KR101999309B1 - 흰들버섯 생물전환 추출물을 포함하는 화장료 조성물 - Google Patents

흰들버섯 생물전환 추출물을 포함하는 화장료 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 흰들버섯 생물전환 추출물을 포함하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 항산화 활성, 항균 활성, 피부 주름 개선, 피부 탄력 증진 및 피부 노화방지 효과가 우수하므로, 피부 주름 개선 등 피부 상태를 개선 및 미용 목적 등을 위하여 유용하게 활용될 수 있다.

Description

흰들버섯 생물전환 추출물을 포함하는 화장료 조성물{Cosmetic Composition comprising Biorenovation Extract of Agaricus blazei}
본 발명은 흰들버섯 생물전환 추출물을 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.
피부는 인체의 모든 장기와 기관을 싸고 있는 기관으로 체중의 15~20%를 차지할 정도로 가장 큰 기관으로 외부 침입으로부터 신체를 보호하며, 체내의 수분과 온도를 보존하여 체내의 항상성을 조절하는데 중요한 역할을 한다. 이러한 피부 노화의 원인은 크게 내적 노화와 외적 노화로 나눌 수 있다. 내적 노화는 나이가 들어감에 따라 신진대사를 조절하는 각종 호르몬 분비의 감소, 면역 세포의 기능 및 세포 활성 저하 등이 원인이며, 외적 노화는 자외선, 환경오염 등 외부적인 요인에 의해 자유 라디칼 및 활성 유해 산소 등이 증가함으로써 발생한다. 피부 노화가 일어나면, 탄력이 감소하고 주름의 증가뿐 아니라 피부 혈색이 나빠지고, 피부 트러블이 자주 발생하며, 기미와 주근깨 및 검버섯 또한 증가하는 등 여러 가지 변화가 피부에 나타나게 된다.
주름, 피부톤 변화, 착색 등이 피부노화와 연관된 변화이다. 이러한 피부노화는 생체 내에서 콜라겐, 엘라스틴과 같은 세포외기질의 합성과 분해가 적절하게 조절되지 못하거나, 노화가 진행되면서 그 합성이 감소하며, 콜라겐을 분해하는 효소인 기질 금속단백질분해효소(matrix metalloproteinase, MMP), 엘라스틴을 분해하는 효소인 엘라스틴분해효소(elastase)의 발현이 촉진되어 피부의 탄력이 저하되고 주름이 형성될 수 있다. 또한, 노화의 진행이나 자외선에 등에 의해 피부 세포에서는 염증성 사이토카인(proinflammatory cytokine)을 생성하는 효소인 사이클로옥시게나제-2(cyclooxygenase-2, COX-2)의 증가로 인해 프로스타글란딘 E2(Prostaglandin E2, PGE2)의 생합성이 증가하며, iNOS(inducible nitric oxide synthase)에 의해 NO(nitricoxide) 생성이 증가하는 것으로 알려져 있다. 이러한 염증 반응들로 인해서 기질 금속단백질분해효소(MMP)의 생합성이 증가하여 콜라겐 분해가 나타나게 된다.
이러한 피부의 노화를 늦추고, 피부 상태를 개선하기 위하여, 다양한 화장품이 개발되고 있으며, 이러한 기능성 화장품에 대한 소비 역시 최근 급격하게 증가하고 있다. 종래 피부 주름 개선에 효과적이라고 알려진 물질로는 아데노신, 레티노인산(retinoic acid) 등이 있으나, 아데노신은 임상에서의 효능이 미미하고, 레티노인산은 가임여성에게 사용할 수 없고, 홍반 등 자극의 우려가 높다. 이에 따라, 피부의 탄력유지와 피부 주름을 개선할 수 있는 기능성 소재 개발의 필요성이 절실히 요구되고 있다.
이에, 본 발명자는 피부 주름을 개선할 수 있고, 다양한 피부 기능성을 나타내는 소재를 발굴하기 위한 연구를 수행하여 본 발명을 완성하였다
대한민국 특허공개 제10-2000-0018402호
본 발명의 하나의 목적은 흰들버섯(Agaricus blazei) 생물전환(biorenovation) 추출물을 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양상은 흰들버섯(Agaricus blazei) 생물전환(biorenovation) 추출물을 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 화장료 조성물은 항산화 활성, 항균 활성, 피부 주름 개선, 피부 탄력 증진 및 피부 노화방지 효과를 나타내는 흰들버섯 생물전환 추출물을 유효성분으로 포함하므로, 피부 주름 개선 등 피부 상태를 개선 및 미용 목적 등을 위하여 유용하게 활용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은, 예를 들어, 크림, 에멀션, 무수의 조성물, 수성 분산액, 기름, 우유, 발삼(balsams), 폼, 로션, 젤, 크림 젤, 히드로알콜 용액, 히드로글리콜릭 용액, 도포제, 비누, 샴푸, 유연제, 세럼(serum), 다당류막, 연고, 무스, 포마드, 파우더, 막대기, 연필, 스프레이와 같은 임의의 고체, 액체 또는 반-고체 제제로 제시될 수 있다.
또한, 본 발명의 화장료 조성물은, 예를 들어, 히드로겔, 접착용 패치, 비-접착용 패치, 마이크로전자 패치 또는 얼굴 마스크와 같은 다른 종류의 고체 용구에 당해 분야의 기술자에게 알려진 사용 기술을 사용하여 포함될 수 있거나, 메이크업 파운데이션, 예를 들어, 유체 파운데이션 및 콤팩트 파운데이션, 메이크업 제거용 로션, 메이크업 제거용 우유, 컨실러, 아이섀도, 립스틱, 립 프로텍터, 립 글로스 및 파우더와 같은 기타 메이크업 제품에 포함될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 생물전환은 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 균주에 의한 것일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "생물전환"은 미생물을 이용하여 기질로부터 인산화(phosphorylation) 또는 글리코실화(glycosylation) 등의 구조적 변화를 유도한 화합물을 제조하는 방법을 말한다. 인산화란 인산화효소(kinase)의 작용에 의하여 인산기(phosphoric acid group, HOPO(OH)O-)가 기질의 수소 원자와 치환됨으로써 기질에 결합하는 것을 의미하며, 글리코실화란 기질에 단당체, 다당체 등의 당류(glucoside)가 첨가되는 것을 의미한다.
본 발명의 흰들버섯 생물전환 추출물은 흰들버섯 추출물을 균주와 함께 배양함으로써 이루어질 수 있으며, 생물전환에 의하여, 흰들버섯 추출물에 함유되어 있던 화합물들의 작용기가 치환됨으로써, 기존의 흰들버섯 추출물에는 존재하지 않던 신규 화합물의 생성을 유도할 수 있다. 따라서, 흰들버섯 생물전환 추출물은 기존의 흰들버섯 추출물과는 다른 생물학적 활성을 나타낼 수 있다. 특히, 본 발명의 화장료 조성물에 유효성분으로 함유되는 흰들버섯 생물전환 추출물은 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 균주에 의하여 생물전환된 것일 수 있으며, 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 균주에 의하여 생물전환된 흰들버섯 생물전환 추출물은 MMP-1 저해 활성 및 Type Ⅰ 콜라겐 생성량 증가 활성을 나타내어 주름 개선 등 피부 상태 개선 효과가 우수하고, 항균 활성 및 항산화 활성을 나타내므로, 기능성 화장료 조성물의 유효성분으로써 유용하게 활용될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 화장료 조성물은 황색포도상구균 및 대장균 중 하나 이상의 균주에 대해 항균 활성을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 흰들버섯 생물전환 추출물은 피부에 독성을 나타내지 않으면서도 황색포도상구균 및/또는 대장균에 대해 항균 활성을 나타내므로, 항균 활성을 갖는 기능성 화장료 조성물의 유효성분으로써 유용하게 활용될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 조성물은 피부 보호, 피부 진정, 주름개선, 피부 자극 완화 및 보습으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 추출물은 화장료 조성물 100중량부에 대하여 2중량부로 포함될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 흰들버섯 생물전환 추출물은 화장료 조성물 100중량부에 대하여 2중량부 포함될 경우 주름개선 효과 등 피부 개선 효과가 가장 우수하다. 2중량부 미만으로 포함될 경우, 유효성분의 함량이 낮아 충분한 피부 개선 효과가 이루어지지 않을 수 있으며, 2중량부 초과로 포함될 경우, 피부 개선 효과의 증가 정도가 미미하다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 제형일 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종 기제 및/또는 첨가물을 포함할 수 있으며, 그 효과를 떨어뜨리지 않는 범위 내에서 비이온 계면활성제, 실리콘 폴리머, 체질안료, 향료, 방부제, 살균제, 산화 안정화제, 유기 용매, 이온성 또는 비이온성 증점제, 유연화제, 산화방지제, 자유 라디칼 파괴제, 불투명화제, 안정화제, 에몰리언트(emollient), 실리콘, α-히드록시산, 소포제, 보습제, 비타민, 곤충 기피제, 향료, 보존제, 계면활성제, 소염제, 물질 P 길항제, 충전제, 중합체, 추진제, 염기성화 또는 산성화제, 또는 착색제 등 공지의 화합물을 더 포함하여 제조될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 흰들버섯 생물전환 추출물의 경피 흡수를 증가시키는 물질, 예를 들어, 디메틸설폭사이드, 디메틸아세트아미드, 디메틸포름아미드, 계면활성제, 아존(azone)(1-도데실아자시클로헵탄-2-온), 알콜, 요소, 에톡시디글리콜, 아세톤, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 더 나아가, 흰들버섯 생물전환 추출물의 보다 큰 침투를 위하여 이온삼투요법, 초음파 치료, 전기천공, 마이크로전자 패치, 기계적 압력, 삼투압 경도, 폐색성 치료, 미세주입법 또는 예를 들어, 산소압에 의한 주사와 같은 압력 방식에 의한 무바늘주사 또는 이들의 임의의 조합과 같은 방식에 의하여 적용될 수 있다.
흰들버섯 생물전환 추출물을 포함하는 화장료 조성물에 따르면, 항산화 활성, 항균 활성, 피부 주름 개선, 피부 탄력 증진 및 피부 노화방지 효과가 우수하므로, 피부 주름 개선 등 피부 상태를 개선 및 미용 목적 등을 위하여 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 흰들버섯 추출물(AC) 및 흰들버섯 생물전환(biorenovation: B.R) 추출물의 HPLC Fraction 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 흰들버섯 생물전환 추출물에 함유된 플라보노이드 및 페놀 함량을 나타낸 그래프이다.
도 3은 흰들버섯 생물전환 추출물의 ABTS 라디칼 소거 활성을 나타낸 그래프이다.
도 4는 흰들버섯 추출물 및 흰들버섯 생물전환 추출물의 세포독성을 나타낸 그래프이다.
도 5는 흰들버섯 추출물 및 흰들버섯 생물전환 추출물이 MMP-1의 발현량에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 6은 흰들버섯 추출물 및 흰들버섯 생물전환 추출물이 Type 1 콜라겐의 생합성량에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 7은 흰들버섯 생물전환 추출물의 MAPKs에 대한 p-p38 및 p-ERK 단백질의 발현량의 변화에 미치는 영향을 나타낸 사진이다.
도 8은 흰들버섯 생물전환 추출물의 황색포도상구균에 대한 항균 활성을 나타낸 그래프이다.
도 9는 흰들버섯 생물전환 추출물의 대장균에 대한 항균 활성을 나타낸 그래프이다.
도 10은 흰들버섯 생물전환 추출물을 함유하는 크림의 임상시험에 따른 주름지수 R1에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 11은 흰들버섯 생물전환 추출물을 함유하는 크림의 임상시험에 따른 주름지수 R2에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 12는 흰들버섯 생물전환 추출물을 함유하는 크림의 임상시험에 따른 주름지수 R3에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 13은 흰들버섯 생물전환 추출물을 함유하는 크림의 임상시험에 따른 주름지수 R4에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 14는 흰들버섯 생물전환 추출물을 함유하는 크림의 임상시험에 따른 주름지수 R5에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 15는 흰들버섯 생물전환 추출물을 함유하는 크림의 임상시험에 따른 육안평가 주름지수의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 16은 흰들버섯 생물전환 추출물을 함유하는 크림의 임상시험에 따른 육안평가 주름지수의 감소 정도를 나타낸 그래프이다.
이하 본 발명을 하나 이상의 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 흰들버섯 생물전환 추출물의 제조 및 확인
1-1. 흰들버섯 추출물의 제조
흰들버섯(Agaricus blazei: AC)은 김상민아가리쿠스(제주, 대한민국)에서 구입하여 부착물을 제거한 후, 깨끗한 담수로 씻어 실온에서 완전히 건조시켰다. 추출탱크에 건조된 흰들버섯을 투입하고, 흰들버섯 무게의 8 내지 10배 무게로 정제수를 첨가하였다. 121℃의 1.2 내지 1.5atm의 조건하에서 6시간 내지 8시간 동안 추출하여 1차 추출물을 회수하고, 추출탱크에 흰들버섯 무게의 8 내지 10배의 정제수를 추가로 첨가하였다. 121℃의 1.2 내지 1.5atm의 조건하에서 6시간 내지 8시간 동안 추출하여 2차 추출물을 회수하였다. 회수한 1차 추출물과 2차 추출물을 혼합하여 1.0㎛의 공극 크기를 갖는 필터(레인보우, 대한민국)로 여과하여 흰들버섯 추출물을 수득하였다.
여과된 추출물은 5 브릭스(brix) 이상으로 진공농축 하였다. 흰들버섯 추출물의 농축액을 회수한 후 성상, 이물, 수분, 일반세균 및 대장균 존재 유무를 검사하여 안전한 것을 확인하였다.
1-2. 미생물 배양
Bacillus amyloliquefaciens(KCTC 13588) 균주를 미생물자원센터에서 분양받아 Nutrient broth(소고기 추출물(beef extract) 3.0g/L 및 펩톤(peptone) 5.0g/L)에서 최적 생육 조건에 맞추어 20시간 배양하였다. 20시간 배양 후, 5,000rpm에서 10분 동안 원심분리하여 미생물 펠렛(pellet)을 수득하였다.
1-3. 흰들버섯 추출물에 대한 생물전환 추출물의 제조
실시예 1-2에서 수득한 미생물 펠렛을 PG 버퍼(50mM 인산염(phosphate)(pH7.2) 및 2% 글리세롤)로 세척하여, PG 버퍼 5㎖에 현탁시켰다. 이후, 현탁액과 실시예 1-1에서 제조한 흰들버섯 추출물을 혼합하여 30℃에서 72시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후, 5000 내지 6000rpm에서 10분 동안 원심분리를 진행하였다. 그 후, 상등액을 수거하여 흰들버섯 생물전환(biorenovation:BR) 시료를 제조하였다.
1-4. 흰들버섯 생물전환 추출물에 포함된 화합물 확인
실시예 1-3에서 흰들버섯의 생물전환을 통하여 수득한 흰들버섯 생물전환 추출물에 포함된 활성 화합물의 동정을 위하여 HPLC Fraction을 수행하였다.
구체적으로, 반응이 끝난 후 상기 반응액을 원심분리하여 상등액을 수거 후, 감압농축하여 H20에 용해시켜, 시마즈사의 HPLC(high performance liquid chromatography) 기기를 이용하여 생물전환 화합물의 생성여부를 확인하였다. 이동상 용매로는 아세트나이트릴과 정제수를 사용하여 gradient 조건으로 분리하였으며, 피크의 끌림(tailing)현상은 버퍼를 첨가하여 개선하였다.
그 결과, 도 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 다수의 신규 피크(peak)를 확인하여, 생물전환을 통하여 실시예 1-1에서 제조한 흰들버섯 추출물에 존재하지 않는 다수의 생물전환 화합물이 실시예 1-3에서 제조한 흰들버섯 생물전환 추출물에 포함되어 있음을 확인하였다.
실시예 2. 흰들버섯 생물전환 추출물의 항산화 활성 분석 확인
2-1. 페놀 및 플라보노이드 함량 분석
흰들버섯 생물전환 추출물의 항산화 활성 여부를 확인하기 위하여, 실시예 1-3에서 제조한 흰들버섯 생물전환 추출물에 포함된 페놀 및 플라보노이드 함량을 분석하였다.
구체적으로, 실시예 1-3에서 제조한 흰들버섯 생물전환 추출물 70㎕에 Folin-Ciocalteu(2N) 페놀 용액 70㎕를 첨가하여 혼합하였다. 실온에서 3분 동안 반응시킨 후, 2% 탄산 나트륨(sodium carbonate) 용액 70㎕를 첨가하고, 상온에서 1시간 동안 암반응시켰다. 푸른색의 혼합물이 생성되면 760㎚에서 흡광도를 측정하고, 지표물질인 Gallic acid를 이용하여 정량곡선을 확인하였다. 실험 결과는 흰들버섯 생물전환 추출물 1g 당 함유된 페놀 함량을 ㎎ 단위로 표시하였다.
그 결과, 페놀 함량은 10.4037㎎/g으로 확인되었으며, 플라보노이드 함량은 1.8751㎎/g으로 확인되어, 실시예 1-3에서 제조한 흰들버섯 생물전환 추출물의 우수한 항산화 활성을 확인하였다(도 2).
2-2. ABTS 라디칼 소거 활성 확인
흰들버섯 생물전환 추출물의 항산화 활성 여부를 확인하기 위하여, 실시예 1-3에서 제조한 흰들버섯 생물전환 추출물에 ABTS 라디칼 함량을 분석하였다. ABTS 라디칼을 이용한 항산화능의 측정은 과황산칼륨(potassium persulfate)과의 반응에 의해 생성된 ABTS 자유 라디칼이 추출물 내의 항산화 물질에 의해 제거되어 라디칼 특유의 색인 청록색이 탈색되는 것을 이용한 방법으로 Van den Berg 등의 방법을 변형하여 측정하였다.
구체적으로, 7.4mM ABTS 용액과 2.6mM 과황산칼륨 용액을 24시간 암소에 방치하여 청록색의 ABTS 라디칼을 형성시킨 다음, 734nm에서 흡광도 값이 2.5가 되도록 희석하였으며, 희석한 용액에 실시예 1-3에서 제조한 흰들버섯 생물전환 추출물(50, 100, 200㎍/㎖) 20㎕를 첨가한 후 10분 동안 암반응시켰다. ABTS 라디칼 소거 활성은 하기와 같이 무첨가군 대비 흡광도의 감소율로 나타내었다.
[ABTS 라디칼 소거 활성(%)=[1-(시료첨가군/무첨가군)]×100]
그 결과, 농도 의존적으로 ABTS 라디칼 소거 활성이 증가하여, 200㎍/㎖ 농도에서 대조군인 아스코르브산 대비 약 50% 정도의 ABTS 라디칼 소거 활성을 나타내는 것으로 확인되었다(도 3). 이와 같은 결과를 통하여, 실시예 1-3에서 제조한 흰들버섯 생물전환 추출물의 우수한 항산화 활성을 확인하였다.
실시예 3. 흰들버섯 생물전환 추출물의 우수한 세포 생존율 확인
흰들버섯 생물전환 추출물이 피부에 적용될 수 있는지 확인하기 위하여, 실시예 1-3에서 제조한 흰들버섯 생물전환 추출물에 대한 세포 독성 시험을 수행하였다.
구체적으로, 24 웰 플레이트에 HDF 세포를 5×104 cells/㎖로 24시간 전배양 후, 실시예 1-1에서 제조한 흰들버섯 추출물 또는 실시예 1-3에서 제조한 흰들버섯 생물전환 추출물(50, 100, 200㎍/㎖)과 TNF-α(10ng/㎖)를 동시에 처리하여 24시간 배양하였다. 배양 후, 배양 상등액을 회수하고, cytoTox 96 Non-Radiocative Cytotoxity assay(promaga)를 사용하여 세포 독성을 평가하였다.
그 결과, 실시예 1-3에서 제조한 흰들버섯 생물전환 추출물은 50, 100 및 200㎍/㎖ 농도범위에서 세포 독성을 나타내지 않으며, 실시예 1-1에서 제조한 흰들버섯 추출물 대비 세포 생존율이 우수함을 확인하였다(도 4).
실시예 4. 흰들버섯 생물전환 추출물의 피부 주름 개선, 피부 탄력 증진 및 피부 노화방지 효과 확인
4-1. 흰들버섯 생물전환 추출물의 우수한 MMP-1 저해 활성 확인
콜라겐 분해효소인 MMP-1(Matrix metalloproteinase-1)은 피부 콜라겐 쇠퇴에서 가장 영향을 끼치는 효소 중 하나로서, MMP-1을 억제하는 활성 성분은 피부 주름 개선, 피부 탄력 증진 및 피부 노화방지 효과를 나타낸다.
흰들버섯 생물전환 추출물의 피부 주름 개선 등의 효과를 확인하기 위하여, 실시예 1-3에서 제조한 흰들버섯 생물전환 추출물에 대한 MMP-1 저해 활성을 평가하였다.
구체적으로, 24 웰 플레이트에 HDF 세포를 5×104 cells/㎖로 24시간 전배양 후, 실시예 1-1에서 제조한 흰들버섯 추출물 또는 실시예 1-3에서 제조한 흰들버섯 생물전환 추출물(50, 100, 200㎍/㎖)과 TNF-α(10ng/㎖)를 동시 처리하여 24시간 배양하였다. 배양 후, 배양 상등액을 회수하고, MMP-1 함량을 측정하였다. MMP-1 저해 활성 정도는 Human pro-MMP-1 immunoassay kit(R&D systems)를 사용하여 측정하였다.
그 결과, 실시예 1-1에서 제조한 흰들버섯 추출물은 MMP-1의 발현량에 영향을 미치지 않는 것으로 확인된 반면, 실시예 1-3에서 제조한 흰들버섯 생물전환 추출물은 농도의존적으로 MMP-1 저해 활성성을 나타내며, 200㎍/㎖에서는 음성 대조군과 유사한 MMP-1 수준을 나타내는 것으로 확인되었다(도 5).
4-2. 흰들버섯 생물전환 추출물의 Type Ⅰ 콜라겐 생성량 증가 활성 확인
흰들버섯 생물전환 추출물의 피부 주름 개선 등의 효과를 확인하기 위하여, 실시예 1-3에서 제조한 흰들버섯 생물전환 추출물에 대한 Type Ⅰ 콜라겐 생성량 평가를 수행하였다.
구체적으로, 24 웰 플레이트에 HDF 세포를 5×104 cells/㎖로 24시간 전배양 후, 실시예 1-1에서 제조한 흰들버섯 추출물 또는 실시예 1-3에서 제조한 흰들버섯 생물전환 추출물(50, 100, 200㎍/㎖)과 TNF-α(10ng/㎖)를 동시 처리하여 24시간 배양하였다. 배양 후, 배양 상등액을 회수하고, Type 1 pro-collagen 생합성량을 측정하였다. Type 1 pro-collagen의 수준은 pro-collagen type-1 C peptide(PIP) ELA kit(TAKARA)를 사용하여 측정하였다.
실시예 1-1에서 제조한 흰들버섯 추출물 대비 실시예 1-3에서 제조한 흰들버섯 생물전환 추출물의 우수한 Type 1 콜라겐의 합성 활성이 확인되었으며, 특히, 200㎍/㎖ 농도에서는 음성 대조군 대비 약 50% 높은 합성 수치를 나타내는 것으로 확인되었다(도 6).
4-3. 흰들버섯 생물전환 추출물의 MAPKs의 ERK, p38의 시그널링 조사
흰들버섯 생물전환 추출물의 주름개선 효과가 MAPKs 신호전달 경로에 의한 것인지 확인하기 위하여, MAPKs의 ERK, p38의 시그널링을 조사하였다.
구체적으로, HDF 세포를 실시예 1-3에서 제조한 흰들버섯 생물전환 추출물(50, 100, 200㎍/㎖)과 TNF-α(10ng/㎖)를 동시 처리하여 24시간 배양하였다. 이후, 세포를 PBS로 2회 세척하고 용해 버퍼(1×RIPA(Upstate Cell Signaling Solution, Lake Placid, NY, USA), 1mM PMSF(pheylmethylsulfonyl fluoride), 1mM Na3VO4, 1mM NaF, 1㎍/㎖ aprotinin, 1㎍/㎖ pepstain 및 1㎍/㎖ leupeptin)를 사용하여 1시간 동안 용해시킨 후, 원심분리하여 단백질 상등액만 분리하였다. 단백질 농도는 BSA kit(Bio-Rad, USA)를 이용하여 정량하였다.
정량한 단백질을 8 내지 12%의 폴리아크릴아마이드 겔에 전기영동하고 PVDF(Poly-vinylidene difluoride) 멤브레인(Milipore, USA)에 200mA으로 2시간 동안 단백질을 맴브레인에 트랜스퍼하였다. 그 후, 5% 탈지분유를 포함한 0.05% Tween 20/Tris-buffered saline(0.05% T/TBS)에 넣고 상온에서 블로킹하고, 1차 항체를 4℃에서 24시간 반응시킨 후, TBST로 4회 세척한 다음, 2차 항체(Jackson ImmunoResearch, USA)를 1:5,000 또는 1:10,000으로 희석하여 상온에서 1시간 반응한 뒤, TBST로 3회 세척하였다. 단백질은 ECL kit(Bio-Rad, USA) 및 imaging densitometer(model GS-700, Bio-rad, USA)를 사용하여 측정하였다.
그 결과, 실시예 1-3에서 제조한 흰들버섯 생물전환 추출물의 처리로 인한 MAPKs의 p-p38 및 p-ERK 단백질의 발현량 변화는 관찰되지 않았다는 점에서(도 7), 흰들버섯 생물전환 추출물의 주름개선 효과는 MAPKs 신호전달 경로가 아닌 다른 경로에 의한 것임을 확인하였다.
실시예 5. 흰들버섯 생물전환 추출물의 항균 활성 확인
흰들버섯 생물전환 추출물의 항균 활성을 확인하기 위하여, 여과지원반법(paper disc assay)으로 실시예 1-3에서 제조한 흰들버섯 생물전환 추출물의 항균 활성을 평가하였다.
구체적으로, 황색포도상구균(Staphylococcus aureus CCARM 0205) 또는 대장균(Escherichia coli ATCC 25922)이 1.0×107 CFU/㎖로 조정된 실험균주 배양액 2㎕를 96 웰 플레이트에 분주한 후, 실시예 1-1에서 제조한 흰들버섯 추출물 또는 실시예 1-3에서 제조한 흰들버섯 생물전환 추출물(12.8㎍/㎖)과 혼합한 후, 균주의 최적배양 조건(37℃, 18시간)에서 배양하였다. 배양 후, 600nm에서 흡광도를 측정하여 시료의 항균성을 확인하였다.
그 결과, 실시예 1-1에서 제조한 흰들버섯 추출물은 항균 활성을 나타내지 않는 것으로 관찰되었으나, 실시예 1-3에서 제조한 흰들버섯 생물전환 추출물의 처리 초기 황색포도상구균(도 8) 및 대장균(도 9)의 생존률이 현저히 감소하는 것으로 확인되었다. 이와 같은 결과를 통하여, 실시예 1-3에서 제조한 흰들버섯 생물전환 추출물의 우수한 항균 활성을 확인하였다.
실시예 6. 임상시험에 따른 흰들버섯 생물전환 추출물의 피부 주름 개선 효과 확인
6-1. 흰들버섯 생물전환 추출물을 함유하는 크림 준비 및 크림의 적용
데일리시 리노베이션 리프팅 크림((주)유앤아이제주)에 실시예 1-3에서 제조한 흰들버섯 생물전환 추출물을 2중량% 혼합하여 흰들버섯 생물전환 추출물을 함유하는 크림을 준비하여 시험시료(TEST)로 사용하였다. 상기 크림의 pH는 6 내지 8이고, 성상은 연한 베이지색의 크림제이다. 대조시료(PLACEBO)로는 흰들버섯 생물전환 추출물을 혼합하지 않은 데일리시 리노베이션 리프팅 크림을 사용하였다.
피험자와 시험자 모두 시료의 내용을 알 수 없도록 시험시료와 대조시료를 동일한 용기에 담아 배포하였으며, 그 위에 무작위로 분류기호(A/B)를 표기하였다. 시험에 참여하지 않은 연구원의 관리하에 시험시료와 대조시료를 구분하고, 구분을 위해 사용한 시료 코드는 밀봉하여 노출되지 않도록 하였다. 피험자들은 시험자의 관리감독하에 시료의 적당량을 매일 2회 시험자의 관리감독하에, 시료의 적당량을 매일 2회 로션 또는 에센스 사용 후 적당량을 취하여 얼굴 안쪽에서 바깥쪽으로 피부결을 따라 부드럽게 펴바르는 방법으로 자가사용하였다.
6-2. 피부 주름 개선 효과 확인 임상시험
<6-2-1> 피험자 선정
식품의약품안전처(Ministry of Food and Drug Safety; MFDS)에서 발간한[기능성 화장품의 유효성 평가를 위한 가이드라인 - 주름 개선에 도움을 주는 기능성 화장품의 유효성 평가를 위한 가이드라인, 2005.07]에 근거하여 통계적 비교가 가능하도록 30세 이상 65세 이하의 성인 여성 21명을 대상으로 임상시험을 수행하여 유효 데이터를 확보하였다. 식품의약품안전처가 발간한 [화장품 인체적용시험 및 효력시험 가이드라인, 2015]에 따라 시험 전 모든 피험자들의 시험참여 동의를 받았다.
<6-2-2> 임상시험 방법
Skin-Visiometer SV600(CK electronic GmbH, Germany) 장비를 사용하여 피부 표면 주름을 분석하였으며, 내장된 광원이 투과할 때 발생하는 음영을 분석하여 R1 내지 R5의 주름지수를 산출하여 주름 개선 효과를 평가하였다.
구분 주름지수
R1 Skin Roughness
R2 Maximum Roughness
R3 Average Roughness
R4 Smoothness Depth
R5 Arithmetic AverageRoughness
임상시험은 총 4회의 평가를 통하여 진행되었다.
1) 첫 번째 평가
방문일 12시간 전부터 기초 제품의 사용을 금지하였다. 시험자가 제공하는 기준 세안제를 사용하여, 세안 후 페이퍼 타올로 가볍게 두드려 물기를 제거한 후 30분간 항온항습조건(20~24℃, 40~60% 습도)에서 안정을 취하였다. 양측 눈가 주름부위의 사진 촬영을 실시하였다. 피부과 전문의를 포함한 숙련된 전문가 2인에 의한 육안 평가를 하기 표 2의 기준에 의하여 실시하였다(0-9 scale). 두 평가자의 점수 판정이 다른 경우, 더 높은 값을 채택하였다.
구분 주름 없음 주름 많음
점수 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
구체적으로, 양측 눈가 주름 부위에서 Visiometer를 이용한 주름 분석을 실시하였다. Replica의 제작 부위는 다음과 같다.
가) 가로축: 눈꼬리선의 가상 연장선
나) 세로축: 외측 눈꼬리에서 가상으로 그은 수직선
다) 가로축과 세로축이 만나는 지점을 0점으로 함
라) 가) 및 나)의 과정으로 만들어진 사각형의 관자놀이 부위 중에서 최대한 편평하고 매끄러운 면을 선정하여 가운데 지점에 표기함
마) 0점으로부터 가로축과 세로축까지의 거리를 재어, 다음 측정시 이용할 수 있도록 함
우측 및 좌측 눈가를 무작위로 A 시료 도포부위 및 B 시료 도포부위로 배정하였다. 피험자 주의사항과 시료 사용방법을 교육한 후 시료를 배포하였다. 시험기간 동안 매일 전화 등의 방법으로 시료 사용의 순응도를 체크하였다.
2) 두 번째 평가(시험 2주차) 및 세 번째 평가(시험 4주차)
방문일 12시간 전부터 기초 제품의 사용을 금지하였다. 시험자가 제공하는 기준 세안제를 사용하여 세안 후, 페이퍼 타올로 가볍게 두드려 물기를 제거한 후, 30분간 항온항습조건(20~24℃, 40~60% 습도)에서 안정을 취하였다.
그 후, 양측 눈가 주름 부위의 사진 촬영을 실시하고, 전문가에 의한 육안 평가를 실시였으며(0-9 scale), 양측 눈가 주름 부위에서 Visiometer를 이용한 주름 분석을 실시하였다.
또한, 홍반 (Erythema), 부종 (Edema), 인설생성 (Scaling), 가려움 (Itching), 자통 (Stinging), 작열감 (Burning), 뻣뻣함 (Tightness), 따끔거림 (Prickling), 기타 이상증과 같은 피부 이상반응 유무를 피부과 전문의가 판정하였다.
3) 네 번째 평가(시험 8주차)
방문일 12시간 전부터 기초 제품의 사용을 금지하였다. 시험자가 제공하는 기준 세안제를 사용하여 세안 후, 페이퍼 타올로 가볍게 두드려 물기를 제거한 후, 30분간 항온항습조건(20~24℃, 40~60% 습도)에서 안정을 취하였다.
그 후, 양측 눈가 주름 부위의 사진 촬영을 실시하고, 전문가에 의한 육안 평가를 실시였으며(0-9 scale), 양측 눈가 주름 부위에서 Visiometer를 이용한 주름 분석을 실시하고, 피부과 전문의가 이상반응 유무를 평가하였다.
또한, 피험자 설문 평가를 실시하였으며(5, 매우개선; 4, 개선; 3, 약간개선; 2, 차이없음; 1, 악화), Replica의 Roughness 분석은 측정 오차를 줄이기 위해 모든 replica 제작이 완료된 네 번째 평가에서 실시하였다.
<6-2-3> 통계적 분석 방법
임상시험 결과의 통계적 분석을 위하여 Minitab 18(Minitab® 181, Minitab Inc) 프로그램을 이용해 유의성을 확인하였으며, 결과 값은 정규성 검정(Ryan-Joiner Normality Test)을 통해 정규 분포로 추정되는 경우, 모수적인 통계법을 통해 유의성을 확인하였다.
구체적으로, 동일 그룹 내 전후 결과값 비교를 위하여, 시험 전 및 후 측정한 값의 비교는 paired t-검정을 이용하였으며, 3회 이상 반복 측정한 경우, 반복측정분산분석(Repeated measure ANOVA)을 통해 유의수준 p<0.05 수준에서 유의성을 확인하였다. 2 이상의 상이한 그룹간 결과값 비교를 위하여, Welch's t-검정을 이용하였으며, 3 이상의 그룹간 결과값 비교는 일원분산분석(one-way ANOVA)을 통해 유의수준 p<0.05 수준에서 유의성을 확인하였다. 또한, 반복 측정한 2 이상의 상이한 그룹의 결과값 비교를 위하여, 반복측정분산분석(Repeated measure ANOVA)을 통해 유의수준 p<0.05 수준에서 유의성을 확인하였으며, 그룹간 초기 측정 값이 유의하게 다른 경우 초기 측정값을 공변량으로 한 공분산분석(Analysis of Covariance)을 통해 그룹간 결과값의 차이를 확인하였다.
정규성 검정(Ryan-Joiner Normality Test)에서 정규성이 기각되는 경우, 비모수적인 통계법을 통해 유의성을 확인하였다.
구체적으로, 동일 그룹 내 전후 결과값 비교를 위하여, 시험 전 및 후 측정한 값의 비교는 Wilcoxon signed rank 검정을 이용하였으며, 3회 이상 반복 측정한 경우, Friedman 검정을 통해 유의수준 p<0.05 수준에서 유의성을 확인하였다. 2 이상의 상이한 그룹간 결과값 비교를 위하여, Mann-Whitney U 검정을 이용하였으며, 3 이상의 그룹간 결과값 비교는 Kruskal-Wallis 검정을 통해 유의수준 p<0.05 수준에서 유의성을 확인하였다. 반복 측정한 2 이상의 상이한 그룹의 결과값 비교를 위하여, Friedman 검정을 통해 유의수준 p<0.05 수준에서 그룹간 결과값의 차이를 확인하였다.
모든 자료는 연속형 변수는 평균과 표준편차로, 범주형 변수는 빈도와 백분율로 요약하였다.
<6-3> 임상시험 결과 - 흰들버섯 생물전환 추출물 함유 크림의 주름지수 개선 효과 확인
실시예 6-1의 흰들버섯 생물전환 추출물을 함유하는 크림의 시험시료를 사용한 시험 부위에 대한 주름지수 R1, R2, R3가 시험 기간 동안 통계적으로 유의한 수준(p<0.05)으로 감소하여, 피부 주름이 개선된 것으로 확인되었다. 주름지수 R3 수치는 시험 2주 후부터, R2 수치는 시험 4주 후부터, R1 수치는 시험 8주 후부터 통계적으로 유의한 수준(p<0.05)으로 개선되었으며, 이러한 결과는 사후검정을 통해 확인되었다. 반면, 대조시료를 사용한 시험 부위에 대한 주름지수 R1 내지 R5에 대해서는 통계적으로 유의한 수준의 주름 개선 효과가 나타나지 않은 것으로 확인되었다(도 10 내지 도 14). 또한, 실시예 6-1의 흰들버섯 생물전환 추출물을 함유하는 크림 시료를 사용한 시험부위와 대조시료를 사용한 대조부위의 주름지수를 비교한 결과, 시험기간 중, R2(최대거칠기) 및 R3(평균거칠기)가 시험부위와 대조부위간에 유의한 수준(p<0.05)의 차이를 가지는 것으로 확인되었으며, 시험부위와 대조부위 주름지수의 변화 경향을 비교한 교호작용 분석 결과, R1, R2 및 R3 지수의 변화 경향이 통계적으로 유의한 차이를 가지는 것으로 확인되었다.
한편, 시험부위의 주름 개선 정도를 전문가 육안 판독한 결과, 시료 사용기간에 따라 시험부위에서 주름지수가 감소하였고, 대조부위에서는 주름지수의 감소 정도가 시험부위보다 작았으나, 이에 따른 통계적 유의성은 나타나지 않은 것으로 확인되었다(도 15). 또한, 시험부위와 대조부위의 주름지수를 비교한 그룹간 비교 대조통계에서도 통계적으로 유의한 수준(p<0.05)의 차이를 확인할 수 없었다(도 16).
상기 결과를 통하여, 실시예 6-1의 흰들버섯 생물전환 추출물을 함유하는 크림은 우수한 피부 주름 개선 효과를 나타내면서도 피부에 특별한 이상 반응을 유발하지 않으므로, 주름 개선을 위하여 안전하고 효과적으로 사용될 수 있음을 확인하였으며, 따라서, 실시예 1-3의 흰들버섯 생물전환 추출물의 주름 개선 효과를 확인하였다.
<6-4> 설문조사를 통한 관능평가 결과 - 흰들버섯 생물전환 추출물 함유 크림의 피부 상태 개선 효과 확인
임상시험 종료 후 실시한 설문조사에서, 하기 표 3 및 표 4에서 확인할 수 있는 같이, 실시예 6-1의 흰들버섯 생물전환 추출물을 함유하는 크림 시료를 사용할 경우, 대조시료를 사용한 경우보다 피부 상태의 개선이 이루어진 것으로 확인되었다.
설문내용 시험부위(시험시료 도포) 대조부위(대조시료 도포)
긍정
답변율
(%)		 5 4 3 2 1 긍정
답변율
(%)		 5 4 3 2 1
제품 사용 후 눈가 주름 정도가 개선되었습니까? 90 3 9 7 2 0 81 3 6 8 4 0
제품 사용 후 피부톤이 밝고 화사해졌다고 생각하십니까? 95 3 8 9 1 0 95 4 6 10 1 0
제품 사용 후 피부가 생기 있고 컨디셔닝이 좋아졌다고 생각하십니까? 90 5 5 9 2 0 90 5 4 10 2 0
피부톤이 한층 어려졌다고 느껴지십니까? 86 2 8 8 3 0 81 1 9 7 4 0
피부 깊이 촉촉해짐을 느꼈습니까? 95 5 11 4 1 0 90 7 5 7 2 0
촉촉하고 윤기가 흐르는 피부가 되었다고 생각하십니까? 95 3 13 4 1 0 95 6 6 8 1 0
피부가 탄력있고 팽팽해졌다고 생각하십니까? 100 2 14 5 0 0 95 3 9 8 1 0
피부 결이 매끄러워졌다고 생각하십니까? 95 7 7 6 1 0 90 6 5 8 2 0
피부가 맑고 투명해졌다고 생각하십니까? 90 3 10 6 2 0 81 3 8 6 4 0
칙칙했던 피부에 생기가 느껴졌다고 생각하십니까? 90 5 9 5 2 0 81 5 8 4 4 0
제품 사용 시 끈적임이 없이 빠르게 흡수가 됩니까? 90 6 8 5 2 0 81 5 9 3 4 0
제품 질감(사용감)의 만족도는 어떻게 됩니까? 95 6 9 5 1 0 90 6 8 5 2 0
제품의 향은 어떠했습니까? 86 4 11 3 3 0 86 5 8 5 2 1
설문내용 시험부위
(시험시료 도포)		 대조부위
(대조시료 도포)
긍정
답변율
(%)		 예 아니오 긍정
답변율
(%)		 예 아니오
제품 사용 중 피부 자극 및 가려움 등 트러블이 없었습니까? 100 21 0 100 21 0
제품 사용에 만족하십니까? 100 21 0 90 19 2
본 제품이 적당한 가격에 출시된다면 구매의사가 있습니까? 100 21 0 90 19 2
본 제품에 개선되어야 할 점이 있다면 어떠한 것 입니까? (자세히 기술) 유분기(3)
향(5)
흡수력(1)		 향(4)
흡수력(3)
끈적임(2)
묽음(1)
이제까지 본 발명에 대하여 그 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (6)

  1. 흰들버섯(Agaricus blazei) 생물전환(biorenovation) 추출물을 포함하고,
    상기 생물전환은 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 균주에 의한 것인
    피부 주름 개선용 화장료 조성물.
  2. 삭제
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 황색포도상구균 및 대장균 중 하나 이상의 균주에 대해 항균 활성을 갖는 것인 화장료 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 피부 보호, 피부 진정, 피부 자극 완화 및 보습으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 효과를 더 나타내는 것인 화장료 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 추출물은 화장료 조성물 100중량부에 대하여 2중량부로 포함되는 것인 화장료 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 제형인 것인 화장료 조성물.
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