出されるとＵＶシグナルが増大する。図２０と比較して非常に異なったピークが観察される。図２３は、実験に対するフィットと共に、逆相クロマトグラフィー（ＲＰ）における直線等温線のより弱く結合する成分（＋）とより強く結合する成分（○）についての測定されたエタノール依存性を示すグラフである。理論的な滞留は、Ｃ_ＥｔＯＨの関数としてＶ_Ｒ−Ｖ_ＮＲの半対数プロットにおいて直線であろう。図２４は、動作線（実線）及び動作点（黒丸）と共にゾーンＩＩＩにおける弱く結合する成分（一転鎖線）及び強く結合する成分（点線）についての計算された初期傾斜、Ａを示すグラフである。動作線は、無限の希釈での等温線の初期傾斜の変化とほぼ同じ傾斜を有することが観察される。図２５は、実験ＩＶにおける抽出物の流れから測定されたＵＶシグナルを示すグラフである。データは３分のシフト時間で８のカラムの各サイクルについてプロットされる。初期ＵＶシグナルは、ＳＭＢプラントのスタートアップにより増大する。図２６は、サイクルの定常状態が得られた後の実験ＩＶについての不溶解物ポートのＵＶシグナルを示すグラフである。再生及び平衡化ゾーンを通過した後、カラムをゾーンＩＩに移動し、それ故ＵＶシグナルは最初にゼロでざる。成分が溶出されるとＵＶシグナルが増大する。供給流は数多くの弱く結合する不純物を含み、図２２において明確なピークは観察されない。

ＧＬＰ−１ペプチドのようなペプチドは、例えば発酵法において組換え的に、または固相で合成的に生産されてよい。生産形態に関わらず、興味あるポリペプチドに加えて数多くの不純物が生産される。例えば、組換え的に生産される場合、興味あるポリペプチドの生産に加えて、細胞は数多くの他の物質、例えば高分子量タンパク質（ＨＭＷＰ）及び小分子（例えばオキサレート）も生産する。興味あるポリペプチドとの類似性を欠いているため、興味あるポリペプチドからこれらを分離することは通常非常に単純である。更に、脱グリコシル化、脱アミド化、切り詰め化、凝集化、二量体化、酸化不純物等の、興味あるポリペプチドとほぼ同一のタンパク質またはペプチドといった、興味あるポリペプチドと非常に類似する成分が細胞によって生産される。これらの不純物は、不純物と興味あるポリペプチドとの間の高い度合いの類似性のため、興味あるポリペプチドから分離することがずっと困難である。クロマトグラフィーでは、興味あるポリペプチドとこれらの不純物の滞留体積は、かくして互いに非常に近い。等温線での態様では、これは供給流と脱着物の流れの条件で狭い拘束しか認めないであろう。

エナンチオマーの分離に適した精製システムが記載されている。エナンチオマーを前記精製システムによって分離する場合、分離される成分は、等しいまたはほぼ等しい濃度で通常存在する。これとは対照的に、例えば発酵ブロスにおける興味あるポリペプチドの濃度は、同様の不純物の濃度よりも有意に高いかもしれず、そのことが興味あるポリペプチドから前記不純物を分離する一方、興味あるポリペプチドの高い収率を達成することをしばしば困難にする。

図２は、精製される流体混合物が、興味あるポリペプチド並びに類似の不純物を含む場合の状況を説明する。ここで二つの等温線がグラフに示されており、そこでは吸着濃度が液相濃度の濃度としてプロットされている。生成物の濃度は８ｇ／ｌであり、ずっと低い濃度で存在する不純物の濃度は０．４ｇ／ｌである。この図から、等温線の初期傾斜がより弱く結合する成分の等温線の良好な近似値である一方、より強く結合する成分の近似値はそれほど良好ではないことが観察される。本発明の一つの特徴点では、より弱く結合する成分の等温線の初期傾斜が、向流方法における調節剤濃度を選択するために使用される。

説明的な実施例として、図５に示されるような向流法が図２に示される等温線と同様な等温線を有する例が考慮されてよい。これは、低濃度で存在する不純物よりも高濃度で存在する生成物の樹脂に対するより強い吸着を生じる。

この場合、例えば不溶解物の流れにおける不純物の溶出は以下のもののいずれかにより生ずることができる：
１．ソーンＩＩＩ中の生成物からの置換効果；
２．不純物自体からの等温線の下方屈曲；または
３．等温線の初期傾斜が十分に低くて溶出を可能にすること。

例えば、弱く結合する不純物が生成物によって置換されるケース１では、生成物は不溶解物の流れにおいて失われてしまうであろう。置換により生成物が作用する直前に、不純物は溶出していってしまう。

ケース２では、弱く結合する不純物は、ゾーンＩＩＩにおける条件下で低濃度で溶出することができない。この場合、弱く結合する成分は、抽出物の流れに洗い出されることも、不溶解物の流れに洗い出されることもせず、単にプラント内に蓄積するであろう。弱く結合する不純物の濃度は、等温線の屈曲により、不純物が溶出するのに十分に高くなるまで蓄積するであろう。この場合の欠点は、プラント内の不純物の蓄積である。この増大した量の不純物は、空のリガンドの量を減少し、それによって生成物の結合能力を減少し、増加した量の不純物はゾーンＩＩで溶出する必要があり、不溶解物の流れにおける終局化からそれを避けなければならない。

弱く結合する不純物を常に不溶解物の流れに溶出できるように、供給の流れ及び脱着剤流における調節剤の濃度を選択するケース３は、ここでカバーされる状況である。この場合、不純物の蓄積は避けられる。これは、ここで示唆される脱着剤流と供給流における調節剤の濃度の正確な選択によって実施することができる。

本発明者らは、本発明で、興味あるポリペプチドから関連する不純物を分離する特に有効な精製方法を提供する。前記精製方法では等温線の初期の傾斜が、興味あるポリペプチドを精製するのに最適であり、ここではペプチド生成物と関連不純物が、発酵法から得られた流体混合物のような、精製される流体混合物中に存在する。本発明の一つの特徴点では、等温線の最適な初期傾斜は、ＳＭＢプラントのような向流精製システムにおける調節剤の勾配を選択することによって得られ、そこでは低濃度で存在するより弱く結合する成分、即ちより弱く結合する不純物が不溶解物の流れに溶出される。一つの特徴点では、本発明の方法に係るより弱く結合する不純物の溶出は、プラント内の前記不純物の蓄積を防止する。本発明の一つの特徴点では、調節剤の勾配は塩の勾配である。一つの特徴点では、本発明に係る向流精製システムは、不純物からのＧＬＰ−１の分離を得るといった、発酵ブロスを精製するために使用される。

一つの特徴点では、合成的に生産されたタンパク質またはペプチド生成物を含む流体混合物の精製のために、向流精製システムが本発明によって使用され、そこでは不純物からＧＬＰ−１ペプチドの分離が得られる。

一つの特徴点では、例えばヒトインスリン、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン、またはＡｓｐＢ２８ヒトインスリンのようなインスリンペプチドを含む流体混合物の精製のために、向流精製システムが本発明によって使用され、そこでは不純物からインスリンの分離が得られる。

一つの特徴点では、不純物からタンパク質またはペプチドを含む流体混合物を精製するために、向流精製システムが本発明によって使用され、そこでは使用されるカラムはＲＰＨＰＬＣカラムである。

興味あるポリペプチド及びその関連する不純物のような各種の成分の滞留の際の平衡化の影響を理解することは、向流精製システムに通常適用されない勾配、例えばＩＥＸにおけるｐＨ勾配の使用を可能にするであろう。かくして一つの特徴点では、不純物からタンパク質またはペプチドを含む流体混合物を精製するために、向流精製システムが本発明によって使用され、そこでは使用される調節剤はｐＨであり、使用されるカラムはＩＥＸカラムである。

有機成分の濃度はＩＥＸにおける平衡化に影響し、それ故例えばＩＥＸにおける有機成分も適用できる。かくして一つの特徴点では、不純物からタンパク質またはペプチドを含む流体混合物を精製するために、向流精製システムが本発明によって使用され、そこでは使用される第二の調節剤は有機成分であり、使用されるカラムはＩＥＸカラムである。

しばしば等温線は凸型であり、吸着される成分の濃度、ｑと液相中の濃度、ｃとの間の比、即ちｑ／ｃは、濃度が減少すると減少する（Guiochon 2006）。これは図２でも観察できる。本発明の一つの特徴点では、等温線は弱く結合する成分の動作線に近づく。これはセクションＩＩＩでのブレイクスルーを避けるという利点を有する。更に、セクションＩＩに荷重をかける際の利用可能なリガンドの減少は、抽出物中に弱く結合する成分を有するという危険を減少する。

本発明の発明者らは、上述の困難な精製の問題に対する解決策が、ＳＭＢ法における勾配の使用であることを見出した。勾配は、困難な精製の問題に有効であることが以前に示されているが、供給流中の生成物と不純物の間の濃度の差異が大きいという本発明で提案されたようには使用されていない。

本発明の一つの特徴点では、供給流とセクションＩＩにおけることなる調節剤の濃度が提供され、そこでプラントのセクションＩＩＩにおける平衡化は供給フローの関数である。

変動とプロセスの変化に向けた特定の労力が所望される。図９では、勾配の場合における無次元フロー、ｍ^ＩＩＩと共に初期傾斜がプロットされている。一つの特徴点では、ｍ^ＩＩＩは、二つの成分の各等温線の初期傾斜、Ａの間に存在する。これは成分が分離されるという効果を有する。図９で観察されるように、供給フローはこの場合約３．３と６．６の間でのみ変化できる。

本発明者らは、新規で創意に富んだ態様で、向流精製法、例えばＳＭＢの知見と熱力学的な知見とを組み合わせることによって、興味あるポリペプチドを精製する魅力的な方法を本発明で提供する。

固定床クロマトグラフィー
固定床（ＦＢ）クロマトグラフィーは、製薬業界において成分を精製するために現在広く使用されている。固定床クロマトグラフィーでは、不純物と混合した所望の生成物がカラムに適用され、その後それがカラムから流出される。カラムの排出口で、生成物は不純物から回収できる。

興味あるポリペプチドと関連不純物のそのような流体混合物のＦＢクロマトグラムでは、しばしば二つのピークが重なって観察される（図１）。この場合、生成物はカラムの排出口で不純物から完全には分離されず、高純度で高い収率の両者を得ることは不可能である。

ＳＭＢ
ＦＢクロマトグラフィーの限界を解消するために、向流クロマトグラフィーが使用できる。広く使用されている方法は模擬移動床（Simulated Moving Bed；ＳＭＢ）であり、これは純度、生産性、及び溶媒消費の全てでタンパク質を精製するのに有効であることが以前に示されている（Schulte 2000）。

ＳＭＢプラントでは、カラムは特定のシフト時間でフローの向きとは向流に移動する。それ故この方法は、時間と位置の両者の点で変化する。

ＳＭＢはインスリンの精製のために考案されており（Jensen 2000）、そこでは１ｇ／ｌのウシインスリンと１／２ｇ／ｌのブタインスリンからなる供給流を分離する理論的な研究がなされた。逆相クロマトグラフィー法でアセトニトリルの勾配を提供することにより、消費数が減少できたことが示された。

インスリンの精製は、EP 1349866B1においてWangによって実験的に示されている。この実験では、インスリンはＺｎＣｌ_２とＨＭＷＰから分離された。

カラムが特定の時間、ｔ_ｓｈｔでシフトするため、ＳＭＢ法は不連続な方法である。これは、時間と位置における両者の微分係数で一連の等式を作製する。

等式の分析を単純化するために、真の移動床（True Moving Bed；ＴＭＢ）がしばしば代わりに研究されている（Guiochon, 2006, p. 780）。ＴＭＢは真の向流（True Counter Current；ＴＣＣ）（Ruthven & Ching 1989）または連続的移動床（Continuous Moving Bed；ＣＭＢ）（Ma & Wang 1997）としても既知である。ＴＭＢでは、樹脂のフローは液体フローとは反対の向きで連続的に移動すると考慮され、この場合前記方法は定常状態となり、位置の微分係数は維持される。これらの等式から得られる濃度のプロフィールは、定常状態濃度プロフィール（Ruthven & Ching 1989）または定常波濃度プロフィール（Ma & Wang 1997）としてしばしば既知である。

理想的な場合では、これらの二つのアプローチは同一であることが以前に示されている（Guiochon 2006）。

完全分離領域
ＳＭＢプラントにおける動作点を決定するために広く適用されているアプローチは三角形理論である（Storti 1989）。このアプローチは、ＴＭＢについての理想的なクロマトグラフィーから由来できる。理想的な場合では、質量移動に対する抵抗及び軸の分散が無視されている。

向流法における制御パラメーターは、二つの相におけるの濃度と比較した二つの相の流速の間の比である（Ruthven 1989）。

三角形理論では、フローの比は以下のように与えられる：

これは二つの相における成分ｉの濃度、ｑ_ｉ／ｃ_ｉに匹敵する。

直線等温線については、完全分離領域は三角形となるであろう（Storti 1993）。最適な動作点は、図１２に示される点Ｗであろう。この場合、セクションＩＩにおけるフローは、完全分離を得るために最小であり、セクションＩＩＩにおけるフローは最大値である。セクションＩＩとＩＩＩのフローの間の差異は供給フローであるため、高いｍ^ＩＩＩと低いｍ^ＩＩは高い供給フローに対応する。

凸型の等温線については、最適な動作点は下方に移動するであろう（ｍ^ＩＩＩとｍ^ＩＩのより低い値）、図１３。

Jensen(2000)は、勾配をＳＭＢプラントに適用した際に、この操作点をどのように上方に動かせ（ｍ^ＩＩＩのより高い値）、脱着剤のより低い消費を導けるかを以前に示している、図１４。

しかしながらこれはあまりよく理解されなかった。熱力学から更なる考察を得ることができる。

例えば、定常波デザイン（Ma及びWang 1997）またはRuthven(1989)によって示唆された定常状態解決法といった、完全分離領域を計算するための他のアプローチが示唆されている。理想的な場合では、これらの方法は同一の結果を与える。

通常、軸の分散及び／または質量の移動が存在するであろう。濃度プロフィールを計算するための分析的な解決法は、例えば定常波法（Ma＆Wang 1997）または定常状態濃度プロフィール（Ruthven 1989)といった直線等温線について出版されている。しかしながら問題は常に計算上の方法を使用して解決できる。等式を計算上で解くことによって計算された濃度プロフィールが図４に示されている。これは直線等温線と非直線等温線について両方解決でき、分析的な解決法と比較してほとんど仮定を必要としない。プレートの数はvan Deemterプロットから通常見出すことができる（図１１、Guiochon 2006）。

勾配
勾配は、逆相クロマトグラフィーにおける有機相の濃度の変化（Jensen 2000）及びイオン交換クロマトグラフィーにおける塩濃度の変化（Wekenberg 2004）の両者に関して適用されている。

ＳＭＢにおいて勾配を適用する利点は、成分が供給点から上流よりも供給点から下流により強く維持され、より高い供給フローを可能にすることである。これは溶媒消費の減少、生産性の増大、生成物の流れのより高度の濃縮を導く（Kessier 2007）。三角形の図形では、これは点「Ｗ」から観察でき、それは勾配を使用した際に上方へ移動する（図１４）。

等温線はしばしば、単純なLangmuir等温線またはマルチ成分Langmuir等温線を使用し、溶媒組成に依存するパラメーター（Antos等 2001）または単純に内挿関数（Abel等 2002）を作製することによって記載される。

しかしながら、等温線を記載するための熱力学を使用することにより、より最適な勾配が本発明者によって開発され、それによって、興味あるポリペプチドと関連不純物との流体混合物を本発明の方法によって精製する場合、興味あるポリペプチドの良好な精製が得られる。

熱力学
樹脂の表面への巨大分子の吸着のための吸着平衡を記載するために、熱力学的原理が最近適用されている（Mollerup 2006及び2008）。

これはパラメーターが吸着平衡にどのように影響するかに対する追加の考察を与える。

結合成分の濃度、ｑ_ｉと非結合成分の濃度、Ｃ_ｉとの間の比は下式によって与えられる：

式中、初期傾斜Ａ_ｉはクロマトグラフィーのタイプに依存する。

イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）
イオン交換クロマトグラフィーについては、初期傾斜は下式によって与えられる：

式中、Λはリガンドの濃度であり、Ｃ_ｓは塩濃度であり、Ｚ_ｓは塩の電荷であり、γ_ｉは活性係数である。成分の電荷ｉと塩の間の比はｖ_ｉであり、ｖ_ｉ＝ｚ_ｉ／ｚ_ｓである（Mollerup 2008）。

通常塩濃度は、吸着を制御する変数である。

これはBrooks及びCramer(1992)によって以前に出版されたものと同一である。

逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）＆疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）及び逆相クロマトグラフィー（ＲＰ）では、初期傾斜Ａ_ｉの依存性は下式によって示される：

式中、ｃは移動相における全濃度である（Mollerup 2008）。

ＨＩＣ及びＲＰでは、吸着は、移動相、それによって活性係数γ_ｉを変化させることによって通常制御される。興味あるタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドについての活性係数は下式として計算できる：

低タンパク質／ペプチド濃度では、以下のように与えられる：

最適な供給濃度
図５に示されたオープンループを使用することは、一つの不純物のみならず多くの不純物が生成物の前に溶出されるため魅力的である。それ故、供給から導入される勾配は、セクションＩ及びＩＩにおける濃度に影響しないであろう。

セクションＩＩＩにおける無次元流体フローは下式として与えられる：

セクションＩＩにおける全フローによって割り算される供給フローとしてのαの定義は下式によって与えられる：

代入は下式によって与えられる：

式中、Ｑ_ＮＥＴは、ＴＭＢプラントにおける孔相フローによって割り算された全液体フローと同一のセクションにおける全流体フローである。ＳＭＢプラントでは、全フローは下式によって与えられる：

供給フローに関してｍ^ＩＩＩの微分係数は下式である：

または無次元フローでは、これは下式となる：

それ故これは、図８〜１０に示されるように、αとｍ^ＩＩＩとの間の直線関係を常に導くであろう。

イオン交換クロマトグラフィー
イオン交換クロマトグラフィーについては、初期傾斜Ａ_ｉは下式によって示される：

主たる制御パラメーターは、ここで塩濃度、Ｃ_ｓである。それゆえ活性係数は無視され、Ｃ_ｓに関する微分係数は下式となる：

セクションＩＩＩにおける塩濃度は、セクションＩＩの排出フローと供給フローを混合することによって得られる：

孔フローによって全てのフローを分割すると下式となる：

供給フローを変えると、セクションＩＩＩにおける塩濃度の変化は下式となろう：

または無次元供給フローでは：

供給フローの変化の関数としてのセクションＩＩＩにおける成分ｉの初期傾斜の変化は、それ故下式で与えられよう：

または無次元供給フローでは：

注入塩濃度の変化が供給フローの変化と同じ平衡での変化を導くのであれば望ましい、特に下式である：

または無次元供給フローでは：

絶対的特性では、これは下式となる：

または無次元供給速度では：

Ｃ_ｓ ^ＩＩＩの代入は以下の関係式を与える：

Ｃ_ｓ ^Ｆの単離では下式を与える：

Ａ^ＩＩＩはＣ_ｓ ^Ｆに依存するエタノール濃度の関数であるため、供給流における正確な塩濃度を得るためにいくつかの相互作用が必要である。

一つの特徴点では、動作点Ｑ^Ｆ及びＱ^ＩＩ並びに初期傾斜Ａ_ｉ ^ＩＩＩは式に代入され、それによって動作点の近くの動作線の傾斜は、等温線の供給フローの変化に依存性の初期傾斜に同一である。

セクションＩＩにおける塩濃度と上述の供給塩濃度に関して、初期傾斜は全ての供給フローについて計算できる、図１０。

逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）＆疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）
ＲＰ及びＨＩＣでは、等温線の初期傾斜は下式によって示される：

式中、ｃ_ｍは調節剤、例えばエタノールの濃度である。

ｃ_ｍの変化は限界で全濃度ｃのみを変化し、かくしてｃは一定であると考慮される。
ｃ_ｍでの初期傾斜の微分係数は下式である：

式中、Ｋ_ｍはｃ_ｍの関数としての

の半対数プロットにおける傾斜として見出すことができる（図７参照）。

セクションＩＩＩにおける調節剤の濃度は下式として示される：

または無次元供給フローでは：

この微分係数は下式である：

または無次元変数では：

セクションＩＩＩにおける調節剤濃度の関数として等温線の初期傾斜の変化は下式である：

これは下式に対応する：

この場合について、最適な解は下式となろう：

または

これは下式を導く：

または

ここで供給濃度を単離することによって下式が導かれる：

または

平衡パラメーターの測定
直線等温泉を有する成分についての滞留体積は下式によって示される：

式中、Ａ_ｉは等温線の初期傾斜である：

Ｖ_ｄｅａｄは死空間である。

非滞留（ＮＲ）成分について、滞留体積は下式となる：

これは下式を導く：

初期傾斜Ａはクロマトグラフィーのタイプ、移動相の組成、及び実装材料に通常依存するであろう（Mollerup 2008）。

イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）
ＩＥＸについてＡ_ｉの式を代入すると下式を示す：

これは下式のように書き直せる：

ＩＥＸを制御する主たる因子は塩濃度であるため、塩依存性はｘ軸上のＣ_ｓとｙ軸上の

をプロットすることによって二重対数プロットで見出すことができる（図６）。この態様でプロットされたデータは以下の直線にフィットする：

ここからｖ_ｉ＝÷α_ｉであることが見出される。

逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣまたはＲＰ）＆疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）
ＲＰ及びＨＩＣでは式は以下のようになる：

これは下式のように書き直せる：

式中、ｌｎ（γ_ｉ）＝Ｋ_ｍ・Ｃ_ｍが代入されている。それ故、塩または有機調節剤に関する依存性が、Ｃ_ｍの関数として

をプロットすることによって半対数プロットで見出すことができる（図７）。この態様でプロットされたデータは、以下の直線にフィットできる：

ここからＫ_ｍ＝α_ｉが見出される。

供給濃度についての間隔
向流システムで使用されるＩＥＸまたはＲＰ／ＨＩＣのクロマトグラフィーのタイプに依存して、平衡は異なって記載され、それ故本発明の方法に係る調節剤供給濃度は、クロマトグラフィーのタイプに依存するであろう。

イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）
ＩＥＸについて、成分ｉと動作線について同じ傾斜を与える供給塩濃度は下式であることがここで以前に記載されている：

ｍ^ＩＩＩ＝（１＋α）・ｍ^ＩＩの代入及びＣ_ｓ ^ＩＩ・Ａ_ｉ ^ＩＩＩでの割り算は下式を与える：

最適な動作点は、セクションＩＩにおける低いフローとセクションＩＩＩにおける高いフローであり、低い脱着剤消費と高い供給フローに対応する、図１２参照。

不溶解物におけるより強く結合する成分Ａの溶出を避けるために、最大のｍ^ＩＩＩはｍ^ＩＩＩ＝Ａ_Ａ ^ＩＩＩに対応し、代入により下式を与える：

より弱く結合する成分Ｂについては、この比は下式を与える：

式中、選択性はα_ＡＢ＝Ａ_Ａ／Ａ_Ｂとして与えられ、実験的なパルス実験（図６並びに表１及び２を参照）にフィットするパラメーターα_ｉ及びβ_ｉの代入により下式を与える：

したがって、セクションＩＩにおける最小のフローがおよそα＝０であり、ｍ^ＩＩ＝Ａ_Ｂ ^ＩＩ＝Ａ_Ｂ ^ＩＩＩに対応するより強く結合する成分について、式は以下のようになる：

セクションＩＩにおける塩濃度に対する供給流における塩濃度についての合理的な間隔は以下のようになる：

無次元供給フローαの合理的な値は、０から１／２の範囲内であろう。これは、セクションＩＩにおけるフローの半分未満である供給フローに対する。それ故間隔は以下のようになる：

ｖ_ｉ＝÷α_ｉであことに注意すべきであり、選択性は実験的パルス実験から測定されたフィットするパラメーターα_ｉ及びβ_ｉから計算される。

かくして、向流システムがイオン交換クロマトグラフィーシステムである本発明の一つの特徴点では、供給流の前のセクションにおける塩濃度に対する供給流における塩濃度は、以下の範囲内である：

逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣまたはＲＰ）＆疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）
ＲＰ及びＨＩＣでは、動作点と初期傾斜の変化の同じ傾斜を導く供給濃度は下式によって示される：

再び上述のＩＥＸで指摘して図１２に示されるように、最適な動作点はｍ^ＩＩＩ＝Ａ_Ａ ^ＩＩＩであり、代入により下式が示される：

弱く結合する成分について、選択性の代入は下式を与える：

ＲＰ及びＨＩＣでは、選択性は下式

にフィットする等温線パルス実験から見出すことができ、二つの成分の間の選択性は下式となる：

式中、α_ｉ＝Ｋ_ｍ，ｉであることに注意すべきである。

より強く結合する成分については、供給流の調節剤濃度は下式となる：

これは下式の範囲に対応する

または

再び無次元供給フローαの合理的な値は０から１／２の範囲内であろう。それ故間隔は下式となる：

α_ｉ＝Ｋ_ｍ，ｉであることに注意すべきであり、選択性は実験的パルス実験から測定されるフィットするパラメーターα_ｉ及びβ_ｉから計算される。

かくして、向流システムが逆相クロマトグラフィーまたは疎水性相互作用クロマトグラフィーである本発明の一つの特徴点では、供給流及び脱着剤流における調節剤濃度の差異は、以下の範囲内にある：

定義
ここで使用される用語「クロマトグラフィー」は、固相に対する混合物の成分の間の選択的な吸着に依存する、混合物と成分の化学的な分離のために使用されるいずれかの技術を指す。例として、吸着クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、及びアフィニティークロマトグラフィーが含まれる。

ここで使用される用語「向流精製システム」は、固相が液体流の向きとは物理的に反対に移動する、またはこの移動を、システムの異なる分離床の配置の変化によって流体流に対した反対向きにするように模擬するいずれかの精製システムを指す。

向流精製システムの固相について使用される際の用語「流体連結」は、排出流または排出流の分画がサイクルの間で別の固相に注入流として使用される、本発明で使用される固相の間の連結をここで意味する。本発明に係る流体連結における複数のセクションを含む向流精製システムは、固相に実装された少なくとも二つのカラム、例えば固相に実装された少なくとも三つのカラムが流体連結されているものを含む。

本発明に係る向流精製システムの非制限的な例は、いずれかの模擬移動床（ＳＭＢ）クロマトグラフィーシステム、並びにマルチカラム向流溶媒勾配精製（ＭＣＳＧＰ）を含む。これは単一で成り立つシステムでも良く、並びにタンデムに且つ多価のセットアップでも良く、他のタイプの精製システムと組み合わされても良い。

適切なＳＭＢシステムは、例えばUS 2,985,589、US 6,719,001、US 4,574,840、US 4,614,205、US 3,040,777、US 4,434,051、US 5,635,072、US 6,544,413、及びUS 6,979,402に開示されている。

他の適切なシステムは、US 6,462,221、US 6,461,858、US 6,458,995、及びUS 6,455,736に開示されており、Gottschlich等, J. Chromatogr. A, 765 (1997) 201、及びWO 2004/024284にも開示されている。別のシステムは、Mun等, Biotechnol. Prog., 18 (2000) 1332によって報告されている。

他の適切なＳＭＢシステムは、WO 2001/087924、WO 2004/024284、及びWO 2008/019228に開示されている。

WO 2008/048395は、小さなスケールの模擬移動床クロマトグラフィーの使用を開示している。

適切なＭＣＳＧＰシステムは、例えばWO 06/116886並びにEP 1877769及びEP 1716900の公開番号を有する欧州特許出願において開示されている。

固相との流体混合物の接触と関連して記載される用語「向流態様」は、固相の全体の向きが液相の全体の移動と反対であることを意味するためにここで使用される。例えば図３では、正味の液体のフローは左から右に移動している一方、特定のシフト時間でのカラムは右から左に移動し、固相の正味のフローが液体のフローとは反対であることを作り出している。

ここで使用される用語「吸着剤」または「固相」は、移動相成分が選択的なアフィニティーを示すクロマトグラフィーで使用される固相を指す。そのようなアフィニティーは吸着以外の各種の態様をとることができる（サイズ排除または錯体形成を含む）ため、この用語は、流体混合物の成分を吸着する固相、及び移動相から成分を技術的に吸着はしないが、クロマトグラフィーシステムにおける別のものに対して一つの成分の移動の速度を遅延することにより、言うまでもなく吸着剤として挙動する固相を指す。吸着剤、すなわちクロマトグラフィー固定化相材料の非制限的な例は、例えば置換化シリカ、例えばＣ−４シリカ、Ｃ−６シリカ、Ｃ−１２シリカ、Ｃ−１８シリカ、及びフェニルベースのシリカ、並びにポリマー材料、例えばポリスチレン、例えばSourceまたはPoros材料；アクリレート及びメタクリレート材料、例えばTosoh社、Rohm & Haas社、及びBioRad社製の材料；アガロースベースの材料、例えばセファロース；及びヒドロキシアパタイトベースの材料である。クロマトグラフィー固定化相の更なる例は、膜、モノリス材料、及びフィルターである。

用語「供給流の前のセクション」は、排出流が供給流と混合されるセクションをここで意味する。図１８では、かくしてそれは「供給流の前のセクション」である脱着剤ＩＩである。

成分または分画を指す際の用語「精製された」は、その相対濃度（流体混合物中の全成分または分画の重量で割り算した成分または分画の重量）が少なくとも２０％まで増大することを示す。一つの一連の特徴点では、相対濃度は少なくとも４０％、５０％、６０％、７５％、１００％、１５０％、または２００％、３００％、４００％、または５００％まで増大する。それが精製される成分の相対濃度（流体混合物中の全成分または分画の重量で割り算したそれが精製される成分または分画の重量）が少なくとも２０％、４０％、５０％、６０％、７５％、８５％、９５％、９８％、または１００％まで減少した際に、成分または分画は精製されると言うこともできる。また別の一連の特徴点では、この成分または分画は、少なくとも５０％、６５％、７５％、８５％、９０％、９７％、９８％、または９９％の相対濃度に精製される。いくつかの特徴点で成分または分画が他の成分または分画から「単離される」と称される場合、この成分または分画は「精製される」ものと理解されよう。

ここで使用される用語「流体混合物」は、少なくとも二つの成分、例えば興味あるポリペプチドとこれらの化合物を含む一つの更なる成分または分画を含む流体混合物を指し、各成分または分画は使用されう吸着剤に対して異なるアフィニティーを示すため、後者は規定されたクロマトグラフィー法を使用して分離できる。

ここで使用される用語「興味あるポリペプチド」は、精製形態で有する必要のあるいずれかのペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を指す。前記用語は、合成的、半合成的、または組換え的なペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質を含む。いくつかの特徴点では、「興味あるポリペプチド」は、グルカゴン様ペプチド、例えばＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１のアナログ、ＧＬＰ−１の誘導体、エキセンジン−４、またはエキセンジン−３である。本発明の一つの特徴点では、興味あるポリペプチドはＧＬＰ−１のアナログまたは誘導体である。本発明の一つの特徴点では、興味あるポリペプチドはＧＬＰ−１の誘導体である。本発明の一つの特徴点では、興味あるポリペプチドは組換え法により生産される。

ここで使用される用語「一つの更なる成分」及び「不純物」は、興味あるポリペプチドではなく、興味あるポリペプチドから分離されなければならない、興味あるポリペプチドを含む流体混合物中に存在する成分を指す。この「一つの更なる成分」は、宿主細胞タンパク質、ポリペプチド、またはペプチド、組換えポリペプチドの他の非所望の形態、例えばグリコシル化、脱アミド化、または酸化形態、及び流体混合物中に存在する他の成分を含んで良い。

いくつかの特徴点では、興味あるポリペプチドは組換えタンパク質である。いくつかの特徴点では、「一つの更なる成分」は、興味あるポリペプチドに類似するペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質であり（ここで「関連不純物」としても記載される）、それらは、前記興味あるポリペプチドのグリコシル化形態、脱アミド化形態、切り詰め形態、伸張形態、脱アミド化形態、不正確にホールディングされた形態、または酸化形態、非所望のグリコシル化を有する形態、ラセミ化から生ずる形態、ペプチド鎖内のアミノ酸を欠いた形態、ペプチド鎖内に外的なアミノ酸を有する形態、並びに所望されるもの以外の別の残基にアシル化が生じている形態といった、興味あるポリペプチドに類似する構造を有する。

本発明の方法によって精製される流体混合物中の「興味あるポリペプチド」と「一つの更なる成分」との間の関係は、例えば少なくとも４：１であって良い、即ち流体混合物中に１当量の「一つの更なる成分」が存在する場合、少なくとも４当量の「興味あるポリペプチド」が存在する。本発明の一つの特徴点では、流体混合物中の「興味あるポリペプチド」と「一つの更なる成分」との関係は少なくとも６：１であり、別の特徴点では前記関係は少なくとも８：１であり、別の特徴点では前記関係は少なくとも９：１であり、別の特徴点では前記関係は少なくとも１４：１であり、別の特徴点では前記関係は少なくとも１９：１であり、別の特徴点では前記関係は少なくとも２０：１であり、別の特徴点では前記関係は少なくとも５０：１であり、更に別の特徴点では前記関係は少なくとも９０：１である。

用語「脱着剤流」、「脱着剤」、「溶出物」、または「溶出流」はここで互換的に使用され、不溶解物ポートと抽出物ポートの間で向流システムに添加される移動相を指す、例えば図４の説明を参照。全移動相と組み合わせた場合、サイズ排除システムでは移動相の速度を増大することによって、または固相から溶液を物理的に置換若しくは除去することによって、脱着剤はそのそれぞれのセクションにおいて各種の成分の脱離波を構成するため、用語「脱着剤流」または「脱着剤」が使用される。かくして用語「脱着剤流」は、脱着剤組成物がいずれかの特定の脱着剤能力を有することや、それがいずれかの特定の物理的メカニズムで脱離することを示すことを意味するものではない。

本発明の一つの特徴点では、より多くの脱着剤流、例えば二つの脱着剤流、「脱着剤Ｉ」及び「脱着剤ＩＩ」を用いる向流システムが使用される。これは例えば図１８に説明されている。

ここで使用される用語「抽出物」は、より強く結合する成分を含む供給点から上方でプラントを去る流れを指す。例えば図３及び５を参照。

ここで使用される用語「不溶解物流」は、より弱く結合する成分を含む供給点から下方でプラントを去る流れを指す。例えば図３及び５を参照。

ここで使用される用語「供給流」は、分離される成分を含むプラントに入る流れを指す。例えば図３及び５を参照。

ここで使用される用語「セクション」及び「ゾーン」は、少なくとも一つのクロマトグラフィーカラムまたは容器を含む向流精製システムの一部を指す。向流システムとして作用するために、前記システムは流体連結を有する複数のセクションを含まなければならないと解されるべきである。規定された時間間隔で、一つの位置のカラムはフローとは反対の向きに切り替えられ、流体流に対して固相の向流の動きを生ずる。

ここで使用される用語「調節剤」は、供給流のいずれかの成分を指し、その濃度は、精製システムの使用によって調節されて良い。したがって、イオン交換クロマトグラフィーまたは疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）システムが使用されるのであれば、調節剤は、供給流中の塩、例えば塩化ナトリウムまたは硫酸アンモニウムの濃度であって良い。逆相クロマトグラフィーが使用されるのであれば、調節剤は有機溶媒、例えばエタノール、メタノール、プロパノール、またはアセトニトリルであって良い。本発明のいくつかの特徴点では、供給流のｐＨが調節剤である。

本発明のいくつかの特徴点では、調節剤は、いずれかの有機または無機塩、及びそれらの混合物から選択される塩成分であり、例えばＮａＣｌ（塩化ナトリウム）、ＫＣｌ（塩化カリウム）、ＮＨ_４Ｃｌ（塩化アンモニウム）、ＣａＣｌ_２（塩化カルシウム）、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、クエン酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、酢酸カルシウム、またはそれらの混合物である。これらの塩成分のそれぞれは、本発明の代わりの特徴点を構成する。適切な塩は、例えばWO 2000/055184またはWO 00/55203に開示されており、それらはここで参考として取り込まれる。

調節剤が塩成分である場合、塩の濃度は溶媒中の塩の濃度である。イオン交換では、塩の濃度は、イオン交換クロマトグラフィーシステムに対するカウンターイオンの濃度である。この場合塩の濃度は、塩として添加されるカウンターイオンと、滴定の間で添加されるカウンターイオンの両者である。これは、例えば溶媒中でｐＨを調節する際に、溶媒に添加されるカウンターイオンを含む。アニオン交換クロマトグラフィーシステムであるＩＥＸでは、塩の濃度はアニオンの濃度である。これは例えば、ＮａＣｌから添加される塩化物と、ＨＣｌを使用する溶媒のｐＨ調節の間で添加される塩化物の両者を含む。同様に、カチオン交換クロマトグラフィーシステムであるＩＥＸでは、塩の濃度はカチオンの濃度である。

一つの特徴点では、本発明の方法で使用される溶媒は、水と有機成分とを含む水性溶媒である。典型的な有機成分は、アセトニトリルまたはアルコールを含む。

一つの特徴点では、調節剤はアルコールである有機成分であり、一つの特徴点では、溶媒は水とアルコールとの混合物である。特に、モノ−アルコール、即ち一つのみのアルコール基を含むアルコールが言及される。本発明の方法で使用できるモノ−アルコールの例として、メタノール、エタノール、１−プロパノール、及び２−プロパノール、並びにそれらの二つ以上の混合物が含まれる。アセトニトリルの使用と結びついた十分に確立された環境上及び職業上の健康問題のため、アセトニトリルよりもむしろアルコールを使用することが更なる利点として考慮される。タンパク質は、溶媒の疎水性度を増大すると、即ち有機化合物の濃度を増大することによって溶出される。カラムにタンパク質を搭載するために使用される溶媒の濃度は、タンパク質の性質、及び有機化合物の疎水性度に依存する。カラムにタンパク質を搭載する前に、この溶媒の１以上のカラム体積で、カラムは通常洗浄または平衡化されているため、この溶媒はしばしば平衡化溶媒と称される。平衡化溶媒中の有機化合物の典型的な濃度は、溶媒の０−８０％、例えば１０−７０％、１０−６０％、または２０−５０％の範囲である。前記濃度は、有機成分の変性効果によって上限設定される。前記濃度が余りに高いと、タンパク質が不可逆的に変性する危険が存在する。固定床クロマトグラフィーにおけるタンパク質の溶出の間、溶媒中の有機成分の濃度は、典型的に５−９５％、例えば１０−９５％、２０−９０％、３０−９０％、または３０−８０％の範囲の濃度に上昇される。適切な有機調節剤は、WO 2007/071768に開示されており、それは参考としてここに取り込まれる。

用語「等温線」は吸着等温線をここで意味し、所定の溶媒システムにおける液相中のある成分の所定の濃度での、吸着化成分の濃度を指す。通常等温線はグラフとして表される、図２参照。クロマトグラフィーで適応する二つの一般的な吸着等温線は、Langmuir吸着等温線とFreundlich吸着等温線である。成分の濃度が低いと、直線等温線が推定できる。直線等温線では、吸着成分の間の濃度と移動相中での濃度が一定である。

等温線に関連して使用される際の用語「初期傾斜」は、成分の濃度が０（ゼロ）に近づく際の等温線の傾きを記載するためにここで使用される、図２参照。

ここで使用される用語「動作線」は、プラントの一つのセクションにおける全重量または体積測定フローを、それが流体と連結している別のセクションにおける全重量または体積フローと結びつける動作の線を指す。動作線の一つの例は図８で観察でき、そこではゾーンＩＩＩにおける無次元の体積測定フローである線ｍ^ＩＩＩは、供給フロー、Ｑ^ＦとゾーンＩＩにおける無次元フロー、ｍ^ＩＩの関数である。

ここで使用される用語「約」または「およそ」は、記載された数値範囲の合理的な近傍、例えばプラスマイナス１０％を意味し、ｐＨの値についてはプラスマイナス０．２を意味する。

本発明の一つの特徴点では、等温線の初期傾斜は、Ｑ^Ｆの関数としてｍ^ＩＩＩ＆Ａについてプロットがなされた際の動作線の傾斜とおよそ平行であり、ここで平行と結びつけて使用される際の「およそ」は、等温線の傾斜が動作線の傾斜からわずかに変化できること、例えば動作線の傾斜から１０％まで変化できることを意味する。一つの特徴点では、等温線の傾斜は動作線の傾斜の１０％以内であり、別の特徴点では、動作線の傾斜から８％以内であり、別の特徴点では、動作線の傾斜から６％以内であり、別の特徴点では、動作線の傾斜から５％以内であり、別の特徴点では、動作線の傾斜から３％以内であり、また別の特徴点では、動作線の傾斜から２％以内である。

ここで使用される用語「グルカゴン様ペプチド」は、グルカゴンファミリーのペプチド、エキセンジン、並びにそれらのアナログ及び誘導体を意味する。グルカゴンファミリーのペプチドは、プレ−プログルカゴン遺伝子によってコードされ、高い度合いのホモロジーを有する３種の小ペプチド、即ちグルカゴン（１−２９）、ＧＬＰ−１（１−３７）、及びＧＬＰ−２（１−３３）を包含する。エキセンジンはトカゲで発現されるペプチドであり、ＧＬＰ−１と同様にインスリン分泌性である。エキセンジンの例は、エキセンジン−３及びエキセンジン−４である。

ここで使用される用語「アナログ」は、修飾グルカゴン様ペプチドを指し、そこでは、グルカゴン様ペプチドの一つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基によって置換されている、及び／または一つ以上のアミノ酸残基がグルカゴン様ペプチドから欠失している、及び／または一つ以上のアミノ酸残基がグルカゴン様ペプチドに付加されている。そのようなアミノ酸残基の付加または欠失は、例えばグルカゴン様ペプチドのＮ末端で、及び／または前記ペプチドのＣ末端で生じることができる。アナログを記載するために単純なシステムが使用される：例えばＡｒｇ^３４−ＧＬＰ−１（７−３７）は、３４位で天然に存在するリシンがアルギニンで置換されているＧＬＰ−１（７−３７）アナログを表す。光学異性体が記載されていない全てのアミノ酸は、Ｌ異性体を意味するものと解される。同様に、アミノ酸についての標準的な一文字表記は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ用語に従って使用される。

一つの特徴点では、本発明に係るアナログは、グルカゴン様ペプチドに対して１７までの修飾（置換、欠失、付加）を含む。一つの特徴点では、アナログは、グルカゴン様ペプチドに対して１６未満の修飾（置換、欠失、付加）を含む。一つの特徴点では、アナログは、グルカゴン様ペプチドに対して１５未満の修飾（置換、欠失、付加）を含む。別の特徴点では、アナログは、グルカゴン様ペプチドに対して１４未満の修飾（置換、欠失、付加）を含む。別の特徴点では、アナログは、グルカゴン様ペプチドに対して１３未満の修飾（置換、欠失、付加）を含む。別の特徴点では、アナログは、グルカゴン様ペプチドに対して１２未満の修飾（置換、欠失、付加）を含む。別の特徴点では、アナログは、グルカゴン様ペプチドに対して１１未満の修飾（置換、欠失、付加）を含む。別の特徴点では、アナログは、グルカゴン様ペプチドに対して１０未満の修飾（置換、欠失、付加）を含む。別の特徴点では、アナログは、グルカゴン様ペプチドに対して９未満の修飾（置換、欠失、付加）を含む。別の特徴点では、アナログは、グルカゴン様ペプチドに対して８未満の修飾（置換、欠失、付加）を含む。一つの特徴点では、アナログは、グルカゴン様ペプチドに対して７未満の修飾（置換、欠失、付加）を含む。一つの特徴点では、アナログは、グルカゴン様ペプチドに対して６未満の修飾（置換、欠失、付加）を含む。別の特徴点では、アナログは、グルカゴン様ペプチドに対して５未満の修飾（置換、欠失、付加）を含む。別の特徴点では、アナログは、グルカゴン様ペプチドに対して４未満の修飾（置換、欠失、付加）を含む。別の特徴点では、アナログは、グルカゴン様ペプチドに対して３未満の修飾（置換、欠失、付加）を含む。別の特徴点では、アナログは、グルカゴン様ペプチドに対して２未満の修飾（置換、欠失、付加）を含む。

ここで使用される用語「親油性に変性されたペプチド」は、ペプチドの一つ以上のアミノ酸に共有結合した親油性基、例えば親油性側鎖を含むペプチドである。本発明に係る一つの特徴点では、親油性基は親油性側鎖である。親油性に変性されるペプチドは、いずれかの適切な方法によって調製され、例えばアルキル化、アシル化、エステル形成、アミド形成、またはマレイミドカップリングといった共役化学により親油性基を結合することによって調製されて良い。本発明に係る一つの特徴点では、本発明に係る親油性に変性されたペプチドは、親油性に変性されていない同じペプチドに対して、実質的に同じ活性を有する。

一つの特徴点では、本発明の製薬組成物に含まれる親油性に変性されたグルカゴン様ペプチドは、ペプチド結合により連結された少なくとも５個の構成アミノ酸とそれに結合したアシル基とからなるＧＬＰ−１アゴニストである。

ここで使用される用語「ＧＬＰ−１アゴニスト」は、ヒトＧＬＰ−１レセプターを十分にまたは部分的に活性化する、いずれかの親油性に変性されたグルカゴン様ペプチドを指す。好ましい特徴点では、「ＧＬＰ−１アゴニスト」は、当該技術分野で既知の方法（例えばWO 98/08871を参照）によって測定すると、好ましくは１μＭ未満、例えば１００ｎＭ未満のアフィニティー定数（ＫＤ）または強度（ＥＣ_５０）でＧＬＰ−１レセプターに結合し、当業者に既知であるin vivoまたはin vitroアッセイで測定してインスリン分泌活性を示す、いずれかの親油性に変性されたグルカゴン様ペプチドである。例えばＧＬＰ−１アゴニストは動物に投与されて、インスリン濃度が経時的に測定されて良い。

一つの特徴点では、本発明の親油性に変性されたグルカゴン様ペプチドはアシル化されている、即ちそれは親油性の変性として結合したアシル基を有する。

アシル基（ＩＵＰＡＣ名：アルカノイル）は、オキソ酸からの一つ以上のヒドロキシル基の除去によって誘導される官能基である。有機化学では、アシル基は通常、ＲＣＯＯＨの形態のカルボン酸から誘導される。それ故それはＲＣ（＝Ｏ）−の式を有し、炭素と酸素原子の間に二重結合を（即ちカルボニル基）、Ｒと炭素の間に単結合を有する。アシル基は、他のタイプの酸、例えばスルホン酸、ホスホン酸、及び他のものからも誘導できる。

本発明のアシル化変性グルカゴン様ペプチドでは、アシル基は、元となるグルカゴン様ペプチドのアミノ酸の以下の官能基の一つに結合できる官能基を含む：
（ａ）Ｎ末端アミノ酸のアルファ炭素に結合したアミノ基；
（ｂ）Ｃ末端アミノ酸のアルファ炭素に結合したカルボキシ基；
（ｃ）いずれかのＬｙｓ残基のイプシロンアミノ基；
（ｄ）いずれかのＡｓｐ及びＧｌｕ残基のＲ基のカルボキシ基；
（ｅ）いずれかのＴｒｐ、Ｓｅｒ及びＴｈｒ残基のＲ基のヒドロキシ基；
（ｆ）いずれかのＴｒｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ及びＨｉｓ残基のＲ基のアミノ基；または
（ｇ）いずれかのＣｙｓ残基のＲ基のチオール基。

一つの特徴点では、アシル基はＲ基のカルボキシ基、即ちいずれかのＡｓｐ及びＧｌｕ残基の側鎖に結合する。別の特徴点では、アシル基は、Ｃ末端アミノ酸のアルファ炭素に結合したカルボキシ基に結合する。また別の特徴点では、アシル基は、いずれかのＬｙｓ残基のイプシロンアミノ酸に結合する。

本発明の一つの特徴点では、アシル基は、スペーサーによって元となるグルカゴン様ペプチドに結合する。スペーサーは少なくとも二つの官能基を含まなければならず、一方はアシル基の官能基に結合し、他方は元となるグルカゴン様ペプチドの官能基に結合する。

一つの特徴点では、アシル基は、直鎖状または分枝状の脂肪酸である。一つの特徴点では、アシル基は式ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｎＣＯ−を有し、式中ｎは４から３８の整数、例えば１２から３８の整数である。一つの特徴点では、アシル基は、ＣＨ_３（ＣＨ_２）_１２ＣＯ−、ＣＨ_３（ＣＨ_２）_１４ＣＯ−、ＣＨ_３（ＣＨ_２）_１６ＣＯ−、ＣＨ_３（ＣＨ_２）_１８ＣＯ−、ＣＨ_３（ＣＨ_２）_２０ＣＯ−、及びＣＨ_３（ＣＨ_２）_２２ＣＯ−からなる群から選択される。別の特徴点では、アシル基はテトラデカノイルである。また別の特徴点では、アシル基はヘキサデカノイルである。

本発明の更なる特徴点では、アシル基は、カルボン酸基のような負に荷電した基を有する。例えばアシル基は、式ＨＯＯＣ（ＣＨ２）ｍＣＯ−の直鎖状または分枝状のアルカンα,ω−ジカルボン酸であって良く、式中ｍは４から３８の整数、例えば１２から３８の整数である。一つの特徴点では、アシル基は、ＨＯＯＣ（ＣＨ_２）_１４ＣＯ−、Ｈ
ＯＯＣ（ＣＨ_２）_１６ＣＯ−、ＨＯＯＣ（ＣＨ_２）_１８ＣＯ−、ＨＯＯＣ（ＣＨ_２）_２０ＣＯ−、またはＨＯＯＣ（ＣＨ_２）_２２ＣＯ−からなる群から選択される。

一つの特徴点では、スペーサーはＣｙｓまたはＭｅｔを除くアミノ酸残基、またはＧｌｙ-Ｌｙｓのようなジペプチドである。本発明の目的のため、用語「Ｇｌｙ-Ｌｙｓのようなジペプチド」は、ＣｙｓまたはＭｅｔを除く二つのアミノ酸のいずれかの組み合わせを意味し、一つの特徴点では、Ｃ末端アミノ酸残基がＬｙｓ、ＨｉｓまたはＴｒｐ、例えばＬｙｓであり、Ｎ末端アミノ酸残基がＡｌａ、Ｓｒｇ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ及びＴｒｐであるジペプチドを意味する。一つの特徴点では、元となるペプチドのアミノ基は、アミノ酸残基またはジペプチドスペーサーのカルボキシル基とアミド結合を形成し、アミノ酸残基またはジペプチドスペーサーのアミノ基は、アシル基のカルボキシル基とアミド結合を形成する。

本発明に係るスペーサーの例は、リシル、グルタミル、アスパラギル、グリシル、ベータ-アラニル、及びガンマ-アミノブタノイルを含み、それらのそれぞれが個々の特徴点を構成する。一つの特徴点では、スペーサーはグルタミル及びベータ-アラニルである。スペーサーがＬｙｓ、ＧｌｕまたはＡｓｐである場合、そのカルボキシル基は、アミノ酸残基のアミノ基とアミド結合を形成し、そのアミノ基は、アシル基のカルボキシル基とアミド結合を形成してよい。Ｌｙｓがスペーサーとして使用される場合、ある例では更なるスペーサーが、Ｌｙｓのε-アミノ基とアシル基との間で挿入されて良い。一つの特徴点では、そのような更なるスペーサーは、Ｌｙｓのアミノ基とアシル基に存在するアミノ基とアミド結合を形成するコハク酸である。別の特徴点では、そのような更なるスペーサーは、Ｌｙｓのε-アミノ基とアミド結合を形成し、アシル基に存在するカルボキシル基ともうひとつのアミド結合を形成するＧｌｕまたはＡｓｐであり、つまりアシル基はＮ^ε−アシル化リシン残基である。

別の特徴点では、スペーサーは、１から７のメチレン基を有する分枝状ではないアルカンα,ω-ジカルボン酸基であり、当該スペーサーは、元となるペプチドのアミノ基と置換基のアミノ基との間で架橋を形成する。一つの特徴点では、スペーサーはコハク酸である。

更なる特徴点では、結合したスペーサーを有するアシル基は、式ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｐＮＨ−ＣＯ（ＣＨ_２）_ｑＣＯ−の基であり、式中ｐは８から３３、代替的には１２から２８の整数であり、ｑは１から６、代替的には２の整数である。

更なる特徴点では、結合したスペーサーを有するアシル基は、式ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｒＣＯ−ＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ_２）_２ＣＯ−の基であり、式中ｒは４から２４、例えば１０から２４の整数である。

更なる特徴点では、結合したスペーサーを有するアシル基は、式ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｓＣＯ−ＮＨＣＨ（（ＣＨ_２）_２ＣＯＯＨ）ＣＯ−の基であり、式中ｓは４から２４、例えば１０から２４の整数である。

更なる特徴点では、アシル基は、式ＣＯＯＨ（ＣＨ_２）_ｔＣＯ−の基であり、式中ｔは６から２４の整数である。

更なる特徴点では、結合したスペーサーを有するアシル基は、式−ＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ_２）_４ＮＨ−ＣＯ（ＣＨ_２）_ｕＣＨ_３の基であり、式中ｕは８から１８の整数である。

更なる特徴点では、結合したスペーサーを有するアシル基は、式ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｖＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ_２）_ｚＣＯの基であり、式中ｖは４から２４の整数であり、ｚは１から６の整数である。

更なる特徴点では、結合したスペーサーを有するアシル基は、式−ＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ_２）_４ＮＨ−ＣＯＣＨ（（ＣＨ_２）_２ＣＯＯＨ）ＮＨ−ＣＯ（ＣＨ_２）_ｗＣＨ_３の基であり、式中ｗは１０から１６の整数である。

更なる特徴点では、結合したスペーサーを有するアシル基は、式−ＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ_２）_４ＮＨ−ＣＯ（（ＣＨ_２）_２ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＮＨＣＯ（ＣＨ_２）_ｘＣＨ_３の基であり、式中ｘは０または１から２２、例えば１０から１６の整数である。

本発明はまた、グルカゴン様ペプチドがＧＬＰ−１（７−３７）である親油性に変性されたグルカゴン様ペプチドを提供し、それは式（Ｉ）のアミノ酸配列を含む（配列番号１）：

［式中、
Ｘ_７（配列番号１の１位）はＬ-ヒスチジン、Ｄ-ヒスチジン、デスアミノ-ヒスチジン、2-アミノ-ヒスチジン、β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、Ｎα-アセチル-ヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジン、α-メチル-ヒスチジン、３-ピリジルアラニン、２-ピリジルアラニン、または４-ピリジルアラニンであり；
Ｘ_８（配列番号１の２位）はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｌｓｙ、Ａｉｂ、（１-アミノシクロプロピル）カルボン酸、（１-アミノシクロブチル）カルボン酸、（１-アミノシクロペンチル）カルボン酸、（１-アミノシクロヘキシル）カルボン酸、（１-アミノシクロヘプチル）カルボン酸、または（１-アミノシクロオクチル）カルボン酸であり；
Ｘ_１６（配列番号１の１０位）はＶａｌまたはＬｅｕであり；
Ｘ_１８（配列番号１の１２位）はＳｅｒ、ＬｙｓまたはＡｒｇであり；
Ｘ_１９（配列番号１の１３位）はＴｙｒまたはＧｌｎであり；
Ｘ_２０（配列番号１の１４位）はＬｅｕ、ＭｅｔまたはＬｙｓであり；
Ｘ_２２（配列番号１の１６位）はＧＬｙ、ＧｌｕまたはＡｉｂであり；
Ｘ_２３（配列番号１の１７位）はＧｌｎ，Ｇｌｕ，ＬｙｓまたはＡｒｇであり；
Ｘ_２５（配列番号１の１９位）はＡｌａまたはＶａｌであり；
Ｘ_２６（配列番号１の２０位）はＬｙｓ，ＧｌｕまたはＡｒｇであり；
Ｘ_２７（配列番号１の２１位）はＧｌｕまたはＬｅｕであり；
Ｘ_３０（配列番号１の２４位）はＡｌａ，Ｇｌｕ，ＬｙｓまたはＡｒｇであり；
Ｘ_３３（配列番号１の２７位）はＶａｌまたはＬｙｓであり；
Ｘ_３４（配列番号１の２８位）はＬｙｓ，Ｇｌｕ，ＡｓｎまたはＡｒｇであり；
Ｘ_３５（配列番号１の２９位）はＧｌｙまたはＡｉｂであり；
Ｘ_３６（配列番号１の３０位）はＡｒｇ、ＧｌｙまたはＬｙｓであり；
Ｘ_３７（配列番号１の３１位）はＧｌｙ，Ａｌａ，Ｇｌｕ，Ｐｒｏ，Ｌｙｓ、アミドまたは不在であり；
Ｘ_３８（配列番号１の３２位）はＬｙｓ，Ｓｅｒ、アミドまたは不在であり；
Ｘ_３９（配列番号１の３３位）はＳｅｒ，Ｌｙｓ，アミドまたは不在であり；
Ｘ_４０（配列番号１の３４位）はＧｌｙ，アミドまたは不在であり；
Ｘ_４１（配列番号１の３５位）はＡｌａ，アミドまたは不在であり；
Ｘ_４２（配列番号１の３６位）はＰｒｏ、アミドまたは不在であり；
Ｘ_４３（配列番号１の３７位）はＰｒｏ、アミドまたは不在であり；
Ｘ_４４（配列番号１の３８位）はＰｒｏ、アミドまたは不在であり；
Ｘ_４５（配列番号１の３９位）はＳｅｒ、アミドまたは不在であり；
Ｘ_４６（配列番号１の４０位）はアミドまたは不在であり；
但しＸ_３８、Ｘ_３９、Ｘ_４０、Ｘ_４１、Ｘ_４２、Ｘ_４３、Ｘ_４４、Ｘ_４５またはＸ_４６；（それぞれ配列番号１の３２から４０位）が不在である場合、各アミノ酸残基の下方も不在である。］

本発明の一つの特徴点では、親油性に変性されたグルカゴン様ペプチドは、前記ＧＬＰ−１アナログがアシル化されている場合、Ａｒｇ^３４ＧＬＰ−１（７−３７）、Ｌｙｓ^３８Ａｒｇ^{２６，３４}ＧＬＰ−１（７−３８）、Ｌｙｓ^３８Ａｒｇ^{２６，３４}ＧＬＰ−１（７−３８）−ＯＨ、Ｌｙｓ^３８Ａｒｇ^{２６，３４}ＧＬＰ−１（７−３６）、Ａｉｂ^{８，２２，３５}ＧＬＰ−１（７−３７）、Ａｉｂ^８，３５ＧＬＰ−１（７−３７）、Ａｉｂ^８，２２ＧＬＰ−１（７−３７）、Ａｉｂ^{８，２２，３５}Ａｒｇ^{２６，３４}ＧＬＰ−１（７−３８）、Ａｉｂ^８，３５Ａｒｇ^{２６，３４}Ｌｙｓ^３８ＧＬＰ−１（７−３８）、Ａｉｂ^８，２２Ａｒｇ^{２６，３４}Ｌｙｓ^３８ＧＬＰ−１（７−３８）、Ａｉｂ^{８，２２、３５}Ａｒｇ^{２６，３４}Ｌｙｓ^３８ＧＬＰ−１（７−３８）、Ａｉｂ^８，３５Ａｒｇ^{２６，３４}Ｌｙｓ^３８ＧＬＰ−１（７−３８）、Ａｉｂ^{８，２２、３５}Ａｒｇ^２６Ｌｙｓ^３８ＧＬＰ−１（７−３８）、Ａｉｂ^８，３５Ａｒｇ^２６Ｌｙｓ^３８ＧＬＰ−１（７−３８）、Ａｉｂ^８，２２Ａｒｇ^２６Ｌｙｓ^３８ＧＬＰ−１（７−３８）、Ａｉｂ^{８，２２、３５}Ａｒｇ^３４Ｌｙｓ^３８ＧＬＰ−１（７−３８）、Ａｉｂ^８，３５Ａｒｇ^３４Ｌｙｓ^３８ＧＬＰ−１（７−３８）、Ａｉｂ^８，２２Ａｒｇ^３４Ｌｙｓ^３８ＧＬＰ−１（７−３８）、Ａｉｂ^{８，２２、３５}Ａｒｇ^３７Ｌｙｓ^３８ＧＬＰ−１（７−３８）、Ａｉｂ^８，３５Ａｒｇ^３７Ｌｙｓ^３８ＧＬＰ−１（７−３８）、Ａｉｂ^８，２２Ａｒｇ^３７Ｌｙｓ^３８ＧＬＰ−１（７−３８）、Ａｉｂ^{８，２２、３５}Ｌｙｓ^３７ＧＬＰ−１（７−３７）、Ａｉｂ^８，３５Ｌｙｓ^３７ＧＬＰ−１（７−３７）、Ａｉｂ^８Ａｒｇ^３４ＧＬＰ−１（７−３７）、及びＡｉｂ^８，２２Ｌｙｓ^３７ＧＬＰ−１（７−３８）からなる群から選択されたＧＬＰ−１アナログである。

本発明の一つの特徴点では、親油性に変性されたグルカゴン様ペプチドは、前記ＡＬＰ−１アナルグがアシル化されている場合、以下のものからなる群から選択されたアシル化ＧＬＰ−１アナログである：
［デスアミノＨｉｓ^７、Ｇｌｕ^２２、Ａｒｇ^２６、Ａｒｇ^３４、Ｌｙｓ^３７］ＧＬＰ−1（７−３７）アミド；
［デスアミノＨｉｓ^７、Ａｒｇ^３４］ＧＬＰ−1（７−３７）；
［Ａｉｂ^８、Ｇｌｕ^２２、Ａｒｇ^２６、Ａｒｇ^３４、Ｌｙｓ^３７］ＧＬＰ−1（７−３７）アミド；
［デスアミノＨｉｓ^７、Ｇｌｕ^２２、Ａｒｇ^２６、Ａｒｇ^３４、Ｐｈｅ（ｍ−ＣＦ３）^２８］ＧＬＰ−1（７−３７）アミド；
［デスアミノＨｉｓ^７、Ｇｌｕ^２２、Ａｒｇ^２６、Ａｒｇ^３４］ＧＬＰ−1（７−３７）−Ｌｙｓ；
［デスアミノＨｉｓ^７、Ｇｌｕ^２２、Ａｒｇ^２６、Ａｒｇ^３４］ＧＬＰ−1（７−３７）−Ｌｙｓ；
［デスアミノＨｉｓ^７、Ａｒｇ^２６、Ａｒｇ^３４］ＧＬＰ−1（７−３７）アミド−Ｌｙｓ；
［デスアミノＨｉｓ^７、Ｇｌｕ^２２、Ａｒｇ^２６、Ａｒｇ^３４、Ｌｙｓ^３７］ＧＬＰ−1（７−３７）アミド；
［デスアミノＨｉｓ^７、Ａｒｇ^２６、Ａｒｇ^３４、Ｌｙｓ^３７］ＧＬＰ−1（７−３７）アミド；
［デスアミノＨｉｓ^７、Ｇｌｕ^２２、Ａｒｇ^２６、Ａｒｇ^３４、Ｌｙｓ^３７］ＧＬＰ−1（７−３７）；
［デスアミノＨｉｓ^７、Ａｒｇ^２６、Ａｒｇ^３４、Ｌｙｓ^３７］ＧＬＰ−1（７−３７）；
［デスアミノＨｉｓ^７、Ｇｌｕ^２２、Ａｒｇ^２６、Ｇｌｕ^３０、Ａｒｇ^３４、Ｌｙｓ^３７］ＧＬＰ−1（７−３７）；
［Ａｉｂ^８、Ｌｙｓ^２０、Ａｒｇ^２６、Ｇｌｕ^３０、Ｔｈｒ（Ｏ−ベンジル）^３３］ＧＬＰ−1（７−３７）アミド；
［Ａｉｂ^８、Ｇｌｕ^２２、Ａｒｇ^２６、Ｌｙｓ^３０］ＧＬＰ−1（７−３７）アミド；
［Ａｉｂ^８、Ｇｌｕ^２２、Ａｒｇ^２６、Ｌｙｓ^３１］ＧＬＰ−1（７−３７）；
［Ａｉｂ^８、Ｌｙｓ^２０、Ａｒｇ^２６、２−ナフチルアラニン^２８、Ｇｌｕ^３０］ＧＬＰ−1（７−３７）アミド；
［Ａｉｂ^８、Ｇｌｕ^２２、Ａｒｇ^２６、Ａｒｇ^３４］ＧＬＰ−1（７−３７）−Ｌｙｓ；
［Ａｉｂ^８、Ｌｙｓ^２０、Ａｒｇ^２６、２−ナフチルアラニン^２８、Ｇｌｕ^３０］ＧＬＰ−1（７−３７）アミド；
［Ａｉｂ^８、Ｇｌｕ^２２、Ａｒｇ^２６、Ｌｙｓ^３１、Ａｒｇ^３４］ＧＬＰ−1（７−３７）；
［Ａｉｂ^８、Ａｒｇ^３４］ＧＬＰ−1（７−３７）；
［Ａｉｂ^８、Ａｒｇ^３４］ＧＬＰ−1（７−３７）アミド；
［Ａｉｂ^８、Ｌｙｓ^１８、Ａｒｇ^２６、Ａｒｇ^３４］ＧＬＰ−1（７−３７）；
［Ａｉｂ^８、Ｇｌｕ^２２、Ａｒｇ^２６、Ａｒｇ^３４、Ｌｙｓ^３７］ＧＬＰ−1（７−３７）アミド；
［Ａｉｂ^８、Ｌｙｓ^２６］ＧＬＰ−1（７−３７）アミド；
［Ａｉｂ^８、Ａｒｇ^３４］ＧＬＰ−1（７−３４）；
［Ａｉｂ^８、Ａｒｇ^３４］ＧＬＰ−1（７−３５）；
［Ａｉｂ^８、Ｌｙｓ^３３、Ａｒｇ^３４］ＧＬＰ−1（７−３４）；
［Ａｉｂ^８、Ａｒｇ^３４］ＧＬＰ−1（７−３６）アミド；
［Ａｉｂ^８、Ｌｙｓ^２６、Ａｒｇ^３４］ＧＬＰ−1（７−３６）アミド；
［Ａｉｂ^８、Ｇｌｕ^２２、Ａｒｇ^２６、Ａｒｇ^３４］ＧＬＰ−1（７−３７）Ｌｙｓ；
［Ａｉｂ^８、Ｌｙｓ２０、Ｇｌｕ^２２、Ａｒｇ^２６、Ｇｌｕ^３０、Ｐｒｏ^３７］ＧＬＰ−1（７−３７）アミド；
［Ａｉｂ^８、Ｇｌｕ^２２、Ａｒｇ^２６、Ａｒｇ^３４、Ｌｙｓ^３７］ＧＬＰ−1（７−３７）アミド；
［デスアミノＨｉｓ^７、Ｇｌｕ^２２、Ａｒｇ^２６、Ａｒｇ^３４、Ｌｙｓ^３７］、ＧＬＰ−1（７−３７）アミド；
［デスアミノＨｉｓ^７、Ａｒｇ^２６、Ａｒｇ^３４、Ｌｙｓ^３７］ＧＬＰ−1（７−３７）アミド；
［Ａｉｂ^８、Ｇｌｕ^２２、Ａｒｇ^２６、Ｇｌｕ^３０、Ｐｒｏ^３７］ＧＬＰ−1（７−３７）Ｌｙｓ；
［Ａｉｂ^８、Ｇｌｕ^２２、Ａｒｇ^２６、Ｇｌｕ^３０、Ｐｒｏ^３７］ＧＬＰ−1（７−３７）Ｌｙｓ；
［Ａｉｂ^８、Ａｒｇ^２６、Ａｒｇ^３４］ＧＬＰ−1（７−３７）；
Ａｒｇ^３４ＧＬＰ−1（７−３７）；及び
Ｇｌｙ^８−ＧＬＰ−1（７−３６）。

また別の特徴点では、親油性に変性されたグルカゴン様ペプチドは、Ｇｌｙ^８−ＧＬＰ−1（７−３６）アミド、Ｇｌｙ^８−ＧＬＰ−1（７−３７）、Ｖａｌ^８−ＧＬＰ−1（７−３６）アミド、Ｖａｌ^８−ＧＬＰ−1（７−３７）、Ｖａｌ^８Ａｓｐ^２２−ＧＬＰ−1（７−３６）アミド、Ｖａｌ^８Ａｓｐ^２２−ＧＬＰ−1（７−３７）、Ｖａｌ^８Ｇｌｕ^２２−ＧＬＰ−1（７−３６）アミド、Ｖａｌ^８Ｇｌｕ^２２−ＧＬＰ−1（７−３７）、Ｖａｌ^８Ｌｙｓ^２２−ＧＬＰ−1（７−３６）アミド、Ｖａｌ^８Ｌｙｓ^２２−ＧＬＰ−1（７−３７）、Ｖａｌ^８Ａｒｇ^２２−ＧＬＰ−1（７−３６）アミド、Ｖａｌ^８Ａｒｇ^２２−ＧＬＰ−1（７−３７）、Ｖａｌ^８Ｈｉｓ^２２−ＧＬＰ−1（７−３６）アミド、Ｖａｌ^８Ｈｉｓ^２２−ＧＬＰ−1（７−３７）、及びそれらのアナログからなる群から選択されるアシル化ＧＬＰ−１アゴニストである。

また別の特徴点では、親油性に変性されたグルカゴン様ペプチドは、Ａｒｇ^２６−ＧＬＰ−1（７−３７）；Ａｒｇ^３４−ＧＬＰ−1（７−３７）；Ｌｙｓ^３６−ＧＬＰ−1（７−３７）；Ａｒｇ^{２６，３４}Ｌｙｓ^３６−ＧＬＰ−1（７−３７）；Ａｒｇ^{２６，３４}−ＧＬＰ−1（７−３７）；Ａｒｇ^{２６，３４}Ｌｙｓ^４０−ＧＬＰ−1（７−３７）；Ａｒｇ^２６Ｌｙｓ^３６−ＧＬＰ−1（７−３７）；Ａｒｇ^３４Ｌｙｓ^３６−ＧＬＰ−1（７−３７）；Ｖａｌ^８Ａｒｇ^２２−ＧＬＰ−1（７−３７）；Ｍｅｔ^８Ａｒｇ^２２−ＧＬＰ−1（７−３７）；Ｇｌｙ^８Ｈｉｓ^２２−ＧＬＰ−1（７−３７）；Ｖａｌ^８Ｈｉｓ^２２−ＧＬＰ−1（７−３７）；Ｍｅｔ^８Ｈｉｓ^２２−ＧＬＰ−1（７−３７）；Ｈｉｓ^３７−ＧＬＰ−1（７−３７）；Ｇｌｙ^８−ＧＬＰ−1（７−３７）；Ｖａｌ^８−ＧＬＰ−1（７−３７）；Ｍｅｔ^８−ＧＬＰ−1（７−３７）；Ｇｌｙ^８Ａｒｇ^２２−ＧＬＰ−1（７−３７）；Ｖａｌ^８Ａｓｐ^２２−ＧＬＰ−1（７−３７）；Ｍｅｔ^８Ａｓｐ^２２−ＧＬＰ−1（７−３７）；Ｇｌｙ^８Ｇｌｕ^２２−ＧＬＰ−1（７−３７）；Ｖａｌ^８Ｇｌｕ^２２−ＧＬＰ−1（７−３７）；Ｍｅｔ^８Ｇｌｕ^２２−ＧＬＰ−1（７−３７）；Ｇｌｙ^８Ｌｙｓ^２２−ＧＬＰ−1（７−３７）；Ｖａｌ^８Ｌｙｓ^２２−ＧＬＰ−1（７−３７）；Ｍｅｔ^８Ｌｙｓ^２２−ＧＬＰ−1（７−３７）；Ｇｌｙ^８Ａｒｇ^２２−ＧＬＰ−1（７−３７）；Ｖａｌ^８Ｌｙｓ^２２Ｈｉｓ^３７−ＧＬＰ−1（７−３７）；Ｇｌｙ^８Ｇｌｕ^２２Ｈｉｓ^３７−ＧＬＰ−1（７−３７）；Ｖａｌ^８Ｇｌｕ^２２Ｈｉｓ^３７−ＧＬＰ−1（７−３７）；Ｍｅｔ^８Ｇｌｕ^２２Ｈｉｓ^３７−ＧＬＰ−1（７−３７）；Ｇｌｙ^８Ｌｙｓ^２２Ｈｉｓ^３７−ＧＬＰ−1（７−３７）；Ｍｅｔ^８Ｌｙｓ^２２Ｈｉｓ^３７−ＧＬＰ−1（７−３７）；Ｇｌｙ^８Ａｒｇ^２２Ｈｉｓ^３７−ＧＬＰ−1（７−３７）；Ｖａｌ^８Ａｒｇ^２２Ｈｉｓ^３７−ＧＬＰ−1（７−３７）；Ｍｅｔ^８Ａｒｇ^２２Ｈｉｓ^３７−ＧＬＰ−1（７−３７）；Ｇｌｙ^８Ｈｉｓ^２２Ｈｉｓ^３７−ＧＬＰ−1（７−３７）；Ｖａｌ^８Ｈｉｓ^２２Ｈｉｓ^３７−ＧＬＰ−1（７−３７）；Ｍａｔ^８Ｈｉｓ^２２Ｈｉｓ^３７−ＧＬＰ−1（７−３７）；Ｇｌｙ^８Ｈｉｓ^３７−ＧＬＰ−1（７−３７）；Ｖａｌ^８Ｈｉｓ^３７−ＧＬＰ−1（７−３７）；Ｍｅｔ^８Ｈｉｓ^３７−ＧＬＰ−1（７−３７）；Ｇｌｙ^８Ａｓｐ^２２Ｈｉｓ^３７−ＧＬＰ−1（７−３７）；Ｖａｌ^８Ａｓｐ^２２Ｈｉｓ^３７−ＧＬＰ−1（７−３７）；Ｍｅｔ^８Ａｓｐ^２２Ｈｉｓ^３７−ＧＬＰ−1（７−３７）；Ａｒｇ^２６−ＧＬＰ−1（７−３６）アミド；Ａｒｇ^３４−ＧＬＰ−1（７−３６）アミド；Ｌｙｓ^３６−ＧＬＰ−1（７−３６）アミド；Ａｒｇ^{２６、３４}Ｌｙｓ^３６−ＧＬＰ−1（７−３６）アミド；Ａｒｇ^{２６、３４}−ＧＬＰ−1（７−３６）アミド；Ａｒｇ^{２６、３４}Ｌｙｓ^４０−ＧＬＰ−1（７−３６）アミド；Ａｒｇ^２６Ｌｙｓ^３６−ＧＬＰ−1（７−３６）アミド；Ａｒｇ^３４Ｌｙｓ^３６−ＧＬＰ−1（７−３６）アミド；Ｇｌｙ^８−ＧＬＰ−1（７−３６）アミド；Ｖａｌ^８−ＧＬＰ−1（７−３６）アミド；Ｍｅｔ^８−ＧＬＰ−1（７−３６）アミド；Ｇｌｙ^８Ａｓｐ^２２−ＧＬＰ−1（７−３６）アミド；Ｇｌｙ^８Ｇｌｕ^２２Ｈｉｓ^３７−ＧＬＰ−1（７−３６）アミド；Ｖａｌ^８Ａｓｐ^２２−ＧＬＰ−1（７−３６）アミド；Ｍｅｔ^８Ａｓｐ^２２−ＧＬＰ−1（７−３６）アミド；Ｇｌｙ^８Ｇｌｕ^２２−ＧＬＰ−1（７−３６）アミド；Ｖａｌ^８Ｇｌｕ^２２−ＧＬＰ−1（７−３６）アミド；Ｍｅｔ^８Ｇｌｕ^２２−ＧＬＰ−1（７−３６）アミド；Ｇｌｙ^８Ｌｙｓ^２２−ＧＬＰ−1（７−３６）アミド；Ｖａｌ^８Ｌｙｓ^２２−ＧＬＰ−1（７−３６）アミド；Ｍｅｔ^８Ｌｙｓ^２２−ＧＬＰ−1（７−３６）アミド；Ｇｌｙ^８Ｈｉｓ^２２Ｈｉｓ^３７−ＧＬＰ−1（７−３６）アミド；Ｇｌｙ^８Ａｒｇ^２２−ＧＬＰ−1（７−３６）アミド；Ｖａｌ^８Ａｒｇ^２２−ＧＬＰ−1（７−３６）アミド；Ｍｅｔ^８Ａｒｇ^２２−ＧＬＰ−1（７−３６）アミド；Ｇｌｙ^８Ｈｉｓ^２２−ＧＬＰ−1（７−３６）アミド；Ｖａｌ^８Ｈｉｓ^２２−ＧＬＰ−1（７−３６）アミド；Ｍａｔ^８Ｈｉｓ^２２−ＧＬＰ−1（７−３６）アミド；Ｈｉｓ^３７−ＧＬＰ−1（７−３６）アミド；Ｖａｌ^８Ａｒｇ^２２Ｈｉｓ^３７−ＧＬＰ−1（７−３６）アミド；Ｖａｌ^８Ａｒｇ^３７−ＧＬＰ−1（７−３６）アミド；Ｇｌｙ^８Ｈｉｓ^３７−ＧＬＰ−1（７−３６）アミド；Ｖａｌ^８Ｈｉｓ^３７−ＧＬＰ−1（７−３６）アミド；Ｍｅｔ^８Ｈｉｓ^３７−ＧＬＰ−1（７−３６）アミド；Ｇｌｙ^８Ａｓｐ^２２Ｈｉｓ^３７−ＧＬＰ−1（７−３６）アミド；Ｖａｌ^８Ａｓｐ^２２Ｈｉｓ^３７−ＧＬＰ−1（７−３６）アミド；Ｍｅｔ^８Ａｓｐ^２２Ｈｉｓ^３７−ＧＬＰ−1（７−３６）アミド；Ｖａｌ^８Ｇｌｕ^２２Ｈｉｓ^３７−ＧＬＰ−1（７−３６）アミド；Ｍｅｔ^８Ｇｌｕ^２２Ｈｉｓ^３７−ＧＬＰ−1（７−３６）アミド；Ｇｌｙ^８Ｌｙｓ^２２Ｈｉｓ^３７−ＧＬＰ−1（７−３６）アミド；Ｖａｌ^８Ｌｙｓ^２２Ｈｉｓ^３７−ＧＬＰ−1（７−３６）アミド；Ｍｅｔ^８Ｌｙｓ^２２Ｈｉｓ^３７−ＧＬＰ−1（７−３６）アミド；Ｇｌｙ^８Ａｒｇ^２２Ｈｉｓ^３７−ＧＬＰ−1（７−３６）アミド；Ｖａｌ^８Ｈｉｓ^２２Ｈｉｓ^３７−ＧＬＰ−1（７−３６）アミド；Ｍｅｔ^８Ｈｉｓ^２２Ｈｉｓ^３７−ＧＬＰ−1（７−３６）アミド；及びそれらのアナログからなる群から選択されるアシル化ＧＬＰ−１アナログである。

また別の特徴点では、アシル化ＧＬＰ−１アゴニストは、Ｖａｌ^８Ｔｒｐ^１９Ｇｌｕ^２２−ＧＬＰ−1（７−３７）、Ｖａｌ^８Ｇｌｕ^２２Ｖａｌ^２５−ＧＬＰ−1（７−３７）、Ｖａｌ^８Ｔｙｒ^１６Ｇｌｕ^２２−ＧＬＰ−1（７−３７）、Ｖａｌ^８Ｔｒｐ^１６Ｇｌｕ^２２−ＧＬＰ−1（７−３７）、Ｖａｌ^８Ｌｅｕ^１９Ｇｌｕ^２２−ＧＬＰ−1（７−３７）、Ｖａｌ^８Ｔｙｒ^１８Ｇｌｕ^２２−ＧＬＰ−1（７−３７）、Ｖａｌ^８Ｇｌｕ^２２Ｈｉｓ^３７−ＧＬＰ−1（７−３７）、Ｖａｌ^８Ｇｌｕ^２２Ｉｌｅ^３３−ＧＬＰ−1（７−３７）、Ｖａｌ^８Ｔｒｐ^１６Ｇｌｕ^２２Ｖａｌ^２５Ｉｌｅ^３３−ＧＬＰ−1（７−３７）、Ｖａｌ^８Ｇｌｕ^２２Ｖａｌ^２５Ｉｌｅ^３３−ＧＬＰ−1（７−３７）、Ｖａｌ^８Ｔｒｐ^１６Ｇｌｕ^２２Ｖａｌ^２５−ＧＬＰ−1（７−３７）、及びそれらのアナログからなる群から選択される。

また別の特徴点では、ここで使用される親油性に変性されたグルカゴン様ペプチドは、アシル化ＧＬＰ−１（７−３７）（配列番号１）及びそのインスリン分泌性アナログを意味する。ＧＬＰ−１アナログ及びアシル化ＧＬＰ−１アナログの非制限的な例としては、ＧＬＰ−１（７−３６）アミド、Ａｒｇ^３４−ＧＬＰ−1（７−３７）、Ｇｌｙ^８−ＧＬＰ−1（７−３７）、Ｖａｌ^８−ＧＬＰ−1（７−３６）アミド、Ｖａｌ^８Ａｓｐ^２２−ＧＬＰ−1（７−３７）、デスアミノＨｉｓ^７、Ａｒｇ^２６、Ｌｙｓ^３４（Ｎ^ε−（γ−Ｇｌｕ（Ｎ^α−ヘキサデカノイル）））−ＧＬＰ−１（７−３７）、デスアミノＨｉｓ^７、Ａｒｇ^２６、Ｌｙｓ^３４（Ｎ^ε−オクタノイル）−ＧＬＰ−１（７−３７）、Ａｒｇ^{２６、３４}、Ｌｙｓ^３８（ω−カルボキシペンタデカノイル）−ＧＬＰ−１（７−３８）、Ａｒｇ^{２６、３４}、Ｌｙｓ^３６（Ｎ^ε−（γ−Ｇｌｕ（Ｎ^α−ヘキサデカノイル）））−ＧＬＰ−１（７−３６）、及びＡｒｇ^３４、Ｌｙｓ^３６（Ｎ^ε−（γ−Ｇｌｕ（Ｎ^α−ヘキサデカノイル）））−ＧＬＰ−１（７−３７）が挙げられる。

一つの特徴点では、本発明の親油性に変性されたグルカゴン様ペプチドは、ジペプチジルアミノペプチダーゼＩＶに対して保護されている。ここで使用される用語「ジペプチジルアミノペプチダーゼＩＶに対して保護」は、天然の化合物、例えばＧＬＰ−１（７−３７）よりもジペプチジルアミノペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）に対してより耐性である化合物、例えばアシル化ＧＬＰ−１アナログを意味する。ジペプチジルアミノペプチダーゼＩＶによる分解に対する親油性に変性されたグルカゴン様ペプチドの耐性は、以下に記載される分解アッセイにより測定される。

親油性に変性されたグルカゴン様ペプチドの採取物（５ｎｍｏｌ）を、１００μｌの０．１ＭトリエチルアミンＨＣｌバッファー、ｐＨ７．４中で１０−１８０分間、５ｍＵの酵素活性に対応する精製ジペプチジルアミノペプチダーゼＩＶの１μｌと３７℃でインキュベートする。５μｌの１０％トリフルオロ酢酸の添加により、酵素反応を終結させ、次いでペプチド分解産物を分離し、ＨＰＬＣ分析を使用して定量する。この分析を実施するための一つの方法では、混合物をＶｙｄａｃＣ１８ワイドポア（３０ｎｍの孔、５μｍの粒子）の２５０×４．６ｍｍカラムに適用し、Siegel等[Regul. Pept. (1999) 79: 93-102]及びMentlein等[Eur. J. Biochem. (1983) 214: 829-35]にしたがって、０．１％トリフルオロ酢酸中のアセトニトリルの段階的な直線勾配で１ｍｌ／分の流速で溶出する（３分間０％アセトニトリル、１７分間０−２４％アセトニトリル、１分間２４−４８％アセトニトリル）。ペプチド及びその分解産物を、２２０ｎｍ（ペプチド結合）または２８０ｎｍ（芳香族アミノ酸）での吸光度によってモニターしてよく、スタンダードのものと関連するピーク領域の統合によって定量する。ジペプチジルアミノペプチダーゼＩＶによる親油性に変性されたグルカゴン様ペプチドの加水分解の速度を、親油性に変性されたグルカゴン様ペプチドの１０％未満の加水分解を引き起こすインキュベーション時間で見積もる。

また別の特徴点では、本発明の製薬組成物に含まれる親油性に変性されたグルカゴン様ペプチドは、親油性に変性されたＧＬＰ−２またはそのアナログである。本発明の製薬組成物に含まれる親油性に変性されたグルカゴン様ペプチドが親油性に変性されたＧＬＰ−２またはそのアナログである場合、親油性に変性されたＧＬＰ−２またはそのアナログは、約１ｍｇ／ｍｌから約１００ｍｇ／ｍｌの濃度、より好ましくは約１ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。

また別の特徴点では、親油性に変性されたグルカゴン様ペプチドは、親油性に変性されたエキセンジン−４または親油性に変性されたエキセンジン−３またはそれらのアナログである。本発明の範囲内に含まれるエキセンジン並びにそのアナログの例は、WO 97/46584、US 5424286及びWO 01/04156に開示されたものである。US 5424286は、エキセンジンペプチドでインスリン放出を刺激する方法を記載している。開示されたエキセンジンペプチドは、ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧＸ（配列番号２）を含み、式中ＸはＰまたはＹであり、エキセンジン−３はＨＳＤＧＴＦＩＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号３）であり、エキセンジン−４（１−３９）はＨＧＥＧＴＦＩＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号４）である。WO 97/46584は、エキセンジンペプチドの切り詰め変異型を記載している。開示されたペプチドはインスリンの分泌及び生合成を増大するが、グルカゴンのものは減少する。WO 01/04156は、エキセンジン−４アナログ及び誘導体、並びにこれらの分子の調製を記載している。
一つの特徴点では、エキセンジンアナログはＨＧＥＧＴＦＩＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＫＫＫＫＫＫ−アミド（ＺＰ−１０）（配列番号５）である。

ここで使用される用語「エキセンジン−４ペプチド」は、エキセンジン−４（１−３９）（配列番号４）、エキセンジン−４（１−３９）アナログ、エキセンジン−４（１−３９）誘導体、またはエキセンジン−４（１−３９）アナログの誘導体、そのインスリン分泌性の断片、そのインスリン分泌性のアナログ、及びそのインスリン分泌性の誘導体を意味する。エキセンジン−４のインスリン分泌性の断片は、全配列がエキセンジン−４の配列（配列番号４）で見出すことができ、少なくとも一つの末端アミノ酸が欠失しているインスリン分泌性のペプチドである。エキセンジン−４（１−３９）のインスリン分泌性の断片の例は、エキセンジン−４（１−３８）及びエキセンジン−４（１−３１）である。

化合物のインスリン分泌特性は、当該技術分野で既知のin vivoまたはin vitro1アッセイによって測定されて良い。例えば、前記化合物は動物に投与されて、インスリン濃度が経時的にモニターされてよい。エキセンジン−４（１−３９）のインスリン分泌性のアナログは、一つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されている分子、及び／または一つ以上のアミノ酸残基が欠失している分子、及び/または一つ以上のアミノ酸残基が付加されている分子を指し、但し前記アナログはインスリン分泌性であるか、インスリン分泌性の化合物のプロドラッグである。エキセンジン−４（１−３９）のインスリン分泌性のアナログの例は、Ｓｅｒ^２Ａｓｐ^３−エキセンジン−４（１−３９）であり、ここで２及び３位のアミノ酸残基がそれぞれセリン及びアスパラギン酸で置換されている（この特定のアナログは、エキセンジン−３として当該技術分野で既知である）。エキセンジン−４（１−３９）のインスリン分泌性の誘導体及びそのアナログは、当業者がこれらのペプチドの誘導体であると考えるもの、即ち元となるペプチド分子に存在しない少なくとも一つの置換基を有するものであり、但し前記誘導体はインスリン分泌性であるか、インスリン分泌性の化合物のプロドラッグである。置換基の例はアミド、炭水化物、アルキル基、エステル、及び親油性の置換基である。エキセンジン−４（１−３９）のインスリン分泌性の誘導体及びそのアナログの例は、Ｔｙｒ^３１−エキセンジン−４（１−３１）アミドである。

ここで使用される用語「安定なエキセンジン−４化合物」は、化学的に変性されたエキセンジン−４（１−３９）、即ち従来の方法によって測定して、ヒトにおいて少なくとも１０時間のin vivo血漿消失半減期を示すアシル化エキセンジン−３またはアシル化エキセンジン−４アナログを意味する。

一つの特徴点では、本発明の親油性に変性されたグルカゴン様ペプチドはインスリン分泌性である。親油性に変性されたグルカゴン様ペプチドに関して言及されるここで使用される用語「インスリン分泌性」は、血漿グルコース濃度の増大に応答してインスリンの分泌を刺激する能力を意味する。インスリン分泌性のペプチド及び化合物は、ＧＬＰ−１レセプターのアゴニストである。化合物のインスリン分泌特性は、当該技術分野で既知のin vitroまたはin vivoアッセイによって測定されて良い。ペプチドのような化合物のインスリン分泌特性を測定するために、以下のin vitroアッセイが使用されてよい。好ましくはインスリン分泌性の化合物は、以下のアッセイにおいて５ｎＭ未満のＥＣ_５０値、より好ましくは５００ｐＭ未満のＥＣ_５０値を示す。

クローン化したヒトＧＬＰ−１レセプターを発現するベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞（ＢＨＫ４６７−１２Ａ）を、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン、１００μｌ／ｍｌのストレプトマイシン、１０％胎児ウシ血清、及び１ｍｇ／ｍｌのGeneticin G-418(Life Technologies)を添加したＤＭＥＭ培地で生育させる。バッファー（更に５ｍｇ／ｍｌのロイペプチン(Sigma)、５ｍｇ・ｌのペプスタチン(Sigma)、１００ｍｇ／ｌのバシトラシン(Sigma)、及び１６ｍｇ／ｌのアプロチニン(Calbiochem-Novabiochem, La Jolla, CA)を含む１０ｍＭのＴｒｉｓ-ＨＣｌ、３０ｍＭのＮａＣｌ、及び１ｍＭのジチオスレイトール、ｐＨ７．４）中でのホモジェナイゼーションにより細胞膜を調製する。ホモジェネートを４１％ｗ／ｗスクロースの層の上部で遠心分離する。二つの層の間の白色バンドをバッファー中で希釈して遠心分離する。細胞膜を更なる使用まで−８０℃で貯蔵する。

インスリン分泌性のペプチドまたはインスリン分泌性の化合物による刺激化に対する応答としてｃＡＭＰを測定することにより、機能的なレセプターアッセイを実施する。１４０ｍｌの全体積で、以下の最終濃度で９６穴マイクロタイタープレートでインキュベーションを実施する：５０ｍＭのＴｒｉｓ-ＨＣｌ、１ｍＭのＥＧＴＡ、１．５ｍＭのＭｇＳＯ_４、１．７ｍＭのＡＴＰ、２０ｍＭのＧＴＰ、２ｍＭの３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、０．０１％ｗ／のＴｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４。化合物を溶解しバッファーで希釈する。ＧＴＰは核実験について新たに調製される：２．５μｇの膜を各ウェルに添加し、混合物を９０分間室温暗所で震盪しながらインキュベートする。２５ｍｌの０．５ＭのＨＣｌの添加により反応を停止する。形成されたｃＡＭＰをシンチレーション接近アッセイによって測定する（PRA542、Amersham, UK）。用量−応答曲線を化合物についてプロットし、ＥＣ_５０値をGraphPad Prismソフトウェアを使用して計算する。

ポリペプチド及びペプチド、例えば親油性に変性されるグルカゴン様ペプチドの生産は、当該技術分野で既知である。ポリペプチドまたはペプチドは、例えば古典的なペプチド合成、例えばｔ−ＢｏｃまたはＦｍｏｃ化学を使用する固相ペプチド合成、または他の良く確立された方法によって生産されてよい、例えばGreene及びWuts [Protective Groups in Organic Synthesis, Joh, Wiley & Sons (1999)]。ポリペプチドまたはペプチドは更に、前記（ポリ）ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含み、ペプチドの発現を可能にする条件下で適切な栄養培地で前記（ポリ）ペプチドを発現できる職種細胞を培養することを含む方法によって生産されてよい。非天然アミノ酸残基を含む（ポリ）ペプチドについては、例えばｔＲＮＡミュータントの使用によって、非天然アミノ酸が前記（ポリ）ペプチドに導入されるように、組換え細胞を改変すべきである。

ここで使用される用語「リラグルチド（Liraglutide）」は、グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ−１）誘導体、Ａｒｇ^３４、Ｌｙｓ^２６（Ｎ^ε−（γ−Ｇｌｕ（Ｎ^α−ヘキサデカノイル）））−ＧＬＰ−１（７−３７）について使用される。

上述のように、本発明は、
ａ）少なくとも一つの固相と第一の脱着剤流を含む、流体連結中の複数のセクションを含む向流精製システムを準備する工程；
ｂ）前記向流精製システム内に供給流として、向流態様で固相と接触する流体混合物を導入する工程；
ｃ）供給流中の少なくとも一つの調節剤の濃度を調節することにより、等温線の初期傾斜が、Ｑ^Ｆまたはαの関数としてｍ^ＩＩＩ及びＡのプロットを作製した際、動作線の傾斜とほぼ平行となるように等温線を制御する工程；
ｄ）少なくとも一つの更なる成分から興味あるポリペプチドの分離を実施する工程；及び
ｅ）興味あるポリペプチドを回収し、その精製組成物を得る工程
を含む、流体混合物中の少なくとも一つの更なる成分からの興味あるポリペプチドのクロマトグラフィー分離のための方法に関する。

本発明のいくつかの特徴点では、供給流中の少なくとも一つの調節剤の濃度は、脱着剤流中の同じ調節剤の濃度とは異なるように制御される。

本発明のいくつかの特徴点では、興味あるポリペプチドはグルカゴン様ペプチド及び／またはＧＬＰ−１アゴニストである。

本発明のいくつかの特徴点では、興味あるポリペプチドはＧＬＰ−１（１−３７）またはそのアナログ若しくは誘導体である。

本発明のいくつかの特徴点では、向流精製システムはイオン交換クロマトグラフィーシステムである。

本発明のいくつかの特徴点では、イオン交換クロマトグラフィーシステムはアニオン交換システムである。

本発明のいくつかの特徴点では、イオン交換クロマトグラフィーシステムはカチオン交換システムである。

本発明のいくつかの特徴点では、等温線の初期傾斜が、Ｑ^Ｆまたはαの関数としてｍ^ＩＩＩ及びＡのプロットを作製した際、動作線の傾斜とほぼ平行となるように等温線を制御する。かくして、初期傾斜を動作線の傾斜の１０％の範囲内とする等温線を得るように、調節剤の濃度を制御することが、本発明の方法の効力、つまり本発明の方法による精製の後に得られる生成物の純度に対して重要であるというのが本発明者の考えである。

本発明のいくつかの特徴点では、等温線は供給流中の塩濃度、Ｃ_ｓ ^Ｆによって制御される。

本発明の一つの特徴点では、供給流の前のセクション（例えば図３のゾーンＩＩにおける）における塩濃度に対して、供給流中の相対的塩濃度は、以下の範囲内である：

選択性は以下のように与えられる：

式中、成分Ａ及びＢについてのパラメーター、α_ｉ及びβ_ｉは、二重対数プロットにおける滞留体積にフィットされる：

本発明の一つの特徴点では、供給流の前のセクションにおける塩濃度に対して、供給流中の相対的塩濃度は、以下の範囲内である：

本発明の一つの特徴点では、供給流中の塩化物濃度、Ｃ_ｓ ^Ｆは約１７．５ｍｍｏｌ／ｋｇから約３６ｍｍｏｌ／ｋｇの範囲内であり、セクションＩＩのような供給流の前のセクションにおける塩化物濃度は約４５ｍｍｏｌ／ｋｇである。

本発明の一つの特徴点では、供給流中の塩化物濃度、Ｃ_ｓ ^Ｆは約２１ｍｍｏｌ／ｋｇから約３５ｍｍｏｌ／ｋｇの範囲内であり、セクションＩＩのような供給流の前のセクションにおける塩化物濃度は約４５ｍｍｏｌ／ｋｇである。

本発明の一つの特徴点では、供給流中の塩化物濃度、Ｃ_ｓ ^Ｆは約２４ｍｍｏｌ／ｋｇから約３４ｍｍｏｌ／ｋｇの範囲内であり、セクションＩＩのような供給流の前のセクションにおける塩化物濃度は約４５ｍｍｏｌ／ｋｇである。

本発明の一つの特徴点では、供給流中の塩化物濃度、Ｃ_ｓ ^Ｆは約２８ｍｍｏｌ／ｋｇから約３３ｍｍｏｌ／ｋｇの範囲内であり、セクションＩＩのような供給流の前のセクションにおける塩化物濃度は約４５ｍｍｏｌ／ｋｇである。

本発明の一つの特徴点では、供給流中の塩化物濃度、Ｃ_ｓ ^Ｆは約８７．１ｍｍｏｌ／ｋｇから約１１４．３ｍｍｏｌ／ｋｇの範囲内であり、セクションＩＩのような供給流の前のセクションにおける塩化物濃度は約１３０ｍｍｏｌ／ｋｇである。

本発明の一つの特徴点では、供給流中の塩化物濃度、Ｃ_ｓ ^Ｆは約９９ｍｍｏｌ／ｋｇから約１１４ｍｍｏｌ／ｋｇの範囲内であり、セクションＩＩのような供給流の前のセクションにおける塩化物濃度は約１３０ｍｍｏｌ／ｋｇである。

本発明のいくつかの特徴点では、供給流と脱着剤は、いずれかの有機または無機塩及びそれらの混合物、例えばＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＮＨ_４Ｃｌ、ＣａＣｌ_２、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、クエン酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、酢酸カルシウム、またはそれらの混合物から選択される塩を含む。本発明の一つの特徴点では、供給流と脱着剤はＮａＣｌを含む。

本発明のいくつかの特徴点では、向流精製システムは、逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）システムである。

本発明のいくつかの特徴点では、向流精製システムは、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）システムである。

本発明のいくつかの特徴点では、供給流と脱着剤は、無機塩、例えば硫酸アンモニウムを含む。

本発明のいくつかの特徴点では、等温線は、供給流中の有機調節剤の濃度によって制御される。

本発明の一つの特徴点では、供給流と脱着剤流中の有機調節剤の間の差異は、以下の範囲内にある：

選択性は以下のように与えられる：

式中、成分Ａ及びＢについてのパラメーターα_ｉ及びβ_ｉは、以下の関数の半対数プロット（例えば図２１で観察される）における滞留体積にフィットされる：

本発明の一つの特徴点では、供給流と供給流の前のセクションにおける流れ（例えば図３のセクションＩＩ）の有機調節剤の間の差異、Ｃ_ｍ ^Ｆ−Ｃ_ｍ ^ＩＩは、−３．５重量％≦Ｃ_ｍ ^Ｆ−Ｃ_ｍ ^ＩＩ≦−１．４重量％である。

本発明の一つの特徴点では、供給流と供給流の前のセクションにおける流れの有機調節剤の間の差異、Ｃ_ｍ ^Ｆ−Ｃ_ｍ ^ＩＩは、約２７．３重量％から約２９．４重量％の範囲であり、セクションＩＩのような供給流の前のセクションにおけるエタノール濃度は約３０．８重量％である。

本発明の一つの特徴点では、供給流と供給流の前のセクションにおける流れの有機調節剤の間の差異、Ｃ_ｍ ^Ｆ−Ｃ_ｍ ^ＩＩは、約５３．７重量％から約５７．１重量％の範囲であり、セクションＩＩのような供給流の前のセクションにおけるエタノール濃度は約５８．４重量％である。

本発明のいくつかの特徴点では、供給流と脱着剤は、有機溶媒、例えばエタノール、メタノール、プロパノール、及びアセトニトリルから選択される有機溶媒を含む。本発明の一つの特徴点では、供給流と脱着剤はエタノールを含む。

本発明のいくつかの特徴点では、向流精製システムは、吸着クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、またはアフィニティークロマトグラフィーを使用する。

本発明のいくつかの特徴点では、向流精製システムは模擬移動床（ＳＭＢ）精製システムである。

本発明のいくつかの特徴点では、向流精製システムはマルチカラム向流溶媒勾配精製（ＭＣＳＧＰ）システムである。

本発明のいくつかの特徴点では、分離は少なくとも一つの成分に対する直線吸着等温線の下部で生じる。

本発明のいくつかの特徴点では、供給流は方法を通じて一定に維持される。

本発明のいくつかの特徴点では、供給流は方法の間で変化する。

本発明のいくつかの特徴点では、等温線は供給流中の少なくとも一つの調節剤の濃度の調節によって制御される。

本発明のいくつかの特徴点では、等温線は、前記興味あるポリペプチドと前記少なくとも一つの更なる成分についての等温線の初期傾斜の間に存在する動作線を導く、供給流中の少なくともひとつの調節剤の濃度の調節によって制御される。

本発明のいくつかの特徴点では、等温線は供給流中の少なくとも一つの調節剤の濃度の調節によって制御され、ここで調節剤は供給流のｐＨである。

本発明のいくつかの特徴点では、少なくとも一つの更なる成分は、前記ポリペプチドの別の形態、例えば前記興味あるポリペプチドのグリコシル化形態、脱アミド化形態、切り詰め形態、伸張形態、脱アミド化形態、不正確にホールディングされた形態、または酸化形態、非所望のグリコシル化を有する形態、ラセミ化から生ずる形態、ペプチド鎖内のアミノ酸を欠いた形態、ペプチド鎖内に外的なアミン酸を有する形態、並びに所望されるもの以外の別の残基にアシル化が生じている形態である。

記号
Ａ［−］等温線の初期傾斜
ｃ［Ｍ］または［ｇ／ｌ］液相中の濃度（記載がなければ全モル濃度）
Ｋ_ｅｑ平衡定数
Ｋ_Ｄ［−］立体排除因子
ｍ［−］流体フローと固体フローの間の比
ｑ［Ｍ］または［ｇ／ｌ］結合タンパク質のむ次元濃度
Ｑ［ｍ^３／ｓ］体積フロー
Ｖ［ｍ^３］体積
Ｖ〜［−］無次元体積Ｖ〜＝Ｖ／Ｖ_ｃｏｌ
Ｚ［−］電荷数
ギリシャ文字
α_ＡＢ［−］選択性
α ［−］無次元供給フロー、α＝ＱＦ／ＱＩＩ
α_ｉ［−］ラインフィットにおけるパラメーター
β_ｉ［−］ラインフィットにおけるパラメーター
ε ［−］隙間の孔度
ε_ｐ［−］粒子の孔度
ε_ｔ［−］カラム全体の孔度、ε_ｔ＝ε＋（１−ε）・ε_ｐ
γ ［−］活性係数
Λ ［−］無次元リガンド密度
下付きの記号
Ｄｅａｄ死空間
ｉ成分数
注入
ｉｎｉｔ初期
ｍ調節剤
ＮＲ滞留なし
ｐ、ｐｏｒｅ孔相
Ｒ滞留
上付きの記号
ｍａｘ最大
Ｆ供給
Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩプラントのセクションに関する、即ちセクションＩ、
セクションＩＩ、セクションＩＩＩ

以下のものは、本発明を更に記載する特徴点のリストである：
１．ａ）少なくとも一つの固相と第一の脱着剤流を含む、流体連結中の複数のセクションを含む向流精製システムを準備する工程；
ｂ）前記向流精製システム内に供給流として、向流態様で固相と接触する流体混合物を導入する工程；
ｃ）供給流中の少なくとも一つの調節剤の濃度を調節することにより、等温線の初期傾斜Ａが、Ｑ^Ｆまたはαの関数としてｍ^ＩＩＩ及びＡのプロットを作製した際、動作線の傾斜とほぼ平行となるように等温線を制御する工程；
ｄ）少なくとも一つの更なる成分から興味あるポリペプチドの分離を実施する工程；及び
ｅ）興味あるポリペプチドを回収し、その精製組成物を得る工程
を含む、流体混合物中の少なくとも一つの更なる成分からの興味あるポリペプチドのクロマトグラフィー分離のための方法。

２．供給流中の少なくとも一つの調節剤の前記濃度が、脱着剤流のような供給流の前のセクションにおける同じ調節剤の濃度とは異なるように制御される、特徴点１に記載の方法。

３．興味あるポリペプチドがグルカゴン様ペプチドまたはＧＬＰ−１アゴニストである、特徴点１または２のいずれか一つに記載の方法。

４．興味あるポリペプチドがＧＬＰ−１（１−３７）またはそのアナログ若しくは誘導体である、特徴点３に記載の方法。

５．ＧＬＰ−１（１−３７）またはそのアナログ若しくは誘導体が組換え的に由来する、特徴点４に記載の方法。

６.向流精製システムがイオン交換クロマトグラフィーシステムである、特徴点１から５のいずれか一つに記載の方法。

７．イオン交換クロマトグラフィーシステムがアニオン交換システムである、特徴点６に記載の方法。

８．イオン交換クロマトグラフィーシステムがカチオン交換システムである、特徴点６に記載の方法。

９．等温線が供給流中の塩濃度、Ｃ_ｓの制御によって制御される、特徴点１から８のいずれか一つに記載の方法。

１０．供給流の前のセクションにおける流れ中の塩濃度に対する供給流中の塩濃度が以下の範囲：

であり、選択性が下式：

によって与えられ、成分Ａ及びＢについてのパラメーターα_ｉ及びβ_ｉが下式：

の二重対数プロットにおける滞留体積にフィットされる、特徴点１から９のいずれか一つに記載の方法。

１１．供給流の前のセクションにおける流れ中の塩濃度に対する供給流中の塩濃度が以下の範囲：

である、特徴点１から１０のいずれか一つに記載の方法。

１２．供給流中の塩濃度、Ｃ_ｓ ^Ｆが約１７．５ｍｍｏｌ／ｋｇから約３６ｍｍｏｌ／ｋｇの範囲内であり、供給流の前のセクションにおける流れ中の塩化物濃度が約４５ｍｍｏｌ／ｋｇである、特徴点１から１０のいずれか一つに記載の方法。

１３．供給流中の塩濃度、Ｃ_ｓ ^Ｆが約２８ｍｍｏｌ／ｋｇから約３３ｍｍｏｌ／ｋｇの範囲内であり、供給流の前のセクションにおける流れ中の塩化物濃度は約４５ｍｍｏｌ／ｋｇである、特徴点１から１０のいずれか一つに記載の方法。

１４．供給流中の塩濃度、Ｃ_ｓ ^Ｆは約８７．１ｍｍｏｌ／ｋｇから約１１４ｍｍｏｌ／ｋｇの範囲内であり、供給流の前のセクションにおける流れ中の塩化物濃度は約１３０ｍｍｏｌ／ｋｇである、特徴点１から１０のいずれか一つに記載の方法。

１５．供給流中の塩濃度、Ｃ_ｓ ^Ｆは約９９ｍｍｏｌ／ｋｇから約１１４ｍｍｏｌ／ｋｇの範囲内であり、供給流の前のセクションにおける流れ中の塩化物濃度は約１３０ｍｍｏｌ／ｋｇである、特徴点１から１０のいずれか一つに記載の方法。

１６．脱着剤がいずれかの有機または無機塩及びそれらの混合物、例えばＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＮＨ_４Ｃｌ、ＣａＣｌ_２、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、クエン酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、酢酸カルシウム、またはそれらの混合物から選択される塩を含む、特徴点１から１５のいずれか一つに記載の方法。

１７．向流精製システムが逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）システムである、特徴点１から５のいずれか一つに記載の方法。

１８．向流精製システムが疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）システムである、特徴点１から５のいずれか一つに記載の方法。

１９．脱着剤が無機塩、例えば硫酸アンモニウムを含む、特徴点１６に記載の方法。

２０．等温線が供給流中の有機調節剤の濃度の制御によって制御される、特徴点１７に記載の方法。

２１．脱着剤が有機溶媒、例えばエタノール、メタノール、プロパノール、及びアセトニトリルから選択される有機溶媒を含む、特徴点１７に記載の方法。

２２．供給流と供給流の前のセクションにおける流れ中の有機調節剤の間の差異は、以下の範囲：

であり、選択性は下式：

によって与えられ、成分Ａ及びＢについてのパラメーターα_ｉ及びβ_ｉは、以下の関数

の半対数プロットにおける滞留体積にフィットされる、特徴点１から５または１７から２１のいずれか一つに記載の方法。

２２．供給流と供給流の前のセクションにおける流れ中の有機調節剤の間の差異、Ｃ_ｍ ^Ｆ−Ｃ_ｍ ^ＩＩが

である、特徴点１から５または１７−２２のいずれか一つに記載の方法。

２３．供給流中の調節剤が約２７．３重量％から約２９．４重量％の範囲で存在し、供給流の前のセクションにおける流れ中のエタノールが約３０．８重量％で存在する、特徴点１から５または１７から２２のいずれか一つに記載の方法。

２４．供給流中の調節剤が約５３．７重量％から約５７．１重量％の範囲で存在し、供給流の前のセクションにおける流れ中のエタノールが約５８．４重量％で存在する、特徴点１から５または１７から２２のいずれか一つに記載の方法。

２３．向流精製システムが吸着クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、またはアフィニティークロマトグラフィーを使用する、特徴点１から５のいずれか一つに記載の方法。

２４．向流精製システムが模擬移動床（ＳＭＢ）精製システムである、特徴点１から２３のいずれか一つに記載の方法。

２５．向流精製システムがマルチカラム向流溶媒勾配精製（ＭＣＳＧＰ）システムである、特徴点１から２３のいずれか一つに記載の方法。

２６．分離が直線吸着等温線の下部で生じる、特徴点１から２５のいずれか一つに記載の方法。

２７．供給流組成が方法を通じて一定に維持される、特徴点１から２６のいずれか一つに記載の方法。

２８．供給流組成が方法の間で変化する、特徴点１から２６のいずれか一つに記載の方法。

２９．供給流中の少なくとも一つの調節剤の濃度の調節による等温線の制御が勾配を有する方法を導く、特徴点１から２８のいずれか一つに記載の方法。

３０．供給流中の少なくとも一つの調節剤の濃度の調節による等温線の制御が、前記興味あるポリペプチドと前記少なくとも一つの更なる成分についての等温線の間に存在する動作点を導く、特徴点１から２９のいずれか一つに記載の方法。

３１．等温線が供給流中の少なくとも一つの調節剤の濃度の調節によって制御され、ここで調節剤は供給流のｐＨである、特徴点１から３０のいずれか一つに記載の方法。

３２．少なくとも一つの更なる成分が前記ポリペプチドの別の形態、例えば前記ポリペプチドのグリコシル化、脱アミド化、または酸化形態である、特徴点１から３０のいずれか一つに記載の方法。

３３．興味あるポリペプチドと前記少なくとも一つのさらな成分の間の関係が少なくとも４：１である、特徴点１から３２のいずれか一つに記載の方法。

３４．興味あるポリペプチドと前記少なくとも一つのさらな成分の間の関係が少なくとも１０：１である、特徴点１から３２のいずれか一つに記載の方法。

３５．興味あるポリペプチドと前記少なくとも一つのさらな成分の間の関係が少なくとも２０：１である、特徴点１から３２のいずれか一つに記載の方法。

３６．興味あるポリペプチドと前記少なくとも一つのさらな成分の間の関係が少なくとも５０：１である、特徴点１から３２のいずれか一つに記載の方法。

３７．興味あるポリペプチドと前記少なくとも一つのさらな成分の間の関係が少なくとも８０：１である、特徴点１から３２のいずれか一つに記載の方法。

［参考文献］

実施例１は、イオン交換クロマトグラフィーを使用する、ＧＬＰ−１アナログ、Liraglutideの精製に関する。実施例２は、逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーを使用する、インスリンアナログ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンの精製に関する。実施例３及び４は、それぞれイオン交換クロマトグラフィー及びＲＰＨＰＬＣクロマトグラフィーにおける調節剤濃度の選択に関する更なる実施例である。

実施例１
ＳＭＢ実験Ｉ−ＩＩＩのための平衡パラメーターを決定するための実験操作
塩勾配での分離をイオン交換クロマトグラフィーによって表した。モデルシステムとして、ＧＬＰ−１アナログLiraglutide（強く結合する成分）と数多くの不純物の分離が選択され、そこではクリティカルな不純物はＧＬＰ−１に非常に類似し、生成物の直前に溶出した。

Ａの測定
等温線の初期傾斜を、定組成パルス実験から測定した。パルス実験の記載は、Pedersen (2003)に見出すことができる。

クロマトグラフィーカラム
使用されたクロマトグラフィー媒体は、GE Healthcare社製のSource 30Qであった。カラムは３．５ｃｍの長さと２．５ｃｍの内径を有した。

溶媒
異なる溶媒強度を有する二つの溶媒を混合した。バッファーは６３重量％のエタノールを含んだ。溶媒を０．２４重量％のＴｒｉｓ（CAS no. 77-86-1）で緩衝し、１ＭのＨＣｌ（CAS no. 7647-01-0）でｐＨをｐＨ＝７．６に調節した。

より弱い脱着剤は０．３７重量％のＮａＣｌ（CAS no. 7647-14-5）を含む一方、より強い溶媒には塩は添加せず、ｐＨを７．６に調節した。

Liraglutideとその不純物は、事前の加工工程から液体形態で存在した。流体混合物を水と１：１で混合し、エタノール濃度を低下した。その後、溶液をＲＰカラムに捕獲させ、上述の塩を含まない溶媒で溶出した。

Ｖ_ＮＲの測定
注入したサンプルの伝導度は、溶出液の伝導度よりわずかに低かった。Aktaシステムの排出口では、伝導度の減少が測定できた。この減少についての滞留体積は、維持されない成分の滞留体積に対応した。維持されない成分由来の滞留体積、Ｖ_ＮＲを１６．５ｍｌと測定した。

別法として、滞留体積は、硝酸塩でのカラムの飽和と少量の水の注入によって測定できる（Pedersen 2003）。

定組成実験
Aktaシステムにおいて勾配ミキサーを使用して、定組成実験のための所望の塩濃度を得た。

定組成実験は、最低の滞留体積を導く最高の塩濃度で開始して実施した。塩濃度は各実験で徐々に減らした。

定組成実験では、カラムを約２カラム体積で平衡化した。その後ＵＶ検出器をリセットし、生成物と不純物とを含む流体混合物を注入した。ピークがカラムから溶出され、安定なベースラインＵＶシグナルに達するまでカラム溶出を続けた。

パルス実験の詳細な記載は、Pedersen (2003)に見出すことができる。

最大の結合能力を測定するためのパラメーターは、このＧＬＰ−１アナログについてHansen & Kidal (2007)で以前に出版されている。等温線の非直線部分の扱いはMollerup (2008)に見出すことができる。

実験の評価
ピーク由来の滞留体積は、全てピークの最大値から得られた。別のアプローチは、ピークの非対称度に依存するガウス関数またはＥＭＧ関数(Jeansonne 1991)のいずれかにピークをフィットすることであろう。

滞留体積は、ピークの第一正常モーメントから測定された。

これらのパルス実験は、生成物のピークと、メインピークの前の生成物のピークに直近で溶出する不純物の混合物で実施された。

データを、上述の二重対数プロットでプロットした、図６。

パルス実験の結果
以下の表１では、弱く結合する不純物（ピークＢ）と生成物Liraglutideピーク（ピークＡ）について測定された滞留体積を与える（ピーク最大値として測定された）

アニオン交換クロマトグラフィーシステムとしてSource 30Qを使用し、実験を通じて使用されるアニオンは塩化物であった(塩と滴定から得られる両者の塩化物が含まれる)。データを二重対数プロットでプロットした、図６参照。

二つのデータのシリーズの直線フィットは、下式を与えた：

二つのピークについて見出されたパラメーターは、表２に記載されている。

二つの成分を分離できるようにするために、液体と固相の間の相対的フロー、ｍを、二つの成分の等温線の初期傾斜の間で設定した。

維持されない成分の滞留体積、Ｖ_ＮＲを１６．５ｍｌと測定し、この体積の約３ｍｌはAkta由来の死空間であった。残りの１３．５ｍｌはカラムの孔から由来した。隙間の孔度を０．３８に設定して、粒子孔度を下式で測定した：

Liraglutideは小分子であり、全ての孔に侵入できると考慮され、それ故Ｋ_Ｄは１と設定された。

動作点の計算
塩濃度についての計算は、以下に記載のＳＭＢ実験ＩＩに対応する。

塩濃度の測定
パルス実験について使用されたカラムよりわずかに短いＳＭＢプラント用の８のカラムを実装し、その長さは特に３．４ｃｍであり、１６．７ｍｌのカラム体積に対応した。

脱着剤Ｉの流れにおける塩濃度は約４４ｍｍｏｌ／ｋｇであり、脱着剤ＩＩの流れにおける塩濃度は約５２ｍｍｏｌ／ｋｇであった。滞留体積は塩濃度の強い関数であるため、二つのパルス実験は正確な塩濃度を決定するために実施された。

二つの溶媒をＳＭＢプラントで使用する前に、パルス実験から滞留体積を測定した。生成したクロマトグラムを図１５でプロットする。ピークをＥＭＧ関数にフィットさせ、二つのピークの第一の正常モーメントはそれぞれ４８．８ｍｌ及び３６．７ｍｌと計算された。脱着剤ＩＩの流れについて、これは下式を与えるように測定された：

これは４５．８ｍｍｏｌ／ｋｇの塩濃度に対応した。

脱着剤Ｉの流れを使用して測定された３６．７ｍｌの滞留体積は、対応して５２．７ｍｍｏｌ／ｋｇであると計算された。

ＳＭＢプラントにおける滞留体積
強く吸着した成分のパラメーターから、脱着剤ＩＩの流れにおける４５．８ｍｍｏｌ／ｋｇの塩化物濃度と共に、ＳＭＢプラントにおける滞留体積は下式であることが観察された：

Ｖ_Ｒ＝４６ｍｌの滞留体積に対応するＡを見出すために、下式において代入がなされた：

これは４．５０のセクションＩＩにおいてより強く結合する成分のＡを導いた。

したがって、より弱く結合する成分の滞留体積は下式となった：

これは３５．５ｍｌのセクションＩＩにおける滞留体積を与え、それは３．０４のＡに対応した。

３５．５ｍｌと４６ｍｌのセクションＩＩにおける滞留体積と共に、低供給フローでの動作点は、これらの二つの転の間の滞留体積に対応するフローであろう。動作点として、２分のシフト時間で１９ｍｌ／分が選択され、これは３８ｍｌの体積測定フローに対応した。

供給流における最適塩濃度の計算
等温線の結合傾斜及び初期傾斜の同じ傾斜を得るために、第一の孔相フローを計算した。これは下式であった：

例えばより弱く結合する成分の同じ傾斜を得るために、供給流における塩濃度は下式で計算された：

それゆえ、供給フローＱ_Ｆ＝０では、下式となった：

より高い供給フローについては、Ａ_ｉ ^ＩＩＩは供給フローとセクションＩＩの混合物から由来する塩濃度に依存するため、計算のために反復方法（例えば連続的置換）を必要とした。

供給流及びセクションＩＩにおける塩濃度を知見して、セクションＩＩＩにおける塩濃度を二つの流れの混合物から計算した。

塩濃度から、二つの成分について生成するＡを計算し、供給流の関数としてプロットした、図１６。更にセクションＩＩＩにおける無次元フローを計算した。

実験における正確な塩濃度はより低く、特に１４．６ｍｍｏｌ／ｋｇであり、結合能力における電荷と比較して動作線のより低い傾斜を導いた、図１７。

ＳＭＢ実験Ｉ
設備
実験室スケールのＳＭＢプラントについて実験を実施した。ＳＭＢプラントにおける実験を、１７．２ｍｌの体積をそれぞれ有する８のカラムを備えたKNAUER SMBシステムCSEP C9116で実施した。ＳＭＢプラントのセットアップは、方法を連続的とするために、平衡化セクションと再生セクションを有した（Abel 2004）

分離を実施する三つのセクションのそれぞれは、図５に示されたような二つのカラムからなった。

溶媒
脱着剤の流れは、塩化物濃度が４４ｍｍｏｌ／ｋｇであることを除き、上述の脱着剤の流れと同一であった。この流れは更に、カラムの平衡化のためにも使用された。

供給流は５．５ｇ／ｌのLiraglutideを含み、より弱く結合する成分の濃度はLiraglutideの濃度の約１％であった。供給流における塩濃度は、上述のように１４ｍｍｏｌ／ｋｇであった。

再生流は１１．７重量％のＮａＣｌと０．３重量％のＨＡｃを含んだ。

動作条件
実験を３分のシフト時間で実施した。再生ゾーン及び平衡化ゾーンにおけるフローは１０ｍｌ／分に設定した。脱着剤フローは２０ｍｌ／分に設定し、ゾーンＩＩのフローは１５ｍｌ／分であり、供給流は１．５ｍｌ／分であった。

結果
不溶解物ポートから採取されたサンプルの分析により、より弱く結合する成分は全ポリペプチド濃度の０．７から８％の範囲内であることが示された。

ＳＭＢ実験ＩＩ
設備
セクションＩとセクションＩＩの間の連結がない第二の実験を実施し、これはこれらの二つのセクションにおいて異なる塩濃度を可能にした、図１８。

実験室スケールのＳＭＢプラントについて実験を実施した。ＳＭＢプラントにおける実験を、１６．７ｍｌの体積をそれぞれ有する８のカラムを備えたKNAUER SMBシステムCSEP C9116で実施した。ＳＭＢプラントのセットアップは、方法を連続的とするために、平衡化セクションと再生セクションを有した（Abel 2004）

分離を実施する三つのセクションのそれぞれは、図１８に示されたような二つのカラムからなった。抽出物の流れと不溶解物の流れの両者は、方法をモニターするためのＵＶ検出器を備えた。

平衡化溶媒の組成は、セクションＩＩにおける溶媒と同一であった。

カラムの再生のための溶媒は、１１．７重量％のＮａＣｌ、０．３重量％のＨＡｃ溶液であった。

脱着剤Ｉ及びＩＩの流れは上述の通りであった。

脱着剤Ｉ及びＩＩの組成は上述の通りであり、「塩濃度の測定」で上記詳細に計算された塩濃度であった。

供給流は４．３ｇ／ｌのLiraglutideを含み、除去される不純物はLiraglutideの濃度の約１％であった。塩濃度は１４．６ｍｍｏｌ／ｋｇであった。

動作条件
実験を２分のシフト時間で実施した。再生、平衡化、及びセクションＩにおけるフローは２０ｍｌ／分に設定した。セクションＩＩにおけるフローは１９ｍｌ／分に設定した。供給フローは１／２ｍｌ／分に設定し、２＋１／２ｍｌ／分までおよそ一時間当たり１／２ｍｌ／分の工程で増大した、図１７。

結果
抽出物の流れから由来するＵＶシグナルを図１９においてプロットした。この図から、供給フローが増大するに連れて、ＵＶシグナルがより高いレベルにどのように増大するかが観察される。不溶解物のポートについてのＵＶシグナルは図２０に与えられている。この図では、ＵＶシグナルが２０−２５ｍＡＵの近傍でプラトーに増大し、その後約１．８分後に再び増大を開始することが観察される。

不溶解物の流れにおける弱く結合する鍵となる成分の濃度は、全ポリペプチドの濃度の０．８から１．３％の範囲内であり、この成分がプラントから効率的に洗浄されないことを示した。

ＳＭＢ実験ＩＩＩ
図５と同様のレイアウトを有するKNAUER SMBシステムCSEP C9116で実験を実施した。プラントは２．６ｃｍの平均長と２．５ｃｍの内径を有する８のカラムを備えた。

カラムの維持されない体積を、Pedersen (2003)によって記載されたようにＫＮＯ_３によって測定し、１０．８ｍｌと測定された。

溶媒
再生流のために使用される溶媒は、上述の再生流について使用される溶媒と同一であり、脱着剤の流れは、塩化物濃度が４５ｍｍｏｌ／ｋｇであることを除き、パルス実験について使用された流れと同一であった。同じ流れを脱着剤と再生について使用した。

供給流を、「ＳＭＢ実験Ｉ−ＩＩＩのための平衡化パラメーターを測定するための実験操作」で上述したようにメインピークから回収し、供給流において塩化物濃度をＮａＣｌの添加により３０ｍｍｏｌ／ｋｇに調節した。Liraglutideの濃度は４．７ｇ／ｌであり、弱く結合する不純物はLiraglutide濃度の約２％の濃度を有した。

動作条件
シフト時間を３分に設定した。再生セクションと平衡化セクションにおけるフローを４ｍｌ／分に設定した。ゾーンＩにおけるフローは１６ｍｌ／分であり、ゾーンＩＩにおけるフローは９．５ｍｌ／分であり、供給フローは０．５ｍｌ／分と２ｍｌ／分を試験した。

塩濃度
下式：

のため、０の供給流フローについての塩濃度は陽関数である。

かくして、セクションＩＩにおける無次元フローは下式となった：

ε＝０．３８及びε_ｐ＝０．７５を使用し、Ｑ_ｐｏｒｅは下式となった：

それ故ｍ^ＩＩは下式となった：

弱く結合する成分の初期傾斜は下式であった：

直線等温泉について弱く結合する不純物を洗浄するための供給濃度における必要とされる塩化物濃度は下式であった：

対応して、より強く結合する成分から計算された塩化物濃度は３６．０ｍｍｏｌ／ｋｇであった。

０ｍｌ／分より高い供給流フローでは、Ａ^ＩＩＩは供給流塩化物濃度の関数であり、反復方法が必要とされた。２ｍｌ／分の供給フローでは、生成した供給流の塩化物濃度は２７．７から３３．１ｍｍｏｌ／ｋｇの間であった。供給流中のこの塩化物濃度に基づいて、３０ｍｍｏｌ／ｋｇに設定された。

セクションＩＩにおける選択性は、下式で計算された：

２ｍｌ／分の供給フローでは、セクションＩＩＩにおける塩化物濃度は下式であった：

この塩化物濃度では、セクションＩＩＩにおける選択性は下式であった：

所定の動作範囲内で、選択性は約２％のみ変化したことが観察される。

塩化物濃度についての合理的な間隔は、下式に対してより早く実施された：

上記表２における定組成パルス実験に対するフィット由来のパラメーターの代入により、下式を与えた：

即ち

セクションＩＩにおける４５ｍｍｏｌ／ｋｇの塩化物では、供給流の間隔は下式であった：

結果
図２２では、実験ＩＩＩから得られた不溶解物ポートについてのＵＶシグナルが示されている。実験ＩＩとＩＩＩから得られた不溶解物ＵＶシグナルの間で大きな差異が観察される。実験ＩＩＩでは、ＵＶシグナルの明白な下降が１．５−２分で観察され、それは実験ＩＩでは観察されない。

両者の実験から得られたサンプルを分析し、弱く結合する不純物の含量を測定した。実験ＩＩでは、供給流における弱く結合する不純物の濃度は、供給流及び不溶解物流の両者において約１％であった。

実験ＩＩＩでは、供給流における弱く結合する不純物の濃度は、全ポリペプチド濃度の約２％であるのに対し、不溶解物流においては、約２５から約５０％の範囲であり（Ｑ^Ｆ＝２＋１／２ｍｌ／分で）、両者の動作点でゾーンＩＩＩにおける弱く結合する不純物の有効な溶出が示された。

それ故、弱く結合する不純物のより有効な溶出は、供給流中の塩濃度の増大によって観察される。

実施例２
ＳＭＢ実験ＩＶ
設備
１７．２ｍｌのカラムを備えたAktaシステムで、平衡化測定を実施した。

実験室スケールのＳＭＢプラントについて実験を実施した。ＳＭＢプラントにおける実験を、１５．７ｍｌの平均体積を有する８のカラムを備えたKNAUER SMBシステムCSEP C9116で実施した。ＳＭＢプラントのセットアップは、方法を連続的とするために、平衡化セクションと再生セクションを有した（Abel 2004）

分離を実施する三つのセクションのそれぞれは、図５に示されたような二つのカラムからなった。抽出物流と不溶解物流の両者は、方法をモニターするためのＵＶ検出器を備えた。

クロマトグラフィーカラム
１５μｍの直径、２００Åの孔径、及びFeF Chemicals A/S社製のＯＤＤＭＳを有する逆相シリカ粒子でカラムを実装した。全てのカラムは２．５ｃｍの直径を有した。

溶媒
Pedersen (2003)によって記載されたように水中に１重量％のＫＮＯ_３を使用して、死空間を測定した。

平衡化溶媒の組成物は脱着剤と同一であり、３０．７５重量％のエタノール、１．５重量％のＫＣｌ、及び０．１８重量％のＴｒｉｓからなり、残部は水であった。ｐＨを１ＭのＨＣｌを使用して８に調節した。

平衡化パラメーターを測定するための溶媒の組成は、上述の溶媒と同じ塩濃度を有するが、それぞれ２５及び３１重量％のエタノールを含んだ。

再生のための溶媒は、ＮａＣｌと２．１重量％のクエン酸とを含む７０重量％のエタノール溶液であった。

供給流は、２９重量％のエタノール、０．１８重量％のＴｒｉｓ、及び約１０ｇ／ｌのインスリン前駆体ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンを含んだ。更に供給流は、０．１５ｇ／ｌより弱く結合する鍵となる成分（またはｄｅｓＢ３０ヒトインスリン濃度の１．５％）を含んだ。この鍵となる成分は、生成物成分に最も近く溶出する成分である。更なる弱く結合する成分も、供給流中に存在した。

パルス実験の結果
以下の表３では、より弱く結合する不純物（ピークＢ）と、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンである生成物（ピークＡ）についての測定された滞留体積（ピーク最大値として測定された）が示されている。全ての測定は、Ｌ＝３．５ｃｍ及びｄ_ｃｏｌ＝２．５ｃｍを有するカラムで実施された。カラムについてのＶ_ＮＡは１１．９ｍｌと測定された。

二つのデータシリーズの直線フィットは下式を与えた：

二つのピークについて見出されたパラメーターは、表４に記載されている。

直線フィットと共に測定されたデータ点が図２３に示されている。

傾斜αは、「逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣまたはＲＰ）＆疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）」の部分の記載で記載されたパラメーターＫ_ｍと同一である。

３０重量％のエタノールで表４における値から計算された選択性は下式となった：

式中へのパラメーターの代入は下式を与えた：

即ち、１．４−３．５重量％である供給流中のエタノール濃度は、セクションＩＩのエタノール濃度より低かった。

動作条件
３分のシフト時間で実験を実施した。再生、平衡化におけるフローは、１０ｍｌ／分に設定した。セクションＩにおけるフローは１８ｍｌ／分であり、セクションＩＩにおけるフローは最初１３ｍｌ／分に設定し、供給フローは２ｍｌ／分であった。

動作の１時間後、セクションＩＩのフローは１２ｍｌ／分に減少し、供給フローは３ｍｌ／分に増大した。

エタノール濃度
カラムの維持されない体積は１１．９ｍｌと測定された。ε＝０．３８に設定し、粒子の孔度は３分のシフト時間、Ｑ_ｐｏｒｅ＝１．９８ｍｌ／分でε_ｐ＝０．６１となった。セクションＩＩにおけるフローは１３ｍｌ／分であり、全体の液体及び無次元フローは下式となった：

３０．７５重量％のエタノールでの二つの成分の初期傾斜を、上記表４に与えられたパラメーターから計算した：

Ｑ^Ｆ＝０ｍｌ／分でのより強く結合する成分について計算された供給エタノール濃度は下式を与えた：

対応してより弱く結合する成分は、Ｃ_Ｆ ^ＥｔＯＨ＝２８．９１重量％を与えた。

Ｑ^Ｆ＝２ｍｌ／分について、Ａ^ＩＩＩは供給流中のエタノール濃度の関数であり、反復方法が必要であった。供給流中のエタノール濃度は、より強く結合する成分とより弱く結合する成分について、それぞれ２８．９７重量％と２８．５６重量％と計算された。

これに基づいて、供給流中のエタノール濃度を２８重量％に設定した。等温線の初期傾斜を示すプロットと、無地減供給フローαの関数としてのｍ^ＩＩＩは図１９に示されている。ＵＶシグナルの傾斜は、上記の計算された供給エタノール濃度から予測されるように、Ａ_Ｂ（α＝０）の初期傾斜、及びより強く結合する成分、α＝０．２２４でのＡ_Ａの初期傾斜とほぼ平行であることが観察される。

結果
抽出物流由来の測定されたＵＶシグナルは図２５に示されている。このデータを各サイクルについて３分のシフト時間で８のカラムについてプロットする。最初ＵＶシグナルは、ＳＭＢプラントのスタートアップのため増大していった。

図２６では、各シフトについての不溶解物流由来のＵＶシグナルをプロットする。最初の０．７分でＵＶシグナルは０であった。この期間では、死空間がカラムから溶出された。その後ＵＶシグナルは増大を開始した。クリアなピークは観察されず、供給流は数多くの弱く結合する不純物を含んだ。

不溶解物流の分析から、この流れが５−２０％の弱く結合する鍵となる成分を含むことが示され、それ故この成分の有効な溶出が示された。

実施例３
以下の実施例は、ＩＥＸ固相を含む向流精製システムにおける他の塩濃度をどのように測定してよいかについての実施例である。
下式

における下式

の測定のため、以下のパラメーターを使用する：

脱着剤流における塩濃度を１３０ｍｍｏｌ／ｋｇに設定する。

１０ｍｌのカラム体積、Ｖ_Ｒ、及び８ｍｌの維持されない体積、Ｖ_ＮＲでは、以下の孔度：ε＝０．３８及びε＝０．６７７が使用できる。強く結合する成分の初期傾斜は下式であろう：

対応して弱く結合する成分については３．８０であろう。

セクションＩＩにおけるフローが９ｍｌ／分であり、カラムを３分毎に移動するのであれば、セクションＩＩにおける無次元フローは下式となるであろう：

０の供給フローでは、供給塩濃度は強く結合する成分について下式となるであろう（ｖ_ｉ＝α_ｉであることに注意）：

対応して弱く結合する成分について下式となるであろう：

無次元供給フローがα＝１／２であるならば、Ａ^ＩＩＩは供給塩濃度の依存するセクションＩＩＩにおける塩濃度の関数であるため、反復方法が必要である。

反復方法を使用して、強く結合する成分についての結果は下式を与える：

この結果は、下式への代入により容易に制御できる：

これは、上記Ｃ_ｓ ^ＩＩＩの計算において代入されたものと同じである。

対応して、弱く結合する成分から計算された供給塩濃度は９７．１ｍｍｏｌ／ｋｇを与え、これはＣ_ｓ ^ＩＩＩ＝１１９．０ｍｍｏｌ／ｋｇを与える。

セクションＩＩにおける選択性は下式である：

セクションＩＩＩにおいて、１１９ｍｍｏｌ／ｋｇでは下式となる：

選択性はほとんど一定であることが観察される：

パラメーターの代入は下式を与える：

または

実施例４
以下の実施例は、ＲＰＨＰＬＣまたはＨＩＣ固相を含む向流精製システムにおける他の調節剤濃度をどのように決定してよいかについての実施例である。

下式

における下式

の測定のため、以下のパラメーターを使用する：

ここで脱着剤流中の調節剤を５８．４重量％に設定する。

対応して弱く結合する成分については３．２３であろう。

０の供給フローでは、供給塩濃度は強く結合する成分について下式となるであろう（Ｋ_ｍ，ｉ＝α_ｉであることに注意）：

対応して弱く結合する成分について下式となるであろう：

この結果は、下式への代入により容易に制御できる：

対応して、弱く結合する成分から計算された供給塩濃度は５５．０ｍｍｏｌ／ｋｇを与え、これはＣ_ｓ ^ＩＩＩ＝５７．３ｍｍｏｌ／ｋｇを与える。

セクションＩＩにおける選択性は下式である：

セクションＩＩＩにおいて、５５．０ｍｍｏｌ／ｋｇでは下式となる：

選択性はほとんど一定であることが観察される：

パラメーターの代入は下式を与える：

または

[参考文献]

Claims

ａ）少なくとも一つの固相と第一の脱着剤流を含む、流体連結中の複数のセクションを含む向流精製システムを準備する工程；
ｂ）前記向流精製システム内に供給流として、向流態様で固相と接触する流体混合物を導入する工程；
ｃ）供給流中の少なくとも一つの調節剤の濃度を調節することにより、等温線の初期傾斜Ａが、Ｑ^Ｆまたはαの関数としてｍ^ＩＩＩ及びＡのプロットを作製した際、動作線の傾斜とほぼ平行となるように等温線を制御する工程；
ｄ）少なくとも一つの更なる成分から興味あるポリペプチドの分離を実施する工程；及び
ｅ）興味あるポリペプチドを回収し、その精製組成物を得る工程
を含む、流体混合物中の少なくとも一つの更なる成分からの興味あるポリペプチドのクロマトグラフィー分離のための方法。
供給流中の少なくとも一つの調節剤の前記濃度が、脱着剤流のような供給流の前のセクションにおける同じ調節剤の濃度とは異なるように制御される、請求項１に記載の方法。
興味あるポリペプチドがグルカゴン様ペプチドまたはＧＬＰ−１アゴニストである、請求項１または２に記載の方法。
向流精製システムがイオン交換クロマトグラフィーシステムである、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
等温線が供給流中の塩濃度、Ｃ_ｓの制御によって制御される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
供給流の前のセクションにおける流れ中の塩濃度に対する供給流中の塩濃度が以下の範囲：

であり、選択性が下式：

によって与えられ、成分Ａ及びＢについてのパラメーターα_ｉ及びβ_ｉが下式：

の二重対数プロットにおける滞留体積にフィットされる、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
供給流中の塩濃度、Ｃ_ｓ ^Ｆが約１７．５ｍｍｏｌ／ｋｇから約３６ｍｍｏｌ／ｋｇの範囲内であり、供給流の前のセクションにおける流れ中の塩化物濃度が約４５ｍｍｏｌ／ｋｇである、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
脱着剤がいずれかの有機または無機塩及びそれらの混合物、例えばＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＮＨ_４Ｃｌ、ＣａＣｌ_２、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、クエン酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、酢酸カルシウム、またはそれらの混合物から選択される塩を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
向流精製システムが逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）システムである、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
向流精製システムが疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）システムである、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
等温線が供給流中の有機調節剤の濃度の制御によって制御される、請求項９に記載の方法。
供給流と供給流の前のセクションにおける流れ中の有機調節剤の間の差異は、以下の範囲：

であり、選択性は下式：

によって与えられ、成分Ａ及びＢについてのパラメーターα_ｉ及びβ_ｉは、以下の関数

の半対数プロットにおける滞留体積にフィットされる、請求項１から３及び９から１１のいずれか一項に記載の方法。
供給流中の調節剤が約２７．３重量％から約２９．４重量％の範囲で存在し、供給流の前のセクションにおける流れ中のエタノールが約３０．８重量％で存在する、請求項１から３及び９から１２のいずれか一項に記載の方法。
向流精製システムが模擬移動床（ＳＭＢ）精製システムである、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
向流精製システムがマルチカラム向流溶媒勾配精製（ＭＣＳＧＰ）システムである、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。