CN101891776A - 一种用高速逆流色谱从海参中分离制备脑苷脂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用高速逆流色谱从海参中分离制备脑苷脂的方法，其特征在于：向海参干粉中加入氯仿和甲醇混合液，室温浸泡，滤液浓缩后得到脑苷脂粗提物；将石油醚、甲醇和水混合，对形成的固定相和流动相分别进行超声脱气；所得粗提物采用该混合溶剂溶解后过滤制得样品溶液；先将固定相泵入高速逆流色谱仪的色谱柱中，然后调节主机转速和流动相流速，泵入流动相，待两相平衡后，经进样阀将样品溶液泵入色谱柱中，再继续泵入流动相，分步收集，并用薄层色谱法检测，合并目标物，浓缩，冻干，得到脑苷脂。本发明制备工艺简单、操作简便、纯化效率高、分离时间短、稳定性好，适用于多种海参样品中脑苷脂的分离制备，适合工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种海参中食用和药用活性成分的提纯方法，特别是涉及一种用高速逆流色谱从海参中分离制备脑苷脂的方法。
背景技术
海参(Holothurian，sea cucumber)为棘皮动物门(Echinodermata)海参纲(Holothuroidea)动物，是重要的海洋食品和药物资源。海参中含有海参多糖、海参皂苷、海参胶原蛋白肽、海参脑苷脂(Cerebrosides from sea cucumber)、神经节苷脂等多种生物活性物质，具有提高免疫功能、抗肿瘤、抗凝血、降血脂和增强大脑学习记忆能力等功效。从海参的各类生物活性物质中寻找和开发新药以及功能因子，已成为海参深度开发利用的重要方向。
海参脑苷脂是一类存在于海参体壁中具有独特结构和活性的鞘糖脂类化合物(sphingolipids)，它属于中性鞘糖脂，由单糖、长链脂肪酸(FA)和长链神经鞘氨醇碱基(简称长链碱，LCB)三部分组成。脑苷脂类化合物主要有抗肿瘤、免疫调节、诱导细胞凋亡、抗菌、抗肝毒等生物活性(姜健，杨宝灵，邰阳.海参资源及生物活性物质的研究.生物技术通讯，2004，15(5)：537-540)。目前文献报道，海参脑苷脂主要由三种不同极性的脑苷脂系列物组成，海参种类和来源不同，所含脑苷脂的结构和功效存有差异(Koji Yamada.Chemo-Pharmaceutical Studies on the Glycosphingolipid Constituents from Echinoderm，SeaCucumbers，as the Medicinal Materials.The Pharmaceutical Society of Japan.2002，122(12)：1133-1143)。通常采用正反相硅胶柱层析的方法分离制备脑苷脂，以除去磷脂、甘油三酯等其它脂质成分，过多的层析步骤使得脑苷脂的制备时间长，损失较大，得率较低，限制其进一步研究。因此，有必要建立一种高效快速的从鲜海参、干海参及海参制品等样品中分离制备脑苷脂的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用高速逆流色谱从海参中分离制备脑苷脂的方法，它能满足现有技术的上述需求。
一种用高速逆流色谱从海参中分离制备脑苷脂的方法，其特征在于：(1)向海参干粉中加入氯仿甲醇混合液，室温下浸泡过夜，过滤，按此步骤重复操作3～8次，合并各次所得滤液，减压浓缩后得脑苷脂粗提物；(2)将石油醚、甲醇和水混合，振荡摇匀，静置分层后分离，取上相作为固定相，下相作为流动相，对两相分别进行超声脱气10～30分钟；(3)将上述脑苷脂粗提物溶解于等体积的固定相和流动相的混合溶液中，过滤得样品溶液；(4)将上述配制好的固定相泵入高速逆流色谱仪的色谱柱中；然后开启高速逆流色谱仪，调节主机转速和流动相流速，将流动相也泵入上述色谱柱内；待两相在色谱柱内平衡后，使上述样品溶液经进样阀进入上述色谱柱；进样完毕后继续泵入流动相，分步收集分离物，并用薄层色谱法检测，合并目标物，浓缩，冻干，得到脑苷脂。
本发明由于采用了组成和配比合理的混合溶剂，控制主机转速和流动相流速等工艺条件可获得高纯度的脑苷脂，不需使用固相载体，无不可逆吸附，样品无损失、无污染、高效、快速、低成本且可大量分离制备脑苷脂，获得的脑苷脂纯度可达90％以上，适用于由多种工艺制备的脑苷脂粗提物中分离制备脑苷脂。
附图说明
图1为高速逆流色谱分离叶瓜参脑苷脂的色谱图。
具体实施方式
本发明的方法由四个步骤组成：(1)向海参干粉中加入氯仿甲醇混合液，室温下浸泡过夜，过滤，按此步骤重复操作3～8次，合并各次所得滤液，减压浓缩后得脑苷脂粗提物；(2)将石油醚、甲醇和水混合，振荡摇匀，静置分层后分离，取上相作为固定相，下相作为流动相，对两相分别进行超声脱气10～30分钟；(3)将上述脑苷脂粗提物溶解于等体积的固定相和流动相的混合溶液中，过滤得样品溶液；(4)将上述配制好的固定相泵入高速逆流色谱仪的色谱柱中；然后开启高速逆流色谱仪，调节主机转速和流动相流速，将流动相也泵入上述色谱柱内；待两相在色谱柱内平衡后，使上述样品溶液经进样阀进入上述色谱柱；进样完毕后继续泵入流动相，分步收集分离物，并用薄层色谱法检测，合并目标物，浓缩，冻干，得到脑苷脂。
本发明中向所述海参干粉中加入氯仿甲醇混合液的量为3～5L/kg海参干粉。所述氯仿甲醇混合液中氯仿与甲醇的体积比为1～8∶1。所述石油醚、甲醇和水的体积比为4～8∶3～4∶1。所述主机转速为500～1000rpm；所述流动相流速为1～4mL/min。
下面通过实施例进一步详细说明本发明。
实施例一
从叶瓜参(Cucumaria frondosa)中提取制备脑苷脂：(1)叶瓜参脑苷脂粗提物的制备：称取叶瓜参干粉1kg，加4L体积比为1∶1的氯仿甲醇混合液，室温下浸泡过夜，过滤，按此步骤重复5次，合并各次所得滤液，减压浓缩至膏状，得叶瓜参脑苷脂粗提物，备用。(2)所用溶剂的配制：将体积比为5∶4∶1的石油醚、甲醇和水置于分液漏斗中，剧烈振荡摇匀，使两相达到平衡，静置分层后分离，取上相作为固定相，下相作为流动相，分别对上下相进行超声脱气20分钟，冷却后备用。(3)样品溶液的制备：准确称取上述叶瓜参脑苷脂粗提取物168mg，充分溶解于等体积(各10mL)的上相和下相的混合溶剂中，过滤，得样品溶液。(4)分离制备：将上述配制好的固定相(上相)以15mL/min的流速泵入高速逆流色谱柱，然后开启制备型高速逆流色谱仪，调节主机转速为900rpm，以1.2mL/min的流速将流动相(下相)也泵入上述色谱柱内，待柱内两相建立动态平衡后，使上述样品溶液由进样阀进样，进样完毕后继续泵入流动相，分步收集分离物，并用薄层色谱法检测。其中所收集的叶瓜参脑苷脂的保留时间为275～480min，浓缩，冷冻干燥后得叶瓜参脑苷脂20.8mg，得率为12.4％，经高效液相色谱法(HPLC)检测，如图1所示，纯度为92.3％。
实施例二
从海地瓜(Acaudina molpadioides)中提取制备脑苷脂：(1)海地瓜脑苷脂粗提物的制备：称取海地瓜干粉1kg，加3L体积比为2∶1的氯仿甲醇混合液，室温下浸泡过夜，过滤，按此步骤重复3次，合并各次所得滤液，减压浓缩至膏状，得海地瓜脑苷脂粗提物，备用。(2)所用溶剂的配制：将体积比为5.5∶3.5∶1的石油醚、甲醇和水置于分液漏斗中，剧烈振荡摇匀，使两相达到平衡，静置分层后分离，取上相作为固定相，下相作为流动相，分别对上下相进行超声脱气20分钟，冷却后备用。(3)样品溶液的制备：准确称取上述海地瓜脑苷脂粗提取物100mg，充分溶解于等体积(各10mL)的上相和下相的混合溶剂中，过滤，得样品溶液。(4)分离制备：将上述配制好的固定相(上相)以15mL/min的流速泵入高速逆流色谱柱，然后开启制备型高速逆流色谱仪，调节主机转速为950rpm，以1.5mL/min的流速将流动相(下相)也泵入上述色谱柱内，待柱内两相建立动态平衡后，使上述样品溶液由进样阀进样，进样完毕后继续泵入流动相，分步收集分离物，并用薄层色谱法检测。其中所收集的海地瓜脑苷脂的保留时间为205～400min，浓缩，冷冻干燥后得海地瓜脑苷脂9.9mg，得率为9.9％，经HPLC检测，纯度为91.0％。
实施例三
从仿刺参(Apostichopus japonicus)中提取制备脑苷脂：(1)仿刺参脑苷脂粗提物的制备：将鲜仿刺参冻干，粉碎。称取仿刺参干粉1kg，加3.6L体积比为3∶1的氯仿甲醇混合液，室温下浸泡过夜，过滤，按此步骤重复4次，合并各次所得滤液，减压浓缩至膏状，得仿刺参脑苷脂粗提物，备用。(2)所用溶剂的配制：将体积比为5∶3.5∶1的石油醚、甲醇和水置于分液漏斗中，剧烈振荡摇匀，使两相达到平衡，静置分层后分离，取上相作为固定相，下相作为流动相，分别对上下相进行超声脱气20分钟，冷却后备用。(3)样品溶液的制备：准确称取上述仿刺参脑苷脂粗提取物130mg，充分溶解于等体积(各10mL)的上相和下相的混合溶剂中，过滤，得样品溶液。(4)分离制备：将上述配制好的固定相(上相)以15mL/min的流速泵入高速逆流色谱柱，然后开启制备型高速逆流色谱仪，调节主机转速为850rpm，以1.8mL/min的流速将流动相(下相)也泵入上述色谱柱内，待柱内两相建立动态平衡后，使上述样品溶液由进样阀进样，进样完毕后继续泵入流动相，分步收集分离物，并用薄层色谱法检测。其中所收集的仿刺参脑苷脂的保留时间为230～330min，浓缩，冷冻干燥后得仿刺参脑苷脂9.9mg，得率为7.6％，经HPLC检测，纯度为90.2％。
Claims (5)
1.一种用高速逆流色谱从海参中分离制备脑苷脂的方法，其特征在于：(1)向海参干粉中加入氯仿甲醇混合液，室温下浸泡过夜，过滤，按此步骤重复操作3～8次，合并各次所得滤液，减压浓缩后得脑苷脂粗提物；(2)将石油醚、甲醇和水混合，振荡摇匀，静置分层后分离，取上相作为固定相，下相作为流动相，对两相分别进行超声脱气10～30分钟；(3)将上述脑苷脂粗提物溶解于等体积的固定相和流动相的混合溶液中，过滤得样品溶液；(4)将上述配制好的固定相泵入高速逆流色谱仪的色谱柱中；然后开启高速逆流色谱仪，调节主机转速和流动相流速，将流动相也泵入上述色谱柱内；待两相在色谱柱内平衡后，使上述样品溶液经进样阀进入上述色谱柱；进样完毕后继续泵入流动相，分步收集分离物，并用薄层色谱法检测，合并目标物，浓缩，冻干，得到脑苷脂。
2.按权利要求1所述用高速逆流色谱从海参中分离制备脑苷脂的方法，其特征在于向所述海参干粉中加入氯仿甲醇混合液的量为3～5L/kg海参干粉。
3.按权利要求1所述用高速逆流色谱从海参中分离制备脑苷脂的方法，其特征在于所述氯仿甲醇混合液中氯仿与甲醇的体积比为1～8∶1。
4.按权利要求1所述用高速逆流色谱从海参中分离制备脑苷脂的方法，其特征在于所述石油醚、甲醇和水的体积比为4～8∶3～4∶1。
5.按权利要求1所述用高速逆流色谱从海参中分离制备脑苷脂的方法，其特征在于所述主机转速为500～1000rpm；所述流动相流速为1～4mL/min。
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