KR20060121496A - 애기닥나무 추출물을 포함하는 미백용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 애기닥나무 추출물을 포함하는 미백용 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물은 피부미백 목적의 화장품, 의약품 및 식품에 사용될 수 있다.
애기닥나무, 추출물, 미백효과, 타이로시나제, 멜라닌,
Description
도 1은 마우스 유래 B-16 멜라노마에서 애기닥나무 추출물을 처리한 후 멜라닌 생성저해 정도를 꾸지나무 추출물과 비교하여 살펴본 결과이다.
본 발명은 애기닥나무 추출물을 포함하는 미백용 조성물에 관한 것이다.
멜라닌은 피부, 머리카락의 색을 결정하는 색소로, 멜라노사이트로부터 생성된 멜라닌은 피부 바깥쪽으로 이동하여 각질층에 분포한다. 자외선을 받으면 멜라노사이트의 수도 증가하고 멜라닌 생성량도 증가하여 색소침착, 기미, 주근깨의 원인이 된다. Becker 모반 (Becker's nevus), 흑자 (lentigines), 반문성모반 (Nevus spilus) 등의 질병 역시 표피 멜라닌의 과도한 침착에 의해 일어난다.
멜라닌은 타이로신이 복잡한 효소적, 비효소적 산화작용을 거쳐 만들어지는 복합체로 이 과정에서 타이로시나아제가 중추적인 역할을 하는 효소로 알려져 있다. 타이로시나아제는 구리와 결합한 금속단백질 효소로서, 동물, 식물, 미생물 및 사람 등에 넓게 분포되어 있고 타이로신(tyrosine)을 디하이드록시 페닐알라닌 (도파, dihydroxyl-L-phenylalanine, L-DOPA), 디하이드록시 페닐알라닌를 도파퀴논 (dopaquinone)으로 변환시키는 작용을 한다. 도파퀴논은 도파크롬(dopachrome)으로, 도파크롬은 디하이드로시인돌(dihydroxyindole)로 전환되고 디하이드로시인돌의 산화적 중합 최종적으로 멜라닌을 합성한다. 현재 널리 사용되는 대부분의 미백제는 타이로시나아제 저해제나 타이로시나아제 저해제를 함유한 물질로 알부틴 (arbutin), 하이드로퀴논 (hydroquinone), 하이드록시아니솔 (hydroxyanisole), 아스코빅산 (ascorbic acid) 유도체, 코지산 (kojic acid), 코티코스테로이드 (corticosteroids), 레티노이드 (retinoids) 등이 있으나, 일부 저해제는 돌연변이를 유발하여 발암 가능성이 있다는 연구결과가 보고되었으며 그 외에도 안전성과 경제성, 경피를 통한 흡수성 등의 문제점으로 사용에 있어서 어려움이 있다. 특히, 하이드록시아니솔 및 하이드로퀴논 등은 강력한 멜라닌 생성 저해활성을 가지지만 색소세포의 변성 또는 치사를 유발하고 세포 본래의 기능을 손상시키는 등의 부작용을 나타낸다. 또한, 코지산은 낮은 저해활성, 사용중의 변색, 물질자체의 불안정성 등의 문제점이 있다. 이와 같이, 지금까지 많은 타이로시나아제 저해제가 개발되어 사용되고 있지만, 여러 가지 문제점이 있기 때문에, 강한 저해 활성을 지니며 안정성 및 경제성이 모두 보장되는 저해제의 개발이 여전히 요구되고 있다.
이와 같은 기존 미백물질들의 한계점과 문제점을 극복하고 보다 우수한 원료 물질을 찾고자 하는 연구의 일환으로 미리 안정성이 입증되어 있는 천연물 중에서 유효물질을 검색하고자 하였다. 이런 연구의 일환으로 본 발명자는, 닥나무속에 속하는 애기닥나무를 대상으로 미백효과를 살펴보았다.
대한민국 특허 제70284호는 닥나무(Broussonetia kazinoki Sieb) 또는 꾸지나무 (Broussonetia papyrifera Vent) 추출물의 미백효과에 대하여 기술하고 있다. 그러나, 본 발명 이전 닥나무속에 속하는 애기닥나무 (Broussonetia kazinoki var. humilis)의 미백효과에 대해서는 기술된 바가 없었으며, 이러한 배경 하에서, 본 발명자는 애기닥나무(Broussonetia kazinoki var. humilis)가 미백효과를 가지며 닥나무 및 꾸지나무에 비해 월등한 미백효과를 제공한다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 애기닥나무 추출물을 포함하는 미백용 조성물을 제공하는 것이다.
하나의 양태로서, 본 발명은 애기닥나무 추출물을 포함하는 미백용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 용어, " 미백(whitening)" 은 기본 피부 색조(tone)의 전체적인 미백, 즉 노화 반점, 흑피증, 간반(기미), 주근깨, 염증후 과색소침착 또는 일광으 로 야기된 색소침착 결점을 비롯한 과색소침착 장애의 미백을 포함하여 피부중의 멜라닌을 감소 또는 개선시키는 모든 것을 의미한다.
본 발명에서 용어, “추출물(extract)"은 천연물로부터 분리된 활성성분, 여기서는 애기닥나무로부터 분리된 미백효과를 보이는 물질을 의미하며, 물, 유기용매, 또는 이들의 혼합용매를 이용하는 추출과정으로 제조되며, 물, 유기용매, 또는 이들의 혼합용매의 추출액, 이의 건조 분말 또는 이를 이용하여 제형화된 모든 형태를 포함한다.
본 발명에서 용어, “애기닥나무(Broussonetia kazinoki var. humilis)"란 천연, 잡종 및 변종의 모든 애기닥나무를 모두 포함하고, 바람직하게는 한국에서 자생하는 천연 애기닥나무에 관한 것이다. 애기닥나무 (Broussonetia kazinoki var. humilis)는 줄기가 가늘고 덩굴성 비슷하며 1m쯤 자라고, 잎의 길이 5~8cm, 葉柄의 길이 5mm, 열매의 지름이 6~7mm로서 위봉산, 내장산, 울릉도 및 완도에 자란다. 애기닥나무의 어린 가지와 잎은 한방에서 구피마(構皮麻)라 하며 풍습으로 인한 사지마비동통, 타박상에 유효하며, 신체가 허약해서 몸이 붓거나 피부염이 있을 때에도 사용하였다. 본 발명의 목적상 애기닥나무 추출물은 이의 모든 기관, 예를 들어, 잎, 꽃, 줄기, 가지 및/또는 뿌리의 추출물을 모두 의미하나, 바람직하게는 줄기 및/또는 잎의 추출물을 의미한다. 닥나무 속에 속하는 꾸지나무 및 닥나무가 미백효과를 갖는다는 것이 알려진 바 있다. 그러나, 천연 추출물에 있어, 같은 속에 속하는 다른 종의 식물이 유사한 효과를 갖는다고 유추할 수 없으며, 이는 동일종의 식물 추출물이 부위별로 상이한 약효를 나타내어 부위별로 다른 용도 로 이용될 수 있다는 것으로부터 확인할 수 있다. 본 발명 이전, 애기닥나무의 미백효과에 대해서는 알려진 바가 없었으며, 본 발명자는 애기닥나무의 미백 효과에 대해서, 타이로시나아제 활성을 억제하는 정도, 엘-도파의 자동 산화를 저해하는 정도, 멜라능 생성을 억제하는 정도로 살펴보고, 이를 꾸지나무, 닥나무와 비교 분석한 결과, 애기닥나무 추출물의 미백효과가 꾸지나무 및 닥나무보다 월등히 우수한 효과를 나타냄을 확인하였다. 하나의 예시로서, 표 3에서 나타난 바와 같이 첨가농도 333.33㎍/㎖에서 엘-도파 자동산화 정해능이 애기닥나무의 잎 추출물이 70.49%, 줄기 추출물이 98.03%, 꾸지나무 잎 추출물이 71.3%, 줄기 추출물이 90.95%, 닥나무 잎 추출물이 45.27%, 줄기 추출물이 86.49%로 애기 닥나무 추출물의 효과가 우수하였으며, 특히 666.67㎍/㎖에서 애기닥나무의 줄기 추출물은 100% 저해능을 나타내었다. 또한, 표 1에 나타난 바와 같이, 애기닥나무 줄기 추출물은 333.33㎍/㎖ 농도에서 타이로시나아제에 대해서도 100% 저해 활성을 보였으며, 이 때 꾸지나무 수피의 추출물은 84.43% 저해효과를 보일 뿐이다. 이러한 결과는 본 발명에서 사용한 애기닥나무 추출물의 우수한 미백효과를 입증한다. 애지닥나무의 잎 및 줄기 추출물은 모두 우수한 미백효과를 나타내었으며, 특히 줄기 추출물의 미백효과가 뛰어났다.
본 발명에서 애기닥나무 추출물은 애기닥나무의 잎 및/또는 줄기를 분쇄하는 공정; 용매로 추출하는 공정; 및 여과액을 농축하는 공정을 포함하는 방법으로 제조된다. 상기 제조방법은 농축된 여과액을 건조시키는 공정을 추가로 포함할 수 있다.
용매는 물 또는 유기용매를 사용할 수 있다. 유기용매를 사용하여 추출하는 경우, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, N, N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합용매인 유기용매를 사용하며 생약의 유효 성분이 파괴되지 않거나 최소화된 조건에서 실온 또는 가온하여 추출할 수 있다. 추출하는 유기용매에 따라 약제의 유효성분의 추출정도와 손실정도가 차이가 날 수 있으므로, 알맞은 유기용매를 선택하여 사용하도록 한다.
여과는 추출액으로부터 부유하는 고체 입자를 제거하는 과정으로, 면, 나일론 등을 이용하여 입자를 걸러내거나 한외여과, 냉동여과법, 원심분리법 등을 사용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 또한, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 크로마토그래피)에 의한 분리 과정을 추가로 포함할 수 있다.
여액을 건조하는 단계는 동결건조, 진공건조, 열풍건조, 분무건조, 감압건조, 포말건조, 고주파건조, 적외선건조 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 경우에 따라, 최종 건조된 추출물을 분쇄하는 공정을 추가할 수 있다.
바람직하게는, 20℃ 내지 60℃에서 애기닥나무 잎 및/또는 줄기를 물과 알코올 혼합용액을 이용하여 1일 내지 5일 동안 추출하고, 이를 1회 내지 3회 수행한 뒤 60℃ 이하 온도에서 농축하도록 한다. 본 발명의 구체적인 양태에서는, 건조된 애기닥나무의 잎 및/또는 줄기를 분쇄하고 95% 에탄올 수용액을 첨가하여 45℃에서 3일간 1회 추출한 뒤, 증류 장치로 45 내지 50℃ 이하에서 감압 농축하여 애기닥나무 추출물을 얻었다.
본 발명의 애기닥나무 추출물을 포함하는 미백용 조성물은 미백용 화장품, 의약품, 식품 등에 응용할 수 있으며, 경구용(내용) 또는 비경구용(외용)의 형태를 취할 수 있다.
경구용의 경우, 예를 들어 의약품 또는 식품 등의 형태로 제형화할 수 있다. 비경구용(외용)의 경우, 화장품, 의약외용품 등, 예를 들어, 미용액, 비누, 피부접착용 패치, 피부점착용 젤 등의 형태로 조제할 수 있다. 비경구용 조성물은 대부분 국소적용 제제로 제조될 수 있다. “국소적용"은 외부 피부상에 직접 도포하거나 바르는 것을 의미한다. 이들 각 제형은 당업계에 주지된 각종의 통상적인 담체와 첨가제를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은, 보다 바람직하게는 미백화장품으로 제형화된다. 이러한 미백 화장품은 피부에 과도하게 발생하는 멜라닌의 침착을 방지할 목적으로 유연화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 팩, 파우더 등의 통상의 화장품 형태로 제조할 수 있다. 일반 피부화장료에 배합되는 사용되는 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급 알콜, 증점제, 킬레이트제, 색소, 기제, 부형제, 안정제, 안료, 향료, 산화방지제, 방부제 등과 배합할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제공한다. 그러나 하기 의 실시예는 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 본 발명이 하기의 실시예에 의하여 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 애기닥나무, 닥나무 및 꾸지나무 추출물의 제조
애기닥나무 잎과 줄기를 물에 깨끗이 씻은 후 그늘에서 건조하여 얻어진 애기닥나무(1 kg)를 분쇄하고, 이 분쇄물에 95% 에탄올 5 ℓ를 부가한 다음, 냉각콘덴서가 부착된 추출기에서 3일 동안 45℃에서 가열하여 추출하였다. 추출물을 350 메쉬 여과포로 여과한 다음 와트만 2번 여과지로 여과하고, 냉각콘덴서가 달린 증류장치로 45-50℃ 온도에서 감압농축하여 건조중량 150g의 추출물을 얻었다. 닥나무, 꾸지나무 추출물 역시 같은 방법으로 얻었다.
실시예 2: 애기닥나무 및 꾸지나무 추출물의 타이로시나아제 활성 억제능 시험
우선, 기질인 티로신을 0.1M 인산나트륨 완충용액 (pH 6.5)에 용해하여 1.5mM의 기질용액을 준비하였다. 실시예 1의 방법으로 제조한 애기닥나무 추출물을 DMSO에 녹인 후 다시 완충용액에 희석하여 최종농도 16.67, 33.34, 66.67, 166.67, 333.33, 666.67㎍/㎖이 되도록 준비하였다. 이어, 기질용액 40㎕를 시험관에 넣은 다음, 추출물 시료액 20㎕를 가하고 완충액 220㎕를 가하였다. 여기에 버섯류로부터 추출한 40유닛(unit) 타이로시나아제 용액 (Sigma, 미합중국)을 가하여 37℃ 항온조에서 10분간 반응시킨 후, 상기 반응액을 포함하는 시험관을 얼음 위에 놓아 급냉시켜 반응을 중지시키고, 분광광도계로 475 nm에서 흡광도를 측정하여 하기 수학식 1에 따라 타이로시나아제 활성 저해율을 계산하였다. 그 결과는 표 1에 나타나 있다. 애기닥나무 추출물 대신에 완충용액 20㎕를 사용한 것을 대조군으로 하였다. 양성대조군은 기존의 미백제인 알부틴 또는 아스코르빌산을 사용하였다.
a : 공시료액의 반응 후의 흡광도
b : 시료액의 반응 후의 흡광도
a', b' : 타이로시나제 대신 완충액으로 대체하여 측정한 흡광도
상기 표 1에서 알 수 있는 바와 같이, 첨가한 애기닥나무 추출물의 양이 증가할수록 타이로시나아제 활성도 억제되었다. 닥나무 속 중 꾸지나무 추출물의 타이로시나아제 활성 억제 효과를 애기닥나무와 비교 분석해본 결과, 꾸지나무의 잎 추출물이 333.33㎍/㎖에서 타이로시나아제 저해효과가 48.42%인 데 비해, 애기닥나무의 잎 추출물은 62.97%로 같은 농도의 꾸지나무 잎 추출물보다 억제 효과가 더 우수하였다. 또한, 줄기 추출물의 경우 거의 모든 농도에서 꾸지나무보다 애기닥나무 추출물의 저해효과가 높았다. 타이로시나아제 활성을 50% 저해하는 IC50 값을 살펴본 결과, 애기닥나무 줄기 추출물은 55.96㎍/㎖로 알부틴의 48.35㎍/㎖, 아스코르빌산의 69.77㎍/㎖과 비교할 때 억제 효과는 우수하다 할 수 있으며, 특히, 꾸지나무 줄기추출물의 IC50 값 81.04㎍/㎖과 비교할 경우, 그 활성이 매우 높았다(표 2).
실시예 3: 애기닥나무, 꾸지나무 및 닥나무 추출물의 엘-도파의 자동산화에 대한 저해능 시험
멜라닌 합성과정의 속도결정 단계를 촉매하는 타이로시나아제의 DOPA 산화반응에 대한 애기닥나무 추출물의 활성저해를 측정하여 애기닥나무 추출물의 미백효과를 평가하였다. 실시예 1의 방법으로 제조한 애기닥나무 추출물을 DMSO에 녹인 후 다시 0.1M 인산나트륨 완충용액(pH 6.5)에 희석하여 최종농도 16.67, 33.34, 66.67, 166.67, 333.33, 666.67㎍/㎖이 되도록 준비한 것을 시료액으로 하였다. 시험관에 0.1M 인산염완충액(pH 7.0) 850 ㎕와 시료액 50 ㎕ 그리고 머쉬룸 타이로시나아제(1500~2,000) U/㎖ 용액 50 ㎕를 순서대로 넣고 10 mM이 되도록 L-DOPA (L-3,4-dihydroxyphenylalanine)액을 넣은 다음 37℃에서 15분 동안 반응시키고 실험 종료 후 마이크로플레이트 리더를 이용하여 475 nm에서 흡광도를 측정하였다. 하기 수학식 2에 따라 DOPA 산화활성 저해율을 계산하였으며 결과를 표 3에 나타내었다.
a : 공시료액의 반응 흡광도
b : 시료액의 반응 흡광도
표 3에서 알 수 있는 바와 같이, 첨가되는 애기닥나무 추출물의 양이 증가할수록 타이로시나아제 활성이 억제되었으며, 줄기 추출물의 경우 666.67㎍/㎖ 첨가한 군에서는 엘-도파의 자동산화를 거의 100% 억제하였다. 꾸지나무 추출물과 닥나무 추출물 역시 엘-도파 자동산화 효과를 보이나, 잎 추출물, 줄기 추출물 모두 거의 모든 시험농도에서 같은 농도의 애기닥나무 추출물보다는 엘-도파 자동산화 저해효과가 낮은 것으로 나타났다. 기존의 미백제로 널리 사용되는 알부틴의 엘-도파 자동산화 저해활성을 살펴보았을 때, 역시 애기닥나무 추출물의 저해활성이 알부틴보다 우수한 것으로 나타났다. 표 4에서 처럼 엘-도파의 자동산화를 50% 저해하는 애기닥나무 추출물의 농도는 12.99㎍/㎖로 기존 미백제인 알부틴이 76.00㎍/㎖, 닥나무 속의 식물인 꾸지나무 수피 30.26㎍/㎖과 비교해볼 때 애기닥나무 추출물의 엘-도파 자동산화 억제 효과는 매우 우수하였다.
실시예 4: 멜라닌 생성 억제능 시험
25 ㎠ T-플라스크에 DMEM 배지 5-6 ㎖를 넣은 후, 동결보관중인 마우스 유래 B-16 멜라노마 (KCLB 80008) 세포주를 접종하여 37℃, 5% CO2 조건 하에서 24시간 동안 배양한 다음, 0.02% EDTA가 함유된 0.05% 트립신을 처리하여 세포를 분리한 후, 6-웰 플레이트에 웰당 1×105 개로 접종한 후 세포가 웰 바닥에 약 80% 이상 부착될 때까지 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 DMSO에 녹인 애기닥나무 시료액이 최종농도 0.5, 5, 50㎍/㎖로 희석된 배지로 교체한 후 5% CO2, 37 ℃하에서 3일간 배양하였다. 3일 후, 배지를 제거한 세포를 PBS(phosphated buffer saline)로 세척하고, 이를 트립신으로 처리하여 세포를 회수하고 5,000 rpm으로 10분간 원심분리한 다음 상등액을 제거하여 펠렛(pellet)을 얻었다. 세포 펠렛은 60℃에서 2시간 동안 건조한 후 10% DMSO가 함유된 1M 수산화나트륨액 100 ㎕ 에 녹인 후 마이크로플레이트 리더로 490 nm에서 흡광도를 측정하여 세포 단백질당 멜라닌양을 구하였다. 합성 멜라닌(Sigma, 미합중국)을 10% DMSO가 함유된 1M 수산화나트륨액 100 ㎕에 여러 농도로 녹여 이로부터 표준농도 곡선을 얻어 멜라닌의 농도를 결정하였다. 이 값을 통해 애기닥나무 추출물의 멜라닌 생성 억제율을 나타내었다.
결과는 도 1과 같다. 애기닥나무 추출물을 최종 농도 50㎍/㎖ 되도록 마우스 유래 B-16 멜라노마 배양액에 첨가했을 때 생성된 멜라닌의 양은 애기닥나무 추출물을 처리하지 않은 대조군보다 현저히 감소하였으며 생성된 멜라닌 양을 처리하지 않은 대조군이나 용매인 DMSO만 처리한 군을 100%로 하였을 때, 애기닥나무의 잎 추출물을 처리하였을 때 생성된 멜라닌은 58.22%, 줄기 추출물은 62.12%로, 애기닥나무 잎 및 줄기 추출물은 우수한 미백제로 작용함을 알 수 있었다. 기존 미백제로 많이 사용되는 알부틴을 272.3㎍/㎖을 처리할 경우, 멜라닌 생성양은 대조군의 멜라닌 생성양의 65.7% 수준이었다. 닥나무속 식물인 꾸지나무의 잎 추출물을 처리할 경우 대조군의 77.12% 수준, 줄기 추출물을 처리할 경우 대조군의 80.33% 수준으로 멜라닌이 생성되었다. 이를 통하여, 애기닥나무 잎 및 줄기 추출물 모두 멜라닌 생성 억제 효과가 알부틴 및 꾸지나무 추출물보다 우수한 미백효과를 가진다는 것을 확인하였다.
본 발명의 애기닥나무 추출물을 포함하는 조성물은 피부 미백 목적의 화장품, 의약품 및 식품에 사용될 수 있다.
Claims (3)
- 애기닥나무(Broussonetia kazinoki var. humilis) 추출물을 포함하는 미백용 조성물.
- 제 1항에 있어서, 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매를 이용하여 추출한 조성물.
- 제1항의 조성물을 포함하는 미백용 화장품.
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