KR20220111576A

KR20220111576A - 파리풀 캘러스 추출물의 바이오리노베이션에 의한 미백 조성물 및 이의 제조 방법

Info

Publication number: KR20220111576A
Application number: KR1020210014991A
Authority: KR
Inventors: 김승영; 박태진; 이경미
Original assignee: 선문대학교 산학협력단
Priority date: 2021-02-02
Filing date: 2021-02-02
Publication date: 2022-08-09
Also published as: KR102481735B1

Abstract

본 발명은 파리풀 캘러스 추출물의 바이오리노베이션에 의한 미백 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 천연물인 파리풀 캘러스의 미생물에 의한 생물전환을 통해 B16F10 흑색종 세포의 활성화를 억제(사멸, 공격성 완화 포함)시키고 멜라닌 합성을 저해하는 반응물을 생성함으로써 피부의 안정성을 높이고 부작용을 감소시키면서 피부 미백에 도움을 주는 것을 목적으로 한다.
본 발명에 의한 파리풀 캘러스 추출물의 바이오리노베이션에 의한 미백 조성물은, 파리풀 캘러스 추출물과 미생물에 의한 생물전환을 통해 파리풀 캘러스 추출물로부터 생성되어 B16F10 흑색종 세포의 활성화를 억제하고 멜라닌 합성을 저해하는 유효성분을 함유한다.
본 발명에 의한 파리풀 캘러스 추출물의 바이오리노베이션에 의한 미백 조성물의 제조 방법은, 파리풀 캘러스 추출물을 제조하는 제1단계와; 미생물을 선정하고 배양한 후 원심분리하여 미생물 펠렛을 수득하는 제2단계와; 상기 제2단계에서 수득한 미생물 펠렛과 상기 제1단계에서 제조한 파리풀 캘러스 추출물의 반응으로 파리풀 캘러스 추출물의 유효성분을 생물전환시키는 제3단계를 포함한다.

Description

파리풀 캘러스 추출물의 바이오리노베이션에 의한 미백 조성물 및 이의 제조 방법{A whitening composition and its manufacturing method by bio-renovation of Phryma leptostachya callus}

본 발명은 파리풀 캘러스를 이용한 미백 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 천연물인 광나무의 유효성분으로부터 피부 미백에 효과적이면서 피부의 안정성을 높이고 부작용을 감소시키는 파리풀 캘러스 추출물의 바이오리노베이션에 의한 미백 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.

이 부분은 본 출원 내용과 관련된 배경 정보를 제공할 뿐 반드시 선행기술이 되는 것은 아니다.

사람의 피부색은 노화, 자외선, 스트레스 등 다양한 요인에 의해 변하게 되며, 피부 내부의 멜라닌(melanin) 농도와 분포에 따라 결정되는데, 유전적인 요인 외에도, 태양 자외선이나 피로, 스트레스 등의 환경적 또는 생리적 조건에 의해서도 영향을 받는다.

멜라닌 세포(melanocyte)는 모발색과 피부색을 결정하는 페놀류의 생체고분자 물질로 검은 단백질의 복합체인 멜라닌(melanin)을 합성하고 분비하여, 자외선에 의한 피부손상을 막아줄 뿐 아니라 독성 약물의 흡수 등 여러 중요한 작용을 수행한다.

멜라닌은 다양한 형태 및 과정으로 피부에 흡수되어 피부 기저층에 존재하며, 자외선 및 외부 손상으로부터 피부를 보호하는 역할을 한다. 특히 자외선은 피부 면역계의 구성 요소를 활성화하여 염증 매개체를 방출하는 각질형성 세포 (keratinocyte) 및 기타 세포의 직접 활성화 등 많은 기전을 통해 염증 반응을 유발할 수 있다. 자외선으로 유도된 DNA 손상은 p53이 POMC (pro-opiomelanocortin) 유전자의 프로모터에 대한 결합을 활성화하여 α-MSH (melanocyte-stimulating hormones)를 생성하며, 생성된 α-MSH는 멜라닌 세포로 신호를 보내는 역할을 하는 MC1R(melanocortin 1 receptor)와 결합하여 cAMP(cyclic adenosine monophosphosphate) 생산을 자극하고, 증가된 cAMP는 PKA (protein kinase A)를 활성화하여 cAMP 반응 요소인 CREB(cAMP response element-binding protein) 단백질을 인산화한다. CREB는 MITF (microphthalmia-associated transcription factor)의 발현을 포함하여 다양한 유전자의 발현을 조절하는 전사 인자이다. MITF는 멜라닌 생성 효소인 TRP(tyrosinase-related protein)-1, 2, 및 티로시나제(tyrosinase)의 발현을 조절한다. 그 중 tyrosinase 효소로부터 시작되는 멜라닌 생성은 티로시나제(tyrosinase) 효소가 도파(DOPA)(3, 4-dihydroxy phenylalanine)를 거쳐 도파퀴논(DOPA-quinone)으로 변환되며, 이것이 효소반응과 자동 산화 반응으로 DOPA-chrome을 거쳐 멜라닌이 형성된다.

이와 같은 멜라닌의 합성이 피부 내에서 과도하게 일어나면, 피부 톤을 어둡게 하고, 기미, 주근깨 등을 발생시키기기도 한다. 따라서, 피부내의 멜라닌 색소의 합성을 저해시키면, 피부 톤을 밝게 하여 피부 미백을 실현할 수 있을 뿐만 아니라 자외선, 호르몬 및 유전적인 원인에 기인하여 발생하는 기미, 주근깨 등의 피부 과색소 침착증을 개선시킬 수 있다. 따라서, 종래에는 하이드로퀴논(hydroquinone)이나 아스콜빈산(ascorbic acid), 코지산(kojic acid), 글루타티온(glutathione)과 같은 티로시나제에 대해 저해 활성을 갖는 물질을 연고, 에센스 등의 화장료에 배합함으로써 피부 미백을 실현하거나, 기미, 주근깨 등의 피부 과색소 침착증을 개선하였다. 그러나, 하이드로퀴논은 소정의 미백효과를 발휘하지만, 피부 자극성이 심하여 배합량을 극소량으로 제한해야 하는 문제점이 있고, 아스콜빈산은 산화되기 쉬워 이를 배합한 화장료는 변색, 변취되는 등의 문제가 발생하는 단점이 있다. 또한, 글루타티온, 시스테인 등의 티올계 반응물은 특유의 불쾌한 냄새를 가질 뿐만 아니라 경피흡수에도 문제점이 있고, 이들의 배당체 및 유도체들도 극성이 높으므로 화장료의 배합 성분으로 사용하기는 어렵다.

피부 미백을 위한 특허문헌으로 등록특허 제10-1326690호는 진세노사이드 F1(20-O-β-D-글루코피라노실-20(S)-프로토파낙사트리올)을 유효 성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물이며, 등록특허 제10-2010235호는 흑난초 (Liparis nervosa (Thunb.) Lindl.), 섬꿩고사리 (Plagiogyria japonica Nakai), 버어먼초 (Burmanniacryptopetala Makino) 및 자주땅귀개 (Utricularia yakusimensis Masam.)의 혼합물로부터 추출된 혼합추출물을 함유하는 피부보습 및 피부미백 기능을 갖는 화장료 조성물이고, 등록특허 제10-0894714호는 물, 알코올 또는 이들의 혼합물로 추출되며, 피부 미백 활성을 가지는 백모사(Humata tyermanni Moore) 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부미백용 화장료 조성물이다.

한편, 파리풀의 미백 효능을 확인한 특허문헌들이 있으며, 등록특허 제10-1428873호는 파리풀 추출물을 이용한 것으로, 건조된 파리풀 뿌리를 분쇄하여 분말화한 후, 상기 파리풀 뿌리 분말에 70% 에탄올을 가하여 상온에서 일주일 동안 추출하고, 상기 70% 에탄올 파리풀 추출물을 진공에서 증발시키는 과정을 통해 감압 농축하여 건조된 파우더로 제조한 것이다.

등록특허 제10-1860496호는 파리지옥풀(Dionaea muscipula) 추출물을 포함하는 조성물로서, 상기 조성물은 가속 또는 내인성 노화(accelerated or chronological aging)에 따른 피부 변화를 포함하는 피부 또는 피부 부속기(skin appendage)의 미용적 처치용이며, 상기 피부 변화는 주름, 견고성 및 탄력성의 상실, 및 착색의 증가를 포함하고, 상기 피부 부속기는 피지선, 털, 및 손발톱을 포함하는 조성물이다.

등록특허 제10-1428873호 등록특허 제10-1860496호

본 발명은 전술한 바와 같은 문제점을 해결하기 위한 것으로, 미생물의 반응을 통해 천연물인 파리풀 캘러스로부터 B16F10 흑색종 세포의 활성화를 억제(사멸, 공격성 완화 포함)하고 멜라닌 합성을 저해하는 화합물을 생성함으로써 피부의 안정성을 높이면서 부작용을 감소시키는 파리풀 캘러스 추출물의 바이오리노베이션에 의한 미백 조성물 및 이의 제조 방법을 제공하려는데 그 목적이 있다.

본 발명에 의한 파리풀 캘러스 추출물의 바이오리노베이션에 의한 미백 조성물은, 파리풀 캘러스 추출물과 미생물에 의한 생물전환을 통해 파리풀 캘러스 추출물로부터 생성되어 B16F10 흑색종 세포의 활성화를 억제하고 멜라닌 합성을 저해하는 유효성분을 함유하는 특징으로 한다.

본 발명에 의한 파리풀 캘러스 추출물의 바이오리노베이션에 의한 미백 조성물의 제조 방법은, 파리풀 캘러스 추출물을 제조하는 제1단계와; 미생물을 선정하고 배양한 후 원심분리하여 미생물 펠렛을 수득하는 제2단계와; 상기 제2단계에서 수득한 미생물 펠렛과 상기 제1단계에서 제조한 파리풀 캘러스 추출물의 반응으로 파리풀 캘러스 추출물의 유효성분을 생물전환시키는 제3단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 의한 파리풀 캘러스 추출물의 바이오리노베이션에 의한 미백 조성물 및 이의 제조 방법에 의하면, 파리풀 캘러스의 유효성분을 미생물과의 반응을 통해 B16F10 흑색종 세포의 활성화를 억제(사멸, 공격성 완화 포함)시키고 멜라닌 합성을 저해하는 화합물을 생성함으로써 피부 미백에 도움을 주는 한편 천연물로서 피부의 안정성을 높이고 부작용을 감소시키는 효과가 있다.

따라서, 스킨, 로션, 크림, 에센스, 팩, 폼 클렌징 등 화장품이나 외용 연고와 같은 약품 등의 피부미백용 조성물에 첨가되어 피부 트러블없이 사용할 수 있어 자외선에 노출되어도 피부 미백이 오랫동안 유지되는 효과를 갖는다.

도 1은 일반적인 파리풀 캘러스와 본 발명에 의한 파리풀 캘러스 추출물의 리노베이션 반응물 및 바실러스 아미로리쿼파시엔스의 HPLC 크로마토그램의 그래프.
도 2 내지 도 8은 본 발명의 실시예에 따른 파리풀 캘러스 추출물의 바이오리노베이션에 의한 미백 조성물의 테스트 결과를 보인 것으로,
도 2는 B16F10 세포 생존율을 보인 그래프이고,
도 3a는 멜라닌에 의한 시료의 색상을 보인 사진이며,
도 3b는 멜라닌(Melanin) 내용물의 양을 보인 그래프이고,
도 4는 티로시나아제(tyrosinase) 활성도 테스트 결과를 보인 그래프이며,
도 5 내지 도 8은 본 발명의 파리풀 캘러스 추출물의 바이오리노베이션에 의한 미백 조성물의 웨스턴 블롯(Western blot) 분석 결과를 보인 영상이다.

하기에서 본 발명을 설명함에 있어, 관련된 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명은 생략할 것이다. 그리고 후술되는 용어들은 본 발명에서의 기능을 고려하여 정의된 용어들로서 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 그러므로 그 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다.

본 발명에 의한 파리풀 캘러스 추출물의 바이오리노베이션에 의한 미백 조성물은, 미생물인 바실러스 아미로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)에 의한 바이오리노베이션(Biorenovation)(생물전환기법)을 통해 파리풀 캘러스의 유효성분으로부터 생성된 바이오리노베이션 반응물이다.

1. 파리풀.

파리풀(Phryma leptostachya)은 파리풀과의 여러해살이풀로서 우리나라 각처의 산과 들에서 자라며 일본, 중국, 히말라야 산맥, 동시베리아 등지에 분포한다. 뿌리를 찧어 벌레 물린 곳에 붙이거나 즙을 내어 바르면 해독하는 효능이 있어 오래전부터 해독제와 살충제로 사용되며 피부 종기 및 부스럼 치료 등에 이용되어왔다. Lignans류의 haedoxan J, phrymarolin III, phrymarolin IV, leptostachyol acetate, haedoxan A 등의 성분을 함유한다고 알려져 있으며, Lignans은 주로 식물에 존재하는 폴리페놀(polyphenol) 성분으로 항산화 활성을 갖으며, 파리풀의 뿌리 추출물에 대한 항염, 항산화, 미백 효능 등이 알려져 있다.

본 발명에서 사용된 파리풀[Phryma leptostachya] 조직(callus)은 한국생명공학연구원 생물자원센터로부터 제공받은 것이다.

파리풀 캘러스 추출물은 다음과 같이 배양된 후 유효성분이 추출되어 사용된다.

파리풀 캘러스 1g에 대하여 9~11배의 증류수를 첨가하고 55~65℃의 온도로 열수추출(바람직하게 10배수 증류수, 60℃)하고 추출액을 여과지(paper filter)로 여과한 후 감압 농축하고 동결건조(예를 들어 -110℃)하여 분말화(분말의 입도에 따른 큰 차이가 없어 구체적인 수치로 한정하지는 않는다)하였다. 즉, 미생물에 의한 바이오리노베이션(생물전환)을 위한 재료로서 파리풀 캘러스 추출물은 분말 상태인 것이다.

한편, 상기 파리풀 캘러스 원료는 다음과 같이 배양된 것이 사용될 수 있다.

상기 파리풀 캘러스 원료는 0.318%(w/v) SH 배지(Schenk & Hildebrandt, Duchefa Biochemie, Netherlands), 5.0 mg/L 티아민 염산(thiamine HCl), 5.0 mg/L 나이아신(nicotinic acid), 0.5 mg/L 피리독신 염산(pyridoxine HCl), 0.1%(w/v) 이노시톨(myo-inositol), 0.5 mg/L 2,4-디클로로페녹시아세트산(dichlorophenoxyacetic acid)(2,4-D), 2.0 mg/L 파라-클로로페녹시아세트산(para-chlorophenoxyacetic acid) (P-CPA), 0.1 mg/L 키네틴(kinetin), 3% (w/v) 수크로스(sucrose), 0.4% (w/v) 젤란검(gelrite)의 혼합물을 배지로 사용하여 6개월간 한 달 주기로 계대배양 하였으며 24℃ 조건에서 암배양하여 획득된 것이다.

2. 미생물 선정 및 배양.

미생물 리노베이션을 위한 미생물로는 바실러스 아미로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)(BA, KCTC 43033)(미생물센터에서 분양)를 선정하였다.

바실러스 아미로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)는 다음과 같이 배양된다.

미생물로 선정한 바실러스 아미로리쿼파시엔스를 Nutrient broth(Beef extract 3.0 g/L, Peptone 5.0 g/L)에서 최적 생육 조건에 맞추어 34~39℃, 180~220rpm, 16시간~20시간 동안 배양한다(바람직하게 37℃, 200rpm, 18시간). 배양 후, 미생물을 4,200~4,800rpm, 12분~20분간, 바람직하게 4,500 rpm, 15분 동안 원심분리하여 미생물 펠렛(pellet)을 수득한다.

수득한 미생물 펠렛을 PG 버퍼(50 mM phosphate buffer, 2% 글리세린)로 1회 이상, 바람직하게 3회 세척하여, PG 버퍼(buffer) 5ml에 현탁시켰다(현탁하는 이유는 미생물을 배양하는 배지에 포함된 이물질을 제거하여 깨끗한 상태에서 반응을 유도하기 위한 것이며, 조성 중 글리세린의 농도를 정확하게 하기 위한 것이다).

3. 바이오리노베이션(생물전환 반응).

가. 반응 합성.

파리풀 캘러스 추출물과 미생물 펠렛을 1 : 9~11 의 중량비로 혼합(PG 버퍼를 함께 혼합하여 반응시키는 경우 PG 버퍼는 파리풀 캘러스 추출물을 기준으로 하여 45~55중량부 혼합)하고 27~33℃에서 120~180rpm의 속도로 70시간~74시간, 바람직하게 30℃에서 150rpm의 속도로 72시간 동안 반응시켜 반응액을 합성한다. 상기 혼합비율은 파리풀 캘러스 추출물의 항산화 유효성분을 회수하기 위한 최적의 비율이다.

나. 바이오리노베이션 반응물의 생성여부 확인.

바이오리노베이션 반응물(반응물)의 반응여부를 확인하는 공정을 더 포함할 수 있으며, 반응이 끝난 후 원심분리하여 상등액을 바이오리노베이션 반응물로 수거하고, 감압 농축하여 DMSO(다이메틸설폭사이드, dimethyl sulfoxide)에 용해시킨 후 HPLC(high performance liquid chromatography, 고성능 액체 크로마토그래피)로 생물전환 반응물의 생성여부를 확인한다.

다. 분리 동정.

HPLC 결과를 바탕으로 Prep-HPLC (preparative high performance liquid chromatography, 제조용 고성능 액체 크로마토그래피)를 이용하여 생성한 바이오리노베이션 반응물에 대한 피크(peak)를 분리하였다. 분리된 시료는 HPLC를 통해 purity를 확인한 후, LC-Mass (Liquid chromatography-mass spectrometry, 액체 크로마토그래피 질량 분석기) 및 NMR (Nuclear magnetic resonance, 핵자기 공명)을 통해 동정한다(분리 동정은 일반적인 방법과 동일하므로 구체적인 설명을 생략한다).

하기의 공정은 필수 공정은 아니며 필요에 따라 선택되는 추가 공정이다.

4. 원심분리 및 여과.

바이오리노베이션 반응물을 4,800~5,200rpm의 속도, 3~5℃, 8분~12분간, 바람직하게 5,000 rpm, 4℃, 10분 동안 원심분리하고, 여과지를 통해 여과한다.

5. 감압 농축.

여과 공정을 거친 바이오리노베이션 반응물의 유효성분 농도를 높이기 위하여 바이오리노베이션 반응물을 감압 농축(통상의 감압 농축 조건 안에서 자유롭게 실시 가능하므로 감압 농축의 조건을 구체적인 수치로 한정하지 아니한다)한다.

6. 동결 건조.

감압 농축을 거친 농축액을 동결 건조하여 보관할 수 있으며, 동결 건조 공정은 필요에 따라 선택되는 것이다.

본 발명에 의한 미백 조성물은 화장품, 외용 약품 등에 0.01~25중량%의 함량을 만족하도록 첨가되어 사용된다.

본 발명에 의한 미백 조성물의 바람직한 실시예는 다음과 같다.

<실시예>

1. 제조.

가. 파리풀 캘러스 추출물 : 파리풀 캘러스 원료 1g에 대하여 10배의 증류수를 첨가하고 60℃의 온도로 열수추출하고 추출액을 여과지(paper filter)로 여과한 후 감압 농축하고 -110℃로 동결건조하여 분말로 제조하였다.

나. 미생물 : 미생물센터에서 분양받은 Bacillus amyloliquefaciens (KCTC 43033) 균주를 이용하여 바이오 리노베이션(Biorenovation) 반응에 사용하였으며, 균주의 증식에 필요한 Nutrient Broth (Beef extract 3.0 g/L, Peptone 5.0 g/L) 배지를 이용하여 37℃에서 200rpm의 속도로 18시간 동안 배양하였다. 이 균주를 4,500rpm, 15분 동안 원심분리하여 미생물 펠렛(pellet)을 수득하였다. 수득한 미생물 펠렛을 PG 버퍼(50 mM phosphate buffer, 2% 글리세린)로 3회 세척하여, PG buffer 5ml에 현탁시켰다.

다. 바이오리노베이션.

파리풀 캘러스 추출물(건조 분말)과 미생물을 혼합(파리풀 캘러스 추출물 100mg에 미생물1000mg)한 후 30℃에서 72시간 동안 150rpm의 속도로 반응시킨 후 분리동정을 통해 바이오리노베이션 반응물의 시료를 생성하고 원심분리를 통해 상등액을 감압 농축 후 -110℃에서 동결건조하여 사용하였다.

2. 테스트.

본 발명은 α-MSH로 자극된 B16F10 melanoma cells에서 파리풀 callus 추출물(PL)과 바이오리노베이션기법을 사용하여 생물 전환된 파리풀 callus 추출물 (PLBR)이 멜라닌 합성에 관여하는 tyrosinase, TRP-1, TRP-2 단백질 발현 및 전사인자 MITF 활성에 미치는 영향을 조사하고 새로운 미백기능성 화장품 소재로서의 활용 가능성을 증명하고자 하는 것이며, 본 실시예의 테스트는 B16F10 melanoma 세포를 이용하여 세포 생존율, melanin 합성 저해, tyrosinase 활성 저해, 멜라닌 합성에 관여하는 TRP-1, TRP-2, MITF, tyrosinase의 단백질 발현량을 확인하는 것이다.

가. 세포 배양.

본 발명에서 사용된 murine B16F10 melanoma cell은 ATCC사 (American Type Cell Culture, USA)에서 분양받아 Dulbecco's Modified Eagle's medium (DMEM, Welgene, Gyeongsan, KOR) 배양액에 10% fetal bovine serum(FBS) 와 100 units/mL penicillin-streptomycin (P/S)을 첨가한 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다.

나. 바이오리노베이션(Biorenovation) 생물전환의 HPLC 분석

HPLC분석을 위해서 Shimadzu SpectroMonitor 3200 digital UV/Vis detector와 Shim-pack GIS C18 Column (5 μm ODS, 250 × 4.6 mm id)을 사용하였다. 이동상 용매는 0.1% trifluoroacetic acid(TFA)를 함유한 water와 acetonitrile을 사용하였다. 시료 10 μl를 주입하여 40℃ 온도에서 gradient 조건의 1.0 mL/min 유속과 254 nm의 파장으로 40분 동안 분석하였다.

도 1은 파리풀 추출물(PL)과 생물 전환된 파리풀 캘러스 추출물(PLBR), 바이오리노베이션(Biorenovation)에 사용된 미생물인 B. amyloliquefaciens(KCTC 43033) 추출물(BA)의 HPLC 크로마토그램의 그래프이며, HPLC로 분석한 결과 PLBR 19~20.5min 에서 PL에 존재하지 않는 신규 peak 생성이 확인되었다. 이는 PL에 존재하는 미지의 반응물이 미생물과의 대사작용을 통해 새로운 반응물로 전환되었을 가능성을 시사한다.

다. 세포생존능(Cell viability).

B16F10 melanoma 세포에 대한 파리풀 캘러스 추출물(PL)과 생물 전환된 파리풀 캘러스 추출물(PLBR), 바이오리노베이션(Biorenovation)에 사용된 미생물인 B. amyloliquefaciens(KCTC 43033) 추출물(BA)의 세포 독성을 MTT assay를 통해 측정하였다.

B16F10 melanoma 세포를 24 well plate에 1.0 × 10⁴ cells/well로 분주하여37°C, 5% CO₂ 인큐베이터에서 24시간 배양하였다. 한 후 α-MSH (200 nM)와 각 시료를 100, 200, 400 μg/mL의 농도로 처리하여 24시간 전 배양하였다.

이후, 시료와 α-MSH (200 nM)를 동시 처리하고 72시간 배양하고 2 mg/ml MTT 시약을 첨가하여 2시간 동안 반응시켰다. 염색된 formazan 결정을 DMSO로 용해시켜 96 well plate로 옮겨주고 ELISA reader (multiwell microplate reader)를 사용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.

미토콘드리아의 환원효소(reductase)에 의하여 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) 시약은 보라색의 포마잔(formazan)으로 전환되며 포마잔(formazan)의 양은 생존 가능한 세포의 수와 비례한다. 도 2에서 보이는 것처럼, B16F10 cell에 PL과 PLBR 그리고 생물전환 반응에 사용한 균(BA)을 100, 200, 400 μg/mL의 농도로 처리하여 세포 생존율을 확인한 결과, 측정 농도에서 PL, PLBR 및 BA 모두 85% 이상의 생존율을 보이는 것으로 확인되었다. 따라서 추후 실험에서는 추출물 처리 군에 대해 세포의 성장 저해 및 사멸을 보이지 않는 400 μg/mL을 최대 농도로 설정하여 실험을 진행하였다.

라. Melanin 생성 억제 활성 평가.

PL과 PLBR의 멜라닌 합성 억제 효능을 확인하기 위해 B16F10 세포를 6 well plate에 4.0 × 10⁴ cells/well로 분주하여 37°C, 5% CO₂ 인큐베이터에서 24시간 전 배양한 뒤 시료와 α-MSH(200 nM)을 동시처리하고 96시간 배양하였다. phosphate buffered saline (PBS buffer, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)로 1회 세척한 후에 0.5 × trypsin-EDTA (Gibco, Grand Island, NY, USA)으로 세포를 수거하였다. 13000 rpm에서 3 min동안 centrifuge하여 얻은 pellet에 1% protease inhibitor(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 함유한 radioimmunoprecipitation assay buffer (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 100 μl씩 첨가하고 원심분리하였다. 수득한 pellet에 10% DMSO를 함유한 1 N NaOH를 500 μl 넣고 90℃의 heating block에서 1시간 동안 용해시켰다. 이후 ELISA reader를 사용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.

α-MSH (200 nM)로 자극된 B16F10 cell에 PL 및 PLBR 추출물을 농도별로(100, 200, 400 μg/mL) 처리하여 멜라닌 합성에 대한 저해 활성을 조사하였다. 실험결과 α-MSH 자극에 의해 세포 내 멜라닌이 축적되었으며 PL 처리군은 이를 억제하지 못하여 pellet 색이 검게 변한 것이 관찰되었다. 반면 PLBR 처리군에서는 농도 의존적으로 멜라닌 축적을 저해하여 최고농도인 400 μg/mL에서는 α-MSH 무 처리군과 유사한 pellet 색을 나타내었다(도 3a). 또한 흡광도 측정 결과 PL 처리군 보다 PLBR 처리군에서 더 우수한 멜라닌 합성 저해 활성이 확인되었다 (도 3b). 이는 생물전환 과정에서 미백활성을 가진 유효물질이 생성되어 멜라닌 합성을 저해한 것으로 사료된다. 따라서 세포 밖으로 분비되는 melanogenesis에 관여하는 하위인자들의 발현을 알아보기 위하여 추가적인 실험을 진행하였다.

마. 티로시나아제(Tyrosinase) 생성 억제 활성 평가.

티로시나아제(Tyrosinase)는 멜라닌 생성 초기반응에 관여하는 효소로서 L-DOPA와의 반응에 의하여 dopa-chrome을 형성하고 이를 흡광도로 측정함으로써 dopa oxidase 활성 및 tyrosinase 저해 활성을 평가한다.

6 well plate에 B16F10 cell을 4.0 × 10⁴cells/well로 분주하고, 37℃, 5% CO₂조건의 incubator에서 24시간 전 배양 한 후 시료와 α-MSH (200 nM)을 동시에 처리하고 96시간 배양하였다. phosphate buffered saline (PBS buffer, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)로 1회 세척한 후에 0.5 × trypsin-EDTA (Gibco, Grand Island, NY, USA)으로 세포를 수거하였다. 13000 rpm에서 3 min동안 centrifuge하여 얻은 pellet에 1% protease inhibitor (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 함유한 radioimmunoprecipitation assay buffer (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 100 μl씩 첨가하고 원심분리하였다. 수득한 pellet에 10% DMSO를 함유한 1 N NaOH를 500 μl 넣고 90℃의 heating block에서 1시간 동안 용해시켰다. 이후 ELISA reader를 사용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.

α-MSH 자극에 의해서 티로시나아제 활성도(tyrosinase activity) 발현을 유도하고 PL 및 PLBR을 처리한 결과 α-MSH 단독 처리군과 비교하여 PL은 최대농도인 400 μg/mL에서 티로시나아제(tyrosinase) 효소 활성이 5％ 억제된 것에 비해 PLBR은 같은 농도에서 94%의 티로시나아제 활성도(tyrosinase activity) 저해를 나타내며 농도 의존적으로 우수한 활성을 보였다(도 4). 이는 바이오리노베이션 생물전환체에 의해 티로시나아제(tyrosinase) 저해 활성이 크게 향상된 것으로 사료되며, 이러한 티로시나아제(tyrosinase) 저해는 멜라닌 합성이 억제된 주요 원인으로 판단된다.

바. 웨스턴 블롯(Western Blot).

6 well plate에 B16F10 cell을 4.0 × 10⁴cells/well로 분주하고, 37℃, 5% CO₂조건의 incubator에서 72시간 전 배양 하였다. 이후 시료와 α-MSH(200 nM)을 동시처리하고 24시간 후 세포를 수거하였다. 수득한 세포에 세포 용해액 [1 × RIPA buffer, 100 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 200 mM Na₃VO₄및 protease inhibitor] 100 μl를 첨가하고 4℃, 13000 rpm에서 30분 동안 원심분리하여 상층액을 얻었다. BCA kit (Thermo Scientific, USA)를 사용하여 단백질 정량하였고 2 × Laemmli sample buffer (65.8 mM Tris-HCl, pH 6.8, 2.1% SDS, 26.3% (w/v) glycerol, 0.01% bromophenol blue)와 동량 혼합하여 10% SDS-PAGE gel에 전기영동한 후 poly-vinylidene difluoride (PVDF) membrane (Bio-rad, USA)에 전이시켰다. 상온에서 1시간 동안 5% skim milk를 함유한 TBST (10% 10 × TBS, 1% tween 20)에 blocking시킨 다음 TBST를 사용하여 10분 간격으로 4회 세척하였고 1차 항체인 TRP-1, TRP-2, tyrosinase (1:1,000, Santa cruz Biotechnology, USA), MITF (1:500, Santa cruz Biotechnology, USA)를 처리하여 4℃에서 overnight 하였다. 반응이 끝난 후 TBST로 4회 세척한 후 2차 항체인 horseradish peroxidase (HRP)가 결합된 anti-mouse IgG을 (1:1,000) 사용하여 상온에서 1시간 반 동안 반응시켰다. 다시 TBST로 4회 세척한 후 ECL kit (Bio-Rad, USA)를 사용하여 imaging densitometer (model GS-700, Bio-rad, USA)을 통해 측정하였다. 측정 후 β-actin 대비 MITF, TRP1, TRP2, Tyrosinase 단백질 발현량에 대한 면적값을 imageJ program (NIH, Bethesda, MD, USA)을 이용하여 수치화한 뒤 그래프로 나타내었다.

α-MSH 자극으로 유도된 B16F10 melanoma cell에 PL 및 PLBR 처리 시 melanin 합성 하위기전인 TRP-1, TRP-2, 티로시나아제(tyrosinase) 단백질 발현량과 전사인자 MITF 활성에 미치는 영향을 조사하였다. 그 결과 α-MSH 자극에 의하여 무 처리군에 비해 멜라닌(melanin) 합성 관여인자의 발현이 증가된 것을 확인하였으며 PL 처리 시 멜라닌 합성 관여인자들의 단백질 발현량이 일관된 저해를 보이지 않지만 PLBR 처리 시 농도 의존적으로 단백질 발현을 저해하였고 200 μg/mL 이상의 농도에서는 TRP-1, TRP-2, 티로시나아제(tyrosinase) 및 MITF 발현량이 α-MSH 무 처리군과 비슷한 수준으로 확인되어 PLBR 추출물이 멜라닌 합성 관여인자를 효과적으로 저해한다는 것을 확인하였다(도 5 내지 도 8). 이 결과는 바이오리노베이션(biorenovation) 기법으로 생물 전환된 PLBR 내의 유효성분이 티로시나아제 활성도(tyrosinase avtivity) 저해뿐만 아니라 멜라닌 형성(melanogenesis) 관련 인자들에도 직간접적인 영향을 미친 것으로 판단된다.

Claims

파리풀 캘러스 추출물과 미생물에 의한 생물전환을 통해 파리풀 캘러스 추출물로부터 생성되어 B16F10 흑색종 세포의 활성화를 억제하고 멜라닌 합성을 저해하는 유효성분을 함유하는 것을 특징으로 하는 파리풀 캘러스 추출물의 바이오리노베이션에 의한 미백 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 미생물은 바실러스 아미로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)인 것을 특징으로 하는 파리풀 캘러스 추출물의 바이오리노베이션에 의한 미백 조성물.
파리풀 캘러스 추출물을 제조하는 제1단계와;
미생물을 선정하고 배양한 후 원심분리하여 미생물 펠렛을 수득하는 제2단계와;
상기 제2단계에서 수득한 미생물 펠렛과 상기 제1단계에서 제조한 파리풀 캘러스 추출물의 반응으로 파리풀 캘러스 추출물의 유효성분을 생물전환시키는 제3단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 파리풀 캘러스 추출물의 바이오리노베이션에 의한 미백 조성물의 제조 방법.
청구항 3에 있어서, 상기 제3단계는 상기 파리풀 캘러스 원료에 대하여 중량기준으로 9배~11배의 미생물 펠렛을 혼합하여 반응시키는 것을 특징으로 하는 파리풀 캘러스 추출물의 바이오리노베이션에 의한 미백 조성물의 제조 방법.
청구항 3에 있어서, 상기 제1단계는 파리풀 캘러스 원료 1g에 대하여 9~11배의 증류수를 첨가하고 55~65℃의 온도로 열수추출하고 추출액을 여과지(paper filter)로 여과한 후 감압 농축하고 동결건조하여 분말화하여 파리풀 캘러스 추출물을 제조하는 것을 특징으로 하는 파리풀 캘러스 추출물의 바이오리노베이션에 의한 미백 조성물의 제조 방법.