JP2004231616A - 骨形成促進剤 - Google Patents

Abstract

【課題】骨芽細胞の増殖を促進し、骨強化を目的とした治療及び／又は予防に効果を有する骨形成促進剤等を提供する。
【解決手段】棘皮動物から抽出されるα−オキシ脂肪酸及びスフィンゴシン骨格、α−オキシ脂肪酸及びフィトスフィンゴシン骨格を有するスフィンゴ糖脂質、又はスフィンゴリン糖脂質を有効成分として含有する骨形成促進剤、骨粗鬆症等の予防・治療用組成物である上記骨形成促進剤、及び上記骨形成促進剤を添加してなる飲食品組成物又は飼料組成物。
【選択図】 図３

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、骨芽細胞の増殖を促進し、骨強化を目的とした治療及び／又は予防に効果を有する骨形成促進剤に関するものであり、更に詳しくは、棘皮動物門に属する生物から精製されるα−オキシ脂肪酸及びスフィンゴシン骨格、並びにα−オキシ脂肪酸及びフィトスフィンゴシン骨格を有するスフィンゴ糖脂質、又はスフィンゴリン糖脂質を有効成分として含有する骨形成促進剤に関するものである。本発明は、新規骨形成促進剤、該骨形成促進剤を含有してなる飲食品組成物又は飼料組成物を提供するものとして有用である。
【０００２】
【従来の技術】
高齢化に伴い、骨粗鬆症、骨折、腰痛などの骨疾患が増加している。骨組織には、骨芽細胞と破骨細胞が存在しており、それぞれ骨形成と骨吸収を担い、いわば逆の働きをしている。骨代謝異常により引き起こされる疾患としては、骨粗鬆症、慢性関節リューマチ、骨ページェット病、及び変形性関節炎等が知られており、これらの骨疾患に起因した寝たきり老人が増加していく問題は、高齢化社会が進む中で、避けては通れない解決すべき課題となってきている。骨代謝異常により起こる骨量減少症については、骨形成の促進、又は骨吸収の抑制等によって改善される。前記骨形成の促進は、即ち、骨芽細胞の増殖・分化の促進である。また、骨吸収の抑制は、破骨細胞前駆細胞の増殖・分化の抑制、及び成熟破骨細胞の機能抑制等により達成することが可能である。このような骨形成の促進、又は骨吸収の抑制等の活性を有する蛋白質やその他の化合物等の開発が、現在、多方面に渡って進められている。
【０００３】
骨芽細胞とは、間葉系幹細胞由来の単核細胞であり、前骨芽細胞、骨芽細胞、そして骨基質中に包埋された骨細胞や骨表面を覆う休止状態にある骨内膜細胞へと分化する。増殖・分化した骨芽細胞は骨基質（類骨）を産生し骨吸収窩を埋める。更に、骨芽細胞の調節のもとで、類骨は成熟、石灰化し骨となる。前骨芽細胞や骨芽細胞は、このような骨基質の産生のみならず、インスリン様成長因子（ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２）、β２−ミクログロブリン、骨誘導タンパク（ＢＭＰ）、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）、プロスタグランジンＥ_２ （ＰＧＥ_２ ）などの様々な局所因子を分泌し、オートクリン／パラクリン機構で、骨形成を制御しているものと考えられる。更に、骨芽細胞は、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、活性型ビタミン［１α，２５（ＯＨ）_２ Ｄ_３ ］、エストロゲン、ＴＮＦ−α、ＰＧＥ_２ 、ＩＬ−１などの受容体を有することから、これらを介して骨芽細胞自身の増殖・分化の制御や破骨細胞の分化・活性化の制御を行っているものと考えられる。
【０００４】
現在、骨疾患の治療には、ビスフォスフォネート化合物、カルシトニン製剤、活性型ビタミンＤ_３ 製剤、エストラジオール含有のホルモン製剤、ビタミンＫ_２等の医薬品が一般に使用されている。また、副作用の少ない優れた治療薬をめざして、活性型ビタミンＤ_３ 誘導体、エストラジオール誘導体、第３世代ビスフォスフォネート系化合物等の開発が行われている。しかし、前記薬剤を用いた骨疾患の治療法は必ずしも満足できるものではなく、また、副作用の面から使用対象が限定されるものもある。更に、骨代謝疾患の治療には、多剤併用療法が主流になってきていることから、従来の医薬品とは異なった作用メカニズムをもつ新規な医薬品の開発が期待されている。
【０００５】
スフィンゴ脂質は細胞の重要な膜成分として、自然界に広く存在しており、その大部分がスフィンゴ糖脂質や、スフィンゴリン脂質として存在している。スフィンゴ脂質は、細胞の増殖・分化における調節作用（非特許文献１）、アポトーシス誘発（非特許文献２）等、生命現象において重要な役割を果たしていることが知られており、これらの現象にはサイトカインであるＴＮＦ（非特許文献３）、ＩＬ−１（非特許文献４）、及びＦａｓリガンド（非特許文献５）が関与していることが明らかになっている。また、スフィンゴ脂質は、ＥＧＦレセプターの活性化調節（非特許文献６）、カルシウムイオンの細胞内の流動化（非特許文献７）、及びプロテインキナーゼＣの活性抑制・活性化等に関与していることも知られている。
スフィンゴ糖脂質には、長鎖塩基と脂肪酸よりなるセラミドをアグリコンとし、このアグリコンの部分に、ガラクトースやグルコース等の単糖が結合したセレブロシド、乳糖が結合したラクトシルセラミド、糖（単糖又はオリゴ糖）と硫酸基が結合したスルファチド、オリゴ糖とシアル酸等が結合したガングリオシドなどが含まれる（非特許文献８）。その中でも、シアル酸を含むガングリオシドは、細胞間の相互認識（非特許文献９）、接着（非特許文献１０）、増殖（非特許文献１１）、又は分化誘導（非特許文献１２）等、生体内での様々な重要な現象に関与していると言われている。また、この化合物は、虚血障害やパーキンソン病による脳障害の治療（非特許文献１３）にも用いられている。
【０００６】
海洋無脊椎動物である棘皮動物門に属する生物（例えば、ヒトデ類、クモヒトデ類、ウニ類、ナマコ類、ウミユリ類等）由来のスフィンゴ糖脂質の主要骨格は、ほとんどα−オキシ脂肪酸と、スフィンゴシン型長鎖塩基又はフィトスフィンゴシン型長鎖塩基から構成されたセラミド部（アグリコン部）を有し、α位がオキシ化されていない脂肪酸（無置換脂肪酸）とスフィンゴシン型長鎖塩基から構成される哺乳類由来のスフィンゴ糖脂質とは構造的に異っている（非特許文献８、非特許文献１４）。フィトスフィンゴシン骨格は、スフィンゴシン骨格中の４位と５位の二重結合部分が４位に水酸基、５位に水素がそれぞれ飽和された構造を取っており、この構造上の違いから、異なる作用を持つことが期待されている。
【０００７】
前記棘皮動物由来のスフィンゴ糖脂質の中でも、ウミユリ類（とりわけ、ウミシダ類）から得られる糖脂質は、基本構造にイノシトールホスホセラミドを含むスフィンゴリン糖脂質である。このイノシトールホスホセラミドは、植物や前口動物から見出されているが、後口動物からは、この棘皮動物由来のものでしか発見されていない。セラミド部もこれまでの棘皮動物スフィンゴ糖脂質とは異なり、無置換脂肪酸とスフィンゴシン型長鎖塩基から構成されることから、ウミシダ類のスフィンゴ糖脂質は他の棘皮動物のものとは相当異なったものと位置付けられている。フィトスフィンゴシン骨格を有するセラミドを用いた技術としては、化粧品組成物（特許文献１）や、皮膚疾患に対する外用薬（特許文献２）等が開示されている。また、牛脳及び牛乳中由来のセラミド、スフィンゴミエリン、スフィンゴ糖脂質、ガングリオシドなどのスフィンゴシン骨格を有する化合物を有効成分とし、更に、カルシウム剤、ビタミンＤ及びビタミンＫから選ばれる１種類以上の物質を加えた骨関節疾患の予防及び改善剤が開示されている（特許文献３）。
【０００８】
【特許文献１】
特開平８−５０２９６１号公報
【特許文献２】
特開２００１−３９８５９号公報
【特許文献３】
特開２００１−１５８７３６号公報
【非特許文献１】
フェブス・レター（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．）、第５２４巻、第１０３〜１０６ページ、２００２年
【非特許文献２】
フェブス・レター（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．）、第５２６巻、第１５〜２０ページ、２００２年
【非特許文献３】
イー・エム・ビー・オー ジャーナル（ＥＭＢＯ Ｊ． ）、第１９巻、第１３号、第３３０４〜３３１３ページ、２０００年
【非特許文献４】
ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．）、第２７５巻、第４５号、第３５６１７〜３５６２３ページ、２０００年
【非特許文献５】
ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．）、第２７６巻、第２６号、第２３９５４〜２３９６１ページ、２００１年
【非特許文献６】
ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．）、第２７７巻、第１２号、第１０１０８〜１０１１３ページ、２００２年
【非特許文献７】
プロシーディング・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ）、第９８巻、第１号、第３０７〜３１２ページ、２００１年
【非特許文献８】
伏谷伸宏・廣田洋監著、「天然有機化合物の構造解析」、シュプリンガー・フェアラーク東京、第８１〜１４０ページ、１９９４年
【非特許文献９】
ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．）、第２６４巻、第２０１５９〜２０１６２ページ、１９８９年
【非特許文献１０】
ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．）、第２６６巻、第１７５５２〜１７５５８ページ、１９９１年
【非特許文献１１】
ブレイン・リサーチ（Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．）、第２８４巻、第２１５〜２２１ページ、１９８３年
【非特許文献１２】
プロシーディング・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ）、第７６巻、第３３６７〜３３７１ページ、１９７９年
【非特許文献１３】
ニューロロジー（Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ）、第５０巻、第１６３０〜１６３６ページ、１９９８年
【非特許文献１４】
ファルマシア、第３８巻、第９号、第８５１〜８５５ページ、２００２年
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
骨代謝疾患の一つである骨粗鬆症の治療には様々な薬剤が使用されているが、治療薬剤を選択するにあたっては患者の骨代謝状態を把握することが必要であり、骨代謝回転が高代謝回転型であるか、それとも低代謝回転型であるかによって適応する薬剤が決定される。高代謝回転型では破骨細胞による骨吸収の効果を阻害する骨吸収抑制剤が使用され、低代謝回転型では骨芽細胞を増加させる骨形成促進剤が使用される（松本俊夫編、「分子骨代謝学と骨粗鬆症」、メジカルビュー社、第２９３〜２９５ページ、１９９６年：これらを従来技術１と略記することがある。）。前記特許文献３に記載されたスフィンゴシン骨格を有する化合物は、哺乳動物固有の化合物であって、破骨細胞による骨吸収を阻害することによる、骨密度の増加を促す効果を発揮する骨吸収抑制剤であった。
【００１０】
しかしながら、他の先行技術文献には、破骨細胞と骨芽細胞は互いに局所因子を分泌し、それぞれの分化や活性化に影響を及ぼしていることから、骨吸収抑制剤による破骨細胞活性化は、骨芽細胞の不活性化を引き起こし、骨代謝回転を鈍化させる可能性が高いと考えられる旨の記載がある（特開平１０−２９９５０号公報、第２欄、第１８行：これらを従来技術２と略記することがある。）ことからも明らかなように、当該技術分野では、骨粗鬆症やその他の骨代謝疾患に有用な新規な骨形成促進剤の開発が待望されていた。
【００１１】
本発明者等は、珊瑚を食餌とし、漁場の生態系を破壊することが懸念され、大量に捕獲されて廃棄されている、棘皮動物門に属するヒトデなどの有効利用法を検討する中で、これらから抽出精製される、α−オキシ脂肪酸、及びスフィンゴシン骨格又はフィトスフィンゴシン骨格を有するスフィンゴ糖脂質、並びにスフィンゴリン糖脂質に骨芽細胞の増殖を促進する効果が有することを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、骨粗鬆症やその他の骨代謝疾患の治療及び／又は予防に有用な新規な骨形成促進剤を提供することを目的とするものである。
他方、本発明は、水産業の現場において環境上の重大な社会問題として捉えられ、日本の沿岸域で大量に捕獲されるにもかかわらず未だ有効な利用方法が見出されていない棘皮動物を利用し、骨形成促進効果を付与した飲食品組成物及び飼料組成物を製造することによって、環境問題を解決するだけでなく、水産業の発展に寄与する技術を提供することも目的とするものである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
前記課題を解決する本発明の第一の態様は、α−オキシ脂肪酸及びスフィンゴシン骨格を有する化合物を有効成分とする骨形成促進剤であって、α−オキシ脂肪酸及びスフィンゴシン骨格を有する化合物が、セラミド、セレブロシド、ラクトシルセラミド、スルファチド、及びガングリオシドの群より選択される１種又は複数種の混合物であること、であり、本発明は、前記有効成分が棘皮動物門に属する生物から精製されることを望ましい態様とする。また、本発明は、該骨形成促進剤が、骨粗鬆症、慢性関節リューマチ、骨ページェット病、又は変形性関節炎の予防・治療剤であることも望ましい態様としている。
【００１３】
前記課題を解決する本発明の第二の態様は、α−オキシ脂肪酸及びフィトスフィンゴシン骨格を有する化合物を有効成分とする骨形成促進剤であって、α−オキシ脂肪酸及びフィトスフィンゴシン骨格を有する化合物が、セラミド、セレブロシド、ラクトシルセラミド、スルファチド、及びガングリオシドの群より選択される１種又は複数種の混合物であること、であり、本発明は、前記有効成分が棘皮動物門に属する生物から精製されることを望ましい態様とする。また、本発明は、該骨形成促進剤が、骨粗鬆症、慢性関節リューマチ、骨ページェット病、又は変形性関節炎の予防・治療剤であることも望ましい態様としている。
【００１４】
前記課題を解決する本発明の第三の態様は、スフィンゴリン糖脂質を有効成分とする骨形成促進剤であって、スフィンゴリン糖脂質が、イノシトールホスフォセラミド及び／又はシアロシルイノシトールホスフォセラミドであること、であり、本発明は、前記有効成分が棘皮動物門に属する生物から精製されることを望ましい態様としている。また、本発明は、該骨形成促進剤が、骨粗鬆症、慢性関節リューマチ、骨ページェット病、又は変形性関節炎の予防・治療剤であることも望ましい態様としている。
前記課題を解決する本発明の第四の態様は、前記骨形成促進剤を添加してなる飲食品組成物又は飼料組成物、である。
【００１５】
【発明の実施の形態】
次に、本発明について更に詳細に説明する。尚、本明細書において百分率は特に断りのない限り質量による表示である。
本発明の骨形成促進剤は、骨芽細胞の増殖を促進することによって、骨代謝疾患の治療のような骨強化を目的とした治療及び／又は予防に利用することが可能であり、骨粗鬆症、慢性関節リューマチ、骨ページェット病、及び変形性関節炎等の治療薬剤として有用であると考えられる。従って、本発明の骨形成促進剤による骨芽細胞増殖促進効果は、前記特許文献３に記載された破骨細胞による骨吸収を抑制する効果に対して、骨代謝における正反対の関係に位置する作用効果であって、特許文献３に開示された技術からは予期することができない格別のものである。
【００１６】
本発明の骨形成促進剤の有効成分は、棘皮動物門に属する生物から精製されることが好ましい。ここで、棘皮動物門に属する生物としては、分類上、具体的には、海星〔ヒトデ〕綱（例えば、ホシヒトデ、アオヒトデ、ヤツデスナヒトデ、オニヒトデ、ムラサキヒトデ等）、蛇尾〔クモヒトデ〕綱（例えば、スナクモヒトデ、ニホンクモヒトデ等）、海胆〔ウニ〕綱（例えば、ムラサキウニ、バフンウニ等）、海鼠〔ナマコ〕綱（例えば、クロナマコ、シロナマコ等）、及び海百合〔ウミユリ〕綱（例えば、トリノアシ、ニッポンウミシダ、コアシウミシダ、オオウミシダ等）が例示される。
【００１７】
一般的に、スフィンゴ糖脂質とは、図１に示すように、スフィンゴシン骨格又はフィトスフィンゴシン骨格を有する長鎖塩基と脂肪酸よりなるセラミドをアグリコンとし、このアグリコン部に、ガラクトースやグルコース等の中性単糖が結合したものをセレブロシド、乳糖が結合したものをラクトシルセラミド、単糖又はオリゴ糖と硫酸基が結合したものをスルファチド、及び中性糖とアミノ糖（含まれない場合もある）とシアル酸が結合したものをガングリオシド、等として分類している。尚、海洋無脊椎動物である棘皮動物門に属する生物由来のスフィンゴ糖脂質では、図１に示す脂肪酸部のα位がオキシ化されている化合物が存在する。
【００１８】
本発明の骨形成促進剤の有効成分であるスフィンゴ糖脂質としては、具体的には、分子内の脂肪酸のα位がオキシ化されたスフィンゴシン骨格を有する、セラミド、セレブロシド、ラクトシルセラミド、スルファチド、及びガングリオシド等、若しくは、分子内の脂肪酸のα位がオキシ化されフィトスフィンゴシン骨格（即ち、スフィンゴシン骨格中の４位と５位の二重結合部分の４位に水酸基が、５位に水素がそれぞれ飽和された構造）を有する、セラミド、セレブロシド、ラクトシルセラミド、スルファチド、及びガングリオシド等、が例示される。α−オキシ脂肪酸及びスフィンゴシン骨格を有するセラミドの基本構造（Ｒ_２ −Ｃｅｒ１）を化１、α−オキシ脂肪酸及びフィトスフィンゴシン骨格を有するセラミドの基本構造（Ｒ_２ −Ｃｅｒ２）を化２にそれぞれ示す。また、本発明の骨形成促進剤の有効成分には、基本構造にイノシトールホスホセラミドを含有するスフィンゴ糖脂質であるスフィンゴリン糖脂質も含まれ、スフィンゴリン糖脂質として、具体的には、イノシトールホスフォセラミド又はこれにシアル酸等が結合したシアロシルイノシトールホスフォセラミドが例示される。イノシトールホスフォセラミドの基本構造（Ｒ_３ −Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｃｅｒ）を化３に示す。尚、本明細書において、特段の分類や説明がなされる場合を除いて、前記のα−オキシ脂肪酸及びスフィンゴシン骨格を有するスフィンゴ糖脂質、α−オキシ脂肪酸及びフィトスフィンゴシン骨格を有するスフィンゴ糖脂質、及びスフィンゴリン糖脂質を総称して、スフィンゴ糖脂質と記載する。
【００１９】
【化１】

【００２０】
【化２】

【００２１】
【化３】

【００２２】
ここで、「有効成分」とは、本発明の骨形成促進剤において、哺乳動物等の骨芽細胞を増殖する効果を有する成分を意味し、前記スフィンゴ糖脂質が本発明の骨形成促進剤の主成分である必要は無い。また、本発明の骨形成促進剤にはスフィンゴ糖脂質以外に骨芽細胞増殖効果又は骨形成促進効果を有する成分が含まれていても良い。本発明の骨形成促進剤の有効成分は、棘皮動物から抽出精製して製造することが可能であり、該成分としては、例えば、棘皮動物を抽出原料として得られる抽出物、該抽出物の希釈液又は濃縮液、該抽出液を乾燥して得られる乾燥物、若しくはこれらの粗精製物又は精製物等が用いられる。棘皮動物としては、具体的に、海星〔ヒトデ〕綱（例えば、ホシヒトデ、アオヒトデ、ヤツデスナヒトデ、オニヒトデ、ムラサキヒトデ等）、蛇尾〔クモヒトデ〕綱（例えば、スナクモヒトデ、ニホンクモヒトデ等）、海胆〔ウニ〕綱（例えば、ムラサキウニ、バフンウニ等）、海鼠〔ナマコ〕綱（例えば、クロナマコ、シロナマコ等）、及び海百合〔ウミユリ〕綱（例えば、トリノアシ、ニッポンウミシダ、コアシウミシダ、オオウミシダ等）等が例示され、これらから前記有効成分を抽出精製することが可能である。
【００２３】
本発明の骨形成促進剤の有効成分の製造方法の一例としては、好適には、図２に示すフローチャートに基づいた方法が例示され、その具体内容は、次に記載するとおりである。即ち、棘皮動物をミキサーにてホモジナイズし、次いで、クロロホルムとメタノールの混合液で抽出を行い、ろ過した後に抽出液を濃縮する。これに水を加えて懸濁した後、酢酸エチルとｎ−ブタノールの混合液を添加して、分配操作を行い、酢酸エチル／ｎ−ブタノール層（α）と水層（β）に分取し、それぞれ別々に抽出操作を続ける。酢酸エチル／ｎ−ブタノール層（α）を、濃縮した後にアセトンを加えて混合し、アセトン可溶性画分とアセトン不溶性画分に分取する。次いで、各々の画分中に含まれる有機溶媒を揮発させてエキスＡ（アセトン可溶性画分）、エキスＢ（アセトン不溶性画分）を調製する。先に分取した水層（β）に水飽和ｎ−ブタノールを添加して分配操作を行い、ｎ−ブタノール層（γ）と水層（σ）に分取する。ｎ−ブタノール層（γ）の有機溶媒を揮発させてエキスＣとする。また、水層（σ）を濃縮した後に、６０％メタノールに溶解する。成分の分離には溶出液であるメタノール溶液の濃度を６０〜１００％まで段階的に上昇させて溶出させるステップワイズグラジエント法により逆相カラムクロマトグラフィーを行い、１００％メタノール溶出画分の有機溶媒を揮発させてエキスＤを調製する。調製した各エキスを、それぞれ引き続き順相カラムクロマトグラフィー等による分離工程に供することによって、エキスＡからセラミド、エキスＢからセレブロシド、エキスＣからラクトシルセラミド、及びエキスＤからスルファチド、ガングリオシド、又はスフィンゴリン糖脂質、をそれぞれ精製することができる。
【００２４】
本発明の骨形成促進剤の抽出精製の際に使用する溶媒は、特に限定されるものではないが、水、有機溶媒又はこれらの混合物を使用することが好ましい。抽出溶媒として使用し得る水には、水に各種処理（例えば、精製、加熱、殺菌、濾過、イオン交換、浸透圧の調整、緩衝化等）を施したもの、例えば、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。抽出溶媒として使用し得る有機溶媒としては、酢酸エチル、酢酸ブチルなどのエステル、メタノール、エタノール、ブタノール、イソプロピルアルコールなどのアルコール、ヘプタン、ヘキサン、イソオクタンなどの脂肪属炭化水素、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン、ベンゼン、トルエンなどの芳香族化合物、ジエチルエーテル、ｔ−ブチルエーテルなどのエーテル、塩化メチレン、クロロホルム、１，２−ジクロロエタンなどの低級脂肪族炭化水素化合物等が例示され、中でも、メタノール、ｎ−ブタノール、クロロホルムを使用することが好ましい。尚、製造に使用する原料の棘皮動物の種類や、製造する有効成分（スフィンゴ糖脂質）の種類に応じて、有機溶媒を適宜選択し、濃度を調整することができる。また、数種の有機溶媒を混合して使用することもでき、その混合比等は適宜調整することが可能である。
【００２５】
また、本発明の骨形成促進剤の有効成分の製造方法の中で使用される分離方法としては、好適には、吸着クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ゲル充填のカラムクロマトグラフィー等を１種又は数種を組合わせて使用する方法が例示される。本発明の骨形成促進剤の有効成分は、前記製造方法によって棘皮動物から得られたものの他に、同様の構造を有する化合物を化学合成によって製造して使用することも可能である。本発明の骨形成促進剤の有効成分であるスフィンゴ糖脂質の中で、α−オキシ脂肪酸及びスフィンゴシン骨格を有する化合物、α−オキシ脂肪酸及びフィトスフィンゴシン骨格を有する化合物、及びスフィンゴリン糖脂質は、それぞれ単独で使用することも、あるいは複数種の化合物を選択して混合物として使用することも可能である。本発明の組成物の形態は特に限定されるものではなく、本発明の骨形成促進剤の組成物の形態としては、例えば、医薬組成物、飲食品組成物、飼料組成物等が挙げられる。本発明の組成物は、棘皮動物から抽出精製されるスフィンゴ糖脂質それ自体であっても良いし、スフィンゴ糖脂質以外の成分を含有しても良い。スフィンゴ糖脂質以外の成分は、組成物の形態に応じて適宜選択することができる。
【００２６】
医薬組成物は、例えば、スフィンゴ糖脂質を薬学的に許容され得る賦形剤、その他任意の添加剤を用いて製剤化することにより製造することができ、製剤化したスフィンゴ糖脂質は骨形成促進剤として使用することができる。製剤化する場合、製剤中のスフィンゴ糖脂質の含有量は、通常、０．０００００１〜０．１質量％、好ましくは０．０００１〜０．０１質量％である。製剤化にあたっては、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤、注射用溶剤等の添加剤を使用することが可能である。賦形剤としては、例えば、乳糖、ブドウ糖、マンニット、ソルビット等の糖誘導体；トウモロコシ澱粉、馬鈴薯澱粉、α−デンプン、デキストリン、カルボキシメチルデンプン等のデンプン誘導体；結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム等のセルロース誘導体；アラビアゴム；デキストラン；プルラン；軽質無水ケイ酸、合成ケイ酸アルミニウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム等のケイ酸塩誘導体；リン酸ナトリウム、リン酸カルシウム等のリン酸塩誘導体；炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム等の炭酸塩誘導体；硫酸ナトリウム、硫酸カルシウム等の硫酸塩誘導体が挙げられる。
【００２７】
結合剤としては、例えば、上記賦形剤の他、ゼラチン；ポリビニルピロリドン；マクロゴール等が挙げられる。崩壊剤としては、例えば、上記賦形剤の他、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドン等の化学修飾されたデンプン又はセルロース誘導体等が挙げられる。滑沢剤としては、例えば、タルク；ステアリン酸；ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム等のステアリン酸金属塩；コロイドシリカ；ビーガム、ゲイロウ等のワックス類；ホウ酸；グリコール；フマル酸、アジピン酸等のカルボン酸類；安息香酸ナトリウム等のカルボン酸ナトリウム塩；硫酸ナトリウム等の硫酸塩；ロイシン；ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム等のラウリル硫酸塩；無水ケイ酸、ケイ酸水和物等のケイ酸類；デンプン誘導体等が挙げられる。安定剤としては、例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン等のパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコール等のアルコール類；塩化ベンザルコニウム；無水酢酸；ソルビン酸等が挙げられる。矯味矯臭剤としては、例えば、甘味料、酸味料、香料等が挙げられる。注射用溶剤としては、例えば、水、エタノール、グリセリン等が挙げられる。
【００２８】
医薬組成物の投与経路としては、例えば、経口投与、経腸投与等の非経口投与が挙げられる。医薬組成物の投与剤形としては、例えば、注射剤、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、坐剤、軟膏、テープ剤等が挙げられる。また、医薬組成物は飲食品、又は飼料等に配合して投与することもできる。投与量及び投与回数は、目的とする作用効果、投与方法、治療期間、年齢、性別、体重等により異なるが、投与量は成人１日当たり、通常、０．００１〜１０００ｍｇ、好ましくは０．１〜１００ｍｇの範囲から適宜選択でき、投与回数は１日１回から数回の範囲から適宜選択できる。
【００２９】
飲食品組成物は、例えば、本発明の骨形成促進剤の有効成分であるスフィンゴ糖脂質に、デキストリン、デンプン等の糖類；ゼラチン、カゼイン、ホエー、大豆タンパク、トウモロコシタンパク等のタンパク質；アラニン、グルタミン、イソロイシン等のアミノ酸類；セルロース、グアガム、ジェランガム、アラビアガム等の多糖類；大豆油、中鎖脂肪酸トリグリセリド等の油脂類等を配合することにより製造できる。飲食品組成物の形態としては、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果汁飲料、乳酸菌飲料等の飲料（これらの飲料の濃縮原液及び調整用粉末を含む）；アイスクリーム、シャーベット、氷菓等の冷菓；そば、うどん、はるさめ、餃子及びしゅうまいの皮、中華麺、即席麺等の麺類；飴、チューインガム、キャンディー、チョコレート、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、焼き菓子、錠菓等の菓子類；かまぼこ、ハム、ソーセージ等の水産・畜産加工食品；加工乳、発酵乳、調製粉乳等の乳製品；サラダ油、てんぷら油、マーガリン、マヨネーズ、ショートニング、ホイップクリーム、ドレッシング等の油脂及び油脂加工食品；ソース、たれ等の調味料；スープ、シチュー、サラダ、惣菜、漬物；パン類；経腸栄養食；機能性食品等が例示される。尚、飲食品組成物を製造する際に添加する骨形成促進剤の有効成分であるスフィンゴ糖脂質の含有量は、０．０００１〜０．１質量％の範囲から適宜選択することができる。
【００３０】
飼料組成物は、例えば、スフィンゴ糖脂質に、トウモロコシ、小麦、大麦、ライ麦等の穀類；ふすま、麦糠、米糠、脱脂米糠等の糠類；コーングルテンミール、コーンジャムミール等の製造粕類；脱脂粉乳、ホエー、魚粉、骨粉等の動物性飼料類；ビール酵母等の酵母類；リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の鉱物質飼料；油脂類；アミノ酸類；糖類等を配合することにより製造することができる。飼料組成物の形態としては、愛玩動物用飼料（ペットフード等）、家畜飼料、養魚飼料等が例示される。尚、飼料組成物を製造する際に添加する骨形成促進剤の有効成分であるスフィンゴ糖脂質の含有量は、０．０００１〜０．１質量％の範囲から適宜選択することができる。本発明の組成物は、単独で使用しても良いが、その他の骨形成促進剤や骨疾患予防・治療剤等と併用しても良い。併用によって、骨形成や骨疾患の予防・治療効果を高めることができる。また、併用する骨形成促進剤や骨疾患予防・治療剤等は、本発明の組成物中に有効成分として含有させても良いし、本発明の組成物中には含有させずに別個の薬剤として組み合わせて製品として良い。
【００３１】
次に、本発明の骨形成促進剤の有効成分であるスフィンゴ糖脂質の製造例を説明する。尚、各スフィンゴ糖脂質の構造は、マススペクトル法（ＭＳ）、核磁気共鳴スペクトル法（ＮＭＲ）等を利用して決定した。
製造例１
（α−オキシ脂肪酸及びフィトスフィンゴシン骨格を有するセラミドの製造）
ヤツデスナヒトデ（学名：Ｌｕｉｄｉａ ｍａｃｕｌａｔａ ）１ｋｇをミキサーにてホモジナイズし、クロロホルム／メタノール（クロロホルム：メタノール＝１ ：２ ）の混合液２リットルで抽出を行い、ろ過した後に抽出液を濃縮した。該濃縮画分（４１．４ｇ）に水を２５０ｍｌ加えて懸濁した後、酢酸エチル／ｎ−ブタノール（酢酸エチル：ｎ−ブタノール＝３ ：１ ）の混合液２５０ｍｌを添加して、分配操作を行い、酢酸エチル／ｎ−ブタノール層と水層を分取した。このうち酢酸エチル／ｎ−ブタノール層を濃縮し、この濃縮画分（９．９ｇ）にアセトンを加えて混合し、アセトン可溶性画分を回収した後に有機溶媒を揮発させてエキスＡ約５．３ｇを得た。次いで、該エキスＡをクロロホルム５ｍｌに溶解して順相カラム（Ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０ ：メルク社製）に添加し、溶出溶媒にクロロホルム／メタノール混合液（クロロホルム：メタノール＝１００：０、９８：２、９５：５ 、９：１、８５：１５、７：３、及び６：４の各混合比）を使用し、メタノール濃度を段階的に上昇させるステップワイズグラジエント法により溶出した。順相薄層クロマトグラフィーにて既存のセラミドと同様の挙動を示す画分を回収し、該画分について、更に、順相カラムに添加してクロロホルムメタノール混合液（クロロホルム：メタノール＝９７：３→９５：５）で溶出させ、順相薄層クロマトグラフィーにて単一物質の挙動を示すＬＭＣｅｒ−１（３ｍｇ）及びＬＭＣｅｒ−２（４ｍｇ）の２種類のセラミドを各々製造した。ＬＭＣｅｒ−１の構造式を化４、及びＬＭＣｅｒ−２の構造式を化５に各々示す。
【００３２】
化４
Ｈ−Ｃｅｒ１
化５
Ｈ−Ｃｅｒ２
【００３３】
製造例２
（α−オキシ脂肪酸及びフィトスフィンゴシン骨格を有するセレブロシドの製造）
ヤツデスナヒトデ１ｋｇをミキサーにてホモジナイズし、クロロホルム／メタノール（クロロホルム：メタノール＝１：２）の混合液２リットルで抽出を行い、ろ過した後に抽出液を濃縮した。この濃縮画分に水を２５０ｍｌ加えて懸濁した後、酢酸エチル／ｎ−ブタノール（酢酸エチル：ｎ−ブタノール＝３：１）の混合液２５０ｍｌを添加して、分配操作を行い、酢酸エチル／ｎ−ブタノール層と水層を分取した。酢酸エチル／ｎ−ブタノール層は、濃縮した後にアセトンを加えて混合して、アセトン不溶性画分を回収し、更に、有機溶媒を揮発させてエキスＢ約４．５ｇを得た。次いで、該エキスＢをクロロホルム／メタノール／水（混合比＝９：１：０．０５）混合液５ｍｌに溶解し、順相カラム（Ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ６０ ：メルク社製）に添加して、同混合液で溶出した。順相薄層クロマトグラフィーにて既存のセレブロシドと同様の挙動を示す画分について回収し、該画分を逆相カラム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ １４０ Ｃ１８−ＰＲＥＰ：ナカライ社製）に添加して、１００％メタノールにて溶出した。次いで、順相薄層クロマトグラフィーにて既存のセレブロシドと同様の挙動を示す画分を、ゲル濾過カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０：ファルマシア社製）に添加して、クロロホルム／メタノール（クロロホルム：メタノール＝１：１）混合液を溶出液としてカラムクロマトグラフィーを行い、順相薄層クロマトグラフィーにて単一物質の挙動を示すＬＭＣ−１（５ｍｇ）及びＬＭＣ−２（６ｍｇ）の２種類のセレブロシドを各々製造した。ＬＭＣ−１の構造式を化６、及びＬＭＣ−２の構造式を化７に各々示す。
【００３４】
化６
Ｇｌｃβ１→１Ｃｅｒ１
（Ｇｌｃ：グルコース）
化７
Ｇｌｃβ１→１Ｃｅｒ２
（Ｇｌｃ：グルコース）
【００３５】
製造例３
（α−オキシ脂肪酸及びフィトスフィンゴシン骨格を有するラクトシルセラミドの製造）
ヤツデスナヒトデ１ｋｇをミキサーにてホモジナイズし、クロロホルム／メタノール（クロロホルム：メタノール＝１：２）の混合液２リットルで抽出を行い、ろ過した後に抽出液を濃縮した。これに水を２５０ｍｌ加えて懸濁した後、酢酸エチル／ｎ−ブタノール（酢酸エチル：ｎ−ブタノール＝３：１）の混合液２５０ｍｌを添加して、分配操作を行い、酢酸エチル／ｎ−ブタノール層と水層として分取した。ここで、分取した水層に更に水飽和ｎ−ブタノールを添加して分配操作を行い、ｎ−ブタノール層と水層として分取し、このうちｎ−ブタノール層について有機溶媒を揮発させてエキスＣとした。エキスＣの乾燥重量は約３．２ｇであった。次いで、該エキスＣをクロロホルム／メタノール（クロロホルム：メタノール＝１：１）混合液５ｍｌに溶解し、逆相カラム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ １４０
Ｃ１８−ＰＲＥＰ：ナカライ社製）に添加し、同混合液にて溶出した。次いで、順相薄層クロマトグラフィーにて既存のラクトシルセラミドと同様の挙動を示す画分を回収した。該画分を順相カラム（Ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０：メルク社製）に添加し、混合比がクロロホルム：メタノール：水＝９：１．５：０．５、８：２：０．２、及び６：４：１の各クロロホルム／メタノール／水混合液を使用して、メタノール濃度を段階的に上昇させるステップワイズグラジエント法により溶出した。溶出画分のうち、順相薄層クロマトグラフィーにて単一物質の挙動を示すＬＭＣＤＨ−１（１．７ｍｇ）及びＬＭＣＤＨ−２（１．４ｍｇ）の２種類のラクトシルセラミドを各々製造した。ＬＭＣＤＨ−１の構造式を化８、及びＬＭＣＤＨ−２の構造式を化９に各々示す。
【００３６】
化８
Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１→１Ｃｅｒ１
（Ｇａｌ：ガラクトース、Ｇｌｃ：グルコース）
化９
Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１→１Ｃｅｒ２
（Ｇａｌ：ガラクトース、Ｇｌｃ：グルコース）
【００３７】
製造例４
（α−オキシ脂肪酸及びフィトスフィンゴシン骨格を有するガングリオシドの製造）
ヤツデスナヒトデ１ｋｇをミキサーにてホモジナイズし、クロロホルム／メタノール（クロロホルム：メタノール＝１：２）の混合液２リットルで抽出を行い、ろ過した後に抽出液を濃縮した。これに水を２５０ｍｌ加えて懸濁した後、酢酸エチル／ｎ−ブタノール（酢酸エチル：ｎ−ブタノール＝３：１）の混合液２５０ｍｌを添加して、分配操作を行い、酢酸エチル／ｎ−ブタノール層と水層として分取した。ここで、分取した水層に更に水飽和ｎ−ブタノールを添加して分配操作を行い、ｎ−ブタノール層と水層として分取して、そのうちの水層を回収した。該水層を濃縮した後に、逆相カラム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ １４０ Ｃ１８−ＰＲＥＰ：ナカライ社製）を用いて分離を行った。成分の分離には溶出液であるメタノール溶液の濃度を６０〜１００％まで段階的に上昇させて溶出させるステップワイズグラジエント法により行った。メタノールの濃度が１００％に達した時点の溶出画分の有機溶媒を揮発させてエキスＤ約０．１８ｇを調製した。次いで、該エキスＤをクロロホルム／メタノール／水（クロロホルム：メタノール：水＝６：４：１）混合液に溶解し、順相カラム（Ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０：メルク社製）に添加して同混合液で溶出した。次いで、ゲル濾過カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０：ファルマシア社製）に添加して脱塩し、順相薄層クロマトグラフィーにて単一物質の挙動を示すスルファチドＬＭＧ−１（０．６７ｍｇ）及びガングリオシドＬＭＧ−２（２．４ｍｇ）を各々製造した。ＬＭＧ−１の構造式を化１０、ＬＭＧ−２の構造式を化１１に各々示す。
【００３８】
化１０
３−Ｏ−ＨＳＯ_３ Ｇａｌβ１→４Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１→１Ｃｅｒ２
（Ｇａｌ：ガラクトース、Ｇｌｃ：グルコース）
化１１
ＮｅｕＡｃα２→３Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１→１Ｃｅｒ２
（ＮｅｕＡｃ：Ｎ−アセチルノイラミン酸、Ｇａｌ：ガラクトース、Ｇｌｃ：グルコース）
【００３９】
製造例５
（α−オキシ脂肪酸及びフィトスフィンゴシン骨格を有するガングリオシドの製造）
出発原料として、アオヒトデ（学名：Ｌｉｎｃｋｉａ ｌａｅｖｉｇａｔａ ）１８ｋｇを用い、製造例４と同様の方法でガングリオシドＬＬＧ−３（５８ｍｇ）及びＬＬＧ−５（７０ｍｇ）を各々製造した。ＬＬＧ−３の構造式を化１２、ＬＬＧ−５の構造式を化１３に示す。
【００４０】
化１２
８−Ｏ−ＣＨ_３ ＮｅｕＡｃα２→１１ＮｅｕＧｃα２→３Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１→１Ｃｅｒ２
（ＮｅｕＡｃ：Ｎ−アセチルノイラミン酸、ＮｅｕＧｃ：Ｎ−グリコリルノイラミン酸、Ｇａｌ：ガラクトース、Ｇｌｃ：グルコース）
化１３
８−Ｏ−ＣＨ_３ ＮｅｕＧｃα２→１１ＮｅｕＧｃα２→１１ＮｅｕＧｃα２→３Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１→１Ｃｅｒ２
（ＮｅｕＧｃ：Ｎ−グリコリルノイラミン酸、Ｇａｌ：ガラクトース、Ｇｌｃ：グルコース）
【００４１】
製造例６
（α−オキシ脂肪酸及びフィトスフィンゴシン骨格を有するガングリオシドの製造）
出発原料として、ムラサキヒトデ（学名：Ａｓｔｅｒｉａｓ ａｍｕｒｅｎｓｉｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ ）６５ｋｇを用い、製造例４と同様の方法でガングリオシドＧＡＡ−７（８６ｍｇ）を製造した。ＧＡＡ−７の構造式を化１４に示す。
【００４２】
化１４
８−Ｏ−ＣＨ_３ ＮｅｕＧｃα２→６〔８−Ｏ−ＣＨ_３ ＮｅｕＧｃα２→３〕ＧａｌＮＡｃβ１→３Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃβ１→１Ｃｅｒ２
（ＮｅｕＧｃ：Ｎ−グリコリルノイラミン酸、ＧａｌＮＡｃ：Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｇａｌ：ガラクトース、Ｇｌｃ：グルコース）
【００４３】
製造例７
（スフィンゴリン糖脂質の製造）
出発原料として、ニッポンウミシダ（学名：Ｃｏｍａｎｔｈｕｓ ｊａｐｏｎｉｃａ）７．６ｋｇを用い、製造例４と同様の方法でニッポンウミシダ由来のエキスＤを製造した。該エキスＤをクロロホルム／メタノール／水混合液（クロロホルム：メタノール：水＝８：２：０．２）２ｍｌに溶解し、順相カラム（Ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０：メルク社製）に添加して、混合比がクロロホルム：メタノール：水＝８：２：０．２及び６：４：１の各クロロホルム／メタノール／水混合液を使用して、メタノール濃度を上昇させるステップワイズグラジエント法により溶出した。薄層クロマトグラフィー上でスフィンゴリン糖脂質ＣＪＰ−１（９２ｍｇ）、ＣＪＰ−２（１７０．６ｍｇ）及びＣＪＰ−３（５６８．５ｍｇ）を製造した。ＣＪＰ−１の構造式を化１５、ＣＪＰ−２の構造式を化１６、ＣＪＰ−３の構造式を化１７に示す。
【００４４】
化１５
Ｉｎｓ１→Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｃｅｒ
（Ｉｎｓ ：イノシトール）
化１６
９−ＯＣＨ_３ ＮｅｕＧｃα２→３Ｉｎｓ１→Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｃｅｒ
（ＮｅｕＧｃ：Ｎ−グリコリルノイラミン酸、Ｉｎｓ：イノシトール）
化１７
９−ＯＣＨ_３ ＮｅｕＧｃα２→１１〔９−ＯＣＨ_３ 〕ＮｅｕＧｃα２→３Ｉｎｓ１→Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｃｅｒ
（ＮｅｕＧｃ：Ｎ−グリコリルノイラミン酸、Ｉｎｓ：イノシトール）
【００４５】
尚、前記製造例１〜６において、本発明者等が棘皮動物から抽出精製したα−オキシ脂肪酸、及びスフィンゴシン骨格又はフィトスフィンゴシン骨格を有するスフィンゴ糖脂質は、哺乳類や植物から精製されるものとは異なり、棘皮動物特有の構造を有することが確認され、分子内の脂肪酸のα位がオキシ化されている点で、前記特許文献３に記載のスフィンゴシン骨格を有する化合物とは構造上異なる化合物であることが分かった。また、前記製造例７で製造したスフィンゴリン糖脂質は、ウミユリ類やウミシダ類に特有のスフィンゴリン糖脂質の構造を有していた。
【００４６】
次に、試験例を示して本発明を詳細に説明する。
試験例１
本試験は、棘皮動物から抽出精製したスフィンゴ糖脂質の骨芽細胞増殖促進活性を測定するために行った。
（１）試料の調製
前記製造例１〜７で製造した各スフィンゴ糖脂質（ＬＭＣｅｒ−１、ＬＭＣｅｒ−２、ＬＭＣ−１、ＬＭＣ−２、ＬＭＣＤＨ−１、ＬＭＣＤＨ−２、ＬＬＧ−３、ＬＬＧ−５、ＧＡＡ−７、ＣＪＰ−１、ＣＪＰ−２、ＣＪＰ−３）をそれぞれ試験試料として使用した。また、α−オキシ脂肪酸及びフィトスフィンゴシン骨格を持たない従来のスフィンゴ糖脂質の一種であるＣ２セラミド（Ｎ−Ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ ｓｅｍｉｓｙｎｔｈｅｔｉｃ：シグマ社製、カタログＮｏ．Ａ７１９１）を対照試料として使用した。
【００４７】
（２）試験方法
マウス骨芽細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１（ＲＣＢ１１２６：理研セルバンク）を、各々１０％牛胎児血清を含むα−ＭＥＭ培地（ギブコＢＲＬ社製）中で、１ウェル当たり５×１０^４ 個となるように９６ウェルマイクロプレートに分注し、３７℃、５％炭酸ガス存在下で１８時間培養した。培養後に培地を除去し、改めて２％牛胎児血清を含むα−ＭＥＭ培地を各ウェルに１００μｌずつ添加した。次いで、各ウェルに各試験試料及び対照試料を最終濃度が０．２μｇ／ｍｌとなるように添加して更に２日間培養した。培養終了時間の６時間前に各ウェルに５０ｎＣｉ量となるようにトリチウムチミジンを添加した。培養終了後、各ウェルのＤＮＡ合成量を液体シンチレーションカウンター（ＬＫＢ１２１９ ＲＡＣＫ−ＢＥＴＡ：ＬＫＢ社製）を使用して測定した。
【００４８】
（３）試験結果
本試験の結果を図３に示す。図３は、棘皮動物から抽出精製したスフィンゴ糖脂質による骨芽細胞の増殖促進活性を示す。その結果、各試験試料に使用した棘皮動物由来のスフィンゴ糖脂質は、対照試料のＣ２セラミドに対して高い骨芽細胞増殖促進効果を有することが明らかとなった。その中でもフィトスフィンゴシン骨格を有するスフィンゴ糖脂質（ＬＭＣｅｒ−２、ＬＭＣ−２、ＬＭＣＤＨ−２、ＬＬＧ−３、ＬＬＧ−５、ＧＡＡ−７）はスフィンゴシン骨格を有するそれに比して、総じて活性が強いことが判明した。従って、棘皮動物に特異的な構造（例えば、α−オキシ脂肪酸、フィトスフィンゴシン骨格を有する等）を有するスフィンゴ糖脂質は従来のスフィンゴ糖脂質に比して、より強い骨芽細胞増殖促進効果を有することが明らかとなった。
【００４９】
試験例２
本試験は、棘皮動物から抽出精製したスフィンゴ糖脂質を投与したマウスのｅｘ ｖｉｖｏにおける骨芽細胞増殖促進活性を測定するために行った。
（１）試料の調製
前記製造例で製造したスフィンゴ糖脂質のうち、ＬＭＣｅｒ−２、ＬＭＣＤＨ−２、ＣＪＰ−３、ＬＧＧ−３をそれぞれ試験試料として使用した。また、陰性試料として生理食塩水を使用した。
【００５０】
（２）試験方法
本試験においてマウスは、４週齢、雌性ｄｄｙマウス（日本エスエルシー社より購入）を使用した。前記マウスの卵巣を摘出した後、７週間低カルシウム食を給餌して作成した、骨粗鬆症モデルマウスを１群６匹に群分けした。生理食塩水にて１０μｇ／ｍｌに調製した各試験試料溶液を、該骨粗鬆症モデルマウスに各々２００μｌずつ、尾静脈より１日１回１４日間静脈内投与した。投与完了後、大腿骨及び脛骨の骨髄細胞をＲＰＭＩ１６４０培地（ギブコＢＲＬ社製）中に採取した。採取した骨芽細胞を１ウェル当たり１×１０^６ 個となるように６ウェルマイクロプレートに分注し、１０％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地にて７日間培養した。培養終了後、アルカリフォスファターゼ染色（ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＳ，Ｎｏ．８５：シグマ社製）を行い、陽性のコロニーを骨芽細胞コロニーとしてカウントした。
【００５１】
（３）試験結果
本試験の結果を図４に示す。図４は、棘皮動物から抽出精製したスフィンゴ糖脂質による骨粗鬆症モデルマウス骨髄細胞中の骨芽細胞の増殖促進活性を示す。その結果、何れの試験試料においても生体内の骨芽細胞を増殖させる作用を有することが判明した。
【００５２】
試験例３
本試験は、棘皮動物から粗精製した中間精製物であるスフィンゴ糖脂質エキスを投与したマウスのｅｘ ｖｉｖｏにおける骨芽細胞増殖促進活性を測定するために行った。
（１） 試料の調製
前記製造例１で粗精製したエキスＡ（セラミド組成物）、製造例２で粗精製したエキスＢ（セレブロシド組成物）、製造例３で粗精製したエキスＣ（ラクトシルセラミド組成物）、製造例４で粗精製したエキスＤ（ガングリオシド組成物）を各々試験試料とし、生理食塩水で５００μｇ／ｍｌとなるように溶解して試験に供した。この時、エキスＡはセラミドを１μｇ含有し、エキスＢはセレブロシドを１．２μｇ含有し、エキスＣはラクトシルセラミドを０．５μｇ含有し、エキスＤはガングリオシドを８μｇ含有している。また、哺乳類由来のセラミド（和光純薬工業社製、カタログＮｏ．０３１−１８４４１）を生理食塩水で２０μｇ／ｍｌに調製した溶液を対照試料Ａとし、セレブロシド（和光純薬工業社製、カタログＮｏ．０７６−０３９６３）を生理食塩水で２０μｇ／ｍｌに調製した溶液を対照試料Ｂとし、ガングリオシド混合物（和光純薬工業社製、カタログＮｏ．０７４−０３６４３）を生理食塩水で２０μｇ／ｍｌに調製した溶液を対照試料Ｄとし、更に、生理食塩水を陰性試料として各々試験に供した。
【００５３】
（２）試験方法
本試験において、マウスは、６週齢、雄性ｄｂ／ｄｂマウス（日本クレア社より購入）を使用した。前記マウスを１群５匹に群分けし、エキスＡ、エキスＢ、エキスＣ、エキスＤ、対照試料Ａ、対照試料Ｂ、対照試料Ｄ、及び陰性試料をマウスに各々５００μｌずつ、１日１回ゾンデを用いて３６日間連続して強制経口投与した。投与完了後、大腿骨及び脛骨の骨髄細胞をＲＰＭＩ１６４０培地（ギブコＢＲＬ社製）中に採取した。採取した骨芽細胞を１ウェル当たり１×１０^６個となるように６ウェルマイクロプレートに分注し、１０％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地にて７日間培養した。培養終了後、アルカリフォスファターゼ染色（ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＳ，Ｎｏ．８５：シグマ社製）を行い、陽性のコロニーを骨芽細胞コロニーとしてカウントし、１群５匹の平均値を算出した。
【００５４】
（３）試験結果
本試験の結果を表１に示す。表１は、棘皮動物から粗精製した中間精製物であるスフィンゴ糖脂質エキスによる骨芽細胞の増殖促進活性を示す。その結果、エキスＡ、エキスＢ、エキスＣ、エキスＤ、対照試料Ａ、対照試料Ｂ、及び対照試料Ｄは、いずれも陰性試料に対して骨芽細胞コロニー数が増加し、増殖促進活性が高いことが判明した。しかしながら、本発明のスフィンゴ糖脂質エキス（エキスＡ、エキスＢ、エキスＣ、エキスＤ）と、市販のセラミド（対照試料Ａ）、セレブロシド（対照試料Ｂ）、ガングリオシド混合物（対照試料Ｄ）について、陰性試料に対する骨芽細胞コロニー数の増加の割合を比較したところ、対照試料Ａ：３．２に対しエキスＡ（セラミド組成物）：５．０、対照試料Ｂ：１．１に対しエキスＢ（セレブロシド組成物）：２．４、対照試料Ｄ：１．３に対しエキスＤ（ガングリオシド組成物）：７．６であったことから、棘皮動物由来のスフィンゴ糖脂質エキスは、従来の哺乳動物由来のスフィンゴ糖脂質に比して優れた骨芽細胞増殖促進効果を有することが判明した。
【００５５】
【表１】

【００５６】
【実施例】
次に、実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
実施例１
次の組成の注射剤を常法により製造した。
製造例１で製造したセラミド（ＬＭＣｅｒ−２） ０．０１（％）
アクチノマイシンＤ（シグマ社製） ０．００５
塩化ナトリウム（和光純薬社製） ０．９
マンニトール（関東化学社製） １．０
注射用蒸留水（大塚製薬社製） ９８．０８５
【００５７】
実施例２
ホエー蛋白酵素分解物（森永乳業社製）１０．８ｋｇ、デキストリン（昭和産業社製）３６ｋｇ、及び少量の水溶性ビタミンとミネラルを水２００ｋｇに溶解し、水相をタンク内に調製した。これとは別に、大豆サラダ油（太陽油脂社製）３ｋｇ、パーム油（太陽油脂社製）８．５ｋｇ、サフラワー油（太陽油脂社製）２．５ｋｇ、レシチン（味の素社製）０．２ｋｇ、脂肪酸モノグリセリド（花王社製）０．２ｋｇ、及び少量の脂溶性ビタミンを混合溶解し、油相を調製した。タンク内の水相に油相を添加し、攪拌して混合した後、７０℃に加温し、更に、ホモゲナイザーにより１４．７ＭＰａの圧力で均質化した。次いで、９０℃で１０分間殺菌した後、濃縮し、噴霧乾燥して、中間製品粉末約５９ｋｇを調製した。この中間製品粉末５０ｋｇに、蔗糖（ホクレン社製）６．８ｋｇ、アミノ酸混合粉末（味の素社製）１６７ｇ、及び前記製造例７で製造したスフィンゴリン糖脂質（ＣＪＰ−３ ）６０ｇを添加し、均一に混合して、スフィンゴリン糖脂質を含有する骨形成促進効果を有する経腸栄養食粉末約５６ｋｇを製造した。
【００５８】
実施例３
前記製造例６で製造したガングリオシド（ＧＡＡ−７）１００ｇ、ラクチュロース粉末（森永乳業社製）１１０ｇ、マルツデキストリン（松谷化学工業社製）６５５ｇ、脱脂粉乳（森永乳業社製）９５ｇ、ステビア甘味料（三栄源エフ・エフ・アイ社製）１ｇ、ヨーグルト・フレーバー（三栄源エフ・エフ・アイ社製）５ｇ、グリセリン脂肪酸エステル製剤（理研ビタミン社製）３４ｇの各粉末を添加して均一に混合し、打錠機（畑鉄鋼所社製）を使用して、錠剤１錠当り０．５ｇとし、１２錠／分の打錠速度、９．８ＫＰａの圧力で前記混合粉末を連続的に打錠し、ガングリオシド（ＧＡＡ−７）含有タブレット１８００錠（約９００ｇ）を製造した。
【００５９】
実施例４
乳脂肪含量３．５％、無脂乳固形分含量９．２％の生乳１０ｋｇを均質化し、９０〜９２℃で１０分間加熱殺菌した。約４２℃に冷却し、スターターとして市販のストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）及びラクトバシラス・ブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ ）の牛乳カルチャーを各々１００ｇずつ添加した。発酵タンク内で充分に攪拌し、４２〜４５℃で４時間静置して発酵させた。この発酵乳を攪拌しながら５〜８℃に冷却し、次いで、ホモゲナイザーで均質化することによって均質化発酵乳を調製した。次に、１７％のグラニュウ糖（東洋精糖社製）液５ｋｇにペクチン（三栄源ＦＦＩ社製）６０ｇ及び前記製造例２で製造したセレブロシド（ＬＭＣ−２）３０ｇを添加して、９０〜９２℃で１０分間殺菌した後、５〜８℃に冷却して糖液を調製した。これらの方法で調製した均質化発酵乳、糖液のそれぞれ全量をタンク内で十分に混合し、紙容器に１２０ｍｌずつ充填した後、密封してドリンクヨーグルトを製造した。
【００６０】
【発明の効果】
以上詳記したとおり、本発明は、棘皮動物から抽出されるα−オキシ脂肪酸及びスフィンゴシン骨格、α−オキシ脂肪酸及びフィトスフィンゴシン骨格を有するスフィンゴ糖脂質、又はスフィンゴリン糖脂質を有効成分として含有する骨形成促進剤等に係るものであり、本発明により、以下のような効果が奏される。
（１）哺乳動物等の骨芽細胞の増殖を促進する新規骨形成促進剤を提供することができる。
（２）本発明の骨形成促進剤は、骨粗鬆症やその他の骨代謝疾患の治療及び／又は予防に効果を有する。
（３）骨粗鬆症等の予防・治療用医薬組成物、飲食品組成物、又は飼料組成物を提供することができる。
（４）水産業の現場において大量に捕獲される棘皮動物の有効な利用法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、スフィンゴ糖脂質の基本構造を示す。
【図２】図２は、棘皮動物から、α−オキシ脂肪酸、及びスフィンゴシン骨格又はフィトスフィンゴシン骨格を有するスフィンゴ糖脂質、並びにスフィンゴリン糖脂質を製造する方法を示すフローチャートである。
【図３】図３は、棘皮動物から抽出精製したスフィンゴ糖脂質による骨芽細胞の増殖促進活性を示す。
【図４】図４は、棘皮動物から抽出精製したスフィンゴ糖脂質による骨粗鬆症モデルマウス骨髄細胞中の骨芽細胞の増殖促進活性を示す。

Claims (9)

1. α−オキシ脂肪酸及びスフィンゴシン骨格を有する化合物を有効成分とすることを特徴とする骨形成促進剤。
2. α−オキシ脂肪酸及びスフィンゴシン骨格を有する化合物が、セラミド、セレブロシド、ラクトシルセラミド、スルファチド、及びガングリオシドの群より選択される１種又は複数種の混合物である請求項１に記載の骨形成促進剤。
3. α−オキシ脂肪酸及びフィトスフィンゴシン骨格を有する化合物を有効成分とすることを特徴とする骨形成促進剤。
4. α−オキシ脂肪酸及びフィトスフィンゴシン骨格を有する化合物が、セラミド、セレブロシド、ラクトシルセラミド、スルファチド、及びガングリオシドの群より選択される１種又は複数種の混合物である請求項４に記載の骨形成促進剤。
5. スフィンゴリン糖脂質を有効成分とすることを特徴とする骨形成促進剤。
6. スフィンゴリン糖脂質が、イノシトールホスフォセラミド及び／又はシアロシルイノシトールホスフォセラミドである請求項７に記載の骨形成促進剤。
7. 有効成分が、棘皮動物門に属する生物から精製された化合物である請求項１から６のいずれか一項に記載の骨形成促進剤。
8. 骨粗鬆症、慢性関節リューマチ、骨ページェット病、又は変形性関節炎の予防・治療用医薬組成物である請求項１から７のいずれか一項に記載の骨形成促進剤。
9. 請求項１から８のいずれか一項に記載の骨形成促進剤を添加してなる飲食品組成物又は飼料組成物。

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