KR20170045462A - 상엽 추출물을 유효성분으로 포함하는 IL-1β에 의한 관절염의 예방 또는 개선용 조성물 - Google Patents
상엽 추출물을 유효성분으로 포함하는 IL-1β에 의한 관절염의 예방 또는 개선용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 상엽 추출물을 유효성분으로 포함하는 IL-1β에 의한 관절염의 예방 또는 개선용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 IL-1β에 의한 관절염 예방 또는 개선용 조성물은 상엽 추출물을 유효성분으로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 상엽 추출물을 유효성분으로 포함하는 IL-1β에 의한 관절염 예방 또는 개선용 조성물에 의하는 경우, MAPK 패밀리 및 NF-κB의 활성을 저해함으로써, iNOS, NO, COX-2, PGE2 및 MMP 발현을 억제하여 기질을 보호하고 염증 반응을 억제할 수 있다.
본 발명에 따른 상엽 추출물을 유효성분으로 포함하는 IL-1β에 의한 관절염 예방 또는 개선용 조성물에 의하는 경우, MAPK 패밀리 및 NF-κB의 활성을 저해함으로써, iNOS, NO, COX-2, PGE2 및 MMP 발현을 억제하여 기질을 보호하고 염증 반응을 억제할 수 있다.
Description
본 발명은 상엽 추출물을 유효성분으로 포함하는 IL-1β에 의한 관절염의 예방 또는 개선용 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는 IL-1β에 의한 관절염의 예방 또는 개선용 조성물로서 이를 유효성분으로 포함한 관절염 예방 또는 개선을 위한 기능성 식품 등에 다양한 분야에 대한 활용될 수 있도록 하는 것이다.
다양한 연구를 통하여 IL-1β(IL-1β, 이하 'IL-1β'라 한다) 등이 염증 반응을 촉진하는 사이토카인의 한 종류로 알려져 있다(Punzi L. et al., Crit Rev Clin Lab Sci., 2002, 39(1):63-88). IL-1β 에 의해 유도되는 NF-κB (factor nuclear factor-kappa B)는 다양한 염증 인자들을 조절하는데, 비활성화 NF-κB인 p65 및 p50 서브유닛(subunit)으로 이루어진 헤테로다이머(heterodimer)가 IκB-α(inhibitor κB-alpha)와 결합된 상태로 세포질(cytoplasm)에 존재하다가, 전염증사이토카인(pro-inflammatory cytokine), 케모카인, 효소 등의 자극에 의하여 IκB-α가 인산화(phosphorylation)되면, IκB-α가 분해(degradation)되고 NF-κB가 핵 내로 이동하여 타겟 유전자의 프로모터(promoter)에 바인딩하여 염증 반응에 의한 사이토카인을 분비한다[Jeong et al., 2010].
최근 보고에 따르면, IL-1β 신호의 다운스트림(down stream)에 있는 MAP 인산화 효소(mitogen-activated protein kinase, 이하, 'MAPK'라 한다) 패밀리, 세포외 신호조절인산화효소(extracellular signal regulated kinase, 이하 'ERK'라 한다), p38 MAP 인산화 효소(p38 MAP kinases) 및 c-Jun N-말단 인산화효소(c-Jun N-terminal kinase, 이하 'JNK'라 한다) 등은 연골 붕괴 및 MMP에 의한 사이토카인 조절에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다[Thalhamer et al., 2008]. 관절염 연골 모델에서 인산화된 MAPK의 수준이 정상 연골보다 높은 것으로 나타났으며, MAPK 이하 신호 전달 경로를 통하여 NO, 프로스타글란딘 E2(PGE2), MMP-1, MMP-2, MMP-13을 증가시키는 것으로 알려져 있다[Geng et al., 1996; Liacini et al., 2003; Mengshol et al., 2000].
이처럼 IL-1β에 의해 유도되는 신호전달 체계와 염증성 질환 및 대사성 질환과의 관련성은 이미 알려져 있다. 염증성 질환은 염증을 주병변으로 하는 질병을 총칭하는 것으로서, 상기 염증성 질환에는 급성 및 만성 염증 질환이 있으며, 구체적으로 부종, 피부염, 알레르기, 아토피, 천식, 결막염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위염, 크론병, 대장염, 치질, 통풍, 간직성 척추염, 루푸스, 섬유근통(fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스 관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome) 및 다발성 경화증 등이 있다.
한편, 인체 내에서 관절조직은 움직이는 두 뼈가 만나는 곳으로서, 관절에서 충격을 흡수하도록 부드러운 연골 구조로 되어 있다. 관절염은 관절 연골, 골극(osteophyte) 형성 저하 및 연골하골(subchondral bone) 경화 등을 특징으로 하며, 이는 관절에서의 염증은 부종과 통증이 유발되고 관절이 뻣뻣해지는 만성질환이다. 관절에서의 염증 증상은 유사하지만 각각 다른 원인에 의해 다양한 신호전달체계를 통한 매우 다양한 관절염들이 존재하며, 가장 흔한 관절염으로는 골관절염(퇴행성관절염)과 류마티스 관절염이 있고 통풍성 관절염, 강직성 척수염, 감염성 관절염, 연소형 관절염, 아킬레스건 낭염 등으로 분류할 수 있다. 최근 관절염 치료제로는 TNF를 억제하여 통증을 관리하고 합병증 발생을 예방하는 약물 및 연골 재생 촉진/보호제로 히알루론산, 글루코사민, 콘드로이틴 등이 소개되고 있다.
대사성 질환은 당질, 지질, 단백질, 비타민, 미네랄 및 수분 등의 불균형에 의한 질환을 총칭하는 것으로, 골다공증, 당뇨병, 고혈압, 고지혈증, 심장병 등이 있으며, 특히 우리 몸은 골형성과 골흡수가 반복하여 일어나는데, 이 과정에서 불균형이 일어나 골다공증이 발생한다. 이 때, IL-1β은 파골세포 분화에 관여하고 있어, 골다공증에 있어 치료 표적이 될 수 있음이 알려져 있다(A Nemetz, Gut 2001;49:644-649).
이와 같이 IL-1β에 의한 질환을 치료하기 위하여, IL-1β에 의해 유도되는 신호전달체계의 억제에 대하여 연구가 활발히 진행되고 있으며, IL-1β의 수용체인 항 IL-1R 항체를 이용한 것(대한민국 등록특허 10-1317045호)이 알려져 있다. 그러나 항 IL-1R 항체의 경우 개체 내로 도입되는 경우 외래 단백질로서 인지될 수 있는 부분인 에피토프를 가질 수 있으므로, 치료제로서 사용될 경우 여전히 면역원성일 수 있다. 상기와 같은 문제를 해결하기 위하여 면역체계에 인지되지 않는 단백질이 아닌 작은 분자 화합물(small molecule compound)을 이용하여 IL-1β에 의해 매개되는 질병의 치료제를 개발하기 위하여 많은 연구가 이루어지고 있다.
약학 조성물을 천연물 소재로 개발하고 있는 것으로는 대부분 추출물을 이용하여 제품화하고 있어 정확한 약리기전이 밝혀져 있지 않으나, 경구제로서 복용이 용이하고 독성 및 그에 따른 부작용이 적어 장기간 복용을 할 수 있으므로 그 개발이 활발하게 이루어지고 있다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 IL-1β에 의해 활성화되는 경로를 표적으로 하는 천연물을 찾기 위하여 노력한 결과, 상엽 추출물이 IL-1β에 의해 유도되는 신호전달 체계를 효과적으로 저해시킴을 확인하고, 상기 추출물을 유효성분으로 포함하는 IL-1β에 의한 질환 예방 또는 개선용 조성물의 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 IL-1β에 의한 관절염 예방 또는 개선용 조성물을 활용하여 IL-1β에 의한 염증 또는 대사 질환 모델에서 염증 반응 및 기질 분해의 억제 효능을 낼 수 있도록 하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 상기 IL-1β에 의한 관절염 예방 또는 개선용 조성물을 활용하여 관절염에 대한 예방 또는 개선 효과를 낼 수 있는 건강기능 식품 조성물 등 다양한 분야에 제공될 수 있도록 하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 IL-1β에 의한 관절염 예방 또는 개선용 조성물은 상엽 추출물을 유효성분으로 포함하는 것이다.
상기 상엽 추출물은 물, 탄소수 1 내지 6의 알코올 및 이들의 혼합 용매로 구성되는 군으로부터 선택된 용매로 추출된 것일 수 있다.
상기 관절염은 골관절염 또는 류마티스 관절염인 것일 수 있다.
상기 IL-1β에 의한 관절염 예방 또는 개선용 조성물에서 상기 상엽은 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus), 비피도 박테리윰 비피듐(Bifidobacterium bifidum) 비피더스균, 비피도 박테리움 브레브(Bifidobacterium breve) 비피더스균, 및 락토바실러스 아시도 필루스(Lactobacillus acidophilus)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 접종하여 발효된 것일 수 있다.
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상기 IL-1β에 의한 관절염 예방 또는 개선용 조성물은 노간주나무 열수추출물을 더 포함하는 것일 수 있다.
상기 IL-1β에 의한 관절염 예방 또는 개선용 조성물은 병조희풀 열수추출물을 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 IL-1β에 의한 IL-1β에 의한 관절염 예방 또는 개선용 의약외품 조성물은 상기 IL-1β에 의한 관절염 예방 또는 개선용 조성물을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 IL-1β에 의한 IL-1β에 의한 관절염 예방 또는 개선용 식품 조성물은 상기 IL-1β에 의한 관절염 예방 또는 개선용 조성물을 포함하는 것일 수 있다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 IL-1β에 의한 질환의 예방 또는 개선용 조성물은 상엽 추출물을 유효성분으로 포함하는 것이다.
본 발명에서 말하는 상엽은 뽕나무 Morus alba Linne 또는 산뽕나무 Morus bombycis Koidzumi(뽕나무과 Moraceae)의 잎이다. 일명 동상엽(冬桑葉)이라고도 한다. 잎으로 달걀모양 또는 넓은 달걀모양이고 3 내지 5개로 갈라진 것도 있으며 길이 8 내지 15cm, 너비 7 내지 13cm이다. 윗면은 황록색 또는 연한 황갈색이다. 잎 끝은 뾰족하고 아랫부분은 심장형으로 되어 있으며, 잎 가장자리는 거치가 있다. 아랫면에는 엽맥이 돌출되어 있고 작은 엽맥은 그물 모양이며 그 위에 털이 나 있다. 질은 부스러지기 쉽고 가볍다. 냄새가 거의 없고 맛은 담담하나 약간 쓰며 떫다.
상기 'IL-1β에 의한 질환'은 IL-1β이 IL-1β의 수용체에 결합하여, MAPK와 NF-κB의 활성을 유도하고, 그의 타겟 유전자를 발현시킴으로써 발병되는 질환을 의미한다. 상기 IL-1β에 의한 질환은 이에 한정되지 않으나, 염증성 질환 또는 대사성 질환일 수 있다. 상기 염증성 질환은 염증을 주병변으로 하는 질병을 총칭하는 의미로서, 골관절염, 류마티스 관절염, 건선관절염, 아토피성 피부염, 건선, 천식, 전신 홍반성 루푸스, 및 다발성 경화증으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것일 수 있고, 바람직하게는 골관절염 또는 류마티스 관절염인 것일 수 있다. 상기 대사성 질환은 생체 내 물질대사 장애에 의해서 발생하는 질환을 총칭하는 의미로서, 골다공증, 동맥경화 및 심근경색으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 골다공증일 수 있다.
상기 'IL-1β에 의한 질환'은 IL-1β이 IL-1β의 수용체에 결합하여, MAPK와 NF-κB의 활성을 유도하고, 그의 타겟 유전자를 발현시킴으로써 발병되는 질환을 의미한다. 상기 IL-1β에 의한 질환은 이에 한정되지 않으나, 염증성 질환 또는 대사성 질환일 수 있다. 상기 염증성 질환은 염증을 주병변으로 하는 질병을 총칭하는 의미로서, 골관절염, 류마티스 관절염, 건선관절염, 아토피성 피부염, 건선, 천식, 전신 홍반성 루푸스, 및 다발성 경화증으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것일 수 있고, 바람직하게는 골관절염 또는 류마티스 관절염인 것일 수 있다. 상기 대사성 질환은 생체 내 물질대사 장애에 의해서 발생하는 질환을 총칭하는 의미로서, 골다공증, 동맥경화 및 심근경색으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 골다공증일 수 있다.
IL-1β는 IL-1β의 수용체인 IL-1R에 결합하면서 이후 다운스트림(down stream)에 있는 MAPK와 NF-κB를 경유하여 기질 분해 관련 MMP와 염증 관련 iNOS, COX-2를 조절한다. 본 발명의 상엽 추출물은 IL-1β에 의한 신호 전달에 있어서, MAPK 패밀리인 p38, JNK의 발현을 억제하는 활성을 가지며, IκB-α의 분해의 저해제(inhibitor)로서 IκB-α의 분해를 억제하고 NF-κB 활성을 감소시킬 수 있다(도 7 및 도 8).
본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 상엽 추출물이 염증 유발 관련 iNOS 및 iNOS에 의해 증가하는 NO(산화질소), COX-2 및 아라키돈산으로부터 합성되는 PGE2(프로스타글란딘E2)의 발현을 억제함으로써, 염증 반응을 억제하는데 우수한 조성물임을 알 수 있었다. 이와 같은 결과로부터 본 발명의 상엽 추출물이 대표적인 염증성 질환의 일종인 골관절염, 류마티스 관절염을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있음을 보여, 염증성 질환과 같은 IL-1β에 의한 질환의 치료에 유용하게 사용할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 상엽 추출물이 결합조직의 세포외 기질과 기저막의 주성분을 분해하는 MMP의 활성을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다. MMP는 섬유아세포와 다형핵성백혈구, 상피세포 및 대식세포에 의하여 분비되는 콜라게나아제로, 골 흡수와 관련하여 부갑상선 호르몬 및 세포내 독소, 프로스타글란딘은 MMP의 합성을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 상엽 추출물은 MAPK 패밀리 및 MAPK의 타겟 유전자인 MMP, 특히 MMP-1, MMP-3, MMP-13의 발현을 감소시켜 콜라게나아제를 억제함으로써 연골을 보호하므로 골대사 질환에 적합한 약학 조성물이라는 것을 보여주었다. 이와 같은 결과로부터 본 발명의 상엽 추출물이 대표적인 염증성 질환인 골관절염, 류마티스 관절염과 대표적인 대사성 질환인 골다공증을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있음을 확인하였고, 이는 염증성 질환 또는 대사성 질환과 같은 IL-1β에 의한 질환의 치료에 효과적일 수 있음을 의미한다.
본 발명에 있어서, '예방'은 상기 조성물의 투여에 의해 IL-1β에 의한 질환을 억제하거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미하며, '치료'는 상기 조성물의 투여에 의해 IL-1β에 의한 질환에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 행위를 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 상엽 추출물은 물, 탄소수 1 내지 6의 알코올 및 이들의 혼합 용매로 구성되는 군으로부터 선택된 용매로 추출한 것일 수 있다. 상기 '상엽 추출물'이란 상엽을 추출하여 수득한 추출물을 의미한다. 상기 상엽 추출물은 상엽 분쇄물을 물, 에탄올, 메탄올 등과 같은 탄소수(C1) 내지 (C6)의 알코올과 같은 극성 용매, 또는 알코올과 물의 1:0.1 내지 1:10의 혼합비를 갖는 혼합 용매로 용출할 수 있으며, 바람직하게는 1: 3 내지 5 의 에탄올과 물의 혼합비를 가지는 혼합 용매로 용출할 수 있다. 이 때, 추출 온도는 10℃ 내지 100℃, 바람직하게는 실온에서, 추출 기간은 12시간 내지 4일, 바람직하게는 24시간 동안 추출한 추출물 일 수 있다. 여과된 추출물을 진공 회전 농축기로 감압 농축하여 수득한 결과물일 수 있으나, 본 발명의 IL-1β에 의한 질환의 치료 효과를 나타낼 수 있는 상엽 추출물인 한, 이에 제한되지 않고, 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 이의 조정제물 또는 정제물을 모두 포함한다.
상기 상엽은 뽕나무의 줄기, 뿌리, 열매 등에 비하여 IL-1β에 대한 억제 효과가 우수하다. 따라서, 바람직하게는 상엽에 대한 에탄올 추출물을 사용하는 것일 수 있다.
바람직하게는 상기 에탄올은 12 내지22 중량%인 것일 수 있다. 상기 범위에 의한 추출물은 유효성분의 수득에 가장 유리할 수 있다.
상기 상엽 추출물은 발효된 상엽을 사용하여 추출된 것일 수 있다. 발효된 상엽을 사용하는 경우 세포독성이 낮아 상대적으로 높은 농도에서 안정적으로 사용할 수 있는 장점이 있다.
상기 발효에 사용하는 미생물로는 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 델브루에키(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 레우테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 부츠네리(Lactobacillus buchneri), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 존스니(Lactobacillus johonsonii), 락토바실러스 케피르(Lactobacillus kefir) 등과 같은 유산 바실리, 락토코코스 락티스(Lactococcus lactis), 락토코코스 플랜타룸(Lactococcus plantarum), 락토코코스 라피노락티스(Lactococcus raffinolactis), 엔테로코코스파에칼리스(Enterococcus faecalis), 엔테로코코스 파에시늄(Enterococcus faecium), 스트렙토코코스 터모필리우스(Streptococcus thermophilus), 류코노스톡락티스(Leuconostoc lactis), 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) 등과 같은 유산 콕사이 및 비피도박테리움 애닐멀스(Bifidobacterium animals), 비피도 박테리움 비피듐(Bifidobacterium bifidum),비피도박테리움 브레브(Bifidobacterium breve), 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis), 비피도바테리움 롱굼(Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 수도롱굼(Bifidobacterium pseudolongum), 비피도박테리움 터모필룸(Bifidobacterium themophilum), 비피도박테리움 아돌센티스(Bifidobacterium adolescentis) 등과 같은 비피도박테리아를 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus), 비피도 박테리윰 비피듐(Bifidobacterium bifidum) 비피더스균, 비피도 박테리움 브레브(Bifidobacterium breve) 비피더스균, 및 락토바실러스 아시도 필루스(Lactobacillus acidophilus)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함될 수 있으며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들어 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결 건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.
본 발명의 상엽 추출물은 예로부터 식용 및 약용으로 사용되어 온 것으로 그 투여용량에 특별한 제약은 없고, 체내 흡수도, 체중, 환자의 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다. 일반적으로 상엽 추출물은 바람직하게는 체중 1 kg당 10 내지 1000 mg 정도를 투여할 수 있으며, 보다 바람직하게는 체중 1 kg당 50 내지 500 mg 정도 투여할 수 있다. 본 발명의 상엽 추출물을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물은 유효량 범위를 고려하여 제조하도록 하며, 이렇게 제형화된 단위 투여형 제제는 필요에 따라 약제의 투여를 감시하거나 관찰하는 전문가의 판단과 개인의 요구에 따라 전문화된 투약법을 사용하거나 일정 시간 간격으로 수회 투여할 수 있다.
본 발명은 또한, 상엽 추출물을 유효성분으로 포함하는 IL-1β에 의한 질환 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다. 상기 상엽 추출물의 제조 및 구성에 관해서는 상기에서 설명한 바와 같다. 보다 구체적으로, 본 발명의 상엽 추출물은 IL-1β에 의한 질환의 예방 또는 치료를 목적으로 의약외품 조성물에 첨가할 수 있다.
본 명세서에서 말하는 '병조희풀'은 낙엽 관목으로 미나리아재빗과 에 속한다. 그 잎은 마주나고 3개의 작은 잎으로 구성되는 3출 겹잎이다. 작은 잎은 넓은 달걀꼴이며 3개 중 옆에 달린 2개는 작다. 잎은 위로 올라갈수록 커지는데 끝이 뾰족하고 거칠며 가장자리에 약간 붉은빛이 도는 거친 톱니가 드문드문 있으나 흔히 3개로 얕게 갈라진다.
상기 병조희풀을 사용하는 경우 세정 및 피부 주름개선에 효과가 있다. 다만 상기 병조희풀은 자체의 독성이 있으므로 발효과정을 통하여 독성을 제거할 필요가 있다.
바람직하게 상기 병조희풀 추출물은 발효 추출법에 의해 제조된 병조희풀 발효 추출물인 것일 수 있다. 상기 병조희풀은 약한 독성이 있으므로 발효과정을 통하여 독성을 제거할 필요가 있다.
본 발명에서 말하는 병조희풀 발효 추출물은 쌀뜨물 100 부피부에 대하여, 1 ~ 3 부피부의 당류 및 0.05 ~ 0.25 부피부의 천일염을 첨가하고, 0.5 ~ 2.0 부피부의 미생물액을 혼합한 혼합물에 병조희풀 분쇄물을 10 ~30 부피비로 부피부로 침지시킨 후, 공기와 차단된 상온 분위기에서 3 ~ 15일 발효시켜 수득할 수 있다.
상기 미생물은 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus), 비피도 박테리윰 비피듐(Bifidobacterium bifidum) 비피더스균, 비피도 박테리움 브레브(Bifidobacterium breve) 비피더스균, 및 락토바실러스 아시도 필루스(Lactobacillus acidophilus)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명에서 사용하는 노간주나무는 두송(杜松)이라고도 불리우며, 측백나뭇과에 속한다. 잎은 좁고 가는 선형의 바늘잎이 한 마디에서 3개씩 돌려나는데 길이는 12~20mm이고 끝이 뾰족하며 표면의 가운데에 흰색의 좁은 홈이 있다.
바람직하게 상기 노간주나무는 상기 병조희풀과 동일한 방법으로 발효된 것일 수 있다. 상기 노간주나무를 발효시키는 경우 상엽이 가지는 고유한 텁텁한 향을 제거하는 효과가 높고 향미가 증진될 수 있도록 하는 장점을 가진다.
본 발명에서 사용하는 '낭아초'는 장미과에 속한 여러해살이풀. 높이는 30~100센티미터 정도이고, 굵은 뿌리줄기에서 줄기가 나와 자라며 전체에 털이 있다. 잎은 어긋나고 깃꼴 겹잎이며 작은 잎은 5~7개이다. 6~8월에 노란 꽃이 총상(總狀) 꽃차례로 피고, 열매에는 가시 모양의 털이 있어 다른 것에 잘 붙는다.
본 발명에 있어서 '의약외품'은 사람이나 동물의 질병을 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 섬유, 고무제품 또는 이와 유사한 것, 인체에 대한 작용이 약하거나 인체에 직접 작용하지 아니하며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것, 감염형 예방을 위하여 살균, 살충 및 이와 유사한 용도로 사용되는 제제 중 하나에 해당하는 물품으로서, 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것 및 사람이나 동물의 구조와 기능에 약리학적 영향을 줄 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것을 제외한 물품을 의미한다.
본 발명의 상엽 추출물을 의약외품 첨가물로 사용할 경우, 상기 상엽 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 또는 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
본 발명의 의약외품 조성물은 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 소독청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제 비누, 핸드워시, 가습기 충진제, 마스크, 연고제 또는 필터 충진제일 수 있다.
본 발명은 또한, 상엽 추출물을 유효성분으로 포함하는 IL-1β에 의한 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다. 상기 상엽 추출물의 제조 및 구성에 관해서는 상기에서 설명한 바와 같다. 보다 구체적으로, 본 발명의 상엽 추출물은 IL-1β에 의한 질환의 예방 또는 치료를 목적으로 건강기능식품 조성물에 첨가할 수 있다.
본 발명의 상엽 추출물을 건강기능식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 상엽 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 건강기능식품 또는 건강기능식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
본 발명의 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 추출 혼합물을 첨가할 수 있는 건강기능식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있고, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함할 수 있으며, 동물을 위한 사료로 이용되는 식품을 포함할 수 있다. 상기 외에 본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 조성물을 인간을 제외한 IL-1β에 의한 질환 의심 개체에 투여하는 단계를 포함하는, IL-1β에 의한 질환 치료 방법을 제공한다.
본 발명에서 상기 IL-1β에 의한 질환 의심 개체는 염증성 질환 또는 대사성 질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 모든 동물을 의미하며, 본 발명의 상엽 추출물을 포함하는 약학 조성물을 IL-1β에 의한 질환 의심 개체에 투여함으로써, 개체를 효율적으로 치료할 수 있다. 상기 IL-1β에 의한 질환에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명에 있어서 '투여'는 어떠한 적절한 방법으로 IL-1β에 의한 질환 의심 개체에게 본 발명의 약학 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.
본 발명의 치료 방법은 상엽 추출물을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있으며, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 상엽 추출물을 유효성분으로 포함하는 IL-1β에 의한 질환 예방 또는 개선용 조성물에 의하는 경우, MAPK 패밀리 및 NF-κB의 활성을 저해함으로써, iNOS, NO, COX-2, PGE2 및 MMP 발현을 억제하여 기질을 보호하고 염증 반응을 억제할 수 있다. 특히 상기 IL-1β에 의한 질환은 IL-1β에 의한 관절염일 수 있고, 상기 관절염에 대하여 우수한 예방 또는 개선효과를 낼 수 있다.
따라서 또한 상기 IL-1β에 의한 질환 예방 또는 개선용 조성물을 활용하여 관절염 예방 및 개선 효과를 낼 수 있는 건강기능 식품 등 다양한 분야에 제공될 수 있다.
도 1은 SW1353 연골세포의 생존에 대한 본 발명의 일실시예에 따른 상엽 추출물의 효과에 관한 그래프이다.
도 2는 SW1353 연골세포의 생존에 대한 본 발명의 일실시예에 따른 상엽 발효 추출물의 효과에 관한 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 SW1353 연골세포에서 MMP-1 및 MMP-13의IL-1β 유도 생산을 억제하는 효과에 관한 것이다.
도 4는본 발명의 일실시예에 따른 SW1353 연골 세포에서 MMP-1 및 MMP-13의 IL-1β 유도 발현을 억제하는 효과에 관한 것이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 SW1353 연골 세포에서 IL-1β 유도 산화 질소 및 PGE2의 생산 억제하는 효과에 관한 것이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 SW1353 연골세포에서 IL-1β 유도 iNOS및 COX-2 발현에 관한 것이다.
도 8은 본 발명의 일실시예에 따른 SW1353 연골 세포에서 p38 MAPK의 IL-1β 유도 활성화를 억제하는 효과에 관한 것이다.
도 2는 SW1353 연골세포의 생존에 대한 본 발명의 일실시예에 따른 상엽 발효 추출물의 효과에 관한 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 SW1353 연골세포에서 MMP-1 및 MMP-13의IL-1β 유도 생산을 억제하는 효과에 관한 것이다.
도 4는본 발명의 일실시예에 따른 SW1353 연골 세포에서 MMP-1 및 MMP-13의 IL-1β 유도 발현을 억제하는 효과에 관한 것이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 SW1353 연골 세포에서 IL-1β 유도 산화 질소 및 PGE2의 생산 억제하는 효과에 관한 것이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 SW1353 연골세포에서 IL-1β 유도 iNOS및 COX-2 발현에 관한 것이다.
도 8은 본 발명의 일실시예에 따른 SW1353 연골 세포에서 p38 MAPK의 IL-1β 유도 활성화를 억제하는 효과에 관한 것이다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
[
제조예
:
상엽
추출물의 제조]
1.
상엽의
준비.
뽕나무(M. alba L)의 잎인 상엽(Mori folium)은 바이오-포트 코리사사(부산, 한국)로부터 입수하였고, 동의대 한의대(부산,한국), 생화학과의 S.H. Hong 교수에 의해서 인증받았다. 건조된 잎은 작은 조각으로 절단하고, 미세한 분말로 만든 후에, 3시간 동안 증류수(50g/500㎖)에서 가열하였다. 추출액은 불용성 물질을 제거하기 위해서 와트만 3호 여과지를 통하여 두 번 여과하고, 여액은 동결건조시킨 다음, 미세한 분말로 분쇄하였다.
상엽 추출물은 증류수로 100㎎/㎖의 농도로 용해시키고, 저장액(stock solution)은 사용하기 전에 목적하는 농도로 배지에 희석하였다.
또한, 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei)를 접종하여 5일간 발효시킨 상엽을 사용하여 상기 상엽 추출물의 제조방법과 동일하게 추출하여 발효상엽 추출물을 제조하였다.
2. 세포 배양
SW1353연골세포는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(Manassas, VA, USA)에서 구입하였다.
상기 세포는 소태아혈청(fetal bovine serum) 10% v/v, 페니실린 100 유닛/㎖ 및 스트렙토마이신 100㎎/㎖을 함유하고,상엽이 있거나 또는 없는 상태에서, 5% 이산화탄소와 37℃로 가습된 공기로 둘베코수정이글배지(Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA)에서 배양하였다.
[시험방법]
1.
MTT분석법
세포의 생존율은 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)- 2,5-디페닐테트라졸륨브로바이드를 사용하여 (MMT)분석하였다. 간단하게, SW1353 셀은 웰 당 2X105 세포의 밀도로 6 개의 웰 플레이트에 시딩하였다. 24시간 동안 배양한 후에, 상기 세포들은 상엽 추출물의 다양한 농도 또는 IL-1β의 40ng/㎖ (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA)로 개별적으로 처리되거나,또는 상기 세포들은 IL-1β처리 전의 1시간 동안 상엽 추출물의 상이한 농도로 전처리 하였다.
24시간 후에, 배지를 제거하고, MMT 작업 용액(0.5㎎/㎖, Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO, USA)은 배양 플레이트들에 첨가하고, 2시간 동안 37℃에서 지속적으로 배양하였다.
그후, 배양 상청액을 웰로부터 제거하고, 디메틸설폭사이드 (DMSO, Sigma-Aldrich Chemical Co.)를 가하여, 포르마잔 결정을 용해시켰다.
진탕한 후에, 각 웰의 흡광도를 마이크로 플레이트 리더(Dynatech Laboratories, Chantilly VA, USA)로 540㎚의 파장에서 측정하고, 그 결과는 100% 생존한 것과 처리되지 않은 대조군에 관하여 세포 활성도로 표현하였다.
2. 효소-결합 면역 분석법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)
MMPs (MMP-1, MMP-2, MMP-3 및 MMP-13)및 PGE2 의 생산에 대한 상엽 추출물의 억제 효과는 상용화된 ELISA 키트(R&D Systems Inc.)를 사용하여 측정되었다.
간략하게, 세포들은 IL-1β(40ng/㎖)으로 각각 처리하거나, 또는 IL-1β처리 전 1시간 동안 상엽 추출물의 다양한 농도로 전처리 하였다.
24시간 후에, 배양 배지에서의 MMPs및 PGE2의 농도는 제조업체의 지침에 따라, 선택적인 ELISA 키트들을 사용하여 측정하였다.
3. RNA 분리 및
역전사
중합효소 연쇄 반응 (RT-
PCR
) 분석.
배양된 세포로부터의 총 RNA는 제조업체의 지침에 따라, 트리졸(TRIzol) 시약(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 단리하였다.
cDNA는 MMLV(moloney murine leukemia virus)역전사 효소를 함유하는 AccuPower® RT PreMix(바이오니아, 대전, 한국)를 사용하여 총 RNA 1㎍을 합성하였다. 역전사 효소로 생성된 cDNA는 선택적으로 바이오니아에서 구입한 프라이머[표 1]를 사용하여 PCR로 증폭하였다.
| 프라이머 | 서열 | |
| iNOS | 정방향 프라이머 | 5'- GTG-AGG-ATC-AAA-AAC-TGG-GG-3' |
| 역방향 프라이머 | 5'-ACC-TGC-AGG-TTG-GAC-CAC-3' | |
| COX-2 | 정방향 프라이머 | 5'-TCA-GCC-ACG-CAG-CAA-ATC-CT-3' |
| 역방향 프라이머 | 5'-GTG-ATC-TGG-ATG-TCA-CG-3' | |
| MMP-1 | 정방향 프라이머 | 5'-CTG-TTC-AGG-GAC-AGA-ATG-TGC-3' |
| 역방향 프라이머 | 5'-TTG-GAC-TCA-CAC-CAT-GTG-TT-3' | |
| MMP-3 | 정방향 프라이머 | 5'-TGC-GTG-GCA-GTT-TGC-TCA-GCC-3' |
| 역방향 프라이머 | 5'-GAA-TGT-GAG-TGG-AGT-CAC-CTC-3' | |
| MMP-13 | 정방향 프라이머 | 5'-GGC-TCC-GAG-AAA-TGC-AGT-CTT-TCT-T-3' |
| 역방향 프라이머 | 5'-ATC-AAA-TGG-GTA-GAA-GTC-GCC-ATG-C-3' | |
| GAPDH | 정방향 프라이머 | 5'-CGA-TGC-TGG-GCG-TGA-GTA-C-3' |
| 역방향 프라이머 | 5'-CGT-TCA-GCT-CAG-GGA-TGA-CC-3' | |
증폭 후에, PCR 반응은 1% 아가로오스겔에서 전기영동하고, 에티디움 브로마이드(EtBr, Sigma-Aldrich Chemical Co.)염색법을 사용하여 시각화하였다.
평행 실험에서, 글리세르알데히드-3-포스페이트탈수소효소(GAPDH)를 내부 대조군으로 사용하였다.
4. 단백질 추출 및
웨스턴블롯
분석(western blot analysis)
총 단백질의 추출을 위해, 세포를 수확하고, 1시간 동안 용해 완충액[25mM Tris-Cl(pH 7.5), 250mM NaCl, 5mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 1% 노니뎃(Nonidet-P40, NP-40), 1mM 페닐메틸설포닐플루오라이드(PMSF) 및 5mM 디티오트레이톨(dithiothreitol, DTT)] 에 용해하였다.
평행 실험에서, 핵 및 세포질 단백질은 제조업체의 지침에 따라, 핵 추출 시약(Pierce, Rockford, IL, USA)을 사용하여 제조하였다.
불용성 물질은 4℃에서 20분 동안 13,000xg로 원심 분리하여 폐기하였다.
단백질 농도를 제조업체의 지침에 따라, 바이오레드 단백질 분석키트 (BioRad Laboratories, Hercules, CA, USA)를 사용하여 측정하였다.
웨스턴 브롯 분석을 위해, 단백질에 상응하는 양의 소듐도데실설페이트(SDS)-폴리아크릴아미드 겔에서 전기 영동에 의해 분리하고, 니트로 셀룰로스 막(Schleicher and Schuell, Keene, NH, USA)으로 옮겼다.
5% 탈지유(skimmed milk)로 차단(blocking) 후에, 막은 1시간 동안 단백질 특이적 항체와 함께 배양하였고, 이어서, 적절한 효소-결합 이차항체(ELSA)(Amersham Corp., Arlington Heights, IL, USA)와 함께 배양하고, 제조업체의 지침에 따라 향상된 화학발광(ECL)용액(Amersham Corp.)을 사용하여 시각화하였다.
일차 항체는 산타크루즈 생명공학주식회사(Santa Cruz, CA, USA)와 Abcam (Cambridge, UK)에서 구입하였다.
5.
산화 질소
생성의 측정
배양 상청액에서 산화 질소의 농도는 그리스(Griess) 시약(Sigma-Aldrich Chemical Co.)을 사용하여, 산화 질소의 안정한 산화 생성물, 아질산(nitrite)을 측정함으로써 결정하였다.
세포 배양 조건은 ELISA에 사용된 것과 동일하였다. 24시간 동안 IL-1β및/또는 상엽 추출물과 배양한 다음, 각각의 배양 상청액 100㎕를 상온에서 10분 동안 그리스 시약의 동일한 부피로 혼합하였다.
그 후, 흡광도를 마이크로 플레이트 리더로 540㎚에서 측정하였고, 아질산의 생산은 NaNO2표준 곡선에 의해서 결정하였다.
6. 형광항체법(
Immunofluorescence
staining)
NF-κB p65의 전위를 검출하기 위해서, SW1353 세포는 24시간 동안 6 웰 플레이트에 있는 커버 글라스(glass coverslips)에서 성장시켰다.
세포는 IL-1β(40ng/㎖)로 자극하기 전에 1시간 동안 상엽 추출물(800㎍/ml)로 전처리 하였다.
30분 동안 배양한 후에, 세포를 인산 완충 식염수(phosphate-buffered saline, PBS)로 두 번 세척하고, 3.7% 파라포름알데히드로 고정하고,0.2% 트리톤 X-100로 처리되고, 2% 소혈청 알부민(bovine serum albumin)으로 차단하였다.
상기 세포는 항 NF-κB p65 항체 및 플루오레세인이소티오시아네이트-콘쥬게이티드돈키안티-래빗면역글로블린 G(IgG, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA, USA)와 함께 순차적으로 배양하였다.
PBS로 세정한 후에, 핵은 4'6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI, Sigma-Aldrich Chemical Co.)로 염색하고, 형광은 형광 현미경(Carl Zeiss, Jena, Germany)을 사용하여 시각화하였다.
7. 복합추출물의 제조
상기 상엽 추출물 A 및 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei)로 발효시킨 발효 상엽 추출물 B를 제조하였다.
또한 이를 쌀뜨물로 발효시킨 노간주나무에 대한 열수추출물(추출물 C), 이를 쌀뜨물로 발효시킨 병조희풀에 대한 열수추출물(추출물 D), 낭아초 열수추출물(추출물 E), 녹두에 대한 열수추출물(추출물 F)를 제조하였다.
이후 상기 추출물을 하기의 [표 1]에 따라 혼합하여 실시예를 제조하였다.
| A | B | C | D | E | F | |
| T1 | 500 | - | - | - | - | - |
| T2 | 500 | - | - | - | - | |
| T3 | 500 | 500 | - | - | - | |
| T4 | - | 500 | - | 500 | - | - |
| T5 | - | 500 | 250 | 250 | - | - |
| T6 | - | 500 | 100 | 400 | - | - |
| T7 | - | 500 | 400 | 100 | - | - |
| T8 | - | 500 | 300 | 100 | 100 | - |
| T9 | - | 500 | 300 | 100 | - | 100 |
| T10 | - | 500 | 300 | 100 | 50 | 50 |
(단위: 중량부)
[시험결과]
1. SW1353 연골세포의 생존에 대한
상엽
추출물의 효과
상엽 추출물이 SW1353 세포에 대하여 독성 효과가 있는지 여부를 평가하기 위해서, 세포를 24시간 동안 상엽 추출물의 다양한 농도로 처리하였다.
MTT 분석법에서, 상엽 추출물의 농도가 800㎍/ml까지 SW1353 세포에서 세포 독성을 유발하지 않았다.
반면, 상엽 추출물 1000㎍/ml에서 생존율은 현저하게 감소하였다(약 70%, 도. 1A).
이후의 실험에서는, IL-1β 유도 SW1353 세포에 상엽 추출물을 800㎍/ml 이하의 농도로 처리한 경우 또한, 세포 생존율에 불리한 영향이 없었다(도 1B).
한편, 발효상엽 추출물을 사용한 경우 세포생존율이 상당히 우수하였으며, 1000㎍/ml에서도 생존율이 상대적으로 높게 유지될 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.(도 2) 따라서 발효상엽 추출물을 사용하는 경우 세포독성이 낮아 부작용 없이 제공될 수 있는 장점이 있다.
따라서, 상엽 추출물의 농도는 800㎍/ml 내에서 나머지 실험에 적용하였다.
2. SW1353 연골세포에서
MMP
-1 및
MMP
-
13의IL
-
1β
유도 생산을 억제
상기 상엽 추출물은 SW1353 연골세포에서 MMP-1 및 MMP-13의IL-1β 유도 생산을 억제한다.
다양한 MMPs는 관절 연골에서 생리학적 콜라겐 전환 및 관절염 연골에서 매트릭스 분해 모두에 관여한다. 그러므로, IL-1β 유도 MMPs 생성에 대한 상엽 추출물의 억제 효과를 조사하기 위해서, SW1353 세포는 상엽추출물의 존재 및 부재 하에 24시간 동안 IL-1β(40ng/ml)로 자극하고 나서, SW1353 세포로부터 MMPs의 방출은 ELISA를 사용하여 배양 상청액에서 검출되었다.
MMPs(MMP-1, MMP-2, MMP-3 및 MMP-13)의 증가된 방출은 IL-1β로 자극(도 3) 후에 배양 상청액에서 검출되었다.
그러나, 상엽 추출물로 SW1353 세포의 전처리는IL-1β 자극 콜라게나아제, 예를 들어, MMP-1 및 MMP-13의 생산이 농도 의존적으로 감소되었다. 그러나, MMP-2(겔라티나아제 A) 또는 MMP-3(스트로멜라이신)은 미처리 세포에서 발견되는 수준에 필적하였다.
3. SW1353 연골 세포에서
MMP
-1 및
MMP
-13의 IL-
1β
유도 발현을 억제
상기 상엽 추출물은 SW1353 연골 세포에서 MMP-1 및 MMP-13의 IL-1β 유도 발현을 억제한다.
SW1353 세포에서 MMPs의 IL-1β 유도 발현에 대한 상엽 추출물의 효과를 평가하기 위해서, 세포는 IL-1β 단독으로 또는 상엽 추출물의 다른 농도로 24시간 동안 처리하였다.
RT-PCR 및 면역 블롯 이미지 분석은 IL-1β 단독으로 처리된 SW1353 세포에서 모든 MMPs의 수준이 미처리 세포에서 검출된 수준에 비해 현저하게 증가된 것으로 나타났다(도 4).
4. SW1353 연골 세포에서 IL-
1β
유도
산화 질소
및
PGE2의
생산 억제
상기 상엽 추출물은 SW1353 연골 세포에서 IL-1β 유도 산화 질소 및 PGE2의 생산을 억제시킨다.
산화 질소 및 PGE2와 같은, 염증 매개물질은 관절염에서 연골 파괴의 진행에 중요한 역할을 하는 것으로 잘 알려져 있기 때문에, IL-1β 자극된 SW1353 세포에서 산화 질소 및 PGE2의 농도(level)에 대한 상엽 추출물의 효과를 측정하였다.
SW1353 세포에 의해 생성된 산화 질소 및 PGE2의 농도에 대한 상엽 추출물의 효과를 확인하기 위해서, 처리된 세포배양 상청액을 수집하고, 각각을 그리스 시약 및 ELISA로 처리하였다.
IL-1β 단독으로 SW1353 세포의 치료는 대조군(도 5A 및 B)과 비교할 때, 산화 질소 및 PGE2의 농도가 현저하게 상승한다.
그러나, 상엽 추출물은 200 내지 800㎍/ml 의 범위에서 농도 의존적인 방법으로 IL-1β 유도 SW1353 세포에서 산화 질소 및 PGE2의 방출을 상당히 줄인다.
5. SW1353 연골세포에서 IL-
1β
유도
iNOS및
COX-2 발현
상기 상엽추출물은 SW1353 연골세포에서 IL-1β 유도 iNOS및 COX-2 발현을 감소시킨다.
다음으로, RT-PCR 및 웨스턴 브롯 분석은 iNOS 및 COX-2 발현의 감소된 농도와 연관된 IL-1β 자극된 SW1353 세포들에서 상엽 추출물에 의한 산화 질소 및 PGE2 생성의 억제 여부를 결정하기 위해 수행되었다.
그 결과는 iNOS 및 COX-2 mRNA 농도에서 IL-1β 유도 증가는 농도 의존적인 방법으로 상엽 추출물과 반대인 것을 나타낸다.(도 6A)
평행 실험에서, IL-1β로 인한 자극 때문에 iNOS 및 COX-2의 상승된 단백질 농도는 상엽 추출물과 전처리가 감소되었다.(도 6B)
이러한 결과는 전사 농도에서 iNOS 및 COX-2 감소된 발현이 IL-1β 유도 산화질소 및 PGE2 생성에 대한 상엽 추출물의 억제 효과에 기여하고 있음을 나타낸다.
6. SW1353 연골 세포에서 IL-
1β
유도
NF
-
κB의
핵 전위를 차단
상엽 추출물은 SW1353 연골 세포에서 IL-1β 유도 NF-κB의 핵 전위를 차단한다.
많은 연구는 IL-1β 유도 NF-κB 활성화는 MMPs, iNOS 및 COX-2 전사 활동 상승조절에 관여하는 것으로 보고 있다.
그러므로, NF-κB 신호전달의 억제를 통해 매개되는 MMPs, iNOS 및 COX-2의IL-1β 유도 활성화에 대한 상엽 추출물이 억제 효과가 있는지 여부는 NF-κB의 핵 전위를 측정함으로써 결정하였다.
IL-1β의 치료는 30분 이내에 NF-κB 단백질의 핵 축적을 향상하고, 세포질에서 IκB-α의 분해를 수반하는 것으로 나타났다(도 7A).
그러나, 상엽 추출물과 전처리는IL-1β 유도 NF-κB의 핵 축적 및 IL-1β 단독으로 처리된 세포에 비해 IκB-α의 분해를 감소시켰다.
면역 형광 이미지는 또한 NF-κB P65의 핵 전위가 IL-1β와 세포의 자극 후에 강하게 유도하고, 핵 NF-κB P65에서 변위(shift)는상엽 추출물과 세포 전처리 후에 완전히 없어졌음을 밝혔다.(도 7B)
이러한 연구 결과는 상엽 추출물이 IκB 저하의 억제 및 NF-κB의 핵 전위를 통해 SW1353 세포에서 IL-1β 유도 NF-κB 활성화를 억제할 수 있음을 나타낸다.
7. SW1353 연골 세포에서 p38
MAPK의
IL-
1β
유도 활성화를 억제
상엽 추출물은 SW1353 연골 세포에서 p38 MAPK의 IL-1β 유도 활성화를 억제한다.
MAPKs 경로는 IL-1β 유도 MMPs 및 염증성 매개물질 발현에 매우 연관되어 있음이 잘 알려져 있기 때문에, 우리는 상엽 추출물의 억제 효과가 그들의 발현에 MAPKs 시그날링캐스케이드에 의해 매개되는지 여부를 조사하였다.
웨스턴 브롯 분석은 IL-1β 치료가 총 단백질 농도에 영항을 주지 않고 실험 시스템에서 JNK, p38 MAPK 및 ERK의 인산화를 향상하는 것이 확인되었다.(도 8A)
그러므로, SW1353세포에서 MAPKs의 IL-1β 유도 인산화에 대한 상엽 추출물의 효과를 평가하였다.
결과는 상엽 추출물과 전처리가 농도 의존적 방법으로 대조 농도(control level) 근처에서 p38 MAPK의 IL-1β 자극 활성이 크게 감소되는 것으로 밝혀졌으나, JNK 및 ERK의 활성에 대한 이러한 효과는 없었다(도 8B).
결과는 상엽 추출물에 의한 IL-1β 유도 p38 MAPK 활성의 억제는 IL-1β 자극된 SW1353세포에 상엽 추출물의 관측된 연골 보호 가능성의 역할을 시사한다.
8. 복합추출물의
관능성
평가
위 복합추출물 T1 내지 T10을 음료로 제조하고, 성인남녀 20인에 대한 관능성 평가를 수행하였다. 관능성 평가는 향과 맛을 기초로 기호성에 따라 1 내지 10의 지수로 평가하여 평균지수로 구분하였고 그 결과를 [표 2]에 나타내었다.(하기의 지수는 그 숫자가 높을수록 기호성이 높은 것이다)
| T1 | T2 | T3 | T4 | T5 | T6 | T7 | T8 | T9 | T10 | |
| 향 | 2 | 2 | 4 | 4 | 7 | 6 | 9 | 9 | 9 | 10 |
| 맛 | 3 | 2 | 2 | 3 | 4 | 5 | 5 | 7 | 7 | 9 |
| 기호성 | 2.5 | 2 | 3 | 3.5 | 5.5 | 5.5 | 7 | 8 | 8 | 9.5 |
(단위: 지수)
상기 표 2를 참조하면, 상엽 추출물은 텁텁한 맛이 있고 기호성 있는 향이 나지 않는다. 발효에 의하는 경우 세포독성이 저감되는 장점이 있으나 향미가 높아지는 것은 아니라는 것을 확인할 수 있다.
또한 상기 발효된 상엽에 대한 향은 발효된 병조희풀만으로는 제거되지 않았고, 발효된 노간주나무 열수추출물을 함께 사용하는 경우 거의 나지 않는다는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 낭아초 및 녹두 추출물을 사용하는 경우 음료의 풍미가 높아지면서 높은 기호성을 가지는 것을 확인할 수 있었다.
따라서 상기 복합 추출물에 의하는 경우 상엽 추출물을 포함하여 IL-1β에 의한 관절염 예방 또는 개선 효과를 낼 수 있으면서도, 기호성이 높아 보급하기 용이한 식품 또는 기능성 식품으로 제공될 수 있다.
이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.
Claims (8)
- 상엽 추출물을 유효성분으로 포함하는 것인
IL-1β에 의한 관절염 예방 또는 개선용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 상엽 추출물은 물, 탄소수 1 내지 6의 알코올 및 이들의 혼합 용매로 구성되는 군으로부터 선택된 용매로 추출된 것인
IL-1β에 의한 관절염 예방 또는 개선용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 관절염은 골관절염 또는 류마티스 관절염인 것인
IL-1β에 의한 관절염 예방 또는 개선용 조성물. - 제 1항에 있어서,
상기 상엽은 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus), 비피도 박테리윰 비피듐(Bifidobacterium bifidum) 비피더스균, 비피도 박테리움 브레브(Bifidobacterium breve) 비피더스균, 및 락토바실러스 아시도 필루스(Lactobacillus acidophilus)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 접종하여 발효된 것인
IL-1β에 의한 관절염 예방 또는 개선용 조성물.
- 제 4항에 있어서,
노간주나무 열수추출물을 더 포함하는 것인
IL-1β에 의한 관절염 예방 또는 개선용 조성물.
- 제5항에 있어서,
병조희풀 열수추출물을 더 포함하는 것인
IL-1β에 의한 관절염 예방 또는 개선용 조성물.
- 제 1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 IL-1β에 의한 관절염 예방 또는 개선용 조성물을 포함하는 것인
IL-1β에 의한 관절염 예방 또는 개선용 의약외품 조성물
- 제 1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 IL-1β에 의한 관절염 예방 또는 개선용 조성물을 포함하는 것인
IL-1β에 의한 관절염 예방 또는 개선용 식품 조성물.
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR101770035B1 (ko) | 2017-08-22 |
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