CN107840870A - 一种离心沉淀色谱制备高纯度藻红蛋白的方法 - Google Patents

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顾冬雨
房晨
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李敏晶
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Abstract

本发明公开一种离心沉淀色谱制备高纯度藻红蛋白的方法，其特征在于：采用离心沉淀色谱法从含有藻红蛋白的海藻的粗提物中分离并获取藻红蛋白，具体操作按下列步骤进行：a.向切碎的海藻中加入去离子水，且海藻与去离子水之间的质量体积比为1：2‑40kg/L，采用常规的提取方法进行提取，提取液经过过滤、离心获得上清液；b.上述上清液经过硫酸铵溶液沉淀，离心后得到沉淀；c.采用离心沉淀色谱仪分离上述沉淀，获得高纯度的藻红蛋白。这是一种操作简单、样品回收率高、产品纯度高的藻红蛋白分离制备方法。

Description

一种离心沉淀色谱制备高纯度藻红蛋白的方法
技术领域
本发明涉及一种藻红蛋白的制备方法，特别是一种离心沉淀色谱制备高纯度藻红蛋白的方法。
背景技术
龙须菜是江蓠属海洋红藻，广泛地分布于我国沿海地区，此外，日本、美国、加拿大、南非和委内瑞拉等国家也有分布。在我国，龙须菜原产于山东省和辽宁省，现已成功引种到了福建、广东等地。龙须菜因适应性快、生长率高等特点，已成为我国产量第三养殖大型海藻。研究表明，龙须菜具有抗病毒、抗肿瘤、调节免疫、镇痛抗炎、清除自由基及抗氧化等作用。其化学成分有多糖、蛋白质、多肽、甾醇、氨基酸、脂肪酸、卤化物、糖脂类、核苷类、萜类、酚类等类型的化合物。其中，藻红蛋白在龙须菜中的含量极其丰富。藻红蛋白是一种重要的藻胆蛋白，具有重要的生理功能，因此在医药、食品等领域具有重要的价值。它不但可以作为天然色素添加剂，应用于食品、化妆品领域，安全无副作用，也可以作为荧光剂，用于免疫荧光检测、荧光显微、组织化学。因此，高纯度的藻红蛋白的制备具有非常重要的意义。
现有的藻红蛋白的制备方法主要是利用柱色谱从红藻中分离，色谱填料包括：羟基磷灰石和离子交换树脂等。但都存在收率低、纯度不高等问题。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的上述不足，提出一种操作简单、样品回收率高、产品纯度高的藻红蛋白分离制备方法。
本发明的技术解决方案是：一种离心沉淀色谱制备高纯度藻红蛋白的方法，其特征在于：采用离心沉淀色谱法从含有藻红蛋白的海藻的粗提物中分离并获取藻红蛋白，具体操作按下列步骤进行：
a. 向切碎的海藻中加入去离子水，且海藻与去离子水之间的质量体积比为1：2-40kg/L，采用常规的提取方法进行提取，提取液经过过滤、离心获得上清液；
b.上述上清液经过硫酸铵溶液沉淀，离心后得到沉淀；
c.采用离心沉淀色谱仪分离上述沉淀，获得高纯度的藻红蛋白。
所述的海藻为龙须菜。
所述的步骤a中，常规的提取方法为浸泡、渗漉、超声提取或微波提取，提取温度为0-50℃。
所述的步骤a和b中，离心时的离心力范围是1000-10000g，温度范围是0-20℃。
所述的步骤b中，用于沉淀上清液的硫酸铵溶液的浓度是5%至饱和溶液。
所述的步骤c中，离心沉淀色谱仪的上下通道中先注满硫酸铵溶液，进样后，转数设定为0-2000转/分，然后上通路以0.1-2.0毫升/分的流速泵入硫酸铵溶液，下通路以0.01-2.0毫升/分的流速泵入水，流出液通过紫外可见光检测器进行检测，根据色谱峰进行样品收集。
本发明同现有技术相比，具有如下优点：
本发明所述的方法，其原理是硫酸铵溶液相（上相）和水相（下相）由透析膜分隔开，并在离心力的作用下进行逆流运动，由此在下相水相中形成了由低到高的硫酸铵梯度。注入到下相的蛋白会在一定的硫酸铵浓度下沉淀在柱中，此时降低上相硫酸铵溶液的浓度，下相水相中的整体硫酸铵浓度会降低，已经沉淀的蛋白会溶解。但在其在下相中向前移动，由于浓度梯度，又会遇到浓度较高的硫酸铵，因此再次沉淀。不断降低上相硫酸铵的浓度，下相中的蛋白会重复溶解-沉淀-溶解的过程。最终，不同的化合物根据其在硫酸铵中的溶解度，按照溶解度由大到小的顺序洗脱出来。目前仅有少量用该色谱分离化合物的报道。由于该技术过程中不使用固体填料，因此，避免了样品在固体填料上的不可逆吸附和变性等风险。它利用不同物质在硫酸铵中的溶解度不同，实现物质间的分离，尤其适用于蛋白质的分离。离心沉淀色谱，具有样品处理量大、回收率高、环境友好、重复性好等优点。
具体实施方式
下面将说明本发明的具体实施方式。
一种离心沉淀色谱制备高纯度藻红蛋白的方法，它采用离心沉淀色谱法从含有藻红蛋白的海藻的粗提物中分离并获取藻红蛋白，具体操作按下列步骤进行：
向切碎的海藻中加入去离子水，且海藻与去离子水之间的质量体积比为1：2-40kg/L，采用常规的提取方法进行提取，这里的常规提取方法可以是浸泡、渗漉、超声提取或微波提取方法，提取温度为0-50℃；提取液经过过滤、离心获得上清液；然后将上清液经过硫酸铵溶液沉淀，离心后得到沉淀；上述的离心操作步骤中，离心力的范围是1000-10000g，温度范围是0-20℃；而用于沉淀上清液的硫酸铵溶液的浓度是5%至饱和溶液；采用离心沉淀色谱仪分离上述沉淀，获得高纯度的藻红蛋白，离心沉淀色谱仪的上下通道中先注满硫酸铵溶液，进样后，转数设定为0-2000转/分，然后上通路以0.1-2.0毫升/分的流速泵入硫酸铵溶液，下通路以0.01-2.0毫升/分的流速泵入水，流出液通过紫外可见光检测器进行检测，根据色谱峰进行样品收集；本方法中所述的海藻优选为龙须菜。
实施例1
a 将200克新鲜龙须菜切碎后，加入600毫升去离子水，4 ℃避光浸泡24小时，过滤后，4℃、7000g条件下离心10分钟，获得上清液。
b 上清液用65%硫酸铵溶液沉淀，4 ℃、7000g条件下离心10分钟后得到沉淀。
c 采用离心沉淀色谱分离上述沉淀。离心沉淀色谱仪的上下通道中先注满硫酸铵溶液，进样200毫克后，转数设定为0-2000转/分，然后，上通路以0.5毫升/分的流速泵入饱和硫酸铵溶液，下通路以0.05毫升/分的流速泵入水，流出液通过紫外可见光检测器进行检测，根据色谱峰进行样品收集。冷冻干燥后，获得藻红蛋白10毫克。
实施例2
a 将500克新鲜龙须菜切碎后，加入5升去离子水，室温避光浸泡48小时，过滤后，10℃、7000g条件下离心10分钟，获得上清液。
b 上清液用50%硫酸铵溶液沉淀，10 ℃、7000g条件下离心20分钟后得到沉淀。
c 采用离心沉淀色谱分离上述沉淀。离心沉淀色谱仪的上下通道中先注满硫酸铵溶液，进样500毫克后，转数设定为2000转/分，然后，上通路以0.8毫升/分的流速泵入50%硫酸铵溶液，下通路以0.03毫升/分的流速泵入水，流出液通过紫外可见光检测器进行检测，根据色谱峰进行样品收集。冷冻干燥后，获得藻红蛋白50毫克。
实施例3
a 将1公斤新鲜龙须菜切碎后，加入20升去离子水，4 ℃避光超声提取1小时，过滤后，10 ℃、7000g条件下离心10分钟，获得上清液。
b 上清液用饱和硫酸铵溶液沉淀，4 ℃、7000g条件下离心30分钟后得到沉淀。
c 采用离心沉淀色谱分离上述沉淀。离心沉淀色谱仪的上下通道中先注满硫酸铵溶液，进样300毫克后，转数设定为200转/分，然后，上通路以0.5毫升/分的流速泵入饱和硫酸铵溶液，下通路以0.03毫升/分的流速泵入水，流出液通过紫外可见光检测器进行检测，根据色谱峰进行样品收集。冷冻干燥后，获得藻红蛋白41毫克。
实施例4
a 将500克干燥的龙须菜切碎后，加入20升去离子水，4 ℃避光渗漉提取48小时，过滤后，10 ℃、7000g条件下离心30分钟，获得上清液。
b 上清液用50%硫酸铵溶液沉淀，4 ℃、7000g条件下离心20分钟后得到沉淀。
c 采用离心沉淀色谱分离上述沉淀。离心沉淀色谱仪的上下通道中先注满硫酸铵溶液，进样400毫克后，转数设定为500转/分，然后，上通路以0.5毫升/分的流速泵入饱和硫酸铵溶液，下通路以0.05毫升/分的流速泵入水，流出液通过紫外可见光检测器进行检测，根据色谱峰进行样品收集。冷冻干燥后，获得藻红蛋白55毫克。
本发明适用于含有藻红蛋白的任意提取物，该方法提供了一种从天然资源中快速分离藻红蛋白的方法，具有高效、低成本、环境友好、产品纯度高等特点。

Claims (6)

1.一种离心沉淀色谱制备高纯度藻红蛋白的方法，其特征在于：采用离心沉淀色谱法从含有藻红蛋白的海藻的粗提物中分离并获取藻红蛋白，具体操作按下列步骤进行：
a.向切碎的海藻中加入去离子水，且海藻与去离子水之间的质量体积比为1：2-40kg/L，采用常规的提取方法进行提取，提取液经过过滤、离心获得上清液；
b.上述上清液经过硫酸铵溶液沉淀，离心后得到沉淀；
c.采用离心沉淀色谱仪分离上述沉淀，获得高纯度的藻红蛋白。
2.根据权利要求1所述的离心沉淀色谱制备高纯度藻红蛋白的方法，其特征在于：所述的海藻为龙须菜。
3.根据权利要求1所述的离心沉淀色谱制备高纯度藻红蛋白的方法，其特征在于：所述的步骤a中，常规的提取方法为浸泡、渗漉、超声提取或微波提取，提取温度为0-50℃。
4.根据权利要求1所述的离心沉淀色谱制备高纯度藻红蛋白的方法，其特征在于：所述的步骤a和b中，离心时的离心力范围是1000-10000g，温度范围是0-20℃。
5.根据权利要求1所述的离心沉淀色谱制备高纯度藻红蛋白的方法，其特征在于：所述的步骤b中，用于沉淀上清液的硫酸铵溶液的浓度是5%至饱和溶液。
6.根据权利要求1所述的离心沉淀色谱制备高纯度藻红蛋白的方法，其特征在于：所述的步骤c中，离心沉淀色谱仪的上下通道中先注满硫酸铵溶液，进样后，转数设定为0-2000转/分，然后上通路以0.1-2.0毫升/分的流速泵入硫酸铵溶液，下通路以0.01-2.0毫升/分的流速泵入水，流出液通过紫外可见光检测器进行检测，根据色谱峰进行样品收集。
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