CN114437150A - 一种仿刺参中海参脑苷脂的分离提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种仿刺参中海参脑苷脂的分离方法，属于生物分离技术领域。通过80％乙醇多次回流提取和硅胶柱的分离纯化得到的，其操作较为简单，成本较低，得到纯度较高的1个单体化合物，对进一步研究仿刺参中海参脑苷脂的生理合成具有重要意义。

Description

一种仿刺参中海参脑苷脂的分离提取方法
技术领域
本发明涉及一种仿刺参中海参脑苷脂的分离方法，属于生物分离技术领域。
背景技术
仿刺参作为一种功能性食品，含有丰富的生物活性物质，海参脑苷脂是存在于海参体壁中结构独特的鞘脂类化合物。研究表明，海参脑苷脂具有抗肿瘤和神经保护作用，能够改善阿尔茨海默病，调节糖代谢和脂质代谢，改善机体的能量代谢。海参脑苷脂主要分为葡萄糖脑苷脂和半乳糖脑苷脂两类。本发明主要提取的是葡萄糖脑苷脂，是海参中含量最高的鞘脂类化合物。海参脑苷脂活性作用温和，毒副作用小。具有抗肿瘤、抗病毒、免疫调节等多种活性。徐杰(海参脑苷脂的分离纯化、结构分析及其生物活性研究[D],中国海洋大学，博士论文)对分离得到的脑苷脂(acaudina molpadioides cerebrosides-2，AMC-2)进行活性研究，发现AMC-2使大鼠肝中甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)水平，硬脂酰辅酶A去饱和酶(stearoyl-coenzyme A desaturase，SCD)的活性降低，m RNA的表达明显减少，这表明AMC-2能通过抑制SCD活动和脂肪细胞的生物合成来改善大鼠的非酒精性脂肪肝。杜磊(海参和海星脑苷脂抗肿瘤及改善癌症恶病质作用的研究[D],中国海洋大学，硕士论文)研究了海参中脑苷脂的抗肿瘤活性，结果表明：脑苷脂Acaudina molpadioides cerebrosides(AMC)和Asterias amurensis cerebrosides(AAC)能通过诱导S180细胞的凋亡抑制细胞增殖，在体外和体内通过诱导线粒体介导细胞凋亡而表现出抗肿瘤活性。
海参脑苷脂鞘脂类的结构并不复杂，但因为多个手性碳的存在、长链碱和长链脂肪酸的链长不定，以及双键的数目、位置不同，给其结构鉴定带来了一定的复杂性。本发明提供了一种仿刺参中海参脑苷脂的分离方法，得到单体化合物，明确其结构，为进一步研究海参保健品提供技术支持。
发明内容
为解决现有技术的问题，本发明提供一种仿刺参中海参脑苷脂的分离方法，得到单体化合物，明确其结构，为进一步研究海参保健品提供技术支持。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：
一种仿刺参中海参脑苷脂的分离方法，包括如下步骤：
(1)选取新鲜仿刺参经解剖去肠后粉碎，得到糜肉，向其中加入80％的乙醇水溶液进行回流提取，提取3次，提取时间分别为2小时、1.5小时和0.5小时，提取液回收，进行浓缩，得浓缩浸膏为总提取物。
(2)将步骤(1)中得到的总提取物，均匀分散在水中，通过正丁醇进行萃取，对正丁醇萃取液进行回收浓缩，得正丁醇浸膏。
(3)将步骤(2)中得到的提取物通过正相硅胶柱层析,以不同比例氯仿、甲醇和水作为洗脱溶剂进行梯度洗脱，氯仿、甲醇和水的体积比依次为7：1：0.5、6：1：0.5、6：4：0.5、6：5：0.5、4：1：0.5、2.5：1：0.5；洗脱物再经过薄层色谱分析，选取含量大的部分通过凝胶色谱柱先以氯仿和甲醇作为洗脱溶剂，氯仿：甲醇的体积比为1：1，再以甲醇和水作为洗脱溶剂，甲醇和水的体积比为1：1，继续洗脱；之后将洗脱物通过反向硅胶柱层析以体积比为2:1的乙腈和水作为洗脱溶剂进行纯化，得到海参脑苷脂。
进一步地，上述技术方案中，步骤(1)中，所述糜肉与80％的乙醇水溶液的质量为1:7。
进一步地，上述技术方案中，步骤(2)中，所述浓缩的方式为：真空旋转浓缩，浓缩的温度为40℃。
进一步地，上述技术方案中，步骤(3)中，所述正相硅胶填料的粒度为200-300目；反向硅胶柱中填料的粒度为50μm。
进一步地，上述技术方案中，步骤(3)中，可选取含量大的部分进一步通过多次正反向硅胶柱层析进行分离纯化。
进一步地，上述技术方案中，步骤(3)中，薄层色谱条件：展开剂为氯仿：甲醇：乙酸乙酯，其中氯仿：甲醇：乙酸乙酯体积比为9：2.5：2。
本发明的有益效果：
本发明提供了海参脑苷脂的提取方法，本方法通过80％乙醇多次回流提取和硅胶柱的分离纯化得到的，其操作较为简单，成本较低，得到纯度较高的1个单体化合物，对进一步研究仿刺参中海参脑苷脂的生理合成具有重要意义。
附图说明
图1为本发明实施例1提取的化合物的1HNMR谱。
图2为本发明实施例1提取的化合物的13CNMR谱。
图3为本发明实施例1提取的化合物的DEPT谱。
图4为本发明实施例1提取的化合物的液相色谱。
图5为本发明实施例1提取的化合物的结构式。
具体实施方式
下述非限定性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1
一种仿刺参中海参脑苷脂的分离方法，包括如下步骤：
(1)原材料选取与处理
选取新鲜仿刺参经解剖去肠后，经匀浆机匀浆，约10公斤糜肉，向其中加入7倍量的80％乙醇分批次进行回流提取，提取3次，提取时间分别为2小时、1.5小时和0.5小时，趁热过滤，收集滤液通过旋转蒸发仪40℃浓缩回收，得浓缩浸膏为总提取物。
(2)提取物处理
将步骤(1)中得到的总提取物，均匀分散在水中，采用1倍量的正丁醇萃取，对正丁醇萃取液进行回收，经过旋转蒸发仪40℃进行旋转浓缩，浓缩液得浸膏50g。
(3)分离纯化
将步骤(2)中得到的提取物(浸膏)通过正相硅胶填料(粒度：200-300目，青岛海洋化工厂)进行洗脱，采用层析柱规格为98cm*8cm，干样上样，提取物与正相硅胶填料的质量比为1：1，以不同溶剂体积比例为氯仿、甲醇和水(7：1：0.5、6：1：0.5、6：4：0.5、6：5：0.5、4：1：0.5、2.5：1：0.5)作为洗脱溶剂进行梯度洗脱，分成1-6六部分，进行薄层色谱检测，其中薄层色谱条件为氯仿：甲醇：乙酸乙酯体积比为9：2.5：2，发现3部分海参脑苷脂含量较高，因此对3部分进行进一步纯化；将3部分的洗脱物继续通过填料为sephadex LH-20的凝胶色谱柱洗脱，先采用洗脱剂体积比例为氯仿：甲醇为1：1进行纯化，然后采用洗脱剂甲醇：水体积比为1：1进行洗脱，层析柱规格：4cm*96cm；再经过一次反向硅胶ODS(粒度：50μm，天津博纳艾杰尔科技有限公司)柱层析进行纯化，层析柱规格为3cm*90cm，乙腈和水的体积比例为2：1，柱子流速均为每秒2-3滴，得到白色结晶性粉末，进行薄层色谱检测，其中薄层色谱条件：甲醇：水体积为1：0.2，最终得到纯度为90％以上的单体化合物。
取粉末1mg溶于1ml甲醇中，使用HPLC-DVD进行液相色谱分析，确定纯度为90％的单体化合物。以下是色谱分析条件：
采用Hypersil Gold C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，柱温：35℃，紫外检测波长：205nm，流速：1ml/min，进样量：10ul，流动相为甲醇和水，等度洗脱，洗脱比例为95％甲醇和5％水。该化合物液相色谱如图4所示。
(4)结构鉴定
取约20mg粉末化合物溶于氘代吡啶，使用Bruker 700M核磁共振谱仪(AVANCEⅢ700MHz)进行结构分析，13CNMR信号δ176.28(CONH)、54.30(CHNH)显示存在1个酰胺键，1HNMR信号δ5.90(m,2H)、5.44(m,2H)和13CNMR信号δC 131.08，132.64，129.95提示结构式中含有两个双键，1HNMR信号δ4.90(d,1H,J＝7.6Hz)和13CNMR信号δ105.59,74.87,78.30,71.28,78.18,62.39提示化合物中存在1个β-D-葡萄糖。1HNMR信号δ0.86(t,6H,J＝6Hz,2×CH3)及1.24(s,nH,长链CH2)显示有长脂肪链存在，故推定该化合物为脑苷类化合物海参脑苷脂SJC-2。该化合物的结构式如图5所示，图1为1HNMR谱，图2为13CNMR谱，图3为DEPT谱。
对于任何熟悉本领域的技术人员而言，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的技术内容对本发明技术方案作出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均应仍属于本发明技术方案保护的范围内。

Claims (7)

1.一种仿刺参中海参脑苷脂的分离方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)选取新鲜仿刺参经解剖去肠后粉碎，得到糜肉，向其中加入80％的乙醇水溶液进行回流提取，提取3次，提取液回收，进行浓缩，得浓缩浸膏为总提取物；
(2)将步骤(1)中得到的总提取物，均匀分散在水中，通过正丁醇进行萃取，对正丁醇萃取液进行回收，浓缩，得正丁醇浸膏；
(3)将步骤(2)中得到的正丁醇浸膏通过正相硅胶柱层析,以不同比例氯仿、甲醇和水作为洗脱溶剂进行梯度洗脱，氯仿、甲醇和水的体积比依次为7：1：0.5、6：1：0.5、6：4：0.5、6：5：0.5、4：1：0.5、2.5：1：0.5；再经过薄层色谱分析，选取含量大的部分通过凝胶色谱柱先以氯仿和甲醇作为洗脱溶剂，氯仿：甲醇的体积为1：1，再以甲醇和水作为洗脱溶剂，甲醇和水的体积比为1：1，继续洗脱；之后通过反向硅胶柱层析以体积比为2:1的乙腈和水作为洗脱溶剂进行纯化。
2.根据权利要求1所述的仿刺参中海参脑苷脂的分离方法，其特征在于，步骤(1)中，所述糜肉与80％的乙醇水溶液的质量为1:7。
3.根据权利要求1所述的仿刺参中海参脑苷脂的分离方法，其特征在于，步骤(1)中，所述提取时间分别为2小时、1.5小时和0.5小时。
4.根据权利要求1所述的仿刺参中海参脑苷脂的分离方法，其特征在于，步骤(2)中，所述浓缩的方式为：真空旋转浓缩，浓缩的温度为40℃。
5.根据权利要求1所述的仿刺参中海参脑苷脂的分离方法，其特征在于，步骤(3)中，所述正相硅胶填料的粒度为200-300目；反向硅胶柱中填料的粒度为50μm。
6.根据权利要求1所述的仿刺参中海参脑苷脂的分离方法，其特征在于，步骤(3)中，薄层色谱展开剂为氯仿：甲醇：乙酸乙酯，其中氯仿：甲醇：乙酸乙酯体积比为9：2.5：2。
7.根据权利要求1所述的仿刺参中海参脑苷脂的分离方法，其特征在于，步骤(3)中，选取含量大的部分进一步通过多次正反向硅胶柱层析进行分离纯化。
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