CN102206163B - 一种长链碱的分离制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种长链碱的分离制备方法，包括有1)长链碱粗提物提取；2)固定相和流动相制备；3)长链碱粗提物溶解于流动相中制得样品进样液；4)长链碱的纯化分离步骤；其特征在于：固定相和流动相制备是将正己烷、甲醇和水混合来制备固定相和流动相；其体积比为1～5∶1～20∶1～10。本发明的方法利用特异的固定相和流动相，同时控制主机转速和流动相流速等工艺条件，利用高速逆流色谱分离方法可获得高纯度的长链碱。本发明的方法不需使用固相载体，无不可逆吸附，样品无损失、无污染、高效、快速、低成本且可大量分离制备长链碱，获得的长链碱纯度可达95％以上，适用于用多种工艺制备的长链碱粗提物中分离制备长链碱。
Description
技术领域
本发明属于食用和药用活性成分提纯技术领域，具体涉及一种长链碱的分离制备方法。
背景技术
长链碱(Long chain bases，LCB)，又称鞘氨醇碱基(Sphingoid bases)或鞘氨基醇(sphingoid)，是鞘脂的特征性结构，属最简单的功能性鞘脂类化合物。由于分离与鉴定方法学的进展，近年来已发现的长链碱结构有80余种。在生物体内，LCB是由丝氨酸及脂肪酰辅酶A在丝氨酸-脂肪酰辅酶A转移酶催化下合成的，由于酶活性的不同，不同生物体内LCB的结构存在较大差异。其中，最常见的是神经鞘氨醇(Sphingosine，d18:1)，它含有18个碳的脂肪酸链，羟基位于C-1和C-3上，氨基位于C-2上，双键位于C-4反式构型，简写为d18:1。在哺乳动物体内最常见的是d18:1，也有少量二氢鞘氨醇(dihydrosphingosine，d18:0)及植物鞘氨醇(phytosphingosine，t18:0)存在。而海洋无脊椎动物的LCB组成则更为复杂，在海洋无脊椎动物体内存在特殊的碱基Δ8位去饱和酶，可以在C-8位形成不饱和键，从而产生双不饱和的d18:2，这一点与植物类似。另外，在海洋无脊椎动物体内还发现有特殊的多不饱和d18:3和d19:3长链碱。
长链碱是构成鞘脂类化合物的重要结构组成，并作为细胞内的调节因子，具有诱导多种肿瘤细胞凋亡等生物活性。目前文献报道，不同种类和来源的长链碱结构和功效可能存在差异。通常采用制备薄层层析法分离制备长链碱，以除去其它脂质成分和水解的其他产物，但该方法制备时间长，制备效率低，制备量过低，限制其进一步研究。因此，有必要建立一种高效快速分离制备长链碱的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种长链碱的分离制备方法，即用高速逆流色谱来分离长链碱，以弥补现有技术的不足。
本发明的长链碱的分离制备方法，是用高速逆流色谱来分离长链碱。
用高速逆流色谱来分离长链碱，具体方法包括有1)长链碱粗提物提取；2)固定相和流动相制备；3)长链碱粗提物溶解于流动相中制得样品进样液；4)长链碱的纯化分离步骤；其特征在于：步骤2)固定相和流动相制备是将正己烷、甲醇和水混合来制备固定相和流动相；其中正己烷、甲醇和水的体积比为1～5∶1～20∶1～10。
上述的步骤1)长链碱粗提物提取具体操作如下：首先向样品干粉中加入氯仿甲醇混合液，室温下浸泡过夜，过滤得到滤液，按此步骤重复操作3～8次，合并各次所得滤液，减压浓缩后得总浸膏；然后将总浸膏溶解于0.1～1mol/L氢氧化钾-甲醇溶液中，37℃反应0.5～3小时，冷至室温后加入0.5～3倍于氢氧化钾-甲醇体积的氯仿、0.3～2倍于氢氧化钾-甲醇体积的水萃取3～8次，取下层萃取液减压浓缩至干得总脂质；然后在总脂质中加入10％的HCl-甲醇溶液后，80℃反应8～20小时，冷至室温后，加入与HCl-甲醇溶液等体积的正己烷萃取，下层萃取液加入0.1～1mol/L氢氧化钾-甲醇溶液调至pH 8～11以上，离心，将溶液用0.2～5倍体积的乙醚萃取，乙醚萃取液减压浓缩至干后得到长链碱粗提物。
本发明中所述的样品干粉与氯仿甲醇混合液的比例为1kg样品干粉：3～5L氯仿甲醇混合液。
所述氯仿甲醇混合液中氯仿与甲醇的体积比为1～8∶1。
上述的步骤2)是将正己烷、甲醇和水混合，振荡摇匀，静置分层后分离，取上相作为固定相，下相作为流动相，对两相分别进行超声脱气10～30分钟，即完成，其中正己烷、甲醇和水的体积比优选为1∶2∶1。
上述的步骤4)高速逆流色谱分离步骤具体如下：首先将步骤2)配制好的固定相泵入高速逆流色谱仪的色谱柱中；然后开启高速逆流色谱仪，调节主机转速和流动相流速，将流动相也泵入上述色谱柱内；待两相在色谱柱内平衡后，将步骤3)制备的样品进样液经进样阀进入上述色谱柱；进样完毕后继续泵入流动相，分步收集分离物，根据紫外检测和/或薄层色谱法确定长链碱目标组分，收集长链碱所在的分离物，浓缩冻干得到长链碱。
所述主机转速为500～1000rpm；所述流动相流速为1～4mL/min。
本发明的方法利用特异的固定相和流动相，同时控制主机转速和流动相流速等工艺条件，利用高速逆流色谱分离方法可获得高纯度的长链碱。本发明的方法不需使用固相载体，无不可逆吸附，样品无损失、无污染、高效、快速、低成本且可大量分离制备长链碱，获得的长链碱纯度可达95％以上，适用于用多种工艺制备的长链碱粗提物中分离制备长链碱。
附图说明
图1：叶瓜参长链碱粗提物高速逆流色谱分离后紫外检测谱图。
图2：高速逆流色谱分离制得的叶瓜参长链碱的高效液相色谱图。
具体实施方式
本发明采用高速逆流色谱来分离长链碱，相比于现有的薄层层析法，本发明的方法可以在更短的时间内分离制备到长链碱，并且本发明的方法长链碱的得率提高了2.5倍。
本发明的方法包括四个步骤，具体的步骤如下：1)长链碱粗提物提取；2)固定相和流动相制备；3)长链碱粗提物溶解于流动相中制得样品进样液；4)高速逆流色谱分离步骤。
1)长链碱粗提物提取：
向样品干粉中加入氯仿甲醇混合液，室温下浸泡过夜，过滤，按此步骤重复操作3～8次，合并各次所得滤液，减压浓缩后得总浸膏；将总浸膏溶解于0.1～1mol/L氢氧化钾-甲醇溶液中，37℃反应0.5～3小时，冷至室温后加入0.5～3倍体积的氯仿，0.3～2倍体积的水萃取3～8次，取下层减压浓缩至干得总脂质；总脂质加入体积比为10％的HCl-甲醇溶液后，80℃反应8～20小时，冷至室温后，加入等体积的正己烷萃取，下相中加入氢氧化钾-甲醇溶液调至pH 8～11以上，离心，将溶液用0.2～5倍体积的乙醚萃取，乙醚溶液减压浓缩至干后得到长链碱粗提物，用于高速逆流色谱分离用原料；
2)固定相和流动相制备：
将正己烷、甲醇和水混合，振荡摇匀，静置分层后分离，取上相作为固定相，下相作为流动相，对两相分别进行超声脱气10～30分钟；其中正己烷、甲醇和水的体积比为1～5∶1～20∶1～10。
流动相和固定相的成份、比例等因素对于高速逆流色谱分离制备方法的成功与否具有重要的影响。本发明对分离长链碱的流动相进行了筛选，首先利用玉米或海参样品，按照步骤1)的方法获得长链碱粗提物后，分别采用了正己烷-甲醇-水，正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水，正丁醇-甲醇-水等共六种不同比例的溶剂体系，并按后续的步骤3)和4)提取长链碱，结果发现，正己烷-甲醇-水的制备效果最佳，且当体积比为1∶2∶1时，制备的固定相和流动相对于长链碱的纯化效果最好，长链碱的得率可达80％，纯度在95％以上。而其他的比例下，或是长链碱的得率高，但纯度低；或是纯度高，但得率低。
3)将步骤1)制备的上述长链碱粗提物溶解于步骤2)制备的流动相中，过滤得样品进样液；
4)将上述配制好的固定相泵入高速逆流色谱仪的色谱柱中；然后开启高速逆流色谱仪，调节主机转速和流动相流速，将流动相也泵入上述色谱柱内；待两相在色谱柱内平衡后，使上述样品溶液经进样阀进入上述色谱柱；进样完毕后继续泵入流动相，分步收集分离物，合并目标物，浓缩，冻干后得到长链碱。
下面通过实施例进一步详细说明本发明。
实施例1
从叶瓜参(Cucumaria frondosa)中提取制备长链碱：(1)叶瓜参长链碱粗提物的制备：称取叶瓜参干粉100g，加400mL体积比为1∶1的氯仿甲醇混合液，室温下浸泡过夜，过滤，按此步骤重复5次，合并各次所得滤液，减压浓缩至膏状，得叶瓜参浸膏；将浸膏溶解于0.4mol/L氢氧化钾-甲醇溶液中，37℃反应1小时，冷至室温后加入2倍体积的氯仿，0.8倍体积的水萃取3次，取下层减压浓缩至干得总脂质；总脂质加入1mol/L HCl-甲醇溶液后，80℃反应16小时，冷至室温后，加入等体积的正己烷萃取，下相加入4mol/L氢氧化钾-甲醇溶液调至pH 9.7以上，离心，将溶液用0.5倍体积的乙醚萃取，乙醚溶液减压浓缩至干后得到叶瓜参长链碱粗提物，用于高速逆流色谱分离用原料；备用。(2)所用溶剂的配制：将体积比为1∶2∶1的正己烷、甲醇和水置于分液漏斗中，剧烈振荡摇匀，使两相达到平衡，静置分层后分离，取上相作为固定相，下相作为流动相，分别对上下相进行超声脱气20分钟，冷却后备用。(3)样品溶液的制备：准确称取上述叶瓜参长链碱粗提取物300mg，充分溶解于下相溶剂中，过滤，得样品溶液。(4)分离制备：将上述配制好的固定相(上相)以15mL/min的流速泵入高速逆流色谱柱，然后开启制备型高速逆流色谱仪，调节主机转速为800rpm，以1.5mL/min的流速将流动相(下相)也泵入上述色谱柱内，待柱内两相建立动态平衡后，使上述样品溶液由进样阀进样，进样完毕后继续泵入流动相，分步收集分离物，并根据紫外和薄层色谱法检测，紫外检测波长为210nm，检测结果见附图1，峰1和峰2为叶瓜参长链碱，收集浓缩，冷冻干燥后得叶瓜参长链碱196mg，经高效液相色谱法(HPLC)检测，如图2所示，纯度为96.4％。
实施例2
从海地瓜(Acaudina molpadioides)中提取制备长链碱：(1)海地瓜长链碱粗提物的制备：称取海地瓜干粉100g，加400mL体积比为1∶1的氯仿甲醇混合液，室温下浸泡过夜，过滤，按此步骤重复5次，合并各次所得滤液，减压浓缩至膏状，得海地瓜浸膏；将浸膏溶解于0.4mol/L氢氧化钾-甲醇溶液中，37℃反应1小时，冷至室温后加入2倍体积的氯仿，0.8倍体积的水萃取3次，取下层减压浓缩至干得总脂质；总脂质加入1mol/L HCl-甲醇溶液后，80℃反应16小时，冷至室温后，加入等体积的正己烷萃取，下相加入4mol/L氢氧化钾-甲醇溶液调至pH 9.7以上，离心，将溶液用0.5倍体积的乙醚萃取，乙醚溶液减压浓缩至干后得到海地瓜长链碱粗提物，用于高速逆流色谱分离用原料；备用。(2)所用溶剂的配制：将体积比为1∶2∶1的正己烷、甲醇和水置于分液漏斗中，剧烈振荡摇匀，使两相达到平衡，静置分层后分离，取上相作为固定相，下相作为流动相，分别对上下相进行超声脱气20分钟，冷却后备用。(3)样品溶液的制备：准确称取上述海地瓜长链碱粗提物100mg，充分溶解于下相溶剂中，过滤，得样品溶液。(4)分离制备：将上述配制好的固定相(上相)以15mL/min的流速泵入高速逆流色谱柱，然后开启制备型高速逆流色谱仪，调节主机转速为800rpm，以1.5mL/min的流速将流动相(下相)也泵入上述色谱柱内，待柱内两相建立动态平衡后，使上述样品溶液由进样阀进样，进样完毕后继续泵入流动相，分步收集分离物，并根据紫外和薄层色谱法检测，其中所收集的玉米长链碱的保留时间为120～175min，浓缩，冷冻干燥后得海地瓜长链碱70mg，经高效液相色谱法(HPLC)检测，纯度为95.1％。
实施例3
从玉米中提取制备长链碱：(1)玉米长链碱粗提物的制备：称取玉米干粉100g，加400mL体积比为1∶1的氯仿甲醇混合液，室温下浸泡过夜，过滤，按此步骤重复5次，合并各次所得滤液，减压浓缩至膏状，得玉米浸膏；将浸膏溶解于0.4mol/L氢氧化钾-甲醇溶液中，37℃反应1小时，冷至室温后加入2倍体积的氯仿，0.8倍体积的水萃取3次，取下层减压浓缩至干得总脂质；总脂质加入1mol/L HCl-甲醇溶液后，80℃反应16小时，冷至室温后，加入等体积的正己烷萃取，下相加入4mol/L氢氧化钾-甲醇溶液调至pH 9.7以上，离心，将溶液用0.5倍体积的乙醚萃取，乙醚溶液减压浓缩至干后得到玉米长链碱粗提物，用于高速逆流色谱分离用原料；备用。(2)所用溶剂的配制：将体积比为1∶2∶1的正己烷、甲醇和水置于分液漏斗中，剧烈振荡摇匀，使两相达到平衡，静置分层后分离，取上相作为固定相，下相作为流动相，分别对上下相进行超声脱气20分钟，冷却后备用。(3)样品溶液的制备：准确称取上述玉米长链碱粗提物150mg，充分溶解于下相溶剂中，过滤，得样品溶液。(4)分离制备：将上述配制好的固定相(上相)以15mL/min的流速泵入高速逆流色谱柱，然后开启制备型高速逆流色谱仪，调节主机转速为800rpm，以1.5mL/min的流速将流动相(下相)也泵入上述色谱柱内，待柱内两相建立动态平衡后，使上述样品溶液由进样阀进样，进样完毕后继续泵入流动相，分步收集分离物，并根据紫外和薄层色谱法检测，其中所收集的玉米长链碱的保留时间为192～330min，浓缩，冷冻干燥后得玉米长链碱123mg，经高效液相色谱法(HPLC)检测，纯度为96.9％。
Claims (6)
1.一种长链碱的分离制备方法，是用高速逆流色谱来分离长链碱，包括有1）长链碱粗提物提取；2）固定相和流动相制备；3）长链碱粗提物溶解于流动相中制得样品进样液；4）长链碱的纯化分离步骤；其特征在于，步骤2）固定相和流动相制备是将正己烷、甲醇和水混合来制备固定相和流动相；其中正己烷、甲醇和水的体积比为1～5:1～20:1～10；
其中步骤1）长链碱粗提物提取操作如下：首先向样品干粉中加入氯仿甲醇混合液，室温下浸泡过夜，过滤得到滤液，按此步骤重复操作3~8次，合并各次所得滤液，减压浓缩后得总浸膏；然后将总浸膏溶解于0.1~1mol/L 氢氧化钾-甲醇溶液中，37℃反应0.5~3小时，冷至室温后加入0.5~3倍于氢氧化钾-甲醇体积的氯仿、0.3~2倍于氢氧化钾-甲醇体积的水萃取3~8次，取下层萃取液减压浓缩至干得总脂质；然后在总脂质中加入10%的HCl-甲醇溶液后，80℃反应8~20小时，冷至室温后，加入与HCl-甲醇溶液等体积的正己烷萃取，下层萃取液加入0.1~1mol/L氢氧化钾-甲醇溶液调至pH 8~11以上，离心，将溶液用0.2~5倍体积的乙醚萃取，乙醚萃取液减压浓缩至干后得到长链碱粗提物。
2.如权利要求1所述的分离制备方法，其特征在于上述的正己烷、甲醇和水的体积比为1:2:1。
3.如权利要求1所述的分离制备方法，其特征在于上述的样品干粉与氯仿甲醇混合液的比例为1kg样品干粉：3~5L氯仿甲醇混合液。
4.如权利要求3所述的分离制备方法，其特征在于上述的氯仿甲醇混合液中氯仿与甲醇的体积比为1~8:1。
5.如权利要求1所述的分离制备方法，其特征在于上述的步骤4）高速逆流色谱分离步骤具体如下：首先将步骤2）配制好的固定相泵入高速逆流色谱仪的色谱柱中；然后开启高速逆流色谱仪，调节主机转速和流动相流速，将流动相也泵入上述色谱柱内；待两相在色谱柱内平衡后，将步骤3）制备的样品进样液经进样阀进入上述色谱柱；进样完毕后继续泵入流动相，分步收集分离物，根据紫外检测和/或薄层色谱法确定长链碱目标组分，收集长链碱所在的分离物，浓缩冻干得到长链碱。
6.如权利要求5所述的分离制备方法，其特征在于上述的主机转速为500~1000rpm；所述流动相流速为1~4mL/min。
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