KR102348776B1 - 토란 생물전환 추출물을 포함하는 화장료 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

토란 추출물을 균주로 생물전환하여 수득되는 항염증 화장료 조성물 및 상기 항염증 화장료 조성물의 제조방법에 관한 것이다.

Description

토란 생물전환 추출물을 포함하는 화장료 조성물 및 이의 제조방법{COSMETIC COMPOSITION COMPRISING COLOCASIA ESCULENTA BIORENOVATE EXTRACT AND METHOD OF PREPARING THE SAME}

본 발명은 토란 추출물을 균주로 생물전환하여 수득되는 항염증 화장료 조성물 및 상기 항염증 화장료 조성물의 제조방법에 관한 것이다.

염증은 독성물질, 손상된 조직과 병원균의 감염 등의 유해한 자극으로부터 신체를 방어하기 위해 가장 먼저 일어나는 병리학적 반응의 특징으로, 다양한 면역세포가 염증 매개 인자를 발현하여 외부 감염에 대해 반응을 하는 복잡한 과정이다. 염증 반응은 외부 자극으로 인한 조직의 손상에 대하여 구조나 기능을 회복시킬 수 있는 유익한 체내 방어기전이지만 염증 반응이 만성적이고 과하면 세포나 조직의 기능장애 및 괴사를 일으키며 뇌 질환, 아토피, 암, 심혈관 질환 등과 같은 다양한 질병으로 발달할 수 있어서 염증을 일으키는 인자들을 찾아 조절 및 제거하고 기전을 밝히기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. 이와 같은 염증 반응은 주로 대식세포가 관여하며, 그 중 그람 음성균 외막에 존재하는 Lipopolysaccharide (LPS) 가 대식세포를 자극하는 대표적인 염증 유발 인자로 작용한다. 대식세포는 CD14에 결합된 LPS를 TLR4 (Toll-like receptor 4) 라 불리는 유형인식수용체(pattern recognition receptor)를 통해 인식하여, MAPKs (mitogen-activated protein kinase) family 및 여러 신호전달 경로를 활성화시킨다. 그로 인하여 NF-κB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells) 를 유도하고 iNOS (inducible nitric oxide synthase) 와 COX-2 (cyclooxygenase-2), IL-1β (interleukin-1β), IL-6 (interleukin-6) 및 TNF-α (tumor necrosis factor-α) 등과 같은 전염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)들의 발현으로 이어진다.

이러한, 염증 반응은, 피부 트러블을 일으키는 주 원인이 되고 있으며, 항염의 목적으로 이용되고 있는 물질로는 비스테로이드계로 플루페남산(flufenamic acid), 이부프로펜(ibuprofen) 등의 물질이 효과가 있는 것으로 알려져 있으나, 이들 물질은 피부에 대한 안전성의 문제로 사용량의 제한이 있거나, 효과가 미미하여 실질적으로 염증 완화 효과를 기대할 수 없는 문제점이 있다.

천남성과에 속하는 토란 (Colocasia esculenta L. Schott)은 이용가치가 높은 구황작물로 한국뿐만 아니라 인도, 인도네시아 등에 서식한다. 토란은 생산과 소비지역에 따라 taro, dasheen, eddoe 등으로 불리며, 수분을 제외하고 dextrin과 sucrose, galactan, galactose, mannose 등이 포함되어 있다고 알려져 있다. 동의보감에 따르면 토란은 생식을 하면 약간의 독이 있으며, 피와 원기를 보호하여 숙혈과 사기를 없애주는 특효약으로 민간요법에 이용되었다고 한다.

최근 이미 알려진 소재들을 다양한 기술을 통하여 재활용하는 연구 개발이 이루어지고 있으며, 대한민국 등록특허 제10-1523631호는 할미꽃 추출물, 인도 유향나무 추출물, 후박나무 추출물 및 봉삼 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증 조성물을 개시하고 있다. 그러나, 토란 추출물을 항염증 효과를 나타내는 화장료 조성물로서 이용하는 것에 대하여는 보고된 바 없다. 이에, 인체에 자극이 없는 천연 물질 유래의 물질로, 독성이 없을 뿐 아니라 항염증 효과가 우수하여 화장품에 바로 적용할 수 있는 원료의 개발이 필요한 실정이다.

KR 10-1523631 B

본 발명은 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens) 균주를 이용한 생물전환법(Biorenovation)을 통해 토란 추출물을 생물전환하고, 염증의 치료, 개선, 예방 및 완화효과가 우수한 항염증 화장료 조성물 및 그 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 토란 추출물을 균주로 생물전환하여 수득되는 항염증 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은, 항염증 화장료 조성물 제조방법을 제공한다.

본 발명의 항염증 화장료 조성물은 염증의 치료, 개선, 예방 및 완화효과가 우수하고, 단백질 수준에서도 염증을 완화시키는 효과가 우수하며, 대식세포에 대한 독성이 없어 인체에 무해하고, 피부자극이 적어 화장품, 의약품 및 의약외품의 피부외용제 등의 분야에서 사용될 수 있다.

또한, 본 발명에서는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 균주를 이용한 토란 추출물의 생물전환(Biorenovation)을 통해 항염증 효과를 나타내는 항염증 화장료 조성물을 제조할 수 있으며, 구체적으로, 생물전환된 토란 추출물을 통해 RAW 264.7 세포에 대한 독성이 없고, IL-6, IL-1β의 전염증성 사이토카인의 발현 억제 및 iNOS, COX-2의 단백질 발현 억제 효과를 나타내는 항염증 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

또한, 화장품 소재나 약재 원료 등으로서의 활용 가능하고, 특히 항염증 효과에 의해 여성청결제로 활용 가능한 생물전환 토란 뿌리 추출물을 포함하는 항염증 화장료 조성물을 제공한다.

도 1은 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(NC), 토란 뿌리 추출물(CE), 및 본 발명의 생물전환된 토란 뿌리 추출물에 대한 HPLC 크로마토그램이다.
도 2는 각 조건에 따른 RAW 264.7 세포의 생존도를 나타낸 그래프이다.
도 3은 RAW 264.7 세포에서 각 조건에 따른 산화질소 (NO) 생성율을 나타낸 그래프이다.
도 4는 RAW 264.7 세포에서 각 조건에 따른 PGE₂ 생성율을 나타낸 그래프이다.
도 5a는 RAW 264.7 세포에서 각 조건에 따라 웨스턴 블롯으로 분석된 iNOS의 단백질 레벨(β-actin은 대조군) 및 iNOS 단백질 발현율을 나타낸 그래프이다.
도 5b는 RAW 264.7 세포에서 각 조건에 따라 웨스턴 블롯으로 분석된 COX-2의 단백질 레벨(β-actin은 대조군) 및 COX-2 단백질 발현율을 나타낸 그래프이다.
도 6a는 RAW 264.7 세포에서 각 조건에 따른 TNF-α 생성율을 나타낸 그래프이다.
도 6b는 RAW 264.7 세포에서 각 조건에 따른 IL-6 생성율을 나타낸 그래프이다 (*p<0.05; **p<0.01).
도 6c는 RAW 264.7 세포에서 각 조건에 따른 IL-1β 생성율을 나타낸 그래프이다 (*p<0.05).

본 발명은 생물전환된 토란 추출물 포함하는 항염증 화장료 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 항염증 화장료 조성물은 염증의 치료, 개선, 예방 및 완화효과가 우수하고, 단백질 수준에서도 염증을 완화시키는 효과가 우수하며, 대식세포에 대한 독성이 없어 인체에 무해하고, 피부자극이 적어 화장품, 의약품 및 의약외품의 피부외용제 등의 분야에서 사용될 수 있다.

< 항염증 화장료 조성물 >

본 발명의 항염증 화장료 조성물은 토란 추출물을 균주로 생물전환하여 수득되는 생물전환된 토란 추출물을 유효성분으로 포함한다.

본 발명에서, 상기 토란 추출물은 유기용매를 이용한 용매추출에 의해 추출된 것으로서, 토란의 잎, 줄기 및 뿌리 중 하나 이상의 부위에서 추출될 수 있고, 토란 뿌리의 추출물이 가장 바람직하다.

상기 용매추출에 사용되는 유기용매는 C1 내지 C5의 알코올일 수 있고, 에탄올을 용매추출에 사용하는 것이 가장 바람직하다. 또한, 상기 용매추출에서 사용되는 C1 내지 C5의 알코올의 농도는 60 내지 100%일 수 있고, 70% 농도의 C1 내지 C5의 알코올을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 항염증 화장료 조성물은 세포에 대하여 일산화질소(NO) 생성 억제, PGE₂ 생성 억제, iNOS 발현 억제, COX-2 발현 억제, 인터류킨 6 (IL-6) 생성 억제, 인터류킨 1β (IL-1β) 생성 억제 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 효과를 나타내며, 이에 따라 항염증 효과를 갖는다.

본 발명에서 사용되는 용어, "생물전환(biorenovation)"은 미생물을 이용하여 기질로부터 인산화(phosphorylation) 또는 글리코 실화(glycosylation) 등의 구조적 변화를 유도한 화합물을 제조하는 방법을 말한다. 인산화란 인산화효소(kinase)의 작용에 의하여 인산기(phosphoric acid group, HOPO(OH)O-)가 기질의 수소 원자와 치환됨으로써 기질에 결합하는 것을 의미하며, 글리코실화란 기질에 단당체, 다당체 등의 당류(glucoside)가 첨가되는 것을 의미한다.

또한, 본 발명에서 상기 균주는 바실러스 속의 균주일 수 있으며, 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)일 수 있고, KCTC 43033인 바실러스 아밀로리퀘파시엔스가 특히 바람직하다.

일 구체예에서 상기 항염증 화장료 조성물은 화장료, 의약품 또는 의약외품 용도로 사용될 수 있다. 상기 항염증 조성물은 상기 화장품, 의약품 또는 의약외품 용도로 사용되어 항염증 활성, 예방, 치료 등에 이용할 수 있다.

또한 상기 항염증 화장료 조성물은 약제학적, 또는 화장품학적으로 허용되는 성분을 추가로 포함할 수 있다.

상기 항염증 화장료 조성물을 상기 화장품에 사용 시 통상적인 화장품에 포함되는 성분으로는 담체, 부형제 또는 희석제로 정제수, 오일, 왁스, 지방산, 지방산 알코올, 지방산 에스테르, 계면활성제, 흡습제(humectant), 증점제(thickening agent), 항산화제, 점도 안정화제(viscosity stabilizer), 킬레이팅제, 완충제 및 저급 알코올 등을 포함할 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 항염증 화장료 조성물을 포함하는 상기 화장품의 제형으로는 업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 용액, 유화물, 점성형 혼합물 등의 형상을 취할 수 있고, 바람직하게는 페이스트, 유액, 크림, 겔, 파우더, 스프레이, 용액, 유탁액, 현탁액, 팩, 파운데이션, 로션, 미용수 및 계면활성제를 함유하는 클린징 제형으로 이루어진 군에서 선택된 1종의 제형일 수 있다. 보다 구체적으로는 상기 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 크림, 맛사지크림, 영양크림, 모이스쳐크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클린저로 이루어진 군에서 선택된 1종의 제형을 포함한다.

또한, 본 발명의 항염증 조성물을 상기 의약품에 사용 시 고형제, 반고형제, 용액제, 유제, 분산제, 미셀, 리포좀 등의 형태로 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 여성청결제용인 것이 바람직하다.

본 발명에서 사용되는 용어, "여성청결제"는 질 내 유해세균의 증식 억제, 악취 감소 및/또는 질 내의 적정 pH의 유지를 위한 목적으로 여성의 외음부 및 그 주위에 사용되는 전용 클렌저를 말한다.

본 발명의 여성청결제용 조성물은 여성청결제에 허용되는 부형제, 붕해제 및/또는 활택제를 포함할 수 있다. 본 발명의 여성청결제용 조성물에 포함되는 부형제, 붕해제 및 활택제는 여성청결제의 제조에 통상적으로 이용되는 것으로써, 부형제는 프로솔브, 전분, 미결정 셀룰로오스, 만니톨, 유당, 저치환하이드록시프로필셀룰로오스 및/또는 슈크랄로스일 수 있으며, 구체적으로, 프로솔브(프로솔브 SMCC90), 전분(Starch 1500), 미결정 셀룰로오스(미결정 셀룰로오스 PH102) 및/또는 만니톨(만니톨 160C)일 수 있고, 붕해제는 크로스포비돈, 전분글로콘산 나트륨, 크로스카멜로오스나트륨, 폴리소르베이트 및/또는 라이릴황산나트륨일 수 있으며, 구체적으로, 크로스포비돈(크로스포비돈CL-SF)일 수 있고, 활택제는 스테아르산 마그네슘, 경질무수규산, 탈크 및/또는 글리세릴베헤네이트일 수 있으며, 구체적으로, 스타아르산마그네슘일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 여성청결제용 조성물은 질과 관련된 질환의 예방 또는 개선을 위한 것으로, 질과 관련된 질환은 질이완증, 질건조증 및/또는 질염일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 조성물은 액제, 겔제, 고형제, 세정 조성물 및 질내 삽입용 정제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형일 수 있다.

본 발명은 여성 청결제용 조성물로, 상기 제형은 비경구 투여를 위한 제제일 수 있고, 예를 들어, 액제, 겔(gel)제, 고형제, 세정 조성물, 질내 삽입용 정제, 좌제 형태, 크림, 연고, 드레싱 용액, 분무제, 기타 도포제등의 국소 투여제, 용액형, 현탁형, 유제형 등의 액상 제형일 수 있으며, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결 건조제제, 좌제, 크림, 연고, 젤리, 거품, 세척제 또는 질 삽입물일 수 있고, 바람직하게는 액제, 겔(gel)제, 고형제, 세정 조성물, 질내 삽입용 정제 등의 피부 외용제일 수 있다.

상기 제형은 예를 들어, 멸균수에 용해보조제, 유화제, pH 조절을 위한 완충제 등을 첨가하여 제조할 수 있다. 상기 비수성용제 또는 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol), 올리브 오일과 같은 식물성 기름 및/또는 에틸올레이트 등이 사용될 수 있다. 한편, 좌제 제형은 예를 들어, 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 61(tween 61), 카카오지, 라우린지, 글리세로 젤라틴 등이 첨가되어 제조될 수 있고, 이를 제형화하기 위한 담체를 포함할 수 있으며, 상기 담체로써 결합제, 활탁제, 현탁용제, 가용화제, 완충제, 보존제, 윤활제, 등장제, 안정화제, 분산제, 현탁화제, 색소, 향료 등이 포함될 수 있다.

본 발명의 여성청결제용 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명의 여성청결제용 조성물의 투여량은 투여방법, 복용자의 연령, 성별 및 체중, 및 질환의 중증도 등을 고려하여 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 여성청결제용 조성물의 투여량은 성인 기준으로 0.001 내지 1000 ㎎/kg일 수 있다. 하루에 1회 또는 수 회 나누어 투여될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 여성청결제용 조성물은 하나 이상의 여성 비뇨생식기계 관련 질병병 예방 또는 치료 활성을 나타내는 물질과 함께 투여될 수 있다.

또한, 상기 생물전환된 토란 추출물은 항염증 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.1 내지 20 중량%일수 있고, 바람직하게는 0.1 내지 5 중량%일수 있으며, 가장 바람직하게는 0.1 내지 0.5 중량%로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

< 항염증 화장료 조성물 제조방법 >

본 발명은 상술한 항염증 화장료 조성물의 제조방법을 제공한다. 본 발명의 항염증 화장료 조성물의 제조방법은, 본 발명의 항염증 화장료 조성물에 대하여 기술된 내용을 모두 적용할 수 있으며, 중복되는 부분들에 대해서는 상세한 설명을 생략하였으나, 그 설명이 생략되었더라도 동일하게 적용될 수 있다.

구체적으로, 본 발명은, 토란으로부터 추출물을 제조하는 단계; 및

상기 토란 추출물을 바실러스 속의 균주로 생물전환하는 단계를 포함하는 항염증 화장료 조성물의 제조방법을 제공한다.

보다 구체적으로, 일 구체예에서 항염증 화장료 조성물의 제조방법은,

토란 뿌리를 에탄올로 1회 이상 용매추출하는 단계;

상기 용매추출된 토란을 동결건조한 후 에탄올에 용해시켜 토란 추출물을 수득하는 단계; 및

바실러스 속의 균주를 펠렛화한 후 상기 토란 추출물을 생물전환시키는 단계를 포함할 수 있다.

상기 바실러스 속의 균주는, 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)일 수 있고, 바람직하게는, 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 KCTC 43033 (Bacillus amyloliquefaciens KCTC 43033)일 수 있다.

상기 토란으로부터 추출물을 제조하는 단계는, 토란의 잎, 줄기 및 뿌리 중 하나 이상의 부위에서, 바람직하게는 토란 뿌리에서 유기용매를 이용한 용매추출을 1회 이상, 바람직하게는 2회 수행하는 것을 포함한다. 상기 용매추출에 사용되는 유기용매는 C1 내지 C5의 알코올일 수 있고, 에탄올을 용매추출에 사용하는 것이 가장 바람직하다. 또한, 상기 용매추출에서 사용되는 C1 내지 C5의 알코올의 농도는 60 내지 100%일 수 있고, 70% 농도의 C1 내지 C5의 알코올을 사용하는 것이 바람직하고, 70% 농도의 에탄올을 사용하는 것이 더욱 바람직하다.

또한, 상기 용매추출에 의해 추출된 토란 추출물을 동결전조한 후 유기용매에 용해시키는 것을 추가 포함할 수 있으며, 상기 동결건조는 -130 내지 -90℃에서, 바람직하게는 -120 내지 -100℃에서, 더욱 바람직하게는 -110℃에서 수행될 수 있다. 또한, 상기 동결건조는 압력 0.3 mbar 조건에서 30 내지 48 시간 동안 상기 온도 범위로 수행하는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 유기용매는 용매추출 시 사용한 것과 동일한 종류의 용매를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 항염증 화장료 조성물의 제조방법은 약제학적, 또는 화장품학적으로 허용되는 첨가제를 추가하는 단계를 더 포함할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 하기의 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예: 생물전환된 토란 추출물의 제조

1-1. 토란 추출물 제조

본 실시예에 사용된 토란(Colocasia esculenta (L.) Schott)의 뿌리는 2018년 제주특별자치도 제주시 아라동에서 2018년 4월에 채집되었으며 제주생물자원(주)으로부터 제공받았다. 토란(뿌리)는 실온에서 24시간 동안 70% 에탄올을 이용하여 2회에 걸쳐 추출하였으며, 여과필터(paper filter)로 여과한 후 감압농축기를 사용하여 농축하였다. 농축된 추출물을 -110℃에서 동결 건조한 후 70% 에탄올에 용해하여 최종적으로 토란 추출물을 수득하였다.

1-2. 미생물 배양

미생물은 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens, KCTC 43033) 균주이며 미생물센터에서 분양받아 Nutrient broth (Beef extract 3.0 g/L, Peptone 5.0 g/L)에서 최적 생육 조건에 맞추어 20시간 동안 배양 후, 10분 동안 5,000 rpm으로 원심분리하여 미생물 펠렛(pellet)을 수득하였다. 수득된 펠렛을 PG 버퍼 (50 mM Phosphate buffer, 2% Glycerin)로 2회 세척한 후, 동일 버퍼에 현탁하여 미생물 현탁액을 수득하였다.

1-3. 토란 추출물의 생물전환(Biorenovation)

앞서 제조한 토란 추출물 및 미생물 현탁액을 30℃에서 72시간 반응 후, 원심분리하여 얻어진 상등액을 감압농축기를 사용하여 농축한 후, -110℃에서 동결 건조하여 생물전환된 토란 추출물(Colocasia esculenta Biorenovate Extract, CEB)을 수득하였다.

1-4. 생물전환된 토란 추출물(CEB)의 HPLC 분석

HPLC 분석을 위해 Shimadzu SpectroMonitor 3200 digital UV/Vis detector(Phenomenex 4 μm Hydro-RP 80 Å, 250×4.6 mm)을 사용하였으며, 이동상은 0.1% TFA(Trifluoroacetic acid)를 함유한 물과 아세토니트릴 (용매 B)를 사용하였다. 분석 조건은 1.0 mL/min의 유속, 온도는 40℃에서 10 μl의 시료를 주입하여 Gradient 조건으로 30분 동안 분석하였으며, detection 파장은 254 nm으로 설정하여 분석하였다.

바실러스 아밀로리퀘파시엔스 (KCTC 43033) 균주를 이용하여 토란 뿌리 추출물을 biorenovation 기법으로 생물 전환하였다. 반응 후, 원심분리를 통해 반응물의 상등액을 회수하여 감압농축 하였고, HPLC를 통해 분석을 진행한 결과, 토란의 뿌리 추출물과 비교했을 때 생물전환 추출물 시료에서 신규 피크를 확인할 수 있었다 (도 1). 이는 본 논문에서 사용된 생물전환 기법에 의해 토란 추출물의 다수 화합물이 바실러스 아밀로리퀘파시엔스에 의해 미지의 화합물로 생물전환되어 나타난 피크의 가능성을 시사했다.

실험예: 생물전환된 토란 추출물 평가

2-1. 세포배양

본 실시예에 따른 생물전환된 토란 추출물의 항염증 효과를 확인하기 위한 세포로 RAW 264.7 세포를 사용하였으며, RAW 264.7 세포는 한국세포주은행에서 분양받아 10% FBS(fetal bovine serum)와 100 units/mL 페니실린-스트렙토마이신 (penicillin-streptomycin)이 함유된 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM, Gibco, NY, USA) 배양액을 사용하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다.

2-2. 생물전환된 토란 추출물의 항염 효과 평가

하기 실험예 1 내지 5는 모두 하기 표 1에 나타낸 바와 같은 조건으로 수행하였으며, LPS는 지질다당류(Lipopolysaccharides)로서, 세포의 염증반응을 유도하기 위해 첨가되었다.

하기 표 1에서, 대조군 1은 염증유발이 되지 않은 상태의 RAW 264.7 세포이고, 대조군 2는 염증유도된 상태의 RAW 264.7 세포이다. 또한, 실시예 1 내지 3은 RAW 264.7 세포에 LPS와 본 발명의 생물전환된 토란 추출물(CEB)을 각각 하기 표 1의 함량으로 첨가 후 배양시킨 것이다. 또한, 생물전환하지 않은 토란 추출물(CE)를 각각 하기 표 1의 함량으로 첨가 후 배양시키고 이를 비교예 1 내지 3으로 하여 생물전환에 따른 효과를 확인하였다.

	대조군		비교예			실시예
	1	2	1	2	3	1	2	3
LPS(μg/mL)	-	1	1	1	1	1	1	1
CEB(μg/mL)	-	-	-	-	-	50	100	200
CE(μg/mL)	-	-	50	100	200	-	-	-

2-3. 통계처리

이하 모든 실험예들은 3회 반복하여 측정하였고, 그 결과는 평균값±표준편차로 나타냈으며 통계적 분석은 각 처리구간의 유의성(p<0.05, 0.01)을 검증을 위해 분산분석(analysis of variance, ANOVA) 후 student's t-검정으로 다중비교를 실시하였다.

실험예 1: 세포 독성 측정

세포 독성 측정은 24 well plate에 RAW 264.7 세포를 8.0 × 10⁴ cells/mL만큼 분주하여 37℃, 5%, CO₂ 조건의 인큐베이터에서 24시간 전 배양한 후 시료(CEB 및 CE 추출물)와 LPS(1 μg/mL)를 동시 처리하고, 24시간 동안 배양하였다(실시예 1 내지 3 및 비교예 1 내지 3). 이후 MTT를 첨가하여 37℃에서 4시간 동안 반응시킨 다음 상층액을 제거한 후 DMSO를 첨가하여 침전물을 용해시킨 후 96-well plate에 옮겨 담아 ELISA reader를 사용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료 군에 대한 평균 흡광도를 측정하였으며, 대조군의 흡광도 측정값과 비교하여 세포독성을 평가하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

세포 독성 비교 평가

RAW 264.7 세포에 대한 CEB 추출물의 세포독성을 알아보기 위해 MTT 분석법을 이용하여 세포 생존율을 조사하였다. 그 결과 CEB 추출물 CE 추출물은 50 μg/mL에서 약 90%의 생존율을 나타내었으며 100, 200 μg/mL에서 대조군 1 및 2와 비교 시 유의적인 차이를 보이지 않아 전 농도에서 RAW 264.7 세포에 대한 독성이 미미한 것을 확인하였다(도 2).

실험예 2: NO 생성 억제 활성 측정

24 well plate에 RAW 264.7 세포를 8.0 × 10⁴ cells/mL만큼 분주하고 37℃, 5% CO₂ 조건의 인큐베이터에서 24시간 전 배양시켰다. 이후 시료(CEB 및 CE 추출물)와 LPS (1 μg/mL)를 동시 처리하여 24시간 배양한 후 상층액 100 μL와 Griess 시약 [1% (w/v) sulfanilamide, 0.1% (w/v) naphthylethylenediamine in 2.5% (v/v) phosphoric acid] 100 μL를 96 well plate에서 동량 혼합하여 10분간 암반응 시킨 후 ELISA reader를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

NO 생성 억제 활성 비교 평가

염증을 유발하는 원인이 되는 활성산소 Nitric oxide (NO)의 생성에 CEB 및 CE 추출물이 어떠한 영향을 미치는지에 대해서 조사하였다(도 3). RAW 264.7 세포에 실시예에 따른 CEB 추출물 또는 비교예에 따른 CE 추출물 (50, 100, 200 μg/mL)과 LPS(1 μg/mL)를 동시 처리하여 NO의 생성을 유도한 후 Griess 시약을 이용하여 세포 배양액에 존재하는 NO^2-의 양을 측정하였다. 그 결과 LPS 단독 처리군과 비교했을 시 CEB 추출물은 50 μg/mL 농도에서 NO 생성을 64%, 100 μg/mL 농도에서는 37%, 200 μg/mL에서는 22%로 농도 의존적으로 NO의 생성량을 감소시키는 것으로 나타났다. 따라서 CEB 추출물은 염증 발생에 의한 질환 유발을 효과적으로 제어할 수 있을 것으로 사료된다.

반면, 생물전환하지 않은 CE 추출물은 50 μg/mL 농도에서 NO 생성율이 약 105%로 오히려 증가하였고, 100 및 200 μg/mL 농도에서도 80% 이상의 NO 생성율 나타내어, 토란 추출물을 생물전환하지 않는 경우 NO 생성 억제 효과가 거의 없다는 사실을 확인할 수 있었다. NO 생성 억제 효과를 충분히 만족하지 못하는 것으로 확인된 CE 추출물(비교예 1 내지 3)에 대하여는 이후 추가 실험을 진행하지 않았다.

실험예 3: 프로스타글란딘 E ₂ (PGE ₂ ) 생성 억제 활성 측정

RAW 264.7 cell(8.0 × 10⁴ cells/mL)에 CEB 추출물과 LPS (1 μg/mL)를 동시에 처리하여 24시간 배양하였다. 24시간 후 배양 배지를 원심분리(12,000 rpm, 3 min) 하여 얻어진 상등액의 PGE₂ 함량을 mouse enzyme-linked immnunosorbent assay(ELISA) 키트(R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 측정하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

PGE ₂ 생성 억제 비교 평가

PGE₂는 면역 관련 세포의 활성을 유도해서 염증반응을 일으키며, 부종 및 발열, 암 등을 유발하는 물질로 알려져 있다. CEB 추출물을 상기의 NO 실험과 동일한 조건으로 PGE₂의 생성 억제 활성을 측정한 결과, LPS가 단독 첨가되어 염증이 유발된 대조군 2와 CEB 추출물이 첨가된 각각의 처리 농도(50, 100, 200 μg/mL)를 비교했을 때 각각 88%, 60%, 및 31%로 PGE₂의 생성을 감소시켰다(도 4). 위 결과로 추출물 농도의 증가함에 따라 PGE₂의 생성 억제 효과도 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 특히 200 μg/mL 농도에서는 대조군 2보다 PGE₂ 생성 억제를 69% 하는 것으로 나타났다. 따라서 CEB 추출물은 NO 생성 억제뿐만 아니라 PGE₂의 생성을 감소시킴으로써 보다 나은 항염 효과를 기대할 수 있을 것으로 사료된다.

실험예 4: 웨스턴 블롯법(Western blot analysis) 측정

RAW 264.7 세포를 4.0×10⁵ cells/mL만큼 24시간 전 배양한 후 CEB 추출물과 LPS(1 μg/mL)를 동시 처리하여 24시간 배양하였다. 이후 세포를 PBS를 이용해 2회 세척하고 lysis buffer[1×RIPA (Upstate Cell Signaling Solution, NY, USA), 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 1 mM Na₃VO₄, 1 mM NaF, 1 μg/mL aprotinin, 1 μg/mL pepstatin, and 1 μg/mL leupeptin]를 이용해 1시간 동안 lysis 시킨 후 원심분리하여 단백질 상층액을 분리하였다. 단백질 농도는 BCA kit(Bio-Rad, USA)를 사용하여 정량하였다. 정량한 단백질을 10%의 polyacylamid gel에 전기영동하고 poly-vinylidene difluoride (PVDF) membrane (Milipore, Burlington, MA, USA)에 200 mA, 2시간 동안 전이시켰다. 단백질이 전이된 membrane을 5% 탈지분유를 포함한 0.05% Tween20/Tris-buffered saline (0.05% T/TBS)에 넣고 상온에서 1시간 blocking 시킨 후, 1차 항체와 반응시켰다. 1차 항체 반응은 iNOS antibody (1:5,000, Bio-Rad, USA), COX-2 antibody (1:1,000, Rockland Immunochemicals, Inc., USA), β-actin antibody clone AC-74 (1:10,000, Sigma, USA)를 이용하여 4℃에서 하루 밤 동안 반응시킨 후 0.05% T/TBS 용액으로 3회 세척 후 2차 항체 (Jackson ImmunoResearch, USA)를 1:10,000으로 희석하여 상온에서 1시간 반응한 뒤 0.05% T/TBS 용액으로 3회 세척하였다. 단백질은 ECL kit (Bio-Rad, USA)를 사용하여 imaging densitometer (model GS-700, Bio-rad, USA)를 통해 측정하였고, 그 결과를 도 5a 내도 도 5b에 나타내었다.

iNOS 및 COX-2 발현 억제 비교 평가

대식세포는 LPS에 의하여 자극을 받아 COX-2 및 iNOS 등과 같은 pro-inflammatory 유전자를 발현한다. 그 중 iNOS는 산화질소 합성 효소로 NO의 생성을 지속적으로 유도하여 염증 반응을 매개하며, COX-2는 PGE₂를 합성하는 효소로서 암과 관련되어 있다고 알려져 있다. 따라서 본 실험에서는 CEB 추출물에 의한 염증 억제의 신호 경로를 확인하기 위해 RAW 264.7 세포를 LPS로 자극을 하였고, CEB 추출물을 농도별로 처리하여 iNOS와 COX-2의 단백질 발현 정도를 관찰하였다. 실험 결과, 대조군 1과 비교하여 LPS 처리한 대조군 2에서는 발현량이 증가된 것을 확인하였으며, 증가된 iNOS 단백질 발현량이 CEB 추출물을 처리했을 때 농도가 증가함에 따라 iNOS 단백질 발현량이 크게 감소한 것을 확인하였다(도 5a). 또한, COX-2의 단백질 발현량 역시 CEB 추출물에 의해 농도 의존적으로 감소시키는 것을 확인하였다 (도 5b). 이로써 CEB 추출물에 의한 염증 억제는 NF-κB의 신호 전달과정을 통해 이루어지고 있음을 확인하였다. 이러한 결과는 CEB 추출물이 NO, PGE_2, iNOS, COX-2의 발현을 효과적으로 감소시킴으로써 항염증 효과를 나타내는 것임을 시사했다.

실험예 5: 전염증성 cytokines (IL-6, IL-1β) 생성 억제 활성 측정

RAW 264.7 세포를 24 well plate에 8.0 × 10⁴ cells/mL만큼 37℃, 5% CO₂ 인큐이베터에서 24시간 동안 전 배양한 후 다양한 농도의 CEB 추출물과 LPS(1 μg/mL)를 동시에 처리하여 24시간 배양하였다. 이후 배양 배지를 원심분리(12,000 rpm, 3 min) 하여 얻어진 상층액의 전염증성 cytokine 생성량은 Mouse TNF-α ELISA Kit(Invitrogen, California, USA), Mouse IL-6 ELISA Kit(BD Biosciences, California, USA), Mouse IL-1β ELISA Kit(R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 측정하였고, 그 결과를 도 6a 내지 도 6c에 나타내었다.

전염증성 cytokines(IL-6, IL-1β) 생성 억제 비교 평가

대표적인 pro-inflammatory cytokine으로 알려진 TNF-α, IL-1β 및 IL-6는 염증반응을 조절하는 것으로 알려져 있으며, 면역세포의 활성, 증식 및 분화를 조절하는 것으로 알려져 있다. 본 실험에서는 LPS에 의해 자극된 RAW 264.7 세포에 대한 CEB 추출물이 전염증성 사이토카인 IL-1β, IL-6, TNF-α의 발현에 미치는 영향을 ELISA 키트를 이용하여 조사하였다(도 6a 내지 도 6c). LPS에 의해 RAW264.7 세포의 IL-1β, IL-6, TNF-α의 발현이 유의적으로 증가된 것을 확인하였으며, CEB 추출물을 50, 100 및 200 μg/mL 농도로 처리하여 LPS에 의해 증가된 IL-1β와 IL-6의 생성량이 억제된 것을 확인하였다(도 6b 및 도 6c). 특히, CEB 추출물은 LPS 단독 처리군 대비 200 μg/mL 농도에서 IL-1β와 IL-6 분비량이 각각 87% 와 86%까지 감소되는 것을 확인하였다. 반면, TNF-α은 LPS처리군과 비교했을 때 억제능이 미비하게 관찰되는 것으로 보아 CEB 추출물이 TNF-α 생성 기작에는 크게 관여하지 않는 것으로 사료된다(도 6a). 이는 CEB 추출물이 TNF-α보다 IL-1β와 IL-6의 생성 기전에 뛰어난 영향을 미치는 것으로 사료되며, CEB 추출물에 의해 전염증성 cytokine의 발현이 억제되고 있음을 시사하고 있다.

2-4. 결론

본 실험예에서는 토란 뿌리 추출물을 Biorenovation 생물전환 기법을 이용하여 얻은 CEB 추출물의 항염 효과를 확인하기 위하여 LPS에 의해 염증반응이 유도된 RAW 264.7 세포를 통해 Nitric oxide(NO), Prostaglandin E₂(PGE₂)의 생성 저해 활성과 전염증성 cytokines(IL-6, IL-1β) 생성 억제, iNOS 및 COX-2 단백질의 발현 억제 효과를 측정하였다. 그 결과 생물전환 화합물이 다수 검출된 CEB 추출물은 RAW264.7 세포에 대하여 전 농도에서 세포독성이 관찰되지 않았으며, LPS에 의해 유도된 NO 생성을 농도 의존적으로 억제하였다. 그뿐만 아니라 PGE₂ 생성 억제 활성도 농도 의존적으로 생성을 억제하였으며, 전염증성 cytokine인 IL-1β, IL-6의 분비량도 200 μg/mL 농도에서 뛰어난 억제능을 보였다. 이로써, Biorenovtion 기법을 통한 생물전환 기법은 본래의 효능을 더욱 더 증대시킨다는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 생물전환 (Biorenovation) 기법을 이용한 CEB 추출물은 천연 항염 효능을 가진 화장품 소재로 활용될 가능성을 제시하는 결과로 사료된다.

제조예: 여성청결제의 제형별 제조예

제조예 1: 토란 뿌리 생물전환 추출물을 포함하는 여성청결제(미스트)

토란 뿌리 생물전환 추출물을 포함하는 항염증 화장료 조성물 중 여성청결제(미스트)의 제조예는 하기 표 2와 같다.

성분	함량 (중량%)
생물전환된 토란 추출물	0.1~0.5
정제수	80~90
글리세린	5~10
다이프로필렌글라이콜	5~10
코코-베타인	2~7
1,2-헥산다이올	0.5~2
부틸렌글라이콜	0.5~1.5
소듐클로라이드	0.1~1
다이소듐코코암포다이아세테이트	0.1~1
소듐시트레이트	0.1~1
시트릭애씨드	0.1~0.5
바실러스/서양유채추출발효여과물	0.1~0.5
라벤더오일	0.1~0.5
에틸헥실글리세린	0.05~0.2
헥실렌글라이콜	0.05~0.2
락토바실러스용해물	0.01~0.05
다이소듐이디티에이	0.01~0.05
폴리글리세릴-10미리스테이트	0.01~0.05
폴리글리세릴-10라우레이트	0.01~0.05

제조예 2: 토란 뿌리 생물전환 추출물을 포함하는 여성청결제(젤)

토란 뿌리 생물전환 추출물을 포함하는 항염증 화장료 조성물 중 여성청결제(젤)의 제조예는 하기 표 3과 같다.

성분	함량 (중량%)
생물전환된 토란 추출물	0.1~0.5
정제수	80~90
글리세린	10~20
다이프로필렌글라이콜	5~10
암모늄아크릴로일다이메틸타우레이트/브이피코폴리머	0.5~2
다이소듐코코암포다이아세테이트	0.5~2
부틸렌글라이콜	0.5~2
1,2-헥산다이올	0.5~1.5
소듐클로라이드	0.5~1
시트릭애씨드	0.5~1
코코-베타인	0.5~1
소듐시트레이트	0.1~0.5
폴리글리세릴-10라우레이트	0.1~0.5
에틸헥실글리세린	0.1~0.5
폴리글리세릴-10미리스테이트	0.1~0.5
잔탄검	0.1~0.5
헥실렌글라이콜	0.1~0.5
라벤더오일	0.1~0.5
바실러스/서양유채추출발효여과물	0.1~0.5
락토바실러스용해물	0.01~0.05
다이소듐이디티에이	0.001~0.005

제조예 3: 토란 뿌리 생물전환 추출물을 포함하는 여성청결제(버블)

토란 뿌리 생물전환 추출물을 포함하는 항염증 화장료 조성물 중 여성청결제(버블)의 제조예는 하기 표 4와 같다.

성분	함량 (중량%)
생물전환된 토란 추출물	0.1~0.5
정제수	80~90
글리세린	1~10
코코-베타인	1~10
소듐코코일애플아미노산	1~10
소듐클로라이드	1~10
1,2-헥산다이올	1~5
헥실렌글라이콜	0.1~1
폴리글리세릴-4카프레이트	0.1~1
시트릭애씨드	0.1~1
에틸헥실글리세린	0.1~1
라벤더오일	0.1~1
다이소듐이디티에이	0.1~1
테트라소듐글루타메이트다이아세테이트	0.1~1
바실러스/서양유채추출발효여과물	0.1~0.5
락토바실러스용해물	0.01~0.05

Claims (11)

1. 생물전환된 토란 뿌리 추출물을 포함하며,
   상기 생물전환된 토란 뿌리 추출물은, 유기용매에 의해 토란 뿌리로부터 용매추출된 토란 뿌리 추출물이, 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens) 균주에 의해 생물전환된 것인, 항염증 화장료 조성물.
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 청구항 1에 있어서,
   상기 항염증 화장료 조성물은 세포에 대하여 일산화질소(NO) 생성 억제, PGE₂ 생성 억제, iNOS 발현 억제, COX-2 발현 억제, 인터류킨 6 (IL-6) 생성 억제, 인터류킨 1β (IL-1β) 생성 억제 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 항염증 화장료 조성물.
   
6. 청구항 1에 있어서,
   상기 항염증 화장료 조성물은 여성청결제용인, 항염증 화장료 조성물.
   
7. 청구항 6에 있어서,
   상기 항염증 화장료 조성물은 액제, 겔제, 고형제, 세정 조성물 및 질내 삽입용 정제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형인 것인 항염증 화장료 조성물.
   
8. 청구항 1에 있어서,
   상기 생물전환된 토란 뿌리 추출물은 항염증 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.1 내지 20 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 항염증 화장료 조성물.
   
9. 토란 뿌리를 유기용매로 1회 이상 용매추출하여 토란 뿌리 추출물을 제조하는 단계; 및
   상기 토란 뿌리 추출물을 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 (Bacillus amyloliquefaciens) 균주로 생물전환하여 생물전환된 토란 뿌리 추출물을 수득하는 단계
   를 포함하는, 항염증 화장료 조성물의 제조방법.
   
10. 삭제
11. 청구항 9에 있어서,
    상기 용매추출에 의해 추출된 토란 뿌리 추출물을 동결건조한 후 유기용매에 용해시키는 것을 추가 포함하는 항염증 화장료 조성물의 제조방법.

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