CN103772497B - 蜂王浆中得到王浆主蛋白和活性滤后液的超滤膜分离方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了蜂王浆中得到王浆主蛋白和活性滤后液的超滤膜分离方法。称取蜂王浆，与水在4℃下搅拌混匀，用NaOH调节pH，用NaCl调节离子强度，再用0.2μm的微孔滤膜去除微粒；采用截留分子量为100kDa的超滤膜M1分离去除大分子杂质，再用截留分子量为49kDa的超滤膜M2分离和浓缩M1透过液中的王浆主蛋白，当浓缩至1/3体积时，补充纯水，让小分子溶液透过M2，得到的截流液为纯化和浓缩的王浆主蛋白溶液，经冷冻干燥成为王浆主蛋白冻干粉。小分子溶液含有多糖和10-羟基-2-癸烯酸(10-HDA)，可用于功能饮料生产。本发明首次用超滤装置对王浆主蛋白（MRJPs）进行分离浓缩，MRJPs的提取率达到82.63%，经冷冻干燥成为蛋白含量大于70%的冻干粉；滤后液用于制备饮料，实现王浆的综合利用。

Description

蜂王浆中得到王浆主蛋白和活性滤后液的超滤膜分离方法

技术领域

本发明涉及超滤和免疫学领域，特别地，本发明涉及一种蜂王浆中分离得到王浆主蛋白和活性滤后液的方法。

背景技术

蜂王浆（RoyalJelly）是由6～12日龄工蜂头部的王浆腺(舌腺和鄂腺)分泌，用于喂养饲喂蜂王及幼虫的特殊乳浆状物质，又名蜂乳、皇浆。蜂王浆含有丰富的蛋白质，其中主要水溶性蛋白，即王浆主蛋白(MajorRoyalJellyProteins，MRJPs)占蜂王浆中总蛋白质的46%～89%。MRJPs包括MRJP1～9九种蛋白，分子量为49～87kDa，其中含量最为丰富的是MRJP1，占50%左右。MRJPs有促进细胞生长、抗肿瘤、抗菌等生理功能与营养功效。2011年4月24日，日本富山县立大学镰仓昌树博士在《Nature》首次报道，蜂王浆中的一种57-kDa蛋白（也称Royalactin，即王浆主蛋白MRJP1单体）是使蜜蜂幼虫发育成蜂王的关键活性成分。近年来，MRJPs已成为国内外科学家研究的热点。此外，王浆含游离脂肪酸达26种以上，以10-羟基-2-癸烯酸(10-HDA)最为重要，也是王浆特有的成分，具有抗菌、抗病毒、抑制癌细胞生长等多种功效，是国际上长期以来评价王浆质量的重要指标。

之前已有用离子交换层析、疏水层析、尺寸排阻层析以及离心、透析分离纯化蜂王浆活性蛋白的方法报道。如国内蓝瑞阳等采用碱提酸沉法和盐提酸沉法进行了蜂王浆蛋白质提取，从结果看存在产物纯度低，对蛋白活性影响大，溶剂污染，副产物10-HAD无法利用等问题（蓝瑞阳等，2008，蜜蜂杂志，(3):18-20）。日本学者Salazar-Olivo等用生理盐水（PBS）低温溶解王浆24h，低温离心（4℃，12000g，30min）方法，从王浆分离出具有促进细胞生长的活性蛋白(Salazar-Olivo等,ToxicologyinVitro,2005,19:645-651)。但以往报道的方法普遍存在效率较低，只适合实验室应用，难以实现规模化和产业化。此外，我国和日本已利用蜂王浆开发生产功能饮料，但都采用了有机溶剂脱蛋白工艺，造成王浆蛋白资源浪费和环境污染[（刘进等，食品研究与开发，2003,24（6）53-55]。

超滤膜分离技术是一种借助外界能量或化学位的推动，以选择性透过膜为分离介质，对两组分或多组分气体或液体进行分离、分级和富集的膜分离方法。超滤膜孔径为2～20nm,可分离相对分子质量为数千至数百万的物质如:蛋白质、胶体、病毒、热源、酶、多糖等。与传统分离方法(蒸发、萃取或离子交换等)相比，超滤膜分离是在常温下操作，没有相变，最适宜对热敏性物质和生物活性物质的分离与浓缩；具有高效、节能、工艺过程简单、投资少、污染小等优点，在化工、轻工、电子、医药、纺织、生物工程、环境治理、冶金等方面具有广泛的应用前景。

由于蛋白质的尺寸范围约为5-10nm,分子量可高达几十万以上,属大分子物质,故可应用主要截留高分子溶质或固体颗粒的超滤膜将蛋白质溶液进行浓缩纯化。膜的孔径大小决定能透过膜分子的大小,分子量在某一界限(膜截留分子量)以上的分子会被截留,而分子量小的分子与水溶剂一起透过膜,从而将大于某一相对分子量和小于某一分子量的蛋白质分开,这只达到了分级的目的,因此要提纯一种蛋白质,可以选用微孔孔径不同的两种膜,一种膜孔较小,能使需要的蛋白质全部截住,而让小的蛋白质透出,然后将截住在膜内的蛋白质转移到孔径较大的膜内,截住较大的蛋白质使所需的蛋白质流过微孔透出,这样使蛋白质得到了提纯。目前，超滤膜应用于蛋白纯化已很多有文献报道，并已应用于生产。如Ting等用MWCO为1×104和3×104的PES膜将蛋白浓缩了6.25和5.92倍（Tingetal.IntJFoodSciTechnol,2010，45(8):1633-1640）。Wang等将超滤膜应用于大蒜中超氧化物歧化酶SOD的提取分离，通过采用MWCO为1×105的RC膜、5×104的PES膜两步超滤分离，以及工艺条件pH、离子强度、流速和搅拌速度的优化，得到纯度为98%、得率为90%、比活力为3011U/mg的SOD（Wangetal.MembrSci，2010，352(1/2):231-238）。超滤技术的优势在于操作步骤简单、条件温和、无需添加化学试剂。蜂王浆通常含有粗蛋白11%～14.5%、糖20%～30%，王浆蛋白的分子量为49～87kDa，糖的分子量为120～180。对于蜂王浆利用超滤膜分离技术因为需要涉及到多因素影响，优化条件难于取得，与层析、离心、透析分离纯化等技术相比没有优势，所以目前尚无公开的报道（文献一般仅公开成功的案例）。另外，在实验室条件下纯化某种蛋白易，考虑到规模生产综合利用难。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种蜂王浆中分离得到王浆主蛋白和活性滤后液的方法。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的。

蜂王浆中得到王浆主蛋白和活性滤后液的超滤膜分离方法，包括以下步骤：

1）称取蜂王浆，与水在4℃下搅拌混匀，用NaOH调节pH，用NaCl调节离子强度，再用0.2μm的微孔滤膜去除微粒；

2）采用截留分子量为100kDa的超滤膜M1分离去除大分子杂质，再用截留分子量为49kDa的超滤膜M2分离和浓缩M1透过液中的王浆主蛋白，当浓缩至1/3体积时，补充纯水，让小分子溶液透过M2，得到的截流液为纯化和浓缩的王浆主蛋白溶液。

步骤2）中所述的王浆主蛋白溶液经冷冻干燥成为王浆主蛋白冻干粉。

步骤1）中，水与蜂王浆的质量比例为5：1；pH7，离子强度0.5mol/L。

步骤2）中所述的小分子溶液含有多糖和10-羟基-2-癸烯酸(10-HDA)，可用于功能饮料生产。

本发明的有益效果是：

1)本发明首次用超滤装置对王浆主蛋白（MRJPs）进行分离浓缩，得到高收率MRJPs产物。MRJPs的提取率达到82.63%，经冷冻干燥成为蛋白含量大于70%的冻干粉；可用于功能食品和生物制品；现行的提取工艺包括离子交换层析、疏水层析、尺寸排阻层析以及透析方法，这些试验效率很低，蛋白质损失大，不适合大批量生产，难以实现产业化。

2）建立了高效分离王浆中MRJPs的优化超滤分离浓缩工艺。

3）用浓缩MRJPs后的滤后液用于制备饮料，实现王浆的综合利用。透过超滤膜的含有糖、10-羟基-2-癸烯酸(10-HDA)的小分子产物经浓缩，回收率分别为3.5%和2.11%，可用于功能性饮料生产。

附图说明

下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明范围。

图1是是本发明的超滤装置示意图:1.料液槽，2.循环泵，3.膜组件，4.调压阀；

图2是本发明的方法流程；

图3是超滤分离产物MRJPs蛋白冻干粉实物；

图4是BSA标准曲线图：以BSA为样品，经梯度稀释，采用Bradford法，通过紫外分光光度仪测定595nm处的吸光度。以为吸光值OD₅₉₅为纵坐标，BSA标准溶液浓度为横坐标，绘制成的标准曲线，得到回归方程：y=0.1878x+0.2264，R²=0.9997；

图5是水料比对MRJPs提取率的影响结果示意图；图中，在水料比从3:1～5:1变化过程中，MRJPs提取率逐渐提高，当水料比为5:1时MRJPs提取率达到最高；水料比6:1时提取率开始下降；

图6是对pH值对MRJPs提取率影响的结果示意图；图中，当pH值为7时，MRJPs提取率最高；MRJPs提取率在pH值5到6时迅速提高，在pH值7时达到最大值；随后MRJPs提取率逐渐回落；

图7是离子强度对MRJPs提取率影响的结果示意图；图中，当离子强度为0.5时，MRJPs提取率最高。变化过程中，MRJPs提取率在离子强度0.3到0.5时趋于提高，在离子强度0.5时达到最大值，随后MRJPs提取率逐渐回落；

图8是MRJPsSDS-PAGE分析结果示意图；在最优超滤条件下，即水料比5:1mL/g，pH为7，离子（NaCl）强度0.5mol/L获得的MRJPsSDS-PAGE分析图，泳道1为标准蛋白；泳道2为鲜王浆；泳道3为最优超滤条件下获得的MRJPs；

图9是MRJP1纯化样品标准曲线图；以MRJP1纯化样品为标准抗原，经过梯度稀释，采用Elisa法通过酶标仪器测定的450nm处测吸光值。以吸光值OD₄₅₀为纵坐标，MRJP1标准溶液为横坐标，绘制成的标准曲线：y=0.036x+0.264，R²=0.993。

具体实施方式

首先考察pH值、离子强度和水料比对MRJPs提取率的影响，利用Bradford法测定所得样品的可溶性蛋白MRJPs含量，用凯氏定氮法测定样品的总蛋白含量。然后通过正交试验得到MRJPs的最优分离浓缩工艺，并在最优条件下获得MRJPs样品。以特异性MRJP1多克隆抗体为一抗，通过酶标仪采用Elisa法检测不同浓度MRJP1蛋白样品的吸光度，建立吸光度与MRJP1蛋白浓度的标准曲线。以最优条件下得到的MRJPs样品为抗原，检测样品吸光度，代入所建标准曲线，计算得到样品中的MRJP1的含量。

1、用超滤装置从鲜王浆分离浓缩MRJPs的步骤、方法如下：

称取50鲜王浆，按一定的水料比例混合，4℃下充分搅拌20min，用NaOH调节pH、用NaCl调节离子强度，用0.2μm微孔滤膜去除微粒。然后用截留分子量100kDa的超滤膜M1分离去除大分子杂质，再用截留分子量为49kDa的超滤膜M2度分离和浓缩M1透过液中的MRJPs，当浓缩至初体积的1/3后，向料液罐不断补充纯水，让小分子杂质全部透过超滤膜M2，得到的截流液为纯化和浓缩MRJPs溶液。

取含MRJPs的滤后液先进行旋转蒸发，浓缩液倒在托盘中，厚度为8～10mm，再将盘置真空冷冻干机，开动真空冷冻干燥机，将真空干燥室的温度降至-40℃，使蜂王浆快速冻结，然后将真空度控制在10mmHg左右，使蜂王浆料温保持在-25℃上下，冷凝器的温度控制在-50℃上下，然后在真空（1.3～13帕）下使其中的水分不经液态直接升华成气态，最终使MRJPs脱水成为冻干粉。

2、MRJPs提取率测定，步骤如下：

（1）可溶性蛋白MRJPs含量测定，步骤如下：

①取10μL全溶解蛋白标准品（5mg/mLBSA）稀释至100μL，使终浓度为0.5mg/mL。将样品和标准品分别用PBS依次按相同溶液稀释。

②按0、1、2、4、8、12、20μL/孔的加量，将稀释后BSA标准品分别加到96孔板中，加PBS补足至20μL/孔；

③将适量体积的待测样品加到96孔板中，加PBS稀释至20μL/孔；

④每孔加入200μLBradford染色液，轻轻用移液器吹打均匀，室温静置3～5min；

⑤用酶标仪测定吸光度OD595nm，以为吸光度OD₅₉₅为纵坐标，BSA标准溶液浓度为横坐标，绘制成的标准曲线（如图4所示）：y=0.1878x+0.2264，R²=0.9997。测定待测样品吸光度，代入标准曲线，计算出样品中的蛋白溶度。

（2）总蛋白含量测定，步骤如下：

称取0.2～2.0g固体样品或2～5g半固体样品或吸取10-20mL液体样品（约相当氮30-40mg），移入干燥的100mL或500mL消化管中，加入0.2g硫酸铜，6g硫酸钾及20mL硫酸，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，置于硝化炉中硝化，至液体呈蓝绿色澄清透明后继续加热0.5h。取下放冷，小心加20mL水，放冷后，移入100mL容量瓶中，摇匀。取出10mL溶液，置于福斯2300自动定氮仪，并加入20mL40%NaOH溶液，用10mL2%硼酸溶液作为接受液，蒸馏定氮。测定结果采用下式计算：X=[（V₁-V₂）×N×0.014)/(m×（10/100）)]×F×100%（其中：X：样品中蛋白质的百分含量，g；V1：样品消耗硫酸或盐酸标准液的体积，mL；V₂：试剂空白消耗硫酸或盐酸标准溶液的体积，mL；N：硫酸或盐酸标准溶液的当量浓度；0.014：1N硫酸或盐酸标准溶液1mL相当于氮克数；m：样品的质量（体积），g（mL）；F：氮换算为蛋白质的系数。）

（3）MRJPs提取率计算

根据所测定MRJPs及总蛋白含量计算MRJPs提取率，MRJPs提取率%=可溶性蛋白MRJPs含量/总蛋白含量х100%

3、单因素试验

考察pH值、水料比和离子强度对MRJPs提取率的影响，方法步骤如下：

（1）称取50g鲜王浆，在pH值为7、离子强度0.5的条件下溶解，通过超滤膜装置分离浓缩MRJPs，然后采用Bradford法测定样品中MRJPs的吸光度，根据公式[MRJPs提取率（%）=MRJPs质量/蜂王浆总蛋白质量×100]得出MRJPs提取率，考察水料比对MRJPs提取率的影响。

（2）称取50g鲜王浆，在离子强度0.5、水料比（v/m）6:1条件下溶解，通过超滤膜浓缩MRJPs；然后用Bradford法测定样品中MRJPs的吸光度，根据公式MRJPs提取率（%）=MRJPs质量/蜂王浆总蛋白质量×100，得出MRJPs提取率。

（3）称取50g鲜王浆，在水料比（mL/g）6:1、pH值7条件下溶解，通过超滤膜分离浓缩MRJPs；用Bradford法测定样品的MRJPs吸光度，根据公式[MRJPs提取率（%）=MRJPs质量/蜂王浆总蛋白质量×100]得出MRJPs提取率。

4、正交试验

根据MRJPs提取率，选择最优参数。根据统计分析结果，最佳提取条件：在水料比5:1（mL/g）的条件下，用0.5mol/L的NaCl溶液溶解蜂王浆，调节pH值至7。根据最佳工艺条件进行MRJPs提取验证，测得MRJPs提取率为82.63%，MRJPs提取率高于正交试验其它组合。

5、MRJPs提取物的SDS-PAGE检测，分别将鲜王浆和超滤获得的MRJPs产物进行SDS-PAGE检测，比较MRJPs与鲜王浆蛋白条带差异。

6、MRJP1的Elisa检测，分别将鲜王浆和超滤获得的MRJPs浓缩样品的吸光度代入MRJP1蛋白标准曲线中，计算出两者的MRJP1含量，计算得到标准曲线，得到回归方程（如图8所示）：y=0.036x+0.264，R²=0.993。

7、鲜王浆及滤后液中10-HDA含量测定：所得产物及鲜王浆参照GB9697-2008中10-HDA的HPLC测定方法测定10-HDA含量。10-HDA回收利用率按照下式进行计算：10-HDA回收利用率（%）=滤后液10-HAD质量/新鲜王浆中10-HDA质量×100%。

8、鲜王浆及滤后液中总糖含量测定：分别取鲜王浆及最优条件下所得滤后液冻干物，参照GB/T9695.3-2008中总糖的测定方法测定总糖含量。按照下式进行计算：总糖回收利用率（%）=滤后液中总糖质量/新鲜王浆中总糖质量×100%。

实施例1鲜王浆中MRJPs超滤分离浓缩

1、用超滤膜从鲜王浆中分离浓缩MRJPs工艺

原理：由于蜂皇浆中通常含有11%～14.5%王浆粗蛋白、20%～30%糖，王浆主蛋白的分子量为49～87kDa，糖的分子量为150～200，可以预计，用截留分子量49kDa的超滤膜可高效截留王浆主蛋白，并可有效地将其与糖等低分子量组份分开，达到提纯、浓缩目的。

操作流程：采用图1所示超滤装置（料液槽1、循环泵2、膜组件3、调压阀4顺次相连），按图2方法流程，操作。称取50g鲜王浆，按一定的料水比例混合，4℃下充分搅拌20min，用NaOH调节pH、用NaCl调节离子强度，用0.2μm微孔滤膜去除微粒。然后用截留分子量100kDa的内压式聚砜中空纤维超滤膜组件M1分离去除大分子杂质，再用截留分子量为49kDa的透过膜组件M2度分离和浓缩M1透过液中的MRJPs，当浓缩至初体积的1/3后，向料液罐不断补充纯水，让小分子杂质全部透过膜M2，得到的截流液为纯化和浓缩MRJPs溶液。

取含MRJPs的滤后液先进行旋转蒸发，浓缩液倒在托盘中，厚度为8～10mm，再将盘置真空冷冻干机，开动真空冷冻干燥机，将真空干燥室的温度降至-40℃，使蜂王浆快速冻结，然后将真空度控制在10mmHg左右，使蜂王浆料温保持在-25℃上下，冷凝器的温度控制在-50℃上下，然后在真空（1.3～13帕）下使其中的水分不经液态直接升华成气态。真空低温干燥持续进行12小时左右后，至MRJPs的水分已降至10%左右，继续干燥。此时提高干燥室的温度至30℃，最高不超过40℃，持续4～5小时，让水分快速蒸发，使MRJPs水分含量降低到2%左右，即完成干燥过程得到冻干粉（图3）。

2、MRJPs提取率测定

（1）可溶性蛋白MRJPs含量测定，具体步骤如下：

①取10μL蛋白标准品（5mg/mLBSA）稀释至100μL，使终浓度为0.5mg/mL。将待测样品和标准品用PBS分别依次按相同溶液稀释。

②将稀释后的标准品（0.5mg/mLBSA）按0、1、2、4、8、12、20μL/孔加量分别加到96孔板中，加PBS将所有标准品补足至20μL；

③将适量体积实验蛋白样品加到96孔板的样品空中，加稀释液至20μL；

④每孔加入200μLBradford染色液，轻轻用加样枪吹打均匀，室温静止3～5min；

⑤酶标仪测定A_595nm（595nm是蛋白质最大吸收光谱）的吸光度，建立标准曲线，得到吸光度与蛋白浓度的回归方程。测定待测样品的吸光度，代入回归方程（如图4所示）：y=0.1878x+0.2264，R²=0.9997（其中y表示OD₅₉₅值，x表示MRJPs含量）计算出样品的蛋白含量。

（2）总蛋白含量测定，具体步骤如下：

称取0.2-2.0g固体样品或2-5g半固体样品或吸取10-20mL液体样品（约相当氮30-40mg），移入干燥的100mL或500mL消化管中，加入硫酸铜0.2g，硫酸钾6g及硫酸20mL，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，置于硝化炉中硝化，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5h。取下放冷，小心加20mL水，放冷后，移入100mL容量瓶中，摇匀。取出10mL溶液，置于福斯2300自动定氮仪，并加入20mL40%NaOH溶液，用10mL2%硼酸溶液作为接受液，蒸馏定氮。测定结果采用下式计算：X=[（V₁-V₂）×N×0.014)/(m×（10/100）)]×F×100%（其中：X：样品中蛋白质的百分含量，g；V₁：样品消耗硫酸或盐酸标准液的体积，mL；V₂：试剂空白消耗硫酸或盐酸标准溶液的体积，mL；N：硫酸或盐酸标准溶液的当量浓度；0.014：1N硫酸或盐酸标准溶液1mL相当于氮克数；m：样品的质量（体积），g（mL）；F：氮换算为蛋白质的系数。）

3、MRJPs超滤分离浓缩工艺条件优化

（1）单因素试验

首先进行单因素分析，考察水料比例（因素1）、pH（因素2）、离子强度（因素3）对MRJPs提取率的影响。

操作过程如下：称取适量蜂王浆，按一定的水料比例混合（因素1），4℃下充分搅拌30min，用NaOH调节pH（因素2）、用NaCl调节离子强度（因素3），进行超滤、浓缩，测定MRJPs含量，冷冻干燥，称量MRJPs得到提取率。

②水料比对MRJPs提取率的影响：称取50g鲜王浆，与不同比例的水溶液（pH值为7、离子强度0.5）混合，溶解，通过超滤膜分离、浓缩MRJPs。然后用Bradford法测定样品中MRJPs的含量，根据公式：MRJPs提取率（%）=MRJPs适当质量/蜂王浆总蛋白质量×100，得出MRJPs提取率，比较不同水料比对MRJPs提取率的影响。结果（图5）显示，在水料比从3：1～5:1变化过程中，MRJPs提取率逐渐提高，当水料比为5：1（5mL水:1g王浆）时MRJPs提取率达到最高；水料比6：1（6mL/g）时提取率开始下降（图5）。

②pH值对MRJPs提取率的影响：称取50g鲜王浆，在离子强度0.5、水料比（mL/g）为6:1的条件下溶解，调节pH值，通过超滤膜分离、浓缩MRJPs；然后用Bradford法测定样品中MRJPs的含量，根据公式：MRJPs提取率（%）=MRJPs质量/蜂王浆总蛋白质量×100，得出MRJPs提取率，比较不同pH值对MRJPs提取率的影响。结果(图5)显示，当pH值为7时，MRJPs提取率最高；MRJPs提取率在pH值5到6时迅速提高，在pH值7时达到最大值；随后MRJPs提取率逐渐回落（图6）。

③考察离子强度对MRJPs提取率的影响：称取50g鲜王浆，在水料比（mL/g）为6:1、pH值7的条件下，调节离子强度，通过超滤膜仪器浓缩MRJPs；然后用Bradford法测定样品中MRJPs的含量，根据公式MRJPs：提取率（%）=MRJPs质量/蜂王浆总蛋白质量×100，得出MRJPs提取率，比较不同离子强度对MRJPs提取率的影响。结果(图7)显示，当离子强度为0.5时，MRJPs提取率最高。变化过程中，MRJPs提取率在离子强度0.3到0.5时趋于提高，在离子强度0.5时达到最大值，随后MRJPs提取率逐渐回落（图8）。

（2）正交试验

根据上述料水比例、pH值、离子浓度三个单因素对MRJPs提取率的影响，每个因素选定三个水平，进行3因素（水料比、pH值、离子浓度）组合正交试验分析。正交试验因素水平见表（表1）。正交结果（表2）及极差分析结果(表3)表明，影响MRJPs提取率影响因素依次是pH（B）>离子强度（C）>水料比（A），影响效果达到显著水平(p<0.05)。最佳提取条件是A₃B₂C₂，即在水料比5:1的条件下，用0.5mol/L的NaCl溶液溶解蜂王浆，调节pH值至7。根据最佳工艺条件进行MRJPs提取验证，测得MRJPs提取率为82.63%，MRJPs提取率高于正交试验其它组合。

表1正交试验因素水平

表2正交试验结果与分析

表3正交试验结果的方差分析

实施例2超滤分离MRJPs产物的检测

1、超滤分离MRJPs产物SDS-PAGE检测

取鲜王浆和最优条件下超滤分离得到MRJPs产物作SDS-PAGE电泳检测。电泳浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度为12%，电泳缓冲系统为Tris-甘氨酸缓冲液，蛋白样品上样量为20μL/孔。

①制分离胶：12%分离胶（5mL）:1.6mLddH20，2.0mL30%丙烯酰胺，1.3mL1.5mol/LTris-HCL(pH8.8),50μL10%SDS,50μL10%过硫酸铵，4μLTEMED；

②制浓缩胶：5%浓缩胶（1mL）：0.68mLddH20,0.34mL30%丙烯酰胺，0.26mL1.0mol/LTris-HCL(pH6.6)，10μL10%SDS，10μL10%过硫酸铵，4μLTEMED；

③加样：2×蛋白缓冲液与等量的蛋白样品混匀，加热10min，离心取上清，15μL/well加样；

④电泳：80V跑浓缩胶，120V跑分离胶；

⑤染色：取胶在染色液中染色30min；

⑥脱色：将胶在脱色液中摇床脱色24h，直至条带清洗。结果（图7）显示，超滤分离MRJPs产物蛋白条带与鲜王浆蛋白条带差异不明显，没有出现其它小分子条带，表明分离过程对没有造成明显的蛋白降解。

2、冻干超滤分离MRJPs产物蛋白含量

冻干超滤分离MRJPs产物经总蛋白含量测定为79.8%。

3、MRJP1含量的Elisa检测

将提取分离的MRJP1作为标准蛋白溶于CBS缓冲液(Na₂CO₃1.59g,NaHCO₃2.93g,pH9.6)中，配成10μg/mL的溶液，利用已经制备出的MRJP1多克隆抗体按1:1000的比例稀释，作为一抗；以HRP标记的羊抗兔IgG为酶标二抗，按1:5000稀释加入PBS中，作为二抗溶液。

①包被：将10μg/mL的MRJP1标准蛋白溶液，按倍比梯度稀释法加样于96孔板，每孔加100μL/孔，4℃包被过夜；

②封闭：次日96孔板小孔中的包被液，以PBST（PBS+0.05%Tween-20）为洗涤液，每步洗涤5-10次，并拍干。然后加100μL含5%BSA或者脱脂奶粉的PBST溶液中37℃封闭1.5h；

③弃96孔板小孔中的封闭液，并用PBST洗涤。加入一抗，用磷酸盐缓冲液（PBS，0.27gKH₂PO₄，1.42gNa₂HPO₄，8gNaCl，0.2gKCl，ddH₂O800mL，用浓盐酸调pH至7.4，ddH₂O定容到1L）稀释1000倍，100μL/孔，37℃静置1-2h；

④洗涤：用PBST冲洗10次，拍干；

⑤弃96孔板小孔中的一抗，并用PBST洗涤以HRP标记的羊抗兔IgG为二抗，稀释5000倍，100μL/孔，37℃静置1h；

⑥洗涤：用PBST冲洗10次，拍干；

⑦以TMB为显色底物，100μL/孔，37℃放置15min；以2MH₂SO₄为终止液，50μL/孔，加完立即在酶标仪上测量波长450nm的吸光度。以吸光值OD₄₅₀为纵坐标，MRJP1标准溶液为横坐标，绘制成的标准曲线（图9），得到回归方程：y=y=0.036x+0.264，R²=0.993（其中y表示OD₄₅₀值，x表示MRJP1含量）。

分别将新鲜蜂王浆和最优条件下处理的MRJPs浓缩样品的OD₄₅₀值代入MRJP1蛋白标准曲线的回归方程中，计算MRJP1含量。100g鲜王浆含7.11gMRJP1，即鲜王浆含7.11%MRJP1；在最优条件下，从100g鲜王浆分离得到5.78gMRJP1，MRJPs样品中MRJP1的得率为81.3%（100%×5.78/7.11）。与2.3中最优条件下，MRJPs的提取率82.63%基本相符。

实施例3鲜王浆滤后液中10-HDA和总糖回收

1、滤后液中10-HDA和总糖回收

在最优条件下，运用超滤膜系统处理鲜蜂王浆浓缩MRJPs得到滤后液样品。先利用旋转蒸发仪在40℃条件下浓缩滤后液（每100mL滤后液可得到30mL浓缩样品），再在冷冻真空干燥获得冻干粉。

2、鲜王浆及超滤滤后液10-HDA回收率测定

参照GB9697-2008中10-HDA测定方法，测定滤后液冻干产物及鲜王浆的10-HDA含量，结果（表4）显示，鲜王浆、滤后液冻干产物的10-HDA含量分别为1.13%和0.93%。按照下

式进行10-HDA回收利用率计算：10-HDA回收利用率（%）=滤后液10-HAD质量/鲜王浆10-HAD质量×100%。根据表4计算得：在最优处理条件下，滤后液10-HAD回收利用率（%）=100×(0.93%×2.26/50.87×1.13%)=3.50%（表5）。

表4蜂王浆和最优条件下滤后液冻干产物成分分析

表5王浆超滤分离后10-HAD和总糖的回收率

3、鲜王浆及超滤滤后液总糖回收率测定

取从鲜王浆超滤得到的滤后液样品旋转蒸发、真空冷冻干燥。参照GB/T9695.3-2008中总糖的测定方法，测定滤后液冻干产物及鲜王浆的总糖含量,结果（表4）显示，鲜王浆、滤后液冻干产物的总糖含量分别为2.26%和0.93%。按照下式进行总糖回收利用率计算：总糖回收利用率（%）=滤后液中总糖质量/鲜王浆总糖质量×100%。结果如表4所示。根据表4计算得：在最优处理条件下，滤后液总糖回收利用率（%）=100×(7.06%×2.26/50.87×14.86%)=2.11%（表5）。

Claims (2)

1.一种蜂王浆中得到王浆主蛋白和活性滤后液的超滤膜分离方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）称取蜂王浆，与水在4℃下搅拌混匀，用NaOH调节pH，用NaCl调节离子强度，再用0.2μm的微孔滤膜去除微粒；

2）采用截留分子量为100kDa的第一超滤膜分离去除大分子杂质，再用截留分子量为49kDa的第二超滤膜分离和浓缩第一超滤膜透过液中的王浆主蛋白，当浓缩至1/3体积时，补充纯水，让小分子溶液透过第二超滤膜，得到的截流液为纯化和浓缩的王浆主蛋白溶液；

所述的步骤1）中，水与蜂王浆的质量比例为5：1；pH为7，离子强度为0.5mol/L；

所述的步骤2）中所述的小分子溶液含有多糖和10-羟基-2-癸烯酸(10-HDA)。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）中所述的王浆主蛋白溶液经冷冻干燥成为王浆主蛋白冻干粉。