CN114668790B - 一种超声辅助低共熔溶剂法提取蒲公英抗炎成分的方法 - Google Patents

一种超声辅助低共熔溶剂法提取蒲公英抗炎成分的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于天然产物提取技术领域，具体涉及一种超声辅助低共熔溶剂提取蒲公英抗炎成分的方法。本发明所提供的蒲公英抗炎成分提取方法首次以新型绿色低共熔溶剂组合为提取剂，避免了传统有机溶剂的使用，从而解决了蒲公英提取工艺中传统有机化学试剂所带来的高成本、高风险﹑高危害及高污染等一系列问题。

Description

一种超声辅助低共熔溶剂法提取蒲公英抗炎成分的方法
技术领域
本发明属于天然产物提取技术领域，具体涉及一种超声辅助低共熔溶剂提取蒲公英抗炎成分的方法。
背景技术
蒲公英是国家卫生健康委员会公布的药食同源植物，是一种很好的膳食元素和医疗资源。蒲公英最早记载于《唐本草》：“味甘，平，无毒。主妇人乳痈肿。”《本草纲目》中记载蒲公英主治妇人乳痈肿，解食毒，散滞气，化热毒，消恶肿、结核、丁肿。现代医学研究证明，蒲公英主要含有酚酸、黄酮、多糖、甾醇、萜类、色素类等成分，具有抗菌、抗氧化、抗炎、抗胃损伤、抗糖尿病、抗肿瘤、抗病毒等药理作用，可用于多种急性炎症、感冒发热、尿道感染等疾病的治疗。
研究表明蒲公英中抗炎主要成分主要为黄酮类化合物，主要为槲皮素、木犀草素、芹菜素、艾黄素、芦丁、芫花素、香叶木素等。因此，高效提取此类物质有助于蒲公英抗炎类产品的开发。
目前蒲公英活性成分提取大多采用醇提法、水提法、酶法等，其活性成分得率很难得到保证，且都有明显的弊端，如醇提法所用的乙醇为易燃易爆试剂，水提法和酶法所提取的提取液容易被污染，无法长久保存。因此，寻找经济高效且绿色的提取溶剂具有十分重要的意义。
低共熔溶剂是近些年兴起的一类优良溶剂。该类溶剂是由季铵盐或者天然碱等氢键受体和有机酸、多元醇等氢键供体构成的混合物，具有不易挥发、热稳定性高、可生物降解等优点，且对各种有机物和无机物具有较强溶解能力。低共熔溶剂相比于传统有机溶剂，如乙醇、甲醇等，它具有价格低廉、易于运输储存、毒性小等优点，且不会污染环境，是一种理想的传统有机溶剂替代溶剂。
超声提取是一种常见的高效提取手段，已被广泛应用于天然植物药材的提取。超声辅助提取法主要是利用超声波在溶液中产生的强振动、高加速度、强空化效应及搅拌作用，实现植物细胞壁的破坏，加快药效成分的溶出，从而达到节约提取时间、提高药物有效成分提取率的效果。
有鉴于此，特提出本发明，利用超声辅助低共熔溶剂法提取蒲公英抗炎成分，并结合大孔树脂对提取成分纯化。
发明内容
本发明要解决的技术问题之一，在于提供一种提蒲公英抗炎成分的方法，该提取工艺简单、操作方便、缩短提取周期，提高了蒲公英抗炎成分的提取效率。
本发明是这样实现上述技术问题之一的：
一种超声辅助低共熔溶剂提取蒲公英抗炎成分的方法，包括以下步骤：
将蒲公英粉末加入低共熔溶剂中，经过超声提取获得蒲公英抗炎成分，再通过HPD100大孔树脂分离低共熔溶剂和蒲公英有效成分。
进一步，在本发明提供的技术方案的基础上，所述低共熔溶剂为氯化胆碱和甘油的混合溶液。
进一步，氯化胆碱和甘油的混合溶液中，所述氯化胆碱和甘油的摩尔比为1：1-5，优选1：2-1：4，更优选1：2。
进一步，所述氯化胆碱/甘油混合溶液的含水量为10-50％，体积百分比，优选20-40％，更优选30％。
进一步，所述氯化胆碱/甘油混合溶液的料液比为0.5％-1.25％，m/v质量体积比，药材质量比100mL溶剂，例：1g蒲公英粉末溶于100mL溶剂＝料液比1％，优选0.75-1.25％，更优选1.25％。
进一步，所述的工艺方法，包括以下步骤：
将蒲公英粗粉和低共熔溶剂加入到离心管中，涡旋混匀后将所述离心管置于65℃水浴中，使用超声波细胞破碎仪对蒲公英粗粉进行超声波辅助提取，超声功率为70瓦，超声时间90min，超声处理后得到的液体即为蒲公英粗提液；蒲公英粗提液先用滤布过滤除去大部分药渣，再进行离心，转速为10000rpm，离心10分钟，取上层的清液，最终回收的上清液即为蒲公英提取液，常温保存待用。
进一步，所述的工艺方法，包括以下步骤：
将HPD100大孔树脂进行预处理：先将HPD100大孔树脂置于95％(体积比)乙醇溶液浸泡12h，然后除去乙醇溶液，用去离子水水洗直至大孔树脂无醇味；再用4％(质量分数)的HCl溶液浸泡1h，再用去离子水洗脱至中性；然后用5％(质量分数)NaOH溶液浸泡1h，再用去离子水洗脱至中性；最后用去离子水浸泡HPD100大孔树脂12h，让大孔树脂充分溶胀，并烘干备用。
进一步，所述的工艺方法，包括以下步骤：
先在树脂柱里塞上脱脂棉，然后把经上述预处理后烘干备用的HPD100大孔树脂用水稀释成树脂水溶液倒入树脂柱。待树脂完全沉淀后，加入经过低共熔溶剂提取的溶液50mL，以5BV/h的流速通过树脂柱，所过滤的溶液再次以5BV/h的流速通过树脂柱。接着用200mL蒸馏水以10BV/h的流速通过树脂柱，至流出溶液呈无色。最后用200mL 95％(体积比)乙醇溶液以10BV/h的流速对大孔吸附树脂进行解吸附，至流出溶液呈无色。收集95％乙醇溶液的解吸液，旋蒸至干燥状态，从而得到蒲公英固体提取物。
HPD100大孔树脂与水的质量比为1:2。
技术效果：
本发明所提供的蒲公英抗炎成分提取方法首次以新型绿色低共熔溶剂组合为提取剂，避免了传统有机溶剂的使用，从而解决了蒲公英提取工艺中传统有机化学试剂所带来的高成本、高风险﹑高危害及高污染等一系列问题。
本发明所提供的提取方法在蒲公英药材提取领域，首次将低共熔溶剂与超声辅助两种提取方式进行有机地结合，与常规提取方法相比，有效成分的提取率更高。
本发明所提供的超声辅助低共熔溶剂提取蒲公英抗炎成分的工艺条件优化，将为低共熔溶剂在蒲公英抗炎成分实际生产中的应用提供可靠的参考。
附图说明
图1为实施例1绘制的槲皮素标准曲线；
图2为氯化胆碱/甘油摩尔比对蒲公英中抗炎成分提取率的影响曲线图；
图3为料液比对蒲公英中抗炎成分提取率的影响曲线图；
图4为含水量对蒲公英中抗炎成分提取率的影响曲线图；
图5为蒲公英提取液对巨噬细胞RAW264.7的炎症因子NO浓度的影响图。
具体实施方式
下面将结合附图和具体实施方式，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。这些实施例仅用于说明本发明，并不是对本发明保护范围的限制。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下面结合具体实施例详细描述本发明，这些实施例用于理解而不是限制本发明。
实施例1：标准曲线绘制
(1)称取0.0208克槲皮素标准品，用乙醇定容到100mL容量瓶，配成208μg/mL的溶液。
(2)分别取对照液0、0.5、1、1.5、2、2.5mL置于50mL定量瓶中；并用乙醇定容到50mL，从而配成0μg/mL、2.08μg/mL、4.16μg/mL、6.24μg/mL、8.32μg/mL，10.4μg/mL的溶液；
(3)在374nm波长(最大吸光度值处)处测吸光度。以μg/mL为横坐标，吸光度为纵坐标建立标准曲线，得到线性回归方程y＝0.0656x+0.0036，R2＝0.9977，见图1。
实施例2：超声辅助低共熔溶剂提取蒲公英抗炎成分的工艺条件的优化方法，所述具体步骤如下
2.1确定低共熔溶剂(DESs)组合
从氯化胆碱—乳酸、氯化胆碱—果糖、氯化胆碱—乙二醇、氯化胆碱—甘油、氯化胆碱—尿素中筛选最佳组合，先都以氯化胆碱：氢供体＝1：2的摩尔比投入50mL的试剂量，放置在90℃的油浴锅内搅拌加热1小时，确保低共熔溶剂已经澄清透明，再截取40mL到离心管内，加入10mL的超纯水和0.5g过40目筛的蒲公英粉，配置成含水量20％，料液比1％，1：2的摩尔比的50mL的溶液，在70w，65℃的超声环境中超声90分钟。
超声提取后使用滤布初步分离药渣，将溶剂转移至离心管，以10000转/分钟的转速离心10分钟，取上层清液。经0.45μm微孔滤膜过滤后进行紫外分光光度计测算。
通过紫外分光光度计测算和实际黏度观察，最终确定氯化胆碱—甘油组合是最佳的提取蒲公英抗炎成分的低共熔溶剂组合。
2.2单因素实验确定优选水平
单因素实验一：改变氢键受体氯化胆碱与氢键供体甘油的摩尔比，分别制备比例为1：1、1：2、1：3、1：4、1：5的低共熔溶剂。以槲皮素提取率为考察指标，确定提取效果最佳氯键受体与氢键供体的摩尔比。
准确称取五份0.5g过40目筛的蒲公英粉，加入到50mL含水量20％的不同摩尔比的低共熔溶剂体系中，在温度65℃，70w超声下提取60min。超声提取后使用滤布初步分离药渣，将溶液转移至离心管，以10000转/分钟的转速离心10分钟，取上层清液。经0.45μm微孔滤膜过滤后，进行紫外测定。
提取蒲公英槲皮素的得率结果如图2所示，低共熔溶剂(DESs)随着氯化胆碱/甘油摩尔比的升高，提取率出现了先升高后降低的总体趋势，因此摩尔比在1：2—1：4可以作为优选水平。
单因素实验二：改变料液比，分别制备料液比的比例为0.25％—1.25％的低共熔溶剂。以槲皮素提取率为考察指标，确定提取效果最佳料液比。
准确称取五份0.125g到0.625g过40目筛的蒲公英粉，加入到50mL含水量20％的1：2摩尔比的低共熔溶剂体系(氯化胆碱和甘油的混合溶液)中，在温度65℃，70w超声下提取60min。超声提取后使用滤布初步分离药渣，将溶液转移至离心管，以10000转/分钟的转速离心10分钟，取上层清液。经0.45μm微孔滤膜过滤后，进行紫外分光测定。
提取蒲公英槲皮素的得率结果如图3所示，低共熔溶剂随着蒲公英粗粉在溶液的占比越来越大，提取率出现了不断升高的趋势，但在1％-1.25％的上升阶段，提取增量已经很少了，因此料液比在0.75％-1.25可以作为优选水平。
单因素实验三：改变含水比，分别制备含水比的比例为10％—50％的低共熔溶剂。以槲皮素提取率为考察指标，确定提取效果最佳料液比。
准确称取五份0.5g过40目筛的蒲公英粉，加入到50mL含水量10％—50％的低共熔溶剂体系中，在温度65℃，70w超声下提取60min。超声提取后使用滤布初步分离药渣，将溶液转移至离心管，以10000转/分钟的转速离心10分钟，取上层清液。经0.45μm微孔滤膜过滤后，进行紫外测定。
提取蒲公英槲皮素的得率结果如图4所示，低共熔溶剂随着水的加入提取率出现了先升高后下降的趋势，这可能与水的加入降低了低共熔溶剂的黏稠度，有利于槲皮素溶解；但含水量更多影响了低共熔溶剂的结构，使其破细胞壁能力降低。因此，含水量20％—40％可以作为优选水平。
2.3正交实验确定最优水平
按照正交表，配制九种不同因素水平的溶剂各50mL，在温度65℃，70w超声下提取90min。超声提取后使用滤布初步分离药渣，将溶液转移至离心管，以10000转/分钟的转速离心10分钟，取上层清液。经0.45μm微孔滤膜过滤后，进行紫外分光测定。
正交实验设计及提取结果，如表1所示，由正交实验结果可以看到，超声辅助低共熔溶剂法提取蒲公英抗炎成分的最佳工艺为：氯化胆碱/甘油摩尔比为1：2，DESs含水量为30％(v/v)，料液比为1.25％(m/v)时提取率最高。
表1三因素三水平正交表
所在列 1 2 3 4
因素 摩尔比 含水比 料液比 吸光度
实验1 1 1 1 1 0.48
实验2 1 2 2 2 0.524
实验3 1 3 3 3 0.574
实验4 2 1 2 3 0.481
实验5 2 2 3 1 0.612
实验6 2 3 1 2 0.472
实验7 3 1 3 2 0.39
实验8 3 2 1 3 0.505
实验9 3 3 2 1 0.45
均值1 0.526 0.467 0.486 0.514
均值2 0.522 0.547 0.485 0.479
均值3 0.465 0.499 0.542 0.52
对比例1—2：水提与醇提
将50mL的纯水溶液中按料液比1％投入过40目的药材，在70w，65℃的超声环境中超声90分钟。超声提取后使用滤布初步分离药渣，将溶液转移至离心管，以10000转/分钟的转速离心10分钟，取上层清液。经0.45μm微孔滤膜过滤后进行紫外测算。
将50mL的95％(体积百分比)乙醇溶液中按料液比1％投入过40目的药材，在70w，65℃的超声环境中超声90分钟。超声提取后使用滤布初步分离药渣，将溶剂转移至离心管，以10000转/分钟的转速离心10分钟，取上层清液。经0.45μm微孔滤膜过滤后进行紫外测算。
与本发明中超声辅助低共熔溶剂提取工艺的实施案例2.1：用含水量为20％，DESs按1％的料液比，超声温度为65℃，超声90min，超声功率为70w作为比较，结果如表2所示，低共熔溶剂提取法的提取率明显高于醇提和水提。且氯化胆碱-甘油作为低共熔溶剂时，此低共熔溶剂提取效率是常规的醇提法的1.72倍，是水提法的2.39倍。虽然氯化胆碱—尿素组合的含量比氯化胆碱—甘油略高，但常温下黏稠度太高，为后续的分离药渣和提取液带来困难，故确定氯化胆碱—甘油组合是最佳的提取蒲公英抗炎成分的低共熔溶剂组合。
表2常规提取方法与低共熔溶剂提取方法对比
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改﹑等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。
实施例3：大孔树脂纯化蒲公英提取物
先在树脂柱里塞上脱脂棉，将处理后的干重10g树脂用20mL水稀释成树脂水溶液倒入树脂柱。待树脂完全沉淀后，加入低共熔溶剂的提取物样品溶液为50mL，以5BV/h的流速通过树脂柱，如此操作两次，然后用200mL蒸馏水以10BV/h的流速通过树脂柱，至流出溶液呈无色，从而去除掉残留在树脂内的低共熔溶剂，最后用约200mL 95％乙醇溶液以10BV/h的流速对大孔吸附树脂进行解吸附，至流出溶液呈无色。收集95％乙醇溶液的解吸液，进行旋蒸，从而得到蒲公英固体提取物。
实施例4：体外细胞实验对抗炎效果的验证
本发明使用小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞，对等重药材提取产生的等体积的体积比为60％醇提取液(需旋蒸除去乙醇)和低共熔溶剂分别提取纯化，再经过旋蒸后得到的固体提取物进行抗炎活性测定。
本发明中RAW264.7细胞炎症实验的具体实施过程如下：
a.细胞复苏与传代
将冻存的小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞在37℃下快速复苏，然后转至已预热的2mL含10％胎牛血清、1％青霉素-链霉素的DMEM培养液中，轻轻吹匀、1000rpm离心35min，弃去上清液，再加新培养液吹匀后取适量转至细胞培养皿中，在37℃、5％CO2细胞培养箱中培养。
当培养皿中细胞密度达到80％～90％时，弃去培养基，用细胞刮刀刮下细胞后，1000rpm离心5min、弃上清液，重新加入新培养液，轻轻吹匀后取适量细胞悬液加入培养皿中，轻轻震匀后于细胞培养箱中培养。经过2～3代传代以后，可用于正常实验操作。
b.固体提取物的复溶与稀释
将0.625g蒲公英药材提取产生的50mL 60％醇提液进行旋蒸，得到固体醇提物。将0.625g蒲公英药材提取产生的50mL低共熔溶剂提取液进行旋蒸，得到固体低共熔溶剂提取物。将上述两类固体提取物分别投入到50mL的DMEM不完全培养基，得到醇提法和低共熔溶剂提取法的复溶液。
取两类复溶液各100μL，加入300μL的DMEM不完全培养基，分别得到稀释倍数为4倍的醇提液和低共熔溶剂提取液。取两类复溶液各100μL，加入700μL的DMEM不完全培养基，形成稀释倍数为8倍的醇提液和低共熔溶剂提取液。
c.提取液抗炎活性测定
向96孔板内加入处于对数生长期的细胞悬液100μL/孔，每孔5×104个细胞，设6个小组，分别为对照组、四个给药组(稀释4倍、8倍的醇提液和稀释4倍、8倍低共熔溶剂提取液)、模型组，每组设3个重复，培养24h之后，弃去原培养液，各组操作步骤为(1)对照组：每孔添加不完全培养基200μL，(2)给药组：各个给药组的每个小孔加入对应的不同浓度提取液100μL，再加入100μL的终浓度为1μg/mL LPS，(3)模型组：每孔加入200μL的浓度为1μg/mLLPS，继续培养24h后先收集上清，利用Griess试剂检测NO的分泌水平。
d.数据处理
所有实验结果均重复3次，且表示为平均值±标准差(X±SD)，采用SPSS对抗炎活性数据进行单因素方差分析(S-N-K检验)和多重比较，星号标注表示具有显著差异(P<0.05)。
e.实验结果
相对于模型组而言，提取液低共熔组和提取液60％醇提组对炎症因子NO的分泌都有显著性抑制作用(P<0.05)，且相同稀释倍数情况下，低共熔溶剂组抗炎效果明显优于60％醇提组(体积百分数)(图5)。
综上所述，本发明采用细胞实验对蒲公英提取物抗炎作用进行了考察。结果显示，提取液有明显的抗炎效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种超声辅助低共熔溶剂法提取蒲公英抗炎成分的方法，其特征在于，将蒲公英粉末加入低共熔溶剂中，经过超声提取获得蒲公英抗炎成分，再通过HPD100大孔树脂分离低共熔溶剂和蒲公英抗炎成分；所述低共熔溶剂为氯化胆碱和甘油的混合溶液；氯化胆碱和甘油的混合溶液中，所述氯化胆碱和甘油的摩尔比为1：2-1：4，含水量为20-40%，蒲公英粉末与氯化胆碱和甘油的混合溶液的料液比为0.75-1.25%；将蒲公英粉末加入低共熔溶剂中，经过超声提取获得蒲公英抗炎成分的具体步骤为：将蒲公英粗粉和低共熔溶剂加入到离心管中，涡旋混匀后将所述离心管置于水浴中，使用超声波细胞破碎仪对蒲公英粗粉进行超声波辅助提取，超声处理后得到的液体即为蒲公英粗提液，蒲公英粗提液先用滤布过滤除去大部分药渣，再进行离心，取上层的清液，最终回收的上清液即为蒲公英提取液，常温保存待用，水浴温度65℃，超声功率为70瓦，超声时间90min，离心转速为10000 rpm，离心时间为10分钟。
2.如权利要求1所述的一种超声辅助低共熔溶剂法提取蒲公英抗炎成分的方法，其特征在于，氯化胆碱和甘油的混合溶液中，所述氯化胆碱和甘油的摩尔比为1：2，含水量为30%，蒲公英粉末与氯化胆碱和甘油的混合溶液的料液比为1.25%。
3.如权利要求1所述的一种超声辅助低共熔溶剂法提取蒲公英抗炎成分的方法，其特征在于，通过HPD100大孔树脂分离低共熔溶剂和蒲公英抗炎成分的具体步骤为：
（1）将HPD100大孔树脂进行预处理：先将HPD100大孔树脂置于乙醇溶液浸泡，然后除去乙醇溶液，用去离子水水洗直至大孔树脂无醇味；再用HCl溶液浸泡，再用去离子水洗脱至中性；然后用NaOH溶液浸泡，再用去离子水洗脱至中性；最后用去离子水浸泡HPD100大孔树脂12 h，让大孔树脂充分溶胀，并烘干备用；
（2）先在树脂柱里塞上脱脂棉，然后把经上述预处理后烘干备用的HPD100大孔树脂用水稀释成树脂水溶液倒入树脂柱；待树脂完全沉淀后，加入经过低共熔溶剂提取的溶液通过树脂柱，所过滤的溶液再次通过树脂柱；接着采用蒸馏水通过树脂柱，至流出溶液呈无色；最后用乙醇溶液对大孔吸附树脂进行解吸附，至流出溶液呈无色，收集乙醇溶液的解吸液，旋蒸至干燥状态，从而得到蒲公英固体提取物。
4.如权利要求3所述的一种超声辅助低共熔溶剂法提取蒲公英抗炎成分的方法，其特征在于，步骤（1）中，乙醇溶液体积百分浓度为95％，浸泡时间为12 h；HCl溶液质量百分浓度为4％，浸泡时间为1 h；NaOH溶液质量百分浓度为5%，浸泡时间为1 h。
5.如权利要求3所述的一种超声辅助低共熔溶剂法提取蒲公英抗炎成分的方法，其特征在于，步骤（2）中，HPD100大孔树脂与水的质量比为1:2；低共熔溶剂提取的溶液通过树脂柱的流速为5 BV/h，体积为50 mL；所过滤的溶液再次以5 BV/h的流速通过树脂柱；蒸馏水体积200 mL，通过树脂柱的流速为10 BV/h；乙醇溶液体积百分浓度为95％，以10 BV/h的流速对大孔吸附树脂进行解吸附。
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