CN104892717A - 一种罗汉果甜苷v的工业级制备液相色谱分离方法 - Google Patents
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Abstract
一种罗汉果甜苷V的工业级制备液相色谱分离方法，包括以下步骤：（1）溶解、过滤：取罗汉果粗制品，以固液比1:10～20加入甲醇进行溶解，过滤，得滤液；（2）离心、超滤：将步骤（1）所得滤液进行离心，然后进行超滤，得超滤液；（3）制备液相色谱分离：将步骤（2）所得超滤液注入动态轴向压缩制备液相色谱系统，然后用洗脱剂进行洗脱，收集目标段洗脱液；（4）浓缩、干燥：将步骤（3）所得目标段洗脱液进行浓缩，然后干燥，得罗汉果甜苷V。本发明方法工艺流程简单，自动化程度高，可控性高，精细化程度高，产品质量的重现性良好，产品质量稳定可靠；按照本发明方法分离的产品罗汉果甜苷V纯度≥95%，收率≥75%。
Description
技术领域
本发明涉及一种罗汉果甜苷V的分离方法，具体涉及一种罗汉果甜苷V的工业级制备液相色谱分离方法。
背景技术
罗汉果，拉丁学名Siratia grosvenorii，别名拉汉果，假苦瓜，原产广西桂林，其中永福县与龙胜县盛产，且品质较高，目前，在湖南、江西、广东等省也有种植。
罗汉果为一种药食同源的植物，即可用于制作饮品，也可入药，其营养丰富，极甘甜。研究表明，罗汉果中主要的甜味物质为罗汉果甜苷类物质，其中最主要的化学成分为罗汉果甜苷V，其甜度为蔗糖甜度的250倍以上，而热量仅为蔗糖的二十分之一。
罗汉果甜苷V是一种天然的甜味剂，其具有低热量、高甜度以及口感好等特点，颇受市场青睐。因罗汉果为我国特有的植物品种，对其开发具有独天得厚的优势。
近年来，国内对从罗汉果中提取罗汉果甜苷V进行了大量研究。
CN101029071A公开了一种从罗汉果中制备高纯度罗汉果甜苷V的方法，该方法是以罗汉果干果为原料，经清洗破碎后，使用乙醇提取，依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，过聚酰胺柱后，然后过硅胶层析、C18反相硅胶层析，经回收、干燥等产品，产品纯度≥95%，得率0.45～0.65%，罗汉果收率约45%。该方法由于经过多次萃取与层析，过程复杂，收率低，成本高，不适合工业生产。
CN104086614A公开一种适用于工业生产的罗汉果提取物的制备方法，该方法是将新鲜罗汉果破碎后，提取、浓缩、离心、超滤、大孔树脂多级吸附与分离，经纳滤、浓缩以及干燥后，可同时生产出四种不同规格的产品，罗汉果苷V总收率＞70%，该方法适合工厂化生产，但获得的产品纯度较低，且后续处理过程相对复杂。
CN101407535公开了一种高纯度罗汉果苷V的制备方法，该方法是以罗汉果甜甙粗品（含罗汉果甜甙V60%）为原料，使用甲醇溶解、过滤后，加入丙酮沉淀，将所获得沉淀进行正相硅胶吸附，最后经结晶与重结晶获得高纯度的罗汉果甜甙V产品，产品纯度≥99%，罗汉果苷V收率约60%，该方法制备的产品纯度高，但过程损耗较大，最终获得产品收率较低。
CN104530168A公开了一种罗汉果苷V的工业化制备方法，该方法是将罗汉果提取过滤后，使用制备液相色谱系统进行分离，经浓缩干燥得产品，产品纯度可达95%以上，该方法过程简单，产品纯度高，但因上柱前未经系统的过滤纯化处理，严重影响制备液相填料的使用效率与寿命，生产成本较高，且目前还停留在试验放大阶段，没有生产放大的实例。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种制备过程简单，便于规模化生产，产品纯度高的罗汉果甜苷V的工业级制备液相色谱分离方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：一种罗汉果甜苷V的工业级制备液相色谱分离方法，包括以下步骤：
（1）溶解、过滤：取罗汉果粗制品，以固液比1:10～20加入甲醇进行溶解，过滤，得滤液；
（2）离心、超滤：将步骤（1）所得滤液进行离心，然后进行超滤，得超滤液；
（3）制备液相色谱分离：将步骤（2）所得超滤液注入动态轴向压缩制备液相色谱系统，然后用洗脱剂进行洗脱，收集目标段洗脱液；
（4）浓缩、干燥：将步骤（3）所得目标段洗脱液进行浓缩，然后干燥，得罗汉果甜苷V。
进一步，步骤（3）中，所述洗脱剂为甲醇与超纯水，洗脱方式为梯度洗脱。
进一步，所述洗脱为两段洗脱：先用甲醇/超纯水体积配比为30/70～80/15的混合溶液进行梯度洗脱20～28min，再用甲醇/超纯水体积配比为92/8～98/2的混合溶液进行梯度洗脱20～30min。
进一步，步骤（3）中，所述动态轴向压缩制备液相色谱系统中的动态轴压缩柱填料为十八烷基反相硅胶，硅胶的粒径为5～20μm（优选8～12μm）；所述洗脱的流速为1300～1500mL/min。所述动态轴向压缩柱的规格优选Ф200×250mm。
进一步，在将步骤（2）所得超滤液注入动态轴压缩柱前先进行预柱处理，所述预柱的填料为十八烷基反相硅胶，硅胶的粒径为10～25μm（优选12～18μm）；所述洗脱的流速为1300～1500mL/min。所述预柱的规格优选Ф200×50mm。
步骤（3）中，在洗脱过程中在线检测洗脱液成分，确定目标段洗脱液的收集时间。
进一步，步骤（1）中，所述罗汉果粗制品中罗汉果甜苷V含量≥25%。所述罗汉果粗制品可通过现有传统的破碎、提取、树脂纯化、浓缩、干燥等工艺获得。
进一步，步骤（1）中，所述过滤的目数为100～300目。过滤的目的是除去明显的不溶物，为下一步骤减压。
进一步，步骤（2）中，所述离心为管式离心，离心速率为10000～15000r/min（优选14000r/min）。离心的目的是去除大颗粒物质和部分大分子物质，为后续工艺减压，提高分离效率。
进一步，步骤（2）中，所述超滤采用二次超滤，超滤膜的截留分子量分别为3～5万道尔顿和4000～6000道尔顿。所述超滤膜为卷式超滤膜，3～5万道尔顿超滤膜可去除滤液中的多糖、蛋白质、果胶等大分子物质，而4000～6000道尔顿超滤膜可去除部分色素等，纯化滤液，提高后续制备液相分离的效果，增加填料的使用寿命，间接减少生产成本。
进一步，步骤（4）中，所述浓缩为真空浓缩，真空浓缩的温度为50～60℃，真空度为-0.08～-0.04Mpa，浓缩至百利度为20～30。
进一步，步骤（4）中，所述干燥为真空干燥，真空干燥的温度为60～70℃，真空度为-0.08～-0.06Mpa，干燥至水分含量≤5%。
本发明具有以下有益效果：
（1）本发明方法工艺流程简单，由于使用了制备液相色谱分离方式，不需要经过多次萃取、层析以及结晶与重结晶等复杂工序便可制备出高纯度罗汉果甜苷V产品，自动化程度高；可控性高，精细化程度高，产品质量的重现性良好，产品质量稳定可靠；
（2）本发明方法在液相色谱分离前使用了离心、超滤等前处理工序，去除了大量的大颗粒物质，蛋白质、糖类、果胶等大分子以及色素物质，进一步纯化了滤液，减少了后续制备液相的处理压力，提高了填料的使用效率和分离效果，延长了填料的使用寿命，间接节约了生产成本；
（3）本发明方法的优选方案，在液相色谱系统中，使用了预柱处理，不仅进一步去除了杂质，防止异物对系统分离的污染，同时也对系统高压起到一定的缓冲作用，很好的保护了动态轴压缩柱中的填料，大大延长了填料更换的周期，降低了生产成本；
（4）按照本发明方法分离制得的产品罗汉果甜苷V纯度≥95%，收率≥75%，相对于传统的萃取与层析工艺，罗汉果甜苷收率提高了近30%。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
本发明实施例所使用的化学试剂，如无特殊说明，均通过常规商业途径获得。
实施例1
（1）溶解、过滤：取150g罗汉果粗制品（罗汉果甜苷V含量为25%），用2500mL的甲醇进行溶解，使用200目不锈钢网过滤，得滤液；
（2）离心、超滤：将步骤（1）所得滤液进行管式离心，离心速率为14000r/min，然后使用卷式超滤膜进行二次超滤，超滤膜的截留分子量分别为3万道尔顿与4000道尔顿，得超滤液2250mL；
（3）制备液相色谱分离：将步骤（2）所得超滤液通过进样泵注入动态轴向压缩制备液相色谱系统，进样量为2250 mL，先进预柱处理，预柱的规格为Ф200×50mm，填料为十八烷基反相硅胶，硅胶的粒径为15μm，再进动态轴压缩柱处理，动态轴压缩柱规格为Ф200×250mm，填料为十八烷基反相硅胶，硅胶的粒径为10μm，以流动相为甲醇与超纯水，流速为1500mL/min进行梯度洗脱，具体如下：
时间段 甲醇/水（V/V）
0～20min 30/70～80/20
21～45min 95/5
通过液相色谱的检测，收集15～26min的目标馏分；
（4）浓缩、干燥：将步骤（3）所得馏分在60℃，真空度-0.08～-0.04Mpa下，真空浓缩至百利度为25为止，然后在70℃，真空度-0.08～-0.06Mpa下，干燥至水分为2.33%，得29.38g罗汉果甜苷V。
经HPLC检测，罗汉果甜苷V的纯度为97.03%，收率为76.02%。
实施例2
（1）溶解、过滤：取150g罗汉果粗制品（罗汉果甜苷V含量为25%），用2300mL的甲醇进行溶解，使用200目不锈钢网过滤，得滤液；
（2）离心、超滤：将步骤（1）所得滤液进行管式离心，离心速率为15000r/min，然后使用卷式超滤膜进行二次超滤，超滤膜的截留分子量分别为5万道尔顿与6000道尔顿，得超滤液2125mL；
（3）制备液相色谱分离：将步骤（2）所得超滤液通过进样泵注入动态轴向压缩制备液相色谱系统，进样量为2125 mL，先进预柱处理，预柱的规格Ф200×50mm，填料为十八烷基反相硅胶，硅胶的粒径为15μm，再进动态轴压缩柱处理，动态轴压缩柱规格为Ф200×250mm，填料为十八烷基反相硅胶，硅胶的粒径为10μm，以流动相为甲醇与超纯水，流速为1300mL/min进行梯度洗脱，具体如下：
时间段 甲醇/水（V/V）
0～25min 30/70～70/30
26～50min 95/5
通过液相色谱的检测，收集15.5～28min的馏分；
（4）浓缩、干燥：将步骤（3）所得馏分在50℃，真空度-0.08～-0.04Mpa下，真空浓缩至百利度为23为止，然后在60℃，真空度-0.08～-0.06Mpa下，干燥至水分为3.12%.，得29.94g罗汉果甜苷V。
经HPLC检测，罗汉果甜苷V的纯度为96.68%，收率为77.19%。
实施例3
（1）溶解、过滤：取150g罗汉果粗制品（罗汉果甜苷V含量为25%），用1850mL的甲醇进行溶解，使用200目不锈钢网过滤，得滤液；
（2）离心、超滤：将步骤（1）所得滤液进行管式离心，离心速率为12000r/min，然后使用卷式超滤膜进行二次超滤，超滤膜的截留分子量分别为4万道尔顿与5000道尔顿，得超滤液1715mL；
（3）制备液相色谱分离：将步骤（2）所得超滤液通过进样泵注入动态轴向压缩制备液相色谱系统，进样量为1715mL，先进预柱处理，预柱的规格为Ф200×50mm，填料为十八烷基反相硅胶，硅胶的粒径为15μm，再进动态轴压缩柱处理，动态轴压缩柱规格为Ф200×250mm，填料为十八烷基反相硅胶，硅胶的粒径为10μm，以流动相为甲醇与超纯水，流速为1400mL/min进行梯度洗脱，具体如下：
时间段 甲醇/水（V/V）
0～23min 30/70～75/25
24～50min 95/5
通过液相色谱的检测，收集16～29.5min的馏分；
（4）浓缩、干燥：将步骤（3）所得馏分在55℃，真空度-0.08～-0.04Mpa下，真空浓缩至百利度约26为止，然后在66℃，真空度-0.08～-0.06Mpa下，干燥至水分为3.98%，得30.41g罗汉果甜苷V。
经HPLC检测，罗汉果甜苷V的纯度为95.37%，收率为77.33%。
实施例4
（1）溶解、过滤：取150g罗汉果粗制品（罗汉果甜苷V含量为25%），用2200mL的甲醇进行溶解，使用200目不锈钢网过滤，得滤液；
（2）离心、超滤：将步骤（1）所得滤液进行管式离心，离心速率为14000r/min，然后使用卷式超滤膜进行二次超滤，超滤膜的截留分子量分别为3万道尔顿与6000道尔顿，得超滤液2020mL；
（3）制备液相色谱分离：将步骤（2）所得超滤液通过进样泵注入动态轴向压缩制备液相色谱系统，进样量为2020 mL，先进预柱处理，预柱的规格为Ф200×50mm，填料为十八烷基反相硅胶，硅胶的粒径为15μm，再进动态轴压缩柱处理，动态轴压缩柱规格为Ф200×250mm，填料为十八烷基反相硅胶，硅胶的粒径为10μm，流动相为甲醇与超纯水，流速为1350mL/min进行梯度洗脱，具体如下：
时间段 甲醇/水（V/V）
0～21min 30/70～85/15
22～50min 95/5
通过液相色谱的检测，收集14.5～25.5min的馏分；
（4）浓缩、干燥：将步骤（3）所得馏分在58℃，真空度-0.08～-0.04Mpa下，真空浓缩至百利度为27为止，然后在66℃，真空度-0.08～-0.06Mpa下，干燥至水分为4.03%，得29.98g罗汉果甜苷V。
经HPLC检测，罗汉果甜苷V的纯度为95.63%，收率为76.45%。
Claims (10)
1.一种罗汉果甜苷V的工业级制备液相色谱分离方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）溶解、过滤：取罗汉果粗制品，以固液比1:10～20加入甲醇进行溶解，过滤，得滤液；
（2）离心、超滤：将步骤（1）所得滤液进行离心，然后进行超滤，得超滤液；
（3）制备液相色谱分离：将步骤（2）所得超滤液注入动态轴向压缩制备液相色谱系统，然后用洗脱剂进行洗脱，收集目标段洗脱液；
（4）浓缩、干燥：将步骤（3）所得目标段洗脱液进行浓缩，然后干燥，得罗汉果甜苷V。
2.根据权利要求1所述罗汉果甜苷V的工业级制备液相色谱分离方法，其特征在于：步骤（3）中，所述洗脱剂为甲醇与超纯水，洗脱方式为梯度洗脱。
3.根据权利要求2所述罗汉果甜苷V的工业级制备液相色谱分离方法，其特征在于：所述洗脱为两段洗脱：先用甲醇/超纯水体积配比为30/70～80/15的混合溶液进行梯度洗脱20～28min，再用甲醇/超纯水体积配比为92/8～98/2的混合溶液进行梯度洗脱20～30min。
4.根据权利要求1～3之一所述罗汉果甜苷V的工业级制备液相色谱分离方法，其特征在于：步骤（3）中，所述动态轴向压缩制备液相色谱系统中的动态轴压缩柱填料为十八烷基反相硅胶，硅胶的粒径为5～20μm；所述洗脱的流速为1300～1500mL/min。
5.根据权利要求4所述罗汉果甜苷V的工业级制备液相色谱分离方法，其特征在于：在将步骤（2）所得超滤液注入动态轴压缩柱前先进行预柱处理，所述预柱的填料为十八烷基反相硅胶，硅胶的粒径为10～25μm；所述洗脱的流速为1300～1500mL/min。
6.根据权利要求1～5之一所述罗汉果甜苷V的工业级制备液相色谱分离方法，其特征在于：步骤（1）中，所述罗汉果粗制品中罗汉果甜苷V含量≥25%。
7.根据权利要求1～6之一所述罗汉果甜苷V的工业级制备液相色谱分离方法，其特征在于：步骤（1）中，所述过滤的目数为100～300目。
8.根据权利要求1～7之一所述罗汉果甜苷V的工业级制备液相色谱分离方法，其特征在于：步骤（2）中，所述离心为管式离心，离心速率为10000～15000r/min。
9.根据权利要求1～8之一所述罗汉果甜苷V的工业级制备液相色谱分离方法，其特征在于：步骤（2）中，所述超滤采用二次超滤，超滤膜的截留分子量分别为3～5万道尔顿和4000～6000道尔顿。
10.根据权利要求1～9之一所述罗汉果甜苷V的工业级制备液相色谱分离方法，其特征在于：步骤（4）中，所述浓缩为真空浓缩，真空浓缩的温度为50～60℃，真空度为-0.08～-0.04Mpa，浓缩至百利度为20～30；所述干燥为真空干燥，真空干燥的温度为60～70℃，真空度为-0.08～-0.06Mpa，干燥至水分含量≤5%。
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