KR20180123405A - 상엽 추출물을 포함하는 관절염의 예방 또는 개선용 조성물 및 그 제조방법 - Google Patents
상엽 추출물을 포함하는 관절염의 예방 또는 개선용 조성물 및 그 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 상엽 추출물을 포함하는 관절염의 예방 또는 개선용 조성물은 -130 내지 -60 ℃로 동결된 상엽으로 추출한 상엽 추출물을 유효성분으로 포함하는 것이다.
본 발명에 따른 상엽 추출물을 포함하는 관절염의 예방 또는 개선용 조성물을 사용하는 경우 IL-1β, IL-6 및 TNF-α 등 퇴행성 관절염(osteoarthritis)과 관련된 사이토카인의 발현을 억제할 뿐만 아니라 iNOS, NO, COX-2, PGE2 및 MMP 발현을 억제하고, 연골이 손상되는 것을 억제하는 효과로써 관절염의 예방 또는 개선효과를 낼 수 있다.
본 발명에 따른 상엽 추출물을 포함하는 관절염의 예방 또는 개선용 조성물을 사용하는 경우 IL-1β, IL-6 및 TNF-α 등 퇴행성 관절염(osteoarthritis)과 관련된 사이토카인의 발현을 억제할 뿐만 아니라 iNOS, NO, COX-2, PGE2 및 MMP 발현을 억제하고, 연골이 손상되는 것을 억제하는 효과로써 관절염의 예방 또는 개선효과를 낼 수 있다.
Description
본 발명은 상엽 추출물을 포함하는 관절염의 예방 또는 개선용 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 보다 상세하게는 관절염의 예방 또는 개선용 조성물로서 이를 유효성분으로 포함한 골관절염 예방 또는 개선을 위한 기능성 식품 등에 다양한 분야에 대한 활용될 수 있도록 하는 것이다.
염증반응은 생체나 조직에 물리적 작용이나 화학적 물질, 세균 감염 등의 어떠한 기질적 변화를 가져오는 침습이 가해질 때 그 손상부위를 수복 재생하려는 기전이다. 일단 자극이 가해지면 국소적으로 히스티민(histamine), 세로토닌 (serotonine), 브래드키닌 (bradykinin), 프로스타그랜딘류 (prostaglandins), 하이드록실-에이코사테트라에노익산 (Hydroxyl-eicosatetraenoic acid, HETE), 류코트리엔 (leukotriene)과 같은 혈관 활성 물질이 유리되어 혈관 투과성이 증대되면서 염증을 유발한다. 손상에 따른 초기에 발생하는 적당한 염증은 손상 부위에 대한 빠른 복구를 가져오기 위한 정상적인 반응이다.
그러나 장기간에 걸친 지속적인 염증반응은 손상부분에 대한 복구를 어렵게 하고 주위 세포에 대한 위해(危害)를 가하여 주변조직에 대한 방어력을 떨어뜨려 더욱 증세를 악화시킬 수 있다. 또한 장기간에 걸친 염증반응은 주변조직에 대한 지속적인 손상을 유도해 그 결과 일부에서는 암 발생 등의 질환을 발생시킬 수도 있다.
따라서 염증 반응이 나타난 조직은 빠른 시간 내에 복구프로그램이 잘 작동하도록 적절한 항 염증제를 처치해야 한다. 하지만, 염증성 질환을 치료하기 위해 사용되고 있는 스테로이드성 제제들은 여러 가지 많은 부작용을 나타내고 있어 그 사용을 제한하고 있다. 따라서, 항염증 효과가 탁월하며 부작용이 적은 항염증제의 개발이 요구되고 있는 실정이다.
관절염 관련 질환은 전 세계 인구의 약 12%가 고통을 겪고 있는 대표적인 퇴행성, 난치성 질환으로 국내에도 약 200만 명 이상의 환자가 있다. 관절염은 신체의 근 골격 및 결합 조직에 염증성 변화가 생겨 근 골격계에 전신증상이 나타나는 것을 총칭하는 병명이다. 상기 질환은 관절, 뼈, 연골 조직 또는 척수에 영향을 주어, 종종 영구적인 조직 손상, 기형, 퇴화 및 장애를 일으키는 만성 염증을 특징으로 한다(Hofbause, L.C., et al.,Arthritis and Rheumatisu 44: 253-259, 2001). 관절염은 퇴행성 관절염(골관절염), 류마티스 관절염, 관절외 류마티즘 또는 콜라겐 질환으로 분류된다.
관절염 질환 중 가장 흔히 나타나는 퇴행성 관절염은 관절 연골이 닳아 없어지면서, 국소적인 퇴행성 변화가 나타나는 질환이다. 퇴행성 관절염은 관절을 구성하는 연골세포(chondrocytes)에 노화 등의 퇴행이 발생하여 연골세포에서 관절의 기질물질들인 유형 II 콜라겐(type-II collagen) 및 프로테오글리칸(proteoglycan) 등의 합성이 저해됨과 동시에 인터루킨-1β(interleukin-1β, IL-1β) 및 종양괴사인자(tumor necrosis factor-α, TNF-α) 등의 염증성 사이토카인(cytokine)이 생성됨에 따라 관절 기질을 분해하는 기질 금속 단백질 분해효소(matrix metalloproteinase, MMP)의 합성 및 활성이 관절 세포에서 증가됨으로 인해 관절 조직이 파괴됨으로써 유발되는 질병이다. 또한 관절염은 염증성 사이토카인에 의한 일산화질소(NO)의 생성과 생성된 일산화질소에 의한 자가 증폭적인 사이토카인의 생성으로 더욱 많은 MMP의 합성이 유발되게 되어 관절 기질의 분해가 촉진됨으로써 더욱 악화된다. 이와 동시에 염증성 사이토카인은 지질대사산물인 프로스타글란딘 E2(prostaglandin E2, PGE2)의 생성을 증가시켜 관절염에서 염증반응을 유발시킨다. 그 원인은 불확실하나, 노쇠 현상이나 과다한 체중과 관계가 깊은 질환으로 알려져있으며, 이 질환에서는 일차적으로 관절 연골의 퇴행성 변화가 나타난다. 퇴행성 변화는 관절 연골에서 시작되어 연골 세포가 괴사하게 되고, 기질이 카텝신 B(Cathepsin B), 카텝신D(Cathepsin D), 콜라게나아제(Collagenase) 등에 의해 파괴된다. 프로테오글리칸(Proteoglycan)과 콜라겐(Collagen)의 생성이 파괴정도를 따라가지 못하며 외력에 대한 연골의 적응 능력은 점점 감소하여 결국 연골 하골 조직에 미세 골절 등의 소견이 생기게 된다. 질환이 진행되면, 연골 하골의 경화, 관절 주변에 골의 과잉형성, 관절의 변형 등이 발생하게 되며, 연골의 표면이 거칠어지게 되고 관절막으로 싸인 관절강 안에 염증 반응이 반복되어 나타나게 된다. 따라서, 반복적인 동통, 관절의 강직감, 관절의 점진적인 운동 장애 등을 일으키게 된다.
관절염 중 류마티스 관절염은 병적 증상이 주로 가동 관절에 대칭적으로 나타나는 전신성, 만성 염증성 질환이며, 면역체계에 이상이 생겨 발생되는, 아직은 그 원인이 정확히 밝혀지지 않은 자가 면역 질환으로 알려져 있다. 상기 질환은 주변 관절의 구조적 기형을 일으키는, 연골 파괴 및 골 침식을 야기하는 지속적인 염증성 활막염을 특징으로 한다. 류마티스성 관절염과 관련된 증상에는 관절 부종, 관절 압통, 염증, 조조경직 및 특히 관절을 구부릴 때의 동통이 포함된다. 관절염이 진행된 단계에 있는 대상체는 골침식과 함께 관절 파괴를 비롯한 구조적 손상이 발생하게 된다(Firestein, G.S., Nature 423: 356-361, 2003). 추가로, 환자는 자가면역 과정과 관련된 맥관염에 기인한 피부, 신장, 심장, 폐, 중추 신경계 및 눈의 손상을 비롯한 각종 장기의 손상 같은 다른 임상적 증상이 있을 수 있다.
관절염과 관련된 다른 증상에는 적혈구 침강 속도의 증가 및 혈청 C-반응성 단백질(CRP) 및 (또는) 가용성 IL-2 수용체(IL-2r) 농도의 증가가 포함된다. 적혈구 침강 속도는 활성 류마티스성 관절염에 걸린 거의 모든 환자에서 증가된다. 혈청 C-반응성 단백질의 농도 역시 증가되고 이는 질환 활성도 및 진행성 관절 손상의 가능성과 관련 있다. 추가로, 활성 류마티스성 관절염에 걸린 환자의 혈청 및 활액에서 T-세포 활성화의 산물인 가용성 IL-2r의 농도도 증가된다(Udagawa, N., et.al., Arthritis and Research 4: 281-289, 2002).
류마티스성 관절염의 전개와 지속에 Th1 유형의 CD4+ T 세포가 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 즉, CD4+ T 림프구는 인터페론-감마(IFN-γ) 및 IL-17 같은 가용성 물질과 CD69 같은 세포 표면 물질에 의한 신호전달을 통해 대식 세포, 활막 세포들을 자극하여 염증성 사이토카인(TNF-α, IFN-γ, GM-CSF, IL-2, IL-6)과 매트릭스 메탈로프로티나아제(matrix metalloproteinase, MMP)를 분비하게 한다. 이렇게 분비된 사이토카인들은 활막의 증식을 촉진하여 판누스(pannus)를 형성하고, MMP와 함께 연골 파괴를 일으킨다. 또한 활성화된 CD4 + T 세포는 CD40L, CD28, a1b2 인테그린(integrin) 등이 매개된 세포 표면 접촉을 통해 B 세포를 활성화하여 류마티스성 인자(rheumatoid factor)를 포함한 항체를 생산케 한다. CD4+ T 세포는 활성화됨에 따라 vyas에 오스테오프로데거린 리간드(osteoprotegerin ligand, OPGL)를 발현하여 파골 세포 생성(osteoclastogenesis)을 촉진하여 뼈 파괴에 결정적인 역할을 한다(Kong Y.Y., et al., Nature 402: 304-309, 1999). 활성화된 대식세포, 섬유아세포 등은 VEGF, FGF와 같은 물질을 분비하여 새 혈관 형성을 촉진한다. 활막 조직 내의 활성화된 혈관 내피 세포는 IL-8과 같은 케모카인을 분비하고 결합분자(adhesion molecule) 발현을 유도하고 염증성 세포의 침윤을 촉진하여 염증반응의 증폭 사이클을 이룬다. 또한, 류마티스 관절염은 T-림프구와 항원 제시 세포사이의 항원-비특이성 세포간 상호작용과 관련된 T-세포-매개의 자가 면역 질환이라 생각된다. 일반적으로, T-세포 반응의 크기는 T-세포 표면 분자와 그의 리간드 사이의 상호작용에 의해 유도된 동시 자극 반응에 의해 결정된다. 주된 동시 자극 신호는 T-세포 표면 수용체인 CD28 및 CTLA4와 그의 리간드, 예를 들어 항원 제시 세포 상의 B7-관련 분자 CD80(즉, B7-1) 및 CD86(즉, B7-2) 사이의 상호작용에 의해 제공된다(Linsley, P., et al., ann. Rev. Immunol. 11: 191-212,1993). 동시자극이 없을 때의 T-세포 활성화는 면역 시스템이 자극에 대해 반응하지 않는 무력성(anergic) T-세포 반응을 초래한다(Schwartz, R.H., et.al., Cell 71: 1065-1068, 1992).
골관절염이 유도되면, 관절 내 염증 반응과 함께 통증이 증가하게 되는데, 이러한 통증은 활액 내에서 통증유발과 관련된 중요 인자인 프로스타글란딘 E2(PGE2)의 생성이 증가하기 때문이다. 사이클로 옥시제네이즈2(cyclooxygenase-2, COX-2)는 통증 유발 물질인 프로스타글란딘 E2를 합성하는 효소이며, 이는 NO(nitric oxide), TNF-α, IL-1β와 같은 염증성 사이토카인(IL-1β, TNF-α), 케모카인, 단백 분해효소 등과 같은 염증관련 인자들이 분비된다. 이러한 염증 반응은 골관절염의 초기에도 관찰되며, 활액막에 염증이 생겨 혈청 히알루론산(hyaluronic acid, HA) 농도가 상승되기도 한다. 활액막에는 감각신경 섬유가 분포되어 있으며, IL-1β와 TNF-α는 활액막에 분포하는 생체에 손상을 주거나 손상을 줄 수 있는 유해자극을 감지하는 수용체인 유해 수용기(nociceptor)를 자극하거나 민감하게 할 수 있다. 이러한 염증성 사이토카인들은 연골세포와 비만세포로부터 PGE2와 히스타민을 유리시키며, 이는 다시 유해수용기를 자극하므로 통증을 느끼게 된다. 골관절염에서는 염증반응과 함께 연골이 파괴되어 활액 내로 프로테오글리칸이 방출되어 활액량과 활액 내의 프로테오글리칸의 농도가 증가한다. 프로테오글리칸은 단백질과 당분으로 구성되어 있으며, 콜라겐 섬유와 엉겨 붙어 연골 내에 빽빽하게 밀집된 구조 또는 틀을 형성하여 몸을 굽혔다 폈다 하는 운동을 가능하도록 연골에 탄력성을 부여하는 복합 분자이다. 또한 프로테오글리칸은 연골 조직 내의 수분을 함유할 수 있는 스폰지 기능을 함으로써 연골이 계속적으로 관절 운동을 할 수 있도록 한다. 골관절염이 발생한 연골 조직은 MMP(matrix metalloproteinase)에 의하여 파괴되며, 골관절염이 진행되면 MMP-1, -2, -3, -8, -9, -13 등의 발현과 활성이 증가한다(Wieland, HA., et.al., Nat Rev Drug Discov 4: 331-344, 2005).
현재 사용되고 있는 퇴행성 관절염 및 류마티스 관절염의 치료방법은 다음과 같다. 초기 치료에 많이 사용되는 약물은 비스테로이드성 소염제(NSAID: non-steroidal anti-inflammatory drug)로서, 이들 NSAID들은 증세를 약간 호전시키기는 하지만 관절부위 연골 손실이나 질병의 진행을 막을 수는 없으며, 장기간에 걸쳐 투여되고, 장기 복요 시 위장계, 중추 신경계, 조혈 기관, 신장, 간 등에 부작용이 심하게 나타나서 이 치료법을 사용하는 환자의 절반 가량이 1년 이내에 치료를 중단해야만 한다(Langenegger, T., et. al., Clin Orthop. 366: 22-30, 1999). 다음 단계로는 금을 포함하는 화합물 약제(gold drugs; gold sodium thimalate, gold sodium thiosulfate)나 페니실아민(penicillamine), 항말라리아제(anti-malarials)와 같은 항관절염 제제(diseasemodifying anti-rheumatic drugs, DMARDs) 등이 사용된다. 그러나 상기 제재들 역시 관절염의 진행을 다소 감소시키지만, 심각한 부작용을 동반할 수 있기 때문에 항류마티스제(Disease Modifying Anti-Rheumatic Drug, DMARD)를 이용한 치료법이 시작된 5년 이후에는 5~15% 환자만이 이 약물을 계속 사용하고 있다. 상기의 치료제가 더 이상 효과를 보이지 않을 경우에는 류마티스가 발생한 관절부위를 외관절 시술에 의해 인공관절로 교체해야만 하는 경우도 있다(Simon, L.S., Int. J. clin. Pract., 54: 243-249, 2000).
일산화질소(Nitric oxide, NO)는 내피세포, 호중구 등에서 생성되며 L-아르기닌(L-arginine)에서 nitric oxide synthase(NOS)에 의해 시트룰린(citrulline)으로 전환 시에도 생성된다. 또한 일산화질소(nitric oxide)는 대부분의 기관에서 세포간 메신저(intercellular messenger)로서 작용하고 혈관의 항상성, 혈관 내피세포에 백혈구나 혈소판의 부착 억제와 혈소판 응집억제 및 신경전달 물질로서 작용한다. 아울러 면역계에서는 대식세포 및 항미생물 방어에 관여하며 슈퍼 옥사이드 음이온(superoxide anion)과 쉽게 반응하여 반응성이 매우 높은 산화제인 peroxynitrite (ONOO-)를 생성하기도 한다. NO는 과잉생성 시 신경퇴행성 질환, 만성염증, 패혈증, 고혈압, 혈전증, 신부전증, ARDS (성인호흡곤란 증후군), AIDS에 의한 뇌장애, 기관지 경련, 발작, 남성 발기부전증 등을 야기 시킨다. 일산화질소(Nitric oxide: NO)는 도 다른 종류의 활성종으로서 세포독성이 강하나 세포 간 혹은 세포 내 신호전달에 중요한 역할을 하며 생체 내에서 내피 의존성 확장 인자 (Endothelium Derived Relaxing Factor: EDRF)로서 면역반응에 관계하고 세포 항상성을 유지하는데 특히 기억력과 관련 있는 퇴행성 신경전달물질로서의 가능성 때문에 현재 뜨거운 관심을 받고 있다. 일산화질소는 여러 조직에서 nitric oxide synthase (NOS)에 의해 L-아르기닌(L-arginine)으로부터 합성되는데 NOS는 세 가지의 isoform을 가지고 있으며 type I (neuronal nitric oxide synthase, nNOS), type II (inducible nitric oxide synthase, iNOS) 및 type III (endothelium nitric oxide, ecNOS)로 구분되며 type I과 III는 Ca2 +와 칼모듈린(calmodulin에 의해 조절되는 constitutive form (cNOS)으로, type II는 post-transcription에 의해 조절되는 cytokine-inducible form(iNOS)으로 언급된다. cNOS는 세포 내에 존재하여 정상적인 생리기능을 유지하게 하는데 단기간에 소량의 NO를 생성함으로써 NO로 하여금 직접적인 효과를 나타낼 수 있게 하는 반면 iNOS는 사이토카인(cytokine)에 노출된 후에 발현되어 다량의 NO를 생성함으로써 nitrosation, nitration과 같은 간접적 효과 및 산화반응을 야기하여 유해한 효과를 나타내게 된다. 특히 대식세포가 활성화되면서 생성되는 NO는 주위 조직에 세포독성을 나타내는것으로 유명하다. NO는 반감기는 6-10초로 대단히 짧아 실질적으로 직접 검출하여 연구하는데 어려움이 많으므로 대부분의 NO 연구는 NOS 발현 유무나 NO의 안정화된 부산물인 아질산염(nitrite), 질산염(nitrate)을 측정하여 간접적으로 이루어지고 있다.
염증 반응이 진행하게 되면 염증성 사이토카인의 발현이 지속적으로 증가하게 되고 이로 인해 염증 반응이 장기화하게 되는데 이들 염증성 사이토카인 IL-1β, IL-6, IL-8 등의 발현을 억제시키는 것은 염증을 완화하는데 매우 중요하다. 또한, 염증성 사이토카인의 발현을 유도하는 전사조절인자인 NF-κB의 발현을 억제함으로써 항염증 효능을 보이게 된다(Inoue et al., Cancer Sci, 98, 268-274, 2007). 세균이나 바이러스, 염증성 유도 물질에 민감하게 반응하여 세포내로 신호를 전달하는 Toll-like receptors는 세포 내 신호전달 시스템을 통하여 NF-κB나 IRF3 등과 같은 전사조절 인자를 활성화시켜 염증을 유발하는 사이토카인, 케모카인 등의 발현을 촉진시킨다. (Kollisch et al., Immunology, 114, 531-541, 2005). 염증성 사이토카인의 발현을 억제시키거나 전사조절 인자인 NF-κB나 IRF3의 발현을 억제시키는 물질의 탐색은 항염증 치료 및 개선에 유용한 기능성 화장료 또는 의료제를 제공하게 된다.
한편, 염증 활성 인정을 억제하고 연골분해를 억제하는 효과를 가지는 천연물을 이용하는 경우 단기적인 관절염의 예방 및 개선효과를 이외에 천연물의 경우 그 사용에 따른 부작용이 없으므로 장기간 사용이 가능할 수 있다는 장점이 있다. 따라서 보다 다양한 천연물 유래의 관절염 예방 및 개선 조성물이 개발되고 있다. 이에 본 발명가들은 이용한 골관절염 예방 및 개선을 위한 천연물을 이용한 조성물을 연구하여 연골분해의 억제 활성을 확인하여 본 발명을 완성하였다
본 발명의 목적은 염증성 사이토카인을 억제하고, 연골 손상을 감쇄하는 활성으로 통하여 관절염의 예방 또는 개선효과를 가지는 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 천연물을 이용하면서 관절염 예방 또는 개선효과가 향상될 수 있도록 하는 범위를 제공하여 부작용이 없으면서도 관절염 예방 또는 개선효과가 극대화될 수 있도록 하는 상엽 추출물을 포함하는 관절염의 예방 또는 개선용 조성물을 제공하는 것이다.
한편, 본 발명의 다른 목적은 상엽 추출물을 포함하는 관절염의 예방 또는 개선용 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 관절염 예방 또는 개선용 조성물은 발효된 상엽을 물, 탄소수 1 내지 6의 알코올 및 이들의 혼합 용매로 구성되는 군으로부터 선택된 용매로 추출된 상엽추출물을 유효성분으로 포함하는 것이다.
상기 관절염은 골관절염 또는 류마티스 관절염일 수 있다.
상기 발효된 상엽은 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis)가 접종되어 발효된 것일 수 있다.
상기 관절염 예방 또는 개선용 조성물은 진달래 열수추출물을 더 포함하는 것일 수 있다.
상기 관절염 예방 또는 개선용 조성물은 두리안 껍질 열수추출물을 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 의약외품 조성물은 상기 관절염 예방 또는 개선용 조성물을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 식품 조성물은 상기 관절염 예방 또는 개선용 조성물을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 관절염 예방 또는 개선용 조성물 제조방법은 발효된 상엽을 분쇄하여 상엽 분말을 제조하는 상엽 분쇄단계; 상기 상엽 분말을 정제수를 사용하여 추출하는 추출단계 및 상기 추출물을 150 ℃ 내지 230 ℃에서 1시간 내지 5시간 동안 증류하는 증류단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 관절염 예방 또는 개선용 조성물 제조방법은 상기 상엽 분쇄단계 전에 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis)를 상엽에 접종하여 발효하는 상엽 발효단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 관절염 예방 또는 개선용 조성물은 발효된 상엽을 물, 탄소수 1 내지 6의 알코올 및 이들의 혼합 용매로 구성되는 군으로부터 선택된 용매로 추출된 상엽추출물을 유효성분으로 포함하는 것이다.
본 발명에서 말하는 상엽은 뽕나무 Morus alba Linne 또는 산뽕나무 Morus bombycis Koidzumi(뽕나무과 Moraceae)의 잎이다. 일명 동상엽(冬桑葉)이라고도 한다. 잎으로 달걀모양 또는 넓은 달걀모양이고 3 내지 5개로 갈라진 것도 있으며 길이 8 내지 15cm, 너비 7 내지 13cm이다. 윗면은 황록색 또는 연한 황갈색이다. 잎 끝은 뾰족하고 아랫부분은 심장형으로 되어 있으며, 잎 가장자리는 거치가 있다. 아랫면에는 엽맥이 돌출되어 있고 작은 엽맥은 그물 모양이며 그 위에 털이 나 있다. 질은 부스러지기 쉽고 가볍다. 냄새가 거의 없고 맛은 담담하나 약간 쓰며 떫다.
본 발명에 있어서, '예방'은 상기 조성물의 투여에 의해 IL-1β에 의한 질환을 억제하거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미하며, '개선'은 상기 조성물의 투여에 의해 관절염 질환에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 행위를 의미한다.
본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 상엽 추출물이 염증 유발 관련 iNOS 및 iNOS에 의해 증가하는 NO(산화질소), COX-2 및 아라키돈산으로부터 합성되는 PGE2(프로스타글란딘E2)의 발현을 억제함으로써, 염증 반응을 억제하는데 우수한 조성물임을 알 수 있었다. 이와 같은 결과로부터 본 발명의 상엽 추출물이 대표적인 염증성 질환의 일종인 골관절염, 류마티스 관절염을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있음을 보여, 염증성 질환과 같은 IL-1β에 의한 질환의 치료에 유용하게 사용할 수 있음을 확인하였다.
상기 'IL-1β에 의한 질환'은 IL-1β이 IL-1β의 수용체에 결합하여, MAPK와 NF-κB의 활성을 유도하고, 그의 타겟 유전자를 발현시킴으로써 발병되는 질환을 의미한다. 상기 IL-1β에 의한 질환은 이에 한정되지 않으나, 염증성 질환 또는 대사성 질환일 수 있다. 상기 염증성 질환은 염증을 주병변으로 하는 질병을 총칭하는 의미로서, 골관절염, 류마티스 관절염, 건선관절염, 아토피성 피부염, 건선, 천식, 전신 홍반성 루푸스, 및 다발성 경화증으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것일 수 있고, 바람직하게는 골관절염 또는 류마티스 관절염인 것일 수 있다.
상기 관절염은 골관절염 또는 류마티스 관절염일 수 있다.
IL-1β는 IL-1β의 수용체인 IL-1R에 결합하면서 이후 다운스트림(down stream)에 있는 MAPK와 NF-κB를 경유하여 기질 분해 관련 MMP와 염증 관련 iNOS, COX-2를 조절한다. 본 발명의 상엽 추출물은 IL-1β에 의한 신호 전달에 있어서, MAPK 패밀리인 p38, JNK의 발현을 억제하는 활성을 가지며, IκB-α의 분해의 저해제(inhibitor)로서 IκB-α의 분해를 억제하고 NF-κB 활성을 감소시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 상엽 추출물이 결합조직의 세포외 기질과 기저막의 주성분을 분해하는 MMP의 활성을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다. MMP는 섬유아세포와 다형핵성백혈구, 상피세포 및 대식세포에 의하여 분비되는 콜라게나아제로, 골 흡수와 관련하여 부갑상선 호르몬 및 세포내 독소, 프로스타글란딘은 MMP의 합성을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 상엽 추출물은 MAPK 패밀리 및 MAPK의 타겟 유전자인 MMP, 특히 MMP-1, MMP-3, MMP-13의 발현을 감소시켜 콜라게나아제를 억제함으로써 연골을 보호하므로 골대사 질환에 적합한 약학 조성물이라는 것을 보여주었다. 이와 같은 결과로부터 본 발명의 상엽 추출물이 대표적인 염증성 질환인 골관절염, 류마티스 관절염과 대표적인 대사성 질환인 골다공증을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있음을 확인하였고, 이는 염증성 질환 또는 대사성 질환과 같은 IL-1β에 의한 질환의 치료에 효과적일 수 있음을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 상엽 추출물은 물, 탄소수 1 내지 6의 알코올 및 이들의 혼합 용매로 구성되는 군으로부터 선택된 용매로 추출한 것일 수 있다. 상기 '상엽 추출물'이란 상엽을 추출하여 수득한 추출물을 의미한다. 상기 상엽 추출물은 상엽 분쇄물을 물, 에탄올, 메탄올 등과 같은 탄소수(C1) 내지 (C6)의 알코올과 같은 극성 용매, 또는 알코올과 물의 1:0.1 내지 1:10의 혼합비를 갖는 혼합 용매로 용출할 수 있으며, 바람직하게는 1: 3 내지 5 의 에탄올과 물의 혼합비를 가지는 혼합 용매로 용출할 수 있다. 이 때, 추출 온도는 10℃ 내지 100℃, 바람직하게는 실온에서, 추출 기간은 12시간 내지 4일, 바람직하게는 24시간 동안 추출한 추출물 일 수 있다. 여과된 추출물을 진공 회전 농축기로 감압 농축하여 수득한 결과물일 수 있으나, 본 발명의 IL-1β에 의한 질환의 치료 효과를 나타낼 수 있는 상엽 추출물인 한, 이에 제한되지 않고, 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 이의 조정제물 또는 정제물을 모두 포함한다.
상기 상엽은 뽕나무의 줄기, 뿌리, 열매 등에 비하여 IL-1β에 대한 억제 효과가 우수하다. 따라서, 바람직하게는 상엽에 대한 에탄올 추출물을 사용하는 것일 수 있다.
바람직하게는 상기 에탄올은 12 내지22 중량%인 것일 수 있다. 상기 범위에 의한 추출물은 유효성분의 수득에 가장 유리할 수 있다.
상기 상엽 추출물은 발효된 상엽을 사용하여 추출된 것일 수 있다. 발효된 상엽을 사용하는 경우 세포독성이 낮아 상대적으로 높은 농도에서 안정적으로 사용할 수 있는 장점이 있다.
상기 상엽을 발효시키는데 사용하는 미생물로는 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 델브루에키(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 레우테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 부츠네리(Lactobacillus buchneri), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 존스니(Lactobacillus johonsonii), 락토바실러스 케피르(Lactobacillus kefir) 등과 같은 유산 바실리, 락토코코스 락티스(Lactococcus lactis), 락토코코스 플랜타룸(Lactococcus plantarum), 락토코코스 라피노락티스(Lactococcus raffinolactis), 엔테로코코스파에칼리스(Enterococcus faecalis), 엔테로코코스 파에시늄(Enterococcus faecium), 스트렙토코코스 터모필리우스(Streptococcus thermophilus), 류코노스톡락티스(Leuconostoc lactis), 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) 등과 같은 유산 콕사이 및 비피도박테리움 애닐멀스(Bifidobacterium animals), 비피도 박테리움 비피듐(Bifidobacterium bifidum),비피도박테리움 브레브(Bifidobacterium breve), 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis), 비피도바테리움 롱굼(Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 수도롱굼(Bifidobacterium pseudolongum), 비피도박테리움 터모필룸(Bifidobacterium themophilum), 비피도박테리움 아돌센티스(Bifidobacterium adolescentis) 등과 같은 비피도박테리아를 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus), 비피도 박테리윰 비피듐(Bifidobacterium bifidum) 비피더스균, 비피도 박테리움 브레브(Bifidobacterium breve) 비피더스균, 및 락토바실러스 아시도 필루스(Lactobacillus acidophilus)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다.
특히 상기 발효된 상엽은 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis)가 접종되어 발효된 것일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함될 수 있으며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들어 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결 건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.
본 발명의 상엽 추출물은 예로부터 식용 및 약용으로 사용되어 온 것으로 그 투여용량에 특별한 제약은 없고, 체내 흡수도, 체중, 환자의 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다. 일반적으로 상엽 추출물은 바람직하게는 체중 1 kg당 10 내지 1000 mg 정도를 투여할 수 있으며, 보다 바람직하게는 체중 1 kg당 50 내지 500 mg 정도 투여할 수 있다. 본 발명의 상엽 추출물을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물은 유효량 범위를 고려하여 제조하도록 하며, 이렇게 제형화된 단위 투여형 제제는 필요에 따라 약제의 투여를 감시하거나 관찰하는 전문가의 판단과 개인의 요구에 따라 전문화된 투약법을 사용하거나 일정 시간 간격으로 수회 투여할 수 있다.
본 발명은 또한, 상엽 추출물을 유효성분으로 포함하는 IL-1β에 의한 질환 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다. 상기 상엽 추출물의 제조 및 구성에 관해서는 상기에서 설명한 바와 같다. 보다 구체적으로, 본 발명의 상엽 추출물은 IL-1β에 의한 질환의 예방 또는 치료를 목적으로 의약외품 조성물에 첨가할 수 있다.
상기 관절염 예방 또는 개선용 조성물은 진달래 열수추출물을 더 포함하는 것일 수 있다.
상기 진달래는 참꽃 또는 두견화라고도 한다. 전국의 50 내지 2,000m 높이의 산야에서 무리지어 자란다. 높이는 2 내지 3m이고 줄기 윗부분에서 많은 가지가 갈라지며, 작은가지는 연한 갈색이고 비늘조각이 있다. 잎은 어긋나고 긴 타원 모양의 바소꼴 또는 거꾸로 세운 바소꼴이며 길이가 4 내지 7cm이고 양끝이 좁으며 가장자리가 밋밋하다. 잎 표면에는 비늘 조각이 약간 있고, 뒷면에는 비늘 조각이 빽빽이 있으며 털이 없고, 잎자루는 길이가 6 내지 10mm이다. 진달래의 꽃은 4월에 잎보다 먼저 피고 가지 끝 부분의 곁눈에서 1개씩 나오지만 2 내지 5개가 모여 달리기도 한다. 화관은 벌어진 깔때기 모양이고 지름이 4 내지 5cm이며 붉은빛이 강한 자주색 또는 연한 붉은 색이고 겉에 털이 있으며 끝이 5개로 갈라진다. 수술은 10개이고 수술대 밑 부분에 흰색 털이 있으며, 암술은 1개이고 수술보다 훨씬 길다.
진달래의 열매는 삭과이고 길이 2cm의 원통 모양이며 끝 부분에 암술대가 남아 있다. 관상용으로 심기도 하고, 꽃은 이른봄에 꽃전을 만들어 먹거나 진달래술(두견주)을 담그기도 한다. 한방에서는 꽃을 영산홍(迎山紅)이라는 약재로 쓰는데, 해수·기관지염·감기로 인한 두통에 효과가 있고, 이뇨 작용이 있다.
상기 진달래 추출물을 더 포함하는 경우 염증 유발 관련 iNOS 및 iNOS에 의해 증가하는 NO(산화질소), COX-2 및 아라키돈산으로부터 합성되는 PGE2(프로스타글란딘E2)의 발현을 억제하는 효과가 증대되어 상기 관절염 예방 및 개선효과가 높아지는 장점을 가진다.
바람직하게 상기 관절염 예방 또는 개선용 조성물은 진달래 및 두리안 껍질 열수추출물을 더 포함하는 것일 수 있다.
두리안은 과일 중의 왕자라는 별명을 지닌 크고 맛있는 열매를 생산하지만, 양파 썩은 냄새가 나므로 싫어하는 사람도 있다. 높이 20 내지 30m이며 가지가 굵다. 잎은 어긋나고 두꺼우며 긴 타원형으로 가장자리가 밋밋하고 길이 12 내지 18cm이며 뒷면에 갈색 비늘조각이 있다. 꽃은 3 또는 4월에 피고 원줄기와 큰 가지에 달리며 백황색이다. 열매는 지름 20 내지 25cm이고 타원형이거나 거의 둥글며 7 또는 8월에 갈색으로 익고 굵은 가시가 밀생한다.
상기 진달래 추출물과 두리안 껍질 추출물이 혼합되는 경우 항염증 유효성분이 수득이 증대되어 PGE2(프로스타글란딘E2)의 발현을 효과적으로 억제할 수 있어 보다 적은 함량으로 관절염 예방 및 개선효과가 높아지는 장점을 가진다.
또한 바람직하게 상기 관절염 예방 또는 개선용 조성물은 상엽 추출물 100 중량부에 대하여 진달래 추출물 1 내지 800중량부 및 두리안 껍질 추출물 0.1 내지 100 중량부를 포함하는 것일 수 있다. 상기 범위에 의하는 경우 각 추출물의 혼합에 따른 상승효과로 항염증 효과가 크게 높아질 수 있다.
더 바람직하게 상기 관절염 예방 또는 개선용 조성물은 상엽 추출물 100 중량부에 대하여 진달래 추출물 10 내지 100중량부 및 두리안 껍질 추출물 1 내지 10 중량부를 포함하는 것일 수 있다. 상기 범위에 의하는 경우 각 추출물의 혼합에 의한 상승효과로 적은 함량으로 높은 항염증 효과로서 관절염의 예방 또는 개선효과를 낼 수 있을 뿐만 아니라 각 추출물의 조합에 의한 향미가 우수할 뿐만 아니라 두리안의 기호도 낮은 냄새가 중화될 수 있어 기호도 높은 식품조성물로 제공될 수 있는 장점을 가진다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 의약외품 조성물은 상기 관절염 예방 또는 개선용 조성물을 포함하는 것일 수 있다.
상기 상엽 추출물의 제조 및 구성에 관해서는 상기에서 설명한 바와 같다. 보다 구체적으로, 본 발명의 상엽 추출물은 IL-1β에 의한 질환의 예방 또는 치료를 목적으로 의약외품 조성물에 첨가할 수 있다.
본 발명에 있어서 '의약외품'은 사람이나 동물의 질병을 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 섬유, 고무제품 또는 이와 유사한 것, 인체에 대한 작용이 약하거나 인체에 직접 작용하지 아니하며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것, 감염형 예방을 위하여 살균, 살충 및 이와 유사한 용도로 사용되는 제제 중 하나에 해당하는 물품으로서, 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것 및 사람이나 동물의 구조와 기능에 약리학적 영향을 줄 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것을 제외한 물품을 의미한다.
본 발명의 상엽 추출물을 의약외품 첨가물로 사용할 경우, 상기 상엽 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 또는 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
본 발명의 의약외품 조성물은 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 소독청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제 비누, 핸드워시, 가습기 충진제, 마스크, 연고제 또는 필터 충진제일 수 있다.
본 발명의 상엽 추출물을 건강기능식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 상엽 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 건강기능식품 또는 건강기능식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
본 발명의 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 추출 혼합물을 첨가할 수 있는 건강기능식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있고, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함할 수 있으며, 동물을 위한 사료로 이용되는 식품을 포함할 수 있다. 상기 외에 본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 조성물을 인간을 제외한 IL-1β에 의한 질환 의심 개체에 투여하는 단계를 포함하는, IL-1β에 의한 질환 치료 방법을 제공한다.
본 발명에서 상기 IL-1β에 의한 질환 의심 개체는 염증성 질환 또는 대사성 질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 모든 동물을 의미하며, 본 발명의 상엽 추출물을 포함하는 약학 조성물을 IL-1β에 의한 질환 의심 개체에 투여함으로써, 개체를 효율적으로 치료할 수 있다. 상기 IL-1β에 의한 질환에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명에 있어서 '투여'는 어떠한 적절한 방법으로 IL-1β에 의한 질환 의심 개체에게 본 발명의 약학 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.
본 발명의 치료 방법은 상엽 추출물을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있으며, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.
본 발명은 또한, 상엽 추출물을 유효성분으로 포함하는 IL-1β에 의한 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다. 상기 상엽 추출물의 제조 및 구성에 관해서는 상기에서 설명한 바와 같다. 보다 구체적으로, 본 발명의 상엽 추출물은 IL-1β에 의한 질환의 예방 또는 치료를 목적으로 건강기능식품 조성물에 첨가할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 식품 조성물은 상기 관절염 예방 또는 개선용 조성물을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 관절염 예방 또는 개선용 조성물 제조방법은 발효된 상엽을 분쇄하여 상엽 분말을 제조하는 상엽 분쇄단계; 상기 상엽 분말을 정제수를 사용하여 추출하는 추출단계 및 상기 추출물을 150 ℃ 내지 230 ℃에서 1시간 내지 5시간 동안 증류하는 증류단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 관절염 예방 또는 개선용 조성물 제조방법은 상기 상엽 분쇄단계 전에 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis)를 상엽에 접종하여 발효하는 상엽 발효단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 상엽 추출물을 포함하는 관절염의 예방 또는 개선용 조성물을 사용하는 경우 IL-1β, IL-6 및 TNF-α 등 퇴행성 관절염(osteoarthritis)과 관련된 사이토카인의 발현을 억제할 뿐만 아니라 iNOS, NO, COX-2, PGE2 및 MMP 발현을 억제하고, 연골이 손상되는 것을 억제하는 효과로써 관절염의 예방 또는 개선효과를 낼 수 있다.
또한, 본 발명은 천연물을 이용하면서 관절염 예방 또는 개선효과가 향상될 수 있도록 하는 범위를 제공하여 부작용이 없으면서도 관절염 예방 또는 개선효과가 극대화될 수 있도록 하는 상엽 추출물을 포함하는 관절염의 예방 또는 개선용 조성물을 제공한다.
따라서 상엽 추출물을 포함하는 관절염의 예방 또는 개선용 조성물을 활용하여 관절염 예방 및 개선 효과를 낼 수 있는 건강기능 식품 등 다양한 분야에 제공될 수 있다.
한편, 본 발명은 상엽 추출물을 포함하는 관절염의 예방 또는 개선용 조성물의 제조방법을 제공한다.
도 1은 SW1353 연골세포의 생존에 대한 상엽 추출물의 효과에 관한 것이다.
도 2는 SW1353 연골세포의 생존에 대한 상엽 추출물의 효과에 관한 것이다.
도 3은 상엽 추출물에 의한 MIA의 관절염 유발 억제효과에 관한 것이다.
도 4는 상엽 추출물에 의한 MIA의 관절염 유발 억제효과에 관한 것이다.
도 5는 관절염 유도 모델에 대한 조직학적 평가 결과에 관한 것이다.
도 6은 관절염 유도 모델에 대한 조직학적 평가 결과에 관한 것이다.
도 7은 상엽 추출물의 MMP-13 발현 결과에 관한 것이다.
도 8은 상엽 추출물의 MMP-13 발현 결과에 관한 것이다.
도 9는 상엽 추출물의 COMP와 CTX-Ⅱ 평가결과에 관한 것이다.
도 10은 상엽 추출물의 COMP와 CTX-Ⅱ 평가결과에 관한 것이다.
도 11은 상엽 추출물의 염증성 사이토 카인의 생성 억제 효과에 관한 것이다.
도 2는 SW1353 연골세포의 생존에 대한 상엽 추출물의 효과에 관한 것이다.
도 3은 상엽 추출물에 의한 MIA의 관절염 유발 억제효과에 관한 것이다.
도 4는 상엽 추출물에 의한 MIA의 관절염 유발 억제효과에 관한 것이다.
도 5는 관절염 유도 모델에 대한 조직학적 평가 결과에 관한 것이다.
도 6은 관절염 유도 모델에 대한 조직학적 평가 결과에 관한 것이다.
도 7은 상엽 추출물의 MMP-13 발현 결과에 관한 것이다.
도 8은 상엽 추출물의 MMP-13 발현 결과에 관한 것이다.
도 9는 상엽 추출물의 COMP와 CTX-Ⅱ 평가결과에 관한 것이다.
도 10은 상엽 추출물의 COMP와 CTX-Ⅱ 평가결과에 관한 것이다.
도 11은 상엽 추출물의 염증성 사이토 카인의 생성 억제 효과에 관한 것이다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
[제조예: 상엽 추출물의 제조]
1. 상엽의 준비.
뽕나무(M. alba L)의 잎인 상엽(Mori folium)은 바이오-포트 코리사사(부산, 한국)로부터 입수하였고, 동의대 한의대(부산,한국), 생화학과의 S.H. Hong 교수에 의해서 인증받았다. 건조된 잎은 작은 조각으로 절단하고, 미세한 분말로 만든 후에, 3시간 동안 증류수(50g/500㎖)에서 가열하였다. 추출액은 불용성 물질을 제거하기 위해서 와트만 3호 여과지를 통하여 두 번 여과하고, 여액은 동결건조시킨 다음, 미세한 분말로 분쇄하였다.
상엽 추출물은 증류수로 100㎎/㎖의 농도로 용해시키고, 저장액(stock solution)은 사용하기 전에 목적하는 농도로 배지에 희석하였다.
또한, 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis)를 접종하여 5일간 발효시킨 상엽을 사용하여 상기 상엽 추출물의 제조방법과 동일하게 추출하여 발효상엽 추출물을 제조하였다.
2. 세포 배양
SW1353연골세포는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(Manassas, VA, USA)에서 구입하였다.
상기 세포는 소태아혈청(fetal bovine serum) 10% v/v, 페니실린 100 유닛/㎖ 및 스트렙토마이신 100㎎/㎖을 함유하고,상엽이 있거나 또는 없는 상태에서, 5% 이산화탄소와 37℃로 가습된 공기로 둘베코수정이글배지(Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA)에서 배양하였다.
3. 동물
동물 시험을 진행하기 위해 삼타코사로(오산, 대한민국)부터 180 내지 240g(5주령)의 실험용 레트(rats)을 구입하였다. 상기 동물은 온도 20 내지 24℃, 습도 40 내지 70%로 유지되는 폴리카본 케이지에서 수용하였으며 멸균된 먹이를 제공하였다. 또한 이 연구는 국립보건원의 실험 동물의 관리 및 사용에 관한 권장사항을 엄격히 준수하였고, 본 연구에 사용된 동물 프로토콜은 동의대의 동물 관리 및 사용 위원회의 윤리적 절차 및 과학적 관리 절차에 따라 승인을 받았다.(승인 번호 : A2015-019)
[시험방법]
1. MTT분석법
세포의 생존율은 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)- 2,5-디페닐테트라졸륨브로바이드를 사용하여 (MMT)분석하였다. 간단하게, SW1353 셀은 웰 당 2X105 세포의 밀도로 6 개의 웰 플레이트에 시딩하였다. 24시간 동안 배양한 후에, 상기 세포들은 상엽 추출물의 다양한 농도 또는 IL-1β의 40ng/㎖ (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA)로 개별적으로 처리되거나,또는 상기 세포들은 IL-1β처리 전의 1시간 동안 상엽 추출물의 상이한 농도로 전처리 하였다.
24시간 후에, 배지를 제거하고, MMT 작업 용액(0.5㎎/㎖, Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO, USA)은 배양 플레이트들에 첨가하고, 2시간 동안 37℃에서 지속적으로 배양하였다.
그후, 배양 상청액을 웰로부터 제거하고, 디메틸설폭사이드 (DMSO, Sigma-Aldrich Chemical Co.)를 가하여, 포르마잔 결정을 용해시켰다.
진탕한 후에, 각 웰의 흡광도를 마이크로 플레이트 리더(Dynatech Laboratories, Chantilly VA, USA)로 540㎚의 파장에서 측정하고, 그 결과는 100% 생존한 것과 처리되지 않은 대조군에 관하여 세포 활성도로 표현하였다.
2. MIA 주입을 통한 관절염 유도 및 상엽 추출물 주입
실험을 진행하기 전에 무작위로 상기 레트를 무작위로 각 군별로 8마리가 되도록 할당하였다. 또한 관절염을 유도하기 위해 모노소듐 아이도아세테이트(Monosodium iodoacetate, MIA)를 상기 레트의 오른쪽 무릎 관절에 주입하여 퇴행성 관절염을 유도하였다.
상기 퇴행성 관절염이 유도된 레트를 각 군별로 100mg/kg씩 3주간 각각 SF를 처리하였다.
한편 대조군으로 다른 군에 상엽 추출물(MF)만 100mg/kg의 투여량으로 3주간 경구 투여한 군과 정상대조군으로 생리 식염수만 주입한 군으로 준비하였다.
3. 무릎 관절의 부종 측정
상기 퇴행성 관절염이 유도된 후 약 3주 후 상기 레트가 사망한 후에 오른 쪽 무릎을 분리하여 대퇴골, 경골 및 슬개골 근육을 해부하였다. 또한 퇴행성 관절염의 발달 정도를 평가하기 위해 calibrated digital caliper (Mitutoyo, Kawasaki, Japan)를 사용하여 무릎의 직경을 측정하였다.
4. 혈청분석
상기 퇴행성 관절염이 유도된 후 3주차 마지막 날에 레트의 복부 정맥을 통하여 혈액을 채취하였다. 채취된 혈액에서 혈청을 원심 분리를 통해 분리하고, 사용 전까지 -80 ℃에 보관 하였다. 상기 혈청 시료에서 산화 질소 (NO)의 농도는 Griess의 시약을 이용하여 아질산염을 측정하여 결정 하였다.
5. 면역조직화학적 관찰
면역조직화학법(immunohistochemistry, IHC)은 조직 절편을 15분 동안 3w% 과산화수소로 처리하여 내재성 peroxidase를 비활성화시킨 뒤에 4 ℃에서 24시간 동안 정상 goat serum(Sigma-Aldrich Chemical Co.)을 30분간 처리한 뒤 horseradish peroxidase streptavidin-biotin 염색과 3,3′-diaminobenzidine (DAKO, Glostrup, Denmark)을 처리하였다.
(*Primary antibodies against the following proteins were used: inducible NO synthase (iNOS, 1:100; SC-7271, mouse monoclonal, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA), cyclooxygenase-2 (COX-2, 1:50; SC-19999, mouse monoclonal; Santa Cruz Biotechnology, Inc.), MMP-13 (1:50; ab51072, rabbit monoclonal; Abcam, Cambridge, UK), COMP (1:50; ab11056, rabbit monoclonal; Abcam) and CTX-Ⅱ (1:50; PAA686Hu01, rabbit polyclonal; Cloud-Clone Corp., Houston, TX, USA ).)
6. 혈청 분석.
3 주가 끝날 때 복부 정맥에서 전혈 샘플을 채취하고, 채취된 혈액을 30 분 동안 응고시켰다. 그 다음, 혈청을 10 분간 1,500 g에서 원심 분리를 통해 분리하여 사용할 때까지 -80℃로 저장 하였다. 혈청 시료에서 NO의 농도는 Griess의 시약을 사용하여, NO의 주요 안정한 제품 아질산염을 측정하여 결정 하였다. 광학 밀도는 효소 면역 분석법 (ELISA) 판독기(DYNATECH 연구소 티이, VA, USA)을 사용하여 54 0 nm에서 측정 하였다
6. 복합추출물의 제조
바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis)로 발효시킨 상엽 추출물(MF)를 제조하고, 이를 하기의 표 1과 같은 비율로 진달래 열수 추출물(RF) 및 두리안 껍질 추출물(DF)와 혼합하여 실시예를 제조하였다.
A | B | C | D | E | F | |
MF | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
RF | 1 | 5 | 10 | 50 | 100 | 500 |
DF | 0.1 | 0.5 | 1 | 5 | 5 | 10- |
(단위: 중량부)
[시험결과]
1. SW1353 연골세포의 생존에 대한 상엽 추출물의 효과
상엽 추출물이 SW1353 세포에 대하여 독성 효과가 있는지 여부를 평가하기 위해서, 세포를 24시간 동안 상엽 추출물의 다양한 농도로 처리하였다.
MTT 분석법에서, 상엽 추출물의 농도가 800㎍/ml까지 SW1353 세포에서 세포 독성을 유발하지 않았다.
반면, 상엽 추출물 1000㎍/ml에서 생존율은 현저하게 감소하였다(약 70%, 도. 1A).
이후의 실험에서는, IL-1β 유도 SW1353 세포에 상엽 추출물을 800㎍/ml 이하의 농도로 처리한 경우 또한, 세포 생존율에 불리한 영향이 없었다(도 1B).
한편, 발효상엽 추출물을 사용한 경우 세포생존율이 상당히 우수하였으며, 1000㎍/ml에서도 생존율이 거의 그대로 높게 유지될 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.(도 2) 따라서 발효상엽 추출물을 사용하는 경우 세포독성이 낮아 부작용 없이 제공될 수 있는 장점이 있다.
따라서, 발효 상엽된 상엽을 이용하여 발효된 상엽 추출물(이하 상엽 추출물)의 농도는 800㎍/ml 내에서 나머지 실험에 적용하였다.
2. 상엽 추출물에 의한 MIA의 관절염 유발 억제효과
무릎 관절 직경의 팽윤도를 측정하여 MIA 주입 후 발생한 염증을 평가하였고 그 결과를 하기의 하기의 도 3 및 4에 나타내었다. 하기의 도 3 및 4를 참조하면, 대조군에 비하여 MIA를 주입한 군은 정상대조군에 비하여 무릎 직경이 크게 증가한 것을 알 수 있다. 한편, MIA와 함께 각각 상엽 추출물(MF)을 처리한 군은 MIF 투입 3주가 지난 후에 무릎의 부종이 유의하게 감소하는 것을 알 수 있다. 또한 상엽 추출물(MF)와 진달래 및 두리안 껍질 추출물 혼합물를 100: 10: 1의 중량비로 혼합한 MF.X의 경우 정상대조군에 근접하는 수준으로 감소하는 것을 알 수 있다.
3. 조직학적 평가
연골 변성은 퇴행성 관절염의 주요 조직학적 기작이기 때문에 각 군의 관절 손상 정도를 평가하여 하기의 도 5 및 6에 나타내었다. 하기의 도 4를 참조하면 MIA를 투여한 경우 정상대조군에 비하여 관절손상이 크게 높아지는 것을 알 수 있다. 다만 MIA와 MF를 함께 처리한 경우 그 정도가 낮아지는 것을 확인할 수 있었다. 특히 MF.X를 처리한 경우 대조군에 가까울 정도로 그 효과가 크게 높아진다는 것을 알 수 있다. 따라서 상기 상엽 추출물을 사용하는 경우 MIA에 의해서 유도된 퇴행성 관절염을 억제하는 효과가 있다는 것을 알 수 있다.
4. MIF 유도된 군에서 상엽 추출물의 MMP-13 발현 결과
퇴행성 관절염에 의한 연골 파괴되는 MMps를 포함한 몇가지 효소에 의해 발생된다. 특히 MMP-13은 연골 저하에 있어 가장 중요한 역할을 수행하므로 MIA로 골관절염이 유도된 연골에서 MMP-13의 발현에 상엽추출물의 효과를 평가하였다. 그 결과 도 7 및 8을 참조하면 상기 상엽 추출물(MF) 및 상엽 혼합추출물(MF.X)를 처리하는 경우 MIA 주사 후 MMP-13에 대해 양성인 연골 세포 수가 저하되고, 골관절염이 개선되는 것을 알 수 있다. 특히 MF.X에 의하는 경우 그 효과가 매우 우수하다는 것을 확인하였다.
5. COMP와 CTX-Ⅱ 평가
퇴행성 관절염과 관련된 각 군에 대한 COMP와 CTX-Ⅱ을 평가하여 하기의 도 9 에 나타내었다. 그 결과 MF 및 MF.X를 사용하는 경우 COMP 뿐만 아니라 CTX-Ⅱ의 발현을 상당히 낮춘다는 것으로 확인할 수 있다.
6. 염증성 사이토 카인의 생성 억제 효과
염증성 사이토 카인은 퇴행성 관절염이 발생하는데 중요한 역할을 한다. 따라서 상기 SF가 IL-1β, IL-6 및 TNF-α와 같이 퇴행성 관절염과 관련된 염증성 사이토 카인의 생성을 억제하는지 여부를 확인하였고 그 결과를 하기의 도 10에 나타내었다. 하기의 도 10을 참조하면 정상대조군과 MIA 처리군을 비교하면 상기 사이토 카인의 발현이 증가하는 것을 알 수 있다. 반면, MIA와 MF를 동시에 처리하거나 MIA와 MF.X를 동시에 처리하는 경우 IL-1β, IL-6 및 TNF-α가 효과적으로 억제되는 것을 알 수 있다.
7. NO 및 PEG2 평가
NO 및 PEG2과 같은 염증성 매개체의 발현을 측정하여 MIA에 따른 퇴행성 관절염의 발현 및 SF에 의한 억제를 평가하여 하기의 도 11에 나타내었다. 하기의 도 5를 참조하면 MIA를 처리한 경우 정상대조군에 비하여 NO 및 PEG2이 상당히 높아지는 것으로 알 수 있다. 반면 MIA와 MF를 동시에 처리하거나 MIA와 MF.X를 동시에 처리하는 경우 상기 SF가 NO 및 PEG2의 발현을 조절하여 억제하는 것을 알 수 있다.
8. 복합추출물의 관능성 평가
위 복합추출물 A 내지 F을 음료로 제조하고, 성인남녀 20인에 대한 관능성 평가를 수행하였다. 관능성 평가는 향과 맛을 기초로 기호성에 따라 1 내지 10의 지수로 평가하여 평균지수로 구분하였고 그 결과를 표 2에 나타내었다.(하기의 지수는 그 숫자가 높을수록 기호성이 높은 것이다)
A | B | C | D | E | F | |
향 | 5 | 7 | 8 | 7 | 7 | 4 |
맛 | 6 | 5 | 8 | 8 | 9 | 5 |
기호성 | 2.5 | 2 | 8 | 7.5 | 8 | 4.5 |
(단위: 지수)
상기 표 2를 참조하면, 상엽 추출물은 텁텁한 맛이 있고 기호성 있는 향이 나지 않는다. 상엽의 향은 진달래의 진한 단 향기와 두리안 껍질의 강한 향에 의해 중화되는 것을 확인하였지만 두리안 껍질의 함량이 5 중량부를 초과하는 경우 다른 추출물을 아무리 혼합하여도 두리안 껍질에 의한 강한 향으로 전체적인 향이 크게 저하되는 문제가 있다는 것을 확인하였다.
따라서 바람직하게 상기 C 내지 E 범위에 의하는 복합 추출물에 의하는 경우 상엽 추출물을 포함하여 관절염 예방 또는 개선 효과를 낼 수 있으면서도, 기호성이 높아 보급하기 용이한 식품 또는 기능성 식품으로 제공될 수 있다.
이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.
Claims (8)
- 발효된 상엽을 물, 탄소수 1 내지 6의 알코올 및 이들의 혼합 용매로 구성되는 군으로부터 선택된 용매로 추출된 상엽추출물을 유효성분으로 포함하는
관절염 예방 또는 개선용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 관절염은 골관절염 또는 류마티스 관절염인
관절염 예방 또는 개선용 조성물. - 제 1항에 있어서,
상기 발효된 상엽은 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis)가 접종되어 발효된 것인
관절염 예방 또는 개선용 조성물. - 제 3항에 있어서,
진달래 열수추출물을 더 포함하는
관절염 예방 또는 개선용 조성물. - 제 1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 관절염 예방 또는 개선용 조성물을 포함하는
의약외품 조성물. - 제 1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 관절염 예방 또는 개선용 조성물을 포함하는
식품 조성물. - 발효된 상엽을 분쇄하여 상엽 분말을 제조하는 상엽 분쇄단계;
상기 상엽 분쇄단계에 따라 제조된 상엽 분말을 정제수를 사용하여 추출물을 제조하는 추출단계 및
상기 추출물을 150 ℃ 내지 230 ℃에서 1시간 내지 5시간 동안 증류하는 증류단계를 포함하는
관절염 예방 또는 개선용 조성물 제조방법. - 제 7항에 있어서,
상기 상엽 분쇄단계 전에
바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis)를 상엽에 접종하여 발효하는 상엽 발효단계를 더 포함하는
관절염 예방 또는 개선용 조성물 제조방법.
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