CN101138414A - 一种从龙须菜等含胶海藻中同时提取藻红蛋白和琼胶的方法 - Google Patents

一种从龙须菜等含胶海藻中同时提取藻红蛋白和琼胶的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及海藻生物化工技术领域的一种从龙须菜等含胶海藻中同时提取藻红蛋白和琼胶的方法，具体操作过程为龙须菜藻体经细胞破碎，其水溶性提取物经硫酸铵沉淀即得藻胆蛋白粗提液，该粗提液用Phenyl－Sepharose膨化柱提取即可得到藻红蛋白制品，再用Q－Sepharose离子交换柱对藻红蛋白进行纯化即得到藻红蛋白纯品；然后进一步用提取藻红蛋白后剩余的龙须菜残渣提取琼胶。本发明可同时从龙须菜中得到藻红蛋白和琼胶，且纯化后的藻红蛋白纯度大于2.954，产率为0.097mg/g鲜藻；所得琼胶的产率为2.31％(藻为湿重)，与直接提取琼胶方法的产率相当，因此通过本发明可大大提高了龙须菜的利用率。

Description

一种从龙须菜等含胶海藻中同时提取藻红蛋白和琼胶的方法
技术领域
本发明涉及海藻生物化工技术领域，特别是是一种从龙须菜等含胶海藻中同时提取藻红蛋白和琼胶的方法。
背景技术
龙须菜(Gracilaria Lemaneiformis)是江蓠属的一个重要栽培物种，属红藻门(Rhodophyta)、红藻纲(Rhodophyceae)、真红藻亚纲(Florideae)、杉藻目(Gigartinales)、江蓠科(Gracilariaceae)、江蓠属(Gracilaria)。野生龙须菜在我国主要分布在山东沿海的潮间带。它分枝多，生长快，最适生长温度为15～25℃。目前，龙须菜在我国已经成为继海带、紫菜之后的第三大栽培海藻。但该物种在原产地黄渤海海区不能渡夏和越冬，因而不能有效地积累生物量。为此，实现龙须菜的南移栽培后，该物种可秋冬春三季连续生长。目前龙须菜每亩产量大约为干重1t，价格在8000元左右，因此龙须菜是价格最高的海藻栽培物种之一。龙须菜的重要用途是从中提取琼胶，龙须菜琼胶含量高达20％以上，所产琼胶经改性后是江蓠中质量最好的。从龙须菜中提取的琼胶量已占我国琼胶总产量的80％以上，成为沿海地区海洋经济支柱。琼胶在食品工业、医药工业、日用化工和生物工程等许多方面有广泛的应用。在食品工业和日用化工方面，琼胶主要作为糖果、果冻、羊羹、罐头和灌肠等的胶凝剂和稳定剂，果酱、花生酱、芝麻酱等的增稠剂，冰淇淋、冰糕等冷食品的稳定剂，各种果汁、饮料的分散悬浮剂，酒、酱油和醋等的澄清剂；在医药、农业和生物工程方面，可以用作细菌培养基和微生物载体。除此之外，琼胶本身含有丰富的水溶性事物纤维，具有排毒养颜、降血糖、降血脂等保健功能。据不完全统计，琼胶的全球需求量为大于20000吨/年，国外市场的价格20000美元以上/吨，国内市场160000元人民币/吨。
龙须菜除含有琼胶外，还含有大量其它生物活性物质。传统的提取琼胶的方法在获得琼胶的同时，将这些活性物质全部损失了，而这些活性物质却具有重要作用，特别是龙须菜所含的大量藻胆蛋白。藻胆蛋白除了作荧光探针用于医学诊断、免疫学和细胞学研究中外，还可作为理想的天然色素用于食品、化妆品以及作为药物以提高人体免疫力等。其中藻红蛋白是重要类型的藻胆蛋白，为许多藻类的捕光色素蛋白，在光的激发下，能发出桔红色荧光。藻红蛋白离体的光学活性在肿瘤光动力学治疗(PDT)中作为光敏剂和荧光免疫检测等领域作为荧光探针分子得到广泛应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种同时从龙须菜等含胶海藻中提取藻红蛋白和琼胶的方法，以期合理利用龙须菜资源，提高龙须菜利用率和经济效益。
本发明采取的技术方案是：
一种从龙须菜等含胶海藻中同时提取藻红蛋白和琼胶的方法，其具体步骤如下：
A.提取藻红蛋白
(1).将新鲜龙须菜切碎后，放入淡水中使其细胞溶胀裂解；
(2).在转速为9000～11000rpm、温度为2～5℃条件下离心9～11分钟，收集上清液，得到藻红蛋白粗提液，加入固体硫酸铵使粗提液的终浓度为0.5M；
(3).分别用0.20、0.10、0.05M硫酸铵溶液和蒸馏水以3～5ml/min的速度从Phenyl-Sepharose膨化柱洗脱藻红蛋白，得到藻红蛋白洗脱液；
(4).将洗脱液分别泵入Q-Sepharose离子交换柱，先用50mM、100mM磷酸缓冲液、10mM醋酸钠洗柱，然后再用50mM、100mM磷酸缓冲液洗脱，即得到纯化的藻红蛋白；
B.从粗提液的残渣中提取琼胶
将提取藻红蛋白粗提液后所得的残渣放锥形瓶中加入蒸馏水，控制温度在120～125℃下煮1～3小时，纱布过滤，向滤渣中再加蒸馏水在同样温度条件下煮1～1.5小时，过滤，合并两次滤液并常温下放置16～20小时，冷冻过夜，即得琼胶。
而且，所述的50mM磷酸缓冲液分别含0.15M、0.20M NaCl，100mM磷酸缓冲液含0.20M NaCl，。
而且，所述的磷酸缓冲液的pH＝8.0。
本发明的优点和积极效果是：
本发明可同时从龙须菜中得到藻红蛋白和琼胶，且纯化后的藻红蛋白纯度大于2.954，产率为0.097mg/g鲜藻；所得琼胶的产率为2.31％(藻为湿重)，与直接提取琼胶方法的产率相当，因此通过本发明可大大提高了龙须菜的利用率。
所有含胶海藻都可以按照本发明的方法提取所含的藻胶和相关的蛋白质。
附图说明
图1为龙须菜粗提液在250～400nm的吸收光谱。
图2A为0.2M硫酸铵溶液从Phenyl-Sepharose膨化柱洗提的藻红蛋白在250～700nm的吸收光谱。
图2B为0.1M硫酸铵溶液从Phenyl-Sepharose膨化柱洗提的藻红蛋白在250～700nm的吸收光谱。
图2C为0.05M硫酸铵溶液从Phenyl-Sepharose膨化柱洗提的藻红蛋白在250～700nm的吸收光谱。
图2D为蒸馏水从Phenyl-Sepharose膨化柱洗提的藻红蛋白在250～700nm的吸收光谱。
图3A为0.2M硫酸铵溶液从Phenyl-Sepharose膨化柱洗提的藻红蛋白经离子交换柱纯化后在250～700nm的吸收光谱。
图3B为0.1M硫酸铵溶液从Phenyl-Sepharose膨化柱洗提的藻红蛋白经离子交换柱纯化后在250～700nm的吸收光谱。
图3C为0.05M硫酸铵溶液从Phenyl-Sepharose膨化柱洗提的藻红蛋白经离子交换柱纯化后在250～700nm的吸收光谱。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进一步说明；下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
本实施例仅以典型的含胶海藻——龙须菜为例予以叙述，其他含胶海藻都可以按照此方法提取所含的藻胶和相关的蛋白质，本实施例不再一一叙述。
一、藻红蛋白的提取及纯化方法
(1).称取55g湿重新鲜龙须菜切碎后，加入少量蒸馏水4℃过夜，使其细胞溶胀裂解。
(2).在转速为10000rpm、温度为4℃条件下离心10分钟，收集全部上清液，得到粗提液340ml。
(3).按照公式R-PE＝155.8OD498.5-40.0OD614-10.5OD651，计算得粗提液中含66.630mg藻红蛋白，产率为1.212mg/g。
(4).加入固体硫酸铵使粗提液的终浓度为0.5M，收集所有残渣放入-80℃冰箱中保存以进行琼胶的提取。
(5).Phenyl-Sepharose膨化柱提取
首先用0.5M硫酸铵溶液平衡Phenyl-Sepharose膨化柱。在室温下将粗提液(含0.5.M硫酸铵)以15ml/min的速度从下向上泵入膨化柱，藻胆蛋白被吸附剂捕获。再用0.5M硫酸铵溶液冲洗柱子，将杂质和细胞残片冲洗干净，直至流出液没有颜色。然后分别用0.20、0.10、0.05M硫酸铵溶液和蒸馏水以5ml/min的速度从上向下洗提藻红蛋白。收集全部洗提液，透析后测量其体积、250-700nm吸收光谱。
0.20，0.10，0.05M硫酸铵溶液和蒸馏水从膨化柱洗脱的样品的纯度和含量列在表1中。总蛋白含量为17.685mg，产率为0.322mg/g。
表10.20，0.10，0.05M硫酸铵溶液和蒸馏水从膨化柱洗脱的样品的纯度和含量
  硫酸铵(M)   体积(ml)   OD280   OD498   OD565  纯度(OD565/OD280)   含量(mg)
  0.200.100.050.00   71935724   0.1920.2010.1510.722   0.3410.5540.4280.728   0.4420.7120.5500.831   2.3023.5423.6421.151   3.6417.7483.6692.627
0.20，0.10，0.05M硫酸铵溶液和蒸馏水从膨化柱洗脱的样品的吸收光谱见图1。光谱图显示它在498、535、565nm具有三个吸收峰。
(6).Q-Sepharose离子交换柱纯化
将上步所得的洗提液分别泵入Q-Sepharose离子交换柱，先用50mM、100mM磷酸缓冲液(PH8.0)洗柱，再用10mM醋酸钠洗柱。然后分别用50mM磷酸缓冲液加0.15M Nacl、50mM磷酸缓冲液加0.20M Nacl、100mM磷酸缓冲液加0.20M Nacl溶液洗脱。收集红色洗脱液测量其体积、250-700nm吸收光谱。
不同浓度磷酸缓冲液和氯化钠从离子交换柱洗脱的样品的纯度和含量见表2。磷酸缓冲液(PH8.0)浓度为50、100mM，氯化钠溶液的浓度为0.15、0.2M。总蛋白含量为5.355mg，产率为0.097mg/g。
表2不同浓度磷酸缓冲液和氯化钠从离子交换柱洗脱的样品的纯度和含量
  硫酸铵(M)   磷酸缓冲液(mM)Nacl(M)   体积(ml) OD280 OD498 OD565   纯度(OD565/OD280) 含量(mg)
  0.20M0.10M   100mM PBS浓100mM PBS稀50mM PBS  0.2M NaCl   262321   0.2900.0300.057   0.7300.0900.151   0.9310.1190.199   3.2103.9673.491   2.8540.3110.477
  0.05M   50mM PBS  0.15M NaCl50mM PBS  0.2M NaCl100mM PBS 0.2M NaCl   31238   0.0350.1300.059   0.1040.3100.167   0.1360.3840.217   3.8862.9543.678   0.4851.0720.201
离子交换柱纯化的样品的吸收光谱见图2
二、琼胶的提取
将提取藻红蛋白粗提液后所得的残渣放入锥形瓶中并加入蒸馏水，控制温度在120～125℃下煮2小时，然后8层纱布过滤；
向滤渣中再加蒸馏水在同样温度条件下煮1小时，过滤，合并两次滤液常温下放置18小时，冷冻过夜。
结果：
用新鲜藻体湿重55g提取藻红后剩余残渣得琼胶1.27g，产率2.31％；而用新鲜藻体湿重25g直接提取琼胶得琼胶干重0.57g，产率2.28％。

Claims (3)

1.一种从龙须菜等含胶海藻中同时提取藻红蛋白和琼胶的方法，其特征在于：其具体步骤如下：
A.提取藻红蛋白
(1).将新鲜龙须菜切碎后，放入淡水中使其细胞溶胀裂解；
(2).在转速为9000～11000rpm、温度为2～5℃条件下离心9～11分钟，收集上清液，得到藻红蛋白粗提液，加入固体硫酸铵使粗提液的终浓度为0.5M；
(3).分别用0.20、0.10、0.05M硫酸铵溶液和蒸馏水以3～5ml/min的速度从Phenyl-Sepharose膨化柱洗脱藻红蛋白，得到藻红蛋白洗脱液；
(4).将洗脱液分别泵入Q-Sepharose离子交换柱，先用50mM、100mM磷酸缓冲液、10mM醋酸钠洗柱，然后再用50mM、100mM磷酸缓冲液洗脱，即得到纯化的藻红蛋白；
B.从粗提液的残渣中提取琼胶
将提取藻红蛋白粗提液后所得的残渣放锥形瓶中加入蒸馏水，控制温度在120～125℃下煮1～3小时，纱布过滤，向滤渣中再加蒸馏水在同样温度条件下煮1～1.5小时，过滤，合并两次滤液并常温下放置16～20小时，冷冻过夜，即得琼胶。
2.根据权利要求1所述的一种从龙须菜等含胶海藻中同时提取藻红蛋白和琼胶的方法，其特征在于：所述的50mM磷酸缓冲液分别含0.15M、0.20MNaCl，100mM磷酸缓冲液含0.20M NaCl，。
3.根据权利要求1或2所述的一种从龙须菜等含胶海藻中同时提取藻红蛋白和琼胶的方法，其特征在于：所述的磷酸缓冲液的pH＝8.0。
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