KR20200109810A

KR20200109810A - 오미자 추출물을 포함하는 항산화, 미백, 항주름 또는 항염증용 조성물

Info

Publication number: KR20200109810A
Application number: KR1020190029492A
Authority: KR
Inventors: 서미자; 정아름; 최설매; 김한혁
Original assignee: 농업회사법인(주)하늘호수
Priority date: 2019-03-14
Filing date: 2019-03-14
Publication date: 2020-09-23

Abstract

본 발명은 오미자 추출물을 포함하는 피부상태 개선을 위한 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 오미자 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 DPPH 자유 라디칼 소거활성이 우수하여 항산화 효과가 있으며, 티로시나아제 저해효과를 가져 미백효과를 가질 뿐만 아니라 콜라겐 활성을 증대시켜 주름 개선효과를 가지며, NO 생성 및 염증성 사이토카인의 생성을 억제하여 항염증 효과가 있다. 또한, 본 발명의 오미자 추출물은 세포 독성 및 피부 부작용이 없어 화장료 또는 식품 조성물에 안전하게 사용할 수 있다.

Description

오미자 추출물을 포함하는 항산화, 미백, 항주름 또는 항염증용 조성물 {A COMPOSITION FOR ANTI-OXIDATING, WHITENING, ANTI-WRINKLE OR ANTI-INFLAMMATION COMPRISING EXTRACTS OF OMIJA}

본 발명은 오미자 추출물을 포함하는 피부상태 개선을 위한 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 오미자 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 미백, 항주름 또는 항염증용 화장료 조성물 또는 식품 조성물에 관한 것이다.

최근 생활과 소득 수준이 향상되면서 삶의 질을 향상시키기 위해 많은 관심이 높아지고 있다. 특히 노화와 각종 염증질환, 암의 대처 방안으로 항산화 물질을 비롯한 체내 질병과 대사를 위한 생리활성물질 개발에 대해 관심이 증대되었다 (KB Kim, et al., Journal of Nutrition and Health. 50(5);415-425(2017)). 생체 내에서 필요한 에너지 공급을 위해 생화학적 산화 반응은 끊임없이 일어나며 이 과정 중에 발생하는 유해산소라 불려지는 활성산소 (reactive oxygen species, ROS)는 가장 안정한 형태의 산소인 삼중항산소가 산화, 환원과정에서 생성되는 일중항산소인 수퍼옥사이드 음이온(Superoxide anion), 하이드록실 라디칼(hydroxyl radical), 과산화수소(hydrogen peroxide)과 같은 불안정한 상태의 유리 라디칼(free radical) 및 과산화수소 (H₂O₂)로 불안정하고 산화력이 높아 생체물질과 쉽게 반응하기 때문에 인체 내에서 제거되지 못하면 산화적 스트레스 (oxidative stress)를 유발하게 된다. 이러한 산화적 스트레스는 염증반응과 연결되어 있으므로 여러 대사과정에서 지질과산화를 유도하고, 단백질, 세포막 및 DNA 등을 손상시켜 세포의 노화와 변형을 유도함으로써 뇌졸중, 암, 동맥경화, 알츠하이머병, 파킨슨병, 동맥경화증 등 다양한 질병을 유발한다 (Valko M, et al., Int J Biochem Cell Biol. 39:44-84(2007); 및 Halliwell B, et al., NY, USA. 968(1999)). 이렇게 생성된 활성탄소를 제거시켜 생체를 보호하는 생리학적 항산화 효소로는 수퍼옥사이드 디스무타제(superoxide dismutase, SOD), 카탈라제(catalase), 글루타치온-퍼옥시다제(glutathione-peroxidase, GSHpx) 및 글루타치온 S-트랜스퍼라제(glutathione S-transferase, GST) 등이 있으며, 저분자의 항산화제 혹은 유리 라디칼 소거역할을 하는 것으로 α-토코페롤, β-카로틴, 아스코브산 및 글루타치온 등이 알려져 있다 (Kim SM, et al., Life Sci. 90(21-22);874-882(2012)).

사람의 피부색은 피부 내부의 멜라닌(melanin) 농도와 분포에 따라 결정되는데, 유전적인 요인 외에도, 태양 자외선이나 피로, 스트레스 등의 환경적 또는 생리적 조건에 의해서도 영향을 받는다. 멜라닌은 피부 표피층에 있는 멜라노사이트에서 합성되는데, 멜라노사이트 내 소기관인 멜라노좀(melanosome)에서 아미노산의 일종인 티로신(tyrosine)에 티로시나제(tyrosinase)라는 효소가 작용하여 도파(DOPA), 도파퀴논(dopaquinone)으로 바뀐 후 비효소적인 산화반응을 거쳐 만들어진다. 이와 같은 멜라닌의 합성이 피부 내에서 과도하게 일어나면, 피부 톤을 어둡게 하고, 기미, 주근깨 등을 발생시킨다. 따라서, 피부 내의 티로시나제 활성을 저해하여 멜라닌 색소의 합성을 저해시키면, 피부 톤을 밝게 하여 피부 미백을 실현할 수 있을 뿐만 아니라 자외선, 호르몬 및 유전적인 원인에 기인하여 발생하는 기미, 주근깨 등의 피부 과색소 침착증을 개선시킬 수 있다.

한편, 염증반응은 외부 물리적, 화학적 자극이나 세균감염에 대한 생체방어 반응으로 염증매개물질이라 불리는 산화질소(nitric oxide, NO), 종양괴사인자(tumor necrosis factor, TNF)-α, 인터루킨(IL)-1β, 과립구 마크로파지 콜로니 자극인자(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF), IL-6와 같은 다양한 염증성 사이토카인 (cytokine) 등을 생산 및 분비한다 (YC Yoo, et al., Journal of Life Science. 26(3);338-345(2016)). 또한, 염증 전사 인자인 핵 인자 카파(nuclear factor kappa) B (NF-κB)를 활성화시켜 유도성 산화질소 합성효소 (inducible nitric oxide synthase, iNOS)와 사이클로옥시제나제(cyclooxygenase)-2 (COX-2)를 발현시키고, 프로스타글란딘 (Prostaglandin) E2 (PGE2)를 생성하고 분비된 염증성 사이토카인 (cytokine) 은 다시 NF-κB를 활성화시켜 사이토카인 캐스케이드(cytokine cascade)를 증폭하여 염증상태를 확장시킨다. 특히 NO는 항박테리아, 항종양 등의 효과를 나타낼 수 있지만, 병리적 원인에 의해 과량 생성되어 분비되면 과도한 혈관 확장에 의하여 패혈성 쇼크 및 신경조직의 손상 등의 위험을 초래할 수 있다 (S Han, et al., Immunopharmacol. Immunotoxicol. 35;34-42(2013)). 이러한 염증성 사이토카인 (cytokine)과 염증 매개인자들은 염증과정에서 중요한 역할을 하고, 이들의 비정상적인 생성을 적절하게 조절하는 것이 염증성 질환의 치료법으로 제기되고 있다.

따라서, 화장품 분야에서는 항산화, 미백, 항주름 또는 항염증 효과를 가지는 기능성 화장품에 대한 연구 및 개발이 활발하게 진행되고 있으며, 특히 피부에 독성이나 자극을 주지 않기 위하여 천연 물질을 이용한 연구가 계속되고 있다.

예를 들어, 대한민국 등록특허 제10-1952943호는 아보카도씨 추출물의 항산화 효과를 보고하였으며, 대한민국 등록특허 제10-1950384호는 털마삭줄 추출물, 황련 추출물 및 회화나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백효과 및 주름개선 효과를 가지는 조성물을 기술하였으며, 대한민국 등록특허 제10-1949430호는 번행초 추출물의 항염증 및 항노화 효과를 개시한 바 있다.

한편, 오미자나무(Schizandrachinensis)는 쌍떡잎 식물로 목련목 오미자과의 낙엽 덩굴식물이다. 주로 산골짜기에서 자라며, 줄기는 갈색이고 나무를 기어오르는 성질이 있다. 잎은 어긋나고 넓은 타원형, 긴 타원형 또는 달걀 모양이며 뒷면 잎맥 위에는 털이 있고 가장자리에 치아 모양의 톱니가 있다. 꽃은 6∼7월에 피고 단성화이며 약간 붉은빛이 도는 황백색이다. 꽃이 핀 다음 암꽃의 꽃턱은 길이 3∼5cm로 자라서 열매가 수상(穗狀)으로 달린다. 열매는 장과(漿果)로 거의 둥글고 이삭 모양으로 여러 개가 달린다. 8∼9월에 홍색으로 익으며 1∼2개의 홍갈색 종자가 들어 있다. 어린 순은 나물로 먹는다. 열매에 신맛, 단맛, 쓴맛, 짠맛, 매운맛의 다섯 가지 맛이 섞여 있어 오미자라 하며 약용한다. 한방에서 자양(滋養), 강장, 진해(鎭咳), 거담(祛痰), 지한(止汗) 등의 효력이 있어 해수ㅇ유정(遺精), 구갈, 도한(盜汗), 급성간염 등에 처방한다. 민간에서는 오미자차를 만들어 마시며 술도 담근다.

이에 본 발명자들은 오미자의 활성에 대하여 보다 면밀히 연구를 진행한 결과, 오미자 추출물이 항산화, 미백, 항주름 효과뿐만 아니라 항염증 효과를 나타낸다는 사실을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명에서 해결하고자 하는 기술적 과제는 항산화, 미백, 항주름 또는 항염증 효과를 가지면서 인체 안정성이 우수한 오미자 추출물을 포함하는 조성물을 제공하기 위한 것이다.

상기한 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명에서는 오미자 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화, 미백, 항주름 또는 항염증용 조성물을 제공한다.

바람직하게, 본 발명에서 오미자 추출물을 포함하는 조성물은 화장료 조성물 또는 식품 조성물일 수 있다.

본 발명의 용어 "추출물(extract)"은 오미자를 적절한 침출액으로 짜내고 침출액을 증발시켜 농축한 제제를 의미하는 것으로, 이에 제한되지는 않으나, 추출처리에 의해 얻어지는 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 이들의 조정제물 또는 정제물일 수 있다.

본 발명의 오미자 추출물은 당업계에 공지된 일반적인 추출방법, 분리 및 정제방법을 이용하여 제조할 수 있다. 상기 추출방법으로는 열탕 추출, 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 방법을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 실시양태에 따르면, 오미자 추출물은 음건한 오미자를 분쇄한 후 추출용매, 예컨대 물, 탄소수 1~3개의 무수 또는 함수 저급 알콜, 아세톤 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군에서 선택된 용매를 추출용매로 사용하여 추출할 수 있으며, 상기 추출 용매의 양은 오미자 건조 중량의 2 내지 20 중량배, 바람직하게는 5 내지 15 중량배로 할 수 있다.

본 발명에서는 오미자의 사용부위는 오미자 잎, 줄기 또는 열매 모두 가능하며, 특히 잎, 줄기 또는 이들을 혼합하여 함께 사용할 수 있으며, 바람직하게는 오미자 잎을 단독으로 사용할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시태양에 따르면, 상기 오미자 추출물은 건조된 오미자, 바람직하게는 오미자 잎을 유기용매, 바람직하게는 아세톤, 더욱 바람직하게는 70%(v/v) 아세톤을 오미자 시료의 10 내지 20 중량배의 양으로 사용하여 상온에서 50 내지 100시간 동안 추출한 다음, 여과지로 여과하고 감압농축하여 수득할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시태양에 따르면, 상기 오미자 추출물은 상기 오미자 잎의 아세톤 추출물을 메탄올, 바람직하게는 30 내지 40%(v/v) 메탄올을 용리액으로 사용하여 칼럼 크로마토그래피를 실시하여 수득할 수 있다.

본 발명의 하나의 구현예에 따르면, 본 발명의 오미자 추출물은 오미자 잎의 아세톤 추출물 또는 상기 오미자 잎의 아세톤 추출물을 칼럼 크로마토그래피하여 수득된 메탄올 분획물이다.

본 발명의 하나의 구현예에 따르면, 상기 오미자 잎의 아세톤 추출물 또는 이의 메탄올 분획물은 DPPH 자유 라디칼 소거활성이 우수하여 항산화 효과가 있으며, 티로시나아제 저해효과를 가져 미백효과를 가질 뿐만 아니라 콜라겐 활성을 증대시켜 주름 개선효과를 가지며, NO 생성 및 염증성 사이토카인의 생성을 억제하여 항염증 효과가 있다.

본 발명의 조성물에는 상기 오미자 추출물이 조성물의 총 중량을 기준으로 하여 0.005 내지 50 중량%, 보다 바람직하게는 0.01 내지 30 중량%, 가장 바람직하게는 0.1 내지 10 중량%로 포함될 수 있다. 이 때 오미자 추출물의 함량이 0.005 중량% 미만일 경우 본 발명의 목적효과인 항산화, 미백, 항주름 및 항염증 효과를 수득할 수 없으며, 50 중량%를 초과할 경우 함량의 증가에 따라 효과가 비례적이지 않아 비효율적일 수 있으며 제형상의 안정성이 확보되지 않는 문제점이 있다.

본 발명의 오미자 추출물을 함유하는 조성물은 항산화 효과, 미백효과, 주름 개선효과 및 항염증 효과를 나타내며, 천연 물질로서 세포독성이 거의 없다.

본 발명의 하나의 실시양태에 따르면, 오미자 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 하나의 실시양태에 따른 화장료 조성물에는 유효성분으로서의 오미자 추출물 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 첨가되는 성분, 예컨대 항산화제, 안정화제, 가용화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 및 담체를 추가로 첨가할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 영양 크림, 수렴 화장수, 유연 화장수, 로션, 에센스, 영양젤 또는 마사지 크림의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트 검, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 가용화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 검 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 하나의 실시양태에 따른 식품 조성물에는 유효성분으로서 오미자 추출물뿐만 아니라 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 추가로 포함할 수 있다.

상기 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.

예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 오미자 추출물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.

한편, 본 발명의 오미자 추출물은 인체에 무해하며, 독성 및 부작용이 거의 없으므로 장기간 사용시에도 안심하고 사용할 수 있으며, 특히 상기한 바와 같은 화장료 및 식품 조성물에 안전하게 적용할 수 있다.

이와 같이, 본 발명의 오미자 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 DPPH 자유 라디칼 소거활성이 우수하여 항산화 효과가 있으며, 티로시나아제 저해효과를 가져 미백효과를 가질 뿐만 아니라 콜라겐 활성을 증대시켜 주름 개선효과를 가지며, NO 생성 및 염증성 사이토카인의 생성을 억제하여 항염증 효과가 있다. 또한, 본 발명의 오미자 추출물은 세포 독성 및 피부 부작용이 없어 화장료 및 식품 조성물에 안전하게 사용할 수 있다.

도 1은 오미자 잎과 줄기의 전처리 작업을 보여주는 것이다.
도 2는 오미자 잎과 줄기의 부위별 및 용매조건별 추출물의 사진이다.
도 3은 오미자 추출물의 DPPH 라디칼 전자공여능 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 오미자 추출물의 ABTS^+·양이온 라디칼 소거능 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 오미자 추출물의 티로시나제 저해활성 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 오미자 잎 아세톤 추출물의 Raw 264.7 마크로파지 세포에 대한 세포 생존율 측정 결과이다.
도 7은 오미자 잎 아세톤 추출물의 메탄올 분획물의 Raw 264.7 마크로파지 세포에 대한 세포 생존율 측정 결과이다.
도 8은 오미자 잎 아세톤 추출물의 산화질소(NO) 저해 활성 측정 결과이다.
도 9는 오미자 잎 아세톤 추출물의 메탄올 분획물의 산화질소(NO) 저해 활성 측정 결과이다.
도 10은 오미자 잎 아세톤 추출물의 프로스타글란딘(Prostaglandin) E₂ 저해 활성 측정 결과이다.
도 11은 오미자 잎 아세톤 추출물의 메탄올 분획물의 프로스타글란딘(Prostaglandin) E₂ 저해 활성 측정 결과이다.
도 12는 오미자 잎 아세톤 추출물 및 오미자 잎 아세톤 추출물의 메탄올 분획물의 인간 표피 멜라닌 세포(Human epidermal melanocyte, HEM)에 대한 생존율 측정 결과이다.
도 13은 오미자 잎 아세톤 추출물 및 오미자 잎 아세톤 추출물의 메탄올 분획물에 의한 멜라닌 양의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 14는 오미자 잎 아세톤 추출물 및 오미자 잎 아세톤 추출물의 메탄올 분획물에 의한 티로시나제 저해효과 및 TLC 체크 비교한 결과이다.
도 15는 오미자 잎 아세톤 추출물 및 오미자 잎 아세톤 추출물의 메탄올 분획물의 웨스턴 블랏을 이용한 티로시나제 단백질 및 MITF 발현을 측정한 결과이다.
도 16은 오미자 잎 아세톤 추출물 및 오미자 잎 아세톤 추출물의 메탄올 분획물의 웨스턴 블랏을 이용한 MMP-1 단백질 발현을 측정한 결과이다.
도 17은 오미자 잎 아세톤 추출물 (A) 및 오미자 잎 아세톤 추출물의 메탄올 분획물(B)의 실시간(RT)-PCR을 이용한 proCOL1A2 및 콜라겐의 측정 결과이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

<실시예 1> 오미자 추출물 제조

오미자 잎과 줄기는 주관기관(㈜하늘호수)으로부터 제공받아 표본을 제작하여 첨단메디컬융합섬유센터 시료보관실에 보관하였으며, 소재는 잎과 줄기로 분리하여 무게를 측정하고 24시간동안 음건하였다. 도 1은 오미자 잎과 줄기의 전처리 작업을 보여주는 것이다.

소재의 부위별 및 추출용매별 지표성분 수율을 확인하기 위하여 잎과 줄기에 각각 100℃ 열수와 70% 아세톤 및 80% 메탄올을 넣고 2시간 동안 추출하였다.

도 2는 오미자 잎과 줄기의 부위별 및 용매조건별 추출물의 사진이다. 여기에서 보듯이, 줄기보다 잎이 대체로 진한 빛깔을 나타내었다. 특히, 오미자 잎 70% 아세톤 추출물은 다른 잎에 비해 가장 진한 녹색 빛을 보여 엽록소(클로로필)를 포함한 다양한 물질이 용출되었을 것으로 추정된다.

<실시예 2> 오미자 잎의 아세톤 추출물 제조

오미자 잎 건조 시료 약 1.04kg에 약 15배의 70%(v/v) 아세톤을 가하여 상온에서 72시간 동안 3회 반복 추출한 뒤, 추출액을 여과지로 여과하고 회전식 감압농축기로 농축하였다. 농축된 시료는 동결건조기로 건조하여 80g 수득하였다.

<시험예 1> 오미자 잎의 아세톤 추출물의 항산화 효과 측정

(1) DPPH (1-1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl) 라디칼 전자공여능 측정

상기 실시예 2에서 수득된 오미자 잎의 아세톤 추출물의 농도별 용액 100㎕에 DPPH 용액 (5x10^-4M) 100㎕를 넣고 25℃ 인큐베이터에서 30분간 반응시킨 후 마이클로플레이트 계수기를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였으며 실험 대조구로는 L-아스코브산과 부틸화 하이드록시아니솔을 사용하였다. 전자공여능은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.

도 3은 오미자 잎의 아세톤 추출물의 DPPH 라디칼 전자공여능 측정 결과를 나타낸 그래프이다. 여기에서 보듯이, 오미자 잎의 아세톤 추출물은 500㎍/㎖ 농도에서 82.6%의 항산화 효과를 나타내었다.

(2) ABTS 양이온 라디칼 소거능 (cation radical scavenging activity) 측정

7mM 2,2-azino-bis(3-ethyl-benthiazoline-6-sulfonic acid)와 2.4mM 과황산칼륨을 혼합하여 실온에서 24시간 동안 방치하여 ABTS^+·를 형성시킨 후 에탄올로 희석하여 ABTS^+·100㎕에 시료 100㎕를 가하여 1분동안 방치한 후 732nm에서 흡광도를 측정하였으며, 실험 대조구로는 L-아스코브산을 사용하였다. 라디칼 소거능은 1/2로 환원시키는데 필요한 시료의 농도 값으로 나타내었다.

도 4는 오미자 잎의 아세톤 추출물의 ABTS^+·양이온 라디칼 소거능 측정 결과를 나타낸 그래프이다. 여기에서 보듯이, ABTS^+· 측정 결과, 50㎍/㎖ 농도에서 80.8%의 항산화 효과를 나타내었다.

<시험예 2> 오미자 잎의 아세톤 추출물의 미백효과 측정

티로시나제 (Tyrosinase) 저해활성 측정은 Yagi 등의 방법에 따라 측정하였다. 반응구는 1/15M 인산나트륨 완충액(pH 6.8) 0.5mL에 10mM L-DOPA을 녹인 기질액 0.2mL 및 시료용액 0.1mL의 혼합액에 mushroom tyrosinase(110U/mL) 0.2mL 첨가하여 25℃에서 2분간 반응시켜 반응액 중에 생성된 DOPA chrome을 475nm에서 측정하였다. 티로시나제 저해활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.

도 5는 오미자 잎의 아세톤 추출물의 티로시나제 저해활성 측정 결과를 나타낸 그래프이다. 여기에서 보듯이, 티로시나제 저해활성 측정 결과, 오미자 잎 아세톤 추출물은 5,000㎍/㎖ 농도에서 알부틴 대비 71%의 티로시나제 저해 효과를 나타내었다.

<실시예 3> 오미자 잎의 아세톤 추출물로부터 메탄올 분획물의 제조

오미자 잎 70% 아세톤 추출물의 성분 패턴을 관찰하기 위해 박층 크로마토그래피 (thin layer Chromatography)를 수행한 결과, 이동상 클로로포름 : 메탄올 : 물 = 6 : 4 : 1에서 오미자 잎 70% 아세톤 추출물의 분리 패턴 관찰이 용이하였다.

또한, 오미자 잎 70% 아세톤 추출물은 TLC 체크를 통해 분리 조건을 탐색하고 open column chromatography를 이용하여 1차 구성성분 분리를 진행하였다. 세파덱스 겔 (Sephadex LH-20, 10-25μm, GE Healthcare Bio-Science AB, Sweden)에 용리액 (메탄올)을 넣고 균일화시킨 후, 유리관 컬럼(50x600 mm)에 부어 기포가 생기지 않도록 다져준 다음 용리액을 비극성에서 극성의 비율로 치환시켰다. 최종 용리액(증류수)에 녹인 오미자 잎 70% 아세톤 추출물 30g을 다진 세파덱스 겔 위층에 로딩한 다음, 용리액을 극성에서 비극성으로 비율을 바꿔서 넣어 준 후 구성성분을 분리하였다.

그 결과, 오미자 잎 70% 아세톤 추출물로부터 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 총 3개의 분획물을 얻었다 (Fr.1 : 30% 메탄올에 용리, Fr.2 : 30%~40% 메탄올에 용리, Fr.3 : 50%~100% 메탄올에 용리). 활성 기반에 근거하여 'Fr.2'이 주요 분획물임을 확인하였다.

<시험예 3> 오미자 잎의 아세톤 추출물의 항염증 활성 측정

(1) 오미자 잎의 아세톤 추출물의 세포 생존율 측정

세포 생존율 (Cell viability) 측정은 Carmichael 등의 방법에 따라 측정하였다. Raw 264.7 마크로파지 세포를 96 well plate에 5x10³cells/well이 되게 0.18ml 분주하고, 시료를 농도별로 조제하여 0.02ml 첨가한 후 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 24시간 배양하였다. 5mg/ml 농도로 제조한 MTT 용액 0.02ml를 첨가하여 4시간 배양한 후 배양액을 제거하고 각 well당 DMSO 0.15ml를 가하여 실온에서 30분간 반응시킨 뒤 ELISA 리더로 550nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군으로 덱사메타존(Dexamethasone, Dexa)를 사용하였다.

도 6 및 도 7은 각각 오미자 잎 아세톤 추출물 및 오미자 잎 아세톤 추출물의 메탄올 분획물의 Raw 264.7 마크로파지 세포에 대한 세포 생존율 측정 결과이다.

Raw 264.7 세포의 오미자 70% 아세톤 추출물의 세포 생존율 측정 결과, 100 ㎍/㎖의 농도에서 50%의 이상의 강한 독성을 확인하였고, 분획물 'Fr.2'에서는 100 ㎍/㎖의 농도까지 100%에 가까운 세포 생존율을 나타내는 것을 확인하여 세포내에서의 항염증 활성 검증에는 안전한 농도 구간인 6.25, 12.5, 25, 50 ㎍/㎖을 사용하였다.

(2) 산화질소(NO) 저해 활성 측정

산화질소(NO) 측정은 세포 상층액에서 산화질소(NO)의 양을 아질산염(nitrite)과 질산염(nitrate)으로서 측정하였다. 아질산염에 대한 질산염으로 환원된 후의 안전한 형태인 griess 시약을 사용하였으며, 6 well plate에 2x10⁶ 개의 cell을 confluence가 80%일 때, PBS로 2번 세척한 후에 무혈청 배지를 사용하여 12시간 이상 배양시킨 다음, 지질다당류(LPS) 10 ㎍/㎖을 대조군을 뺀 모든 well에 다 넣어서 자극시켰다. 2시간 후에 시료를 농도별로 처리하였다. NO 생성량은 24시간 후에 상층액를 모아 griess 시약으로 10분간 반응시킨 후에 540 nm에서 흡광도로 측정하였다. LPS만 첨가한 군에서 생성된 NO의 양을 100%로 하여 시료가 첨가된 경우에 측정된 흡광도를 환산하였다. 양성 대조군으로 덱사메타존(Dexamethasone, Dexa)를 사용하였다.

도 8 및 도 9는 각각 오미자 잎 아세톤 추출물 및 오미자 잎 아세톤 추출물의 메탄올 분획물의 산화질소(NO) 저해 활성 측정 결과이다. 여기에서 보듯이, 오미자 70% 아세톤 추출물의 경우, 50㎍/㎖의 농도에서 55%의 우수한 저해능을 보였고, 분획물 'Fr.2'의 경우 50㎍/㎖의 농도에서 25%의 NO 저해능을 확인하였다.

(3) 프로스타글란딘(Prostaglandin) E₂ 저해 활성 측정

세포배양액 내의 프로스타글란딘(Prostaglandin E₂, PGE₂) 생성량은 ELISA kit를 이용하여 측정하였다. Raw 264.7 cell은 DMEM 배지를 이용하여 5x10⁴ cells/mL로 조절한 후 12 well plate에 접종하고, 5% CO₂ 인큐베이터에서 24시간 배양하였다. 세포에 1 ㎍/㎖의 LPS를 처리한 뒤 1시간 후에 5, 10, 25 ㎍/㎖의 복분자 씨앗 추출물을 처리하여 24시간 배양하였다. 배양이 끝난 후 상등액을 취하여 PGE₂를 측정하였다. 양성 대조군으로 덱사메타존(Dexamethasone, Dexa)를 사용하였다.

도 10 및 도 11은 각각 오미자 잎 아세톤 추출물 및 오미자 잎 아세톤 추출물의 메탄올 분획물의 프로스타글란딘(Prostaglandin) E₂ 저해 활성 측정 결과이다. 여기에서 보듯이, Raw 264.7 세포내에서 PGE₂의 저해 활성을 측정한 결과, 오미자 70% 아세톤 추출물에서는 50 ㎍/㎖의 농도에서 45%의 저해능을 보였고, 분획물 'Fr.2'에서는 50 ㎍/㎖의 농도에서 65%의 우수한 PGE₂저해 활성능을 나타내었다.

<시험예 4> 오미자 추출물의 색소침착 저해 활성 측정

(1) 세포 생존율 측정

세포 생존율 측정은 Carmichael 등의 방법에 따라 측정하였다. 인간 표피 멜라닌 세포(Human epidermal melanocyte, HEM)를 96 well plate에 5x10³cells/well이 되게 0.18ml 분주하고, 시료를 농도 별로 조제하여 0.02ml 첨가한 후 37℃, 5% CO₂ incubator에서 5일간 배양하였다. 5mg/ml 농도로 제조한 MTT 용액 0.02ml를 첨가하여 4시간 배양한 후 배양액을 제거하고 각 well당 DMSO 0.15ml를 가하여 실온에서 30분간 반응시킨 뒤 ELISA reader로 550nm에서 흡광도를 측정하였다.

도 12는 오미자 잎 아세톤 추출물 및 오미자 잎 아세톤 추출물의 메탄올 분획물의 인간 표피 멜라닌 세포(Human epidermal melanocyte, HEM)에 대한 생존율 측정 결과이다. 여기에서 보듯이, HEM 세포의 오미자 70% 아세톤 추출물 및 분획물'Fr.2'의 세포 생존율 측정 결과 25, 50, 100, 200 ㎍/㎖의 농도에서 80% 이상의 세포 생존율을 나타내는 것을 확인하여 세포내에서의 색소침착 저해 활성 검증 시에는 안전한 농도 구간인 25, 50, 100, 200 ㎍/㎖을 사용하였다.

(2) 색소침착 억제 시험

멜라닌 양은 '기능성화장품의 유효성평가를 위한 가이드라인I'의 방법을 사용하였다. 6-well plate에 well당 1x10⁵ 개로 접종하고 세포배양조건에서 24시간 배양하고, 배지 제거 후 세포를 PBS로 세척한 다음 추출물 (50, 100, 200 ㎍/㎖) 및 새로운 배지를 넣고 배양하였다. 회수된 세포는 혈구계수기를 이용하여 세포수를 측정한 다음 원심분리하여 상등액을 제거하고 펠렛을 얻었다. 이 펠렛에 1N 수산화나트륨용액 100 μL을 넣고 60℃ 항온수조에서 용해하여 원심분리한 다음 상층액을 가지고 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 실험군의 멜라닌 양은 대조군의 멜라닌 양에 대한 백분율로 계산하였다.

도 13은 오미자 잎 아세톤 추출물 및 오미자 잎 아세톤 추출물의 메탄올 분획물에 의한 멜라닌 양의 변화를 나타낸 그래프이다. 여기에서 보듯이, 분획물'Fr.2'의 경우, 50, 100 ㎍/㎖의 농도에서 오미자 잎 70% 아세톤 추출물보다 우수한 멜라닌 생합성 저해능을 확인하였다. 타이로시나제는 인체 내 멜라닌 생합성 경로에서 가장 중요한 초기 속도결정단계에 관여하는 효소이므로 오미자 잎 분획물'Fr.2'는 티로시나제 저해 활성에서도 유의적인 효과를 나타낼 것으로 예상된다.

(3) 티로시나제 저해 활성 측정 결과 및 TLC 체크 비교

분획물 'Fr.2'과'Fr.3'은 1000 ㎍/㎖ 농도에서 알부틴 대비 89% 이상 티로시나제 저해 효과를 확인하였다.

도 14는 오미자 잎 아세톤 추출물 및 오미자 잎 아세톤 추출물의 메탄올 분획물에 의한 티로시나제 저해효과 및 TLC 체크 비교한 결과이다. 여기에서 보듯이, 오미자 잎 아세톤 추출물(알부틴대비 71%)에서 분획물 'Fr.2', Fr.3'의 색소침착 효과가 증가함을 알 수 있었다.

(4) 웨스턴 블랏(Western blot)을 이용한 티로시나제 단백질 및 MITF 활성 검증

단백질 20μg을 10% SDS-PAGE로 분리하고 PVDF 멤브레인으로 400mV에서 2시간 전이시켰다. 이어서, 5% skim milk에서 1시간 방치한 뒤 일차 항체 티로시나제, MITF를 3% skim milk로 1:1000 희석하고 4℃에서 밤새 방치하였다. 다시 TBST로 세 번 세척한 뒤 이차 항체를 상온에서 1시간 반응 시킨 뒤 Fusion-Fx5 이미지 분석 장치를 이용하여 확인하였다.

도 15는 오미자 잎 아세톤 추출물 및 오미자 잎 아세톤 추출물의 메탄올 분획물의 웨스턴 블랏을 이용한 티로시나제 단백질 및 MITF 발현을 측정한 결과이다. 여기에서 보듯이, 티로시나제 단백질의 경우, 오미자 잎 분획물'Fr.2'처리하였을 때 시간이 지날수록 티로시나제의 활성이 감소되는 경향을 보였는데, 이는 세포가 분획물'Fr.2'을 up-take 하면서 양이 누적될수록 티로시나제의 유입을 점차 차단한 것으로 예상된다.

(5) 웨스턴 블랏을 이용한 MMP-1 단백질 활성 측정 결과

MMP-1의 단백질을 측정하였다. 단백질 15μg을 10% SDS-PAGE로 분리하고 PVDF 멤브레인으로 120 V에서 2시간 전이시켰다. 이어서 5% skim milk에서 1시간 방치한 뒤 일차 항체에서 4℃에서 밤새 방치하였다. 다시 TBST로 세 번 세척한 뒤 이차 항체를 상온에서 1시간 반응시킨 뒤 Fusion-Fx5 이미지 분석 장치를 이용하여 확인하였다.

도 16은 오미자 잎 아세톤 추출물 및 오미자 잎 아세톤 추출물의 메탄올 분획물의 웨스턴 블랏을 이용한 MMP-1 단백질 발현을 측정한 결과이다. 여기에서 보듯이, 오미자 잎 70% 아세톤 추출물과 분획물 'Fr.2'의 MMP-1 발현을 측정한 결과, 자외선을 조사하지 않은 조건에서는 오미자 잎 70% 아세톤 추출물의 MMP-1 단백질 발현 억제율이 우수한 반면, 자외선을 조사한 조건에서는 분획물'Fr.2'가 더욱 우수한 MMP-1 단백질 발현 억제율을 나타내었다.

(6) 실시간(RT)-PCR을 이용한 proCOL1A2 및 콜라겐의 측정 결과

CCD986-sk, HS68 세포주를 각각 6 well plate에 접종한 후 융합 배양하였다. 이후 오미자 추출물과 Fr.2를 각각 100 ug/mL 씩 처리하고 12 시간 배양한 뒤 세포를 회수하였다. RNA 추출과 cDNA 합성은 각각 Accuzol™(Bioneer, Korea)과 M-MLV 역전사효소(Bioneer, Korea)를 이용하여 제조사 프로토콜에 따라 수행하였으며, 콜라겐 유전자의 발현량을 확인하기 위한 RT-PCR은 하기 표 1에 나타낸 바와 같은 프라이머를 디자인하여 수행하였다.

Homo sapiens collagen type I alpha 1 chain (COL1A1), Type-I pro-collagen
전방향 프라이머	5′-GTT CGT GAC CGT GAC CTC G-3′(서열번호: 1)
역방향 프라이머	5′-TCT TGT CCT TGG GGT TCT TGC-3′(서열번호: 2)
Homo sapiens collagen type I alpha 2 chain (COL1A2), Collagen
전방향 프라이머	5'- CTG CAA GAA CAG CAT TGC AT-3′(서열번호: 3)
역방향 프라이머	5'- GGC GTG ATG GCT TAT TTG TT-3′(서열번호: 4)

도 17은 오미자 잎 아세톤 추출물 (A) 및 오미자 잎 아세톤 추출물의 메탄올 분획물(B)의 실시간(RT)-PCR을 이용한 proCOL1A2 및 콜라겐의 측정 결과이다. 여기에서 보듯이, 오미자 잎 추출물과 분획물'Fr.2'을 100ug/mL 농도로 처리하였을 때 콜라겐 발현량에는 큰 변화가 없었으나, Type-I pro-collagen 유전자에서는 오미자 잎 추출물이 0hr 대비 71% 정도 Type-I pro-collagen 발현량을 증가시켰다.

<110> SKYLAKE co.,ltd <120> A COMPOSITION FOR ANTI-OXIDATING, WHITENING, ANTI-WRINKLE OR ANTI-INFLAMMATION COMPRISING EXTRACTS OF OMIJA <130> PA-18-0288 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for Homo sapiens collagen type I alpha 1 chain <400> 1 gttcgtgacc gtgacctcg 19 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for Homo sapiens collagen type I alpha 1 chain <400> 2 tcttgtcctt ggggttcttg c 21 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for Homo sapiens collagen type I alpha 2 chain <400> 3 ctgcaagaac agcattgcat 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for Homo sapiens collagen type I alpha 2 chain <400> 4 ggcgtgatgg cttatttgtt 20

Claims

오미자 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 미백, 항주름 또는 항염증용 화장료 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 오미자는 오미자의 잎을 사용하는 것을 특징으로 하는 항산화, 미백, 항주름 또는 항염증용 화장료 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 오미자 추출물이 오미자 잎을 아세톤으로 추출하여 수득된 오미자 잎의 아세톤 추출물인 것을 특징으로 하는 항산화, 미백, 항주름 또는 항염증용 화장료 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 오미자 추출물이 오미자 잎을 아세톤으로 추출한 다음 메탄올을 용리액으로 사용하여 칼럼 크로마토그래피하여 수득된 오미자 잎 아세톤 추출물의 메탄올 분획물인 것을 특징으로 하는 항산화, 미백, 항주름 또는 항염증용 화장료 조성물.
오미자 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 미백, 항주름 또는 항염증용 식품 조성물.