KR102642545B1 - 새싹삼 발효물을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 및 탄력 개선용 조성물 - Google Patents
새싹삼 발효물을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 및 탄력 개선용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 새싹삼 발효물의 유효성분을 통한 피부 주름 및 탄력 개선용 조성물과 이를 포함하는 화장료 및 식품 조성물에 관한 것으로서, 구체적으로는 새싹삼 추출물을 발효하여 유효성분인 진세노사이드 R1, Rh1, Rd, Rg3 및 Rk1의 함량이 현저히 증가한 조성물 및 이를 이용한 화장료 및 식품 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명 조성물은 발효 과정을 통해 유효성분의 함유량이 현저히 증가함으로써, 기존에 알려진 인삼잎의 미백 효능 대비 8~9배 효과를 나타내는 우수한 효과를 보일 뿐 아니라, 콜라겐 합성촉진 효과를 동시에 가져 우수한 피부 주름개선 및 탄력개선 효과를 나타낸다.
Description
본 발명은 새싹삼 발효물을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 및 탄력 개선용 조성물과 이를 포함하는 화장료 및 식품 조성물에 관한 것으로서, 구체적으로는 새싹삼 추출물을 발효하여 유효성분인 진세노사이드 R1, Rh1, Rd, Rg3 및 Rk1의 함량이 현저히 증가한 조성물 및 이를 이용한 화장료 및 식품 조성물에 관한 것이다.
최근 뷰티 시장이 다양화되고 있으며, 다기능의 화장품 출시와 더불어 내면적인 아름다움을 추구하는 이너뷰티 트렌드가 점차 확산되면서 미래의 성장뷰티 시장을 예고하는 이른바 먹는 화장품, 이너뷰티 브랜드 시대가 열리고 있다.
이너뷰티는 내면의(inner) 아름다움(beauty)을 뜻하며, 화장품을 바르는 등 인위적인 방법으로 피부 표면만을 일시적으로 좋게 만드는 것이 아니라, '식습관'과 '생활습관'을 통해 피부 속 건강을 챙겨 피부 자체를 좋게 한다는 의미로, 아름답기를 소망하는 사람들의 욕망이 커지면서 먹는 화장품이라 불리는 이너뷰티에 대한 관심이 증가하고 있는 실정이다.
한편, 이너뷰티와 관련된 선행기술로서, 한국 공개특허 제10-2015-0016648호에 '천연 식물발효물질을 유효성분으로 하는 화장료 조성물 및 그의 제조방법'등이 개시되어 있다.
그러나 위와 같은 기술은 섭취 가능한 화장품으로서 최근 트렌드에 부합되는 경향은 보이지만, 인체 피부에 직접 도포하는 화장품에 비해 주름개선, 미백효과와 같은 기능성이 미흡하다는 한계점이 존재하였다.
한편, 인삼(Panax ginseng)은 한의학뿐만 아니라 민간요법으로 널리 알려져 사용되어온 오가피(Araliaceae)과의 인삼 속의 한방약제이다. 인삼의 유효성분인 사포닌은 우수한 항산화 활성을 갖는 것으로 잘 알려져 있다. 이에 따라, 새싹삼(ginseng sprouts)에 대한 관심도 증폭되고 있다.
새싹삼의 피부 미백 기능성에 대해서는 공지된 바 있으나, 피부 주름개선 효과와 미백 효과를 동시에 나타내면서도, 기존 대비 현저히 높은 유효성분 함유를 나타내는 새싹삼 발효물과 관련되어서는 아직 공지된 바가 없다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 독성이 없고, 피부 미백 효과 및 피부 주름개선 효과가 우수한 천연 자원에 관하여 연구함으로써, 본 발명의 조성물을 완성하기에 이르렀다.
본 발명은 새싹삼(Panax ginseng) 발효물을 유효성분으로 포함하는, 피부 주름 및 탄력 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 또 다른 목적은, 새싹삼 발효물을 유효성분으로 포함하는, 피부 주름 및 탄력 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
삭제
상기 과제를 해결하기 위한 하나의 구현예로서, 본 발명은 새싹삼(Panax ginseng) 발효물을 유효성분으로 포함하는, 피부 주름 및 탄력 개선용 조성물을 제공한다.
상기 새싹삼은 2년생 미만의 인삼을 싹이 틔워진 새싹을 의미하며, 예를 들어, 싹이 튼 후 15일 내지 20일 사이에 수확된 어린 새싹삼을 의미할 수 있다.
본 발명의 새싹삼은 스마트팜에서 재배함으로써, 재배 중에 농약이 사용되지 않아, 피부에 직접 접촉되거나 섭취해야 하는 화장료 조성물, 약학적 조성물, 식품 조성물, 의약 외품 조성물 등에 독성이나 부작용 없이 사용할 수 있어 활용도가 높은 이점이 있다.
특히, 최근에는 도시형 스마트팜 등에서 완전한 무공해로 재배되는 경우가 증가하여 식품 및 화장품으로서의 활용가치가 높아지고 있다.
용어 “발효”는 원료를 탄소/질소 비율, 산소, 수분, 균주 등과 같은 특정 환경에 장시간 배양하여 상기 원료로부터 유효 성분이 증가되거나 대사산물이 생기는 것을 의미할 수 있다. 상기 발효는 원료인 새싹삼(Panax ginseng) 추출물과 함께, 정제수 또는 특정 배지에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 새싹삼(Panax ginseng) 추출물은 락토오스, 유산균 또는 이들의 혼합물이 포함된 MRS 배지에서 수행될 수 있다. 상기 발효는, 1일 내지 30일, 1일 내지 20일, 1일 내지 15일, 1일 내지 10일, 또는 3일 내지 10일 동안 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 발효는 적절한 농도의 원료를 사용하여, 발효에 의한 유효 성분 추출을 촉진시킬 수 있다. 발효에 적용되는 원료의 농도는 예를 들어, 10 내지 100 brix, 15 내지 80 brix, 또는 25 내지 65 brix일 수 있다.
일 구현 예에서, 상기 발효는 새싹삼 추출물을 유산균과 함께 발효하는 것일 수 있다. 유산균은 새싹삼 추출물을 원료로 생물학적 합성 및 분해 반응을 일으키면서 유효성분을 생산하고, 배양액의 염, 산도 등과 같은 환경을 변화시켜 2차 화학 반응을 유발하거나 새싹삼, 새싹삼 추출물 또는 이의 분획물로부터 유효성분의 용출을 촉진시킨다. 따라서, 이러한 과정을 거쳐 생산된 새싹삼 발효물 또는 이의 분획물은 새싹삼 자체나 이의 추출물에서는 얻을 수 없는 다양한 유효성분을 다량 함유하고 있다.
상기 유산균은 통상적으로 알려진 것으로서, 예를 들어, 락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 람노서스 (Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) 또는 이의 조합일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일 구현예에서, 상기 유산균은 락토바실러스 카제이 및 락토바실러스 펜토서스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 유산균은 생물자원센터(ATCC) 등 분양기관에서 쉽게 입수 가능하다.
일 구현예에서, 상기 유산균은 인삼, 인삼 뿌리, 새싹삼 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 배지에서 배양된 것일 수 있다. 유산균은 새싹삼 추출물의 발효에도 사용되지만, 상기 유산균이 인삼 뿌리 추출물 및 새싹삼 추출물이 존재하는 환경에서 성장하는 경우, 발효에 보다 최적화된 특성을 갖고 유효한 밀도로 증식이 가능하여 새싹삼 추출물을 효과적으로 발효시킬 수 있다.
일 구현예에서, 상기 피부 주름 및 탄력 개선용 조성물은 최종적으로 유산균을 포함하지 않는다. 유효성분을 생산 또는 추출하기 위해, 유산균으로 발효시키는 것이 필요하지만, 최종 산물에 잔류하는 경우 보존성이 떨어지고, 의도치 않은 추가 발효 또는 부패가 발생하여 최종 제품의 품질이 떨어지거나 효과가 감소할 수 있다. 따라서, 최종 제품에는 유산균이 제거되도록 처리될 수 있다.
상기 “추출물”은 새싹삼의 추출처리에 의해 수득되는 추출액, 이의 희석액, 농축액, 건조물, 정제물, 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 추출방법은 특별히 제한되지 않고, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법, 예를 들어, 열수 추출법, 초음파 추출법, 여과법, 환류 추출, 또는 이의 조합의 방법을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 새싹삼 추출물 또는 이의 분획물은, 새싹삼을 물, C1 내지 C4의 알코올, 글리세린, 에틸아세테이트, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디클로로메탄, 클로로포름, 에틸에테르, 부틸렌글리콜, 헥산, 벤젠, 페트로륨 에테르로 이루어진 군에서 선택되는 1 종 이상의 용매로 추출하여 수득한 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 새싹삼추출물 또는 이의 분획물은 새싹삼을 물 및 C1 내지 C4의 알코올의 혼합물로 추출한 것일 수 있다. 추출용매의 농도는, 새싹삼의 유효성분이 용출되어 나올 수 있도록 하는데 매우 중요할 수 있고, 이러한 농도는 예를 들어, 20 내지 60 v/v%, 25 내지 60 v/v%, 30 내지 60 v/v%, 또는 40 내지 60 v/v% 알코올 수용액일 수 있고, 상기 알코올은 구체적으로 에탄올일 수 있다.
본 발명 일 실시예에서는 새싹삼의 10 내지 12배의 50%에탄올을 가하여 80℃에서 2회 환류추출하여 수득하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
용어 “분획물”은 여러 다양한 구성 성분을 포함하는 혼합물 형태의 추출물 또는 발효물로부터 특정 성분 또는 특정 성분 그룹을 분리하기 위하여 수행된 결과물을 의미할 수 있다. 분획물을 얻는 방법은 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법, 예를 들어, 용매 구배에 따른 분획, 특정 용매 구성에 따른 분획에 의해 수행될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 분획물을 얻는데 사용될 수 있는 용매는 예를 들어, 물, 증류수, 알코올 등의 극성 용매; 헥산(Hexane), 에틸 아세테이트(Ethyl acetate), 클로로포름(Chloroform), 디클로로메탄(Dichloromethane) 등의 비극성 용매; 또는 이들의 조합이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 새싹삼 발효물 또는 이의 분획물은 곧바로 사용되지 않고, 추가적으로 추출과정을 거쳐 생산된 것일 수 있다. 발효물은 균주, 균주 배양을 위한 배지, 영양 성분 등과 같은 발효에 기원한 성분 외에 다양한 부수적인 성분을 포함할 수 있다. 따라서, 발효물을 추가적으로 추출함으로써 피부나 인체 내에 직접 적용되는 조성물의 안전성을 높이고, 발효물로부터 수득된 유효 성분의 정제도, 농도 등을 높여 조성물의 효과를 보다 증대시킬 수 있다. 상기 새싹삼 발효물 또는 이의 분획물을 추가적으로 추출하는 방법은, 기존의 새싹삼을 추출할 때 사용한 방법과 유사한 방법을 적용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 상기 새싹삼 발효물 또는 이의 분획물은, 새싹삼, 새싹삼 추출물 또는 이의 분획물을 1차 발효한 후, 상기 1차 발효물을 물, C1 내지 C4의 알코올, 글리세린, 에틸아세테이트, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디클로로메탄, 클로로포름, 에틸에테르, 부틸렌글리콜, 헥산, 벤젠, 페트로륨 에테르로 이루어진 군에서 선택되는 1 종 이상의 용매로 추출하여 수득한 것일 수 있다. 일 구현예에서, 상기 1차 발효물의 추출은 물 및 C1 내지 C4의 알코올의 혼합물, 예를 들어, 20 내지 60 v/v%, 25 내지 60 v/v%, 30 내지 60 v/v%, 또는 40 내지 60 v/v% 알코올 수용액으로 추출하는 것일 수 있고, 상기 알코올은 구체적으로 에탄올일 수 있다.
본 발명의 피부 주름개선 및 미백용 조성물은 멜라닌형성세포의 세포 내에 멜라닌 생성을 차단할 뿐 아니라, 세포 밖으로 멜라닌 색소가 유리되는 것을 차단시킴으로써 미백 기능을 수행할 수 있다.
구체적으로, 본 발명 실험예에서는 사람 멜라닌 세포를 대상으로 본 발명 조성물을 처리하고, 멜라닌 합성 저해 및 티로시나아제 활성 억제 효과를 확인하였다.
나아가, 본 발명 조성물은 피부 섬유아세포(fibroblast)주를 대상으로 한 실험결과, 8~10%의 농도로 처리한 모든 시험군에서 160%이상의 콜라겐 증가율을 보여 우수한 피부 주름 및 탄력 개선 효과를 확인하였다.
상기 화장료 조성물은, 새싹삼 발효물 또는 이의 분획물을, 0.01 w/v% 내지 10 w/v%, 0.05 w/v% 내지 5 w/v%, 또는 0.1 w/v% 내지 2 w/v% 농도로 포함하는 것일 수 있다. 상기 농도 보다 낮으면 유효한 미백 효과를 얻기 어렵고, 상기 농도 범위를 초과하면 세포독성으로 인체에 적용하기에 부적합할 수 있다.
상기 화장료 조성물은, 용액, 외용 연고, 크림, 폼, 영양 화장수, 유연 화장수, 팩, 유연수, 유액, 메이크업 베이스, 에센스, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선 스크린 크림, 선 오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면 활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패취 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 화장료 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면 유분, 물, 계면 활성제, 보습제, 저급 알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 화장품학적으로 허용 가능한 담체는 화장료 조성물의 제형에 따라 다양할 수 있으나, 예를 들어, 상기 제형이 연고, 페이스트, 크림 또는 젤인 경우에는, 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화 아연, 또는 이들의 조합이 이용될 수 있고; 상기 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 또는 이들의 조합, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로하드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 더 포함할 수 있고; 상기 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 용매, 용해화제, 유탁화제 등, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일 등이 이용될 수 있고, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종오일, 올리브 오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜, 소르비탄의 지방산 에스테르 또는 이들의 조합이 이용될 수 있고; 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타하이드록시드, 벤토나이트, 아가, 트라칸트 또는 이들의 조합이 이용될 수 있고, 상기 제형이 비누인 경우에는, 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속 염, 지방산 헤미에스테르 염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알코올, 식물성 유, 글리세롤, 당 또는 이들의 조합이 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
다른 구현예에서, 상기 새싹삼 발효물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 조성물은, 식품 조성물로서 제공될 수 있다.
상기 "식품"은 건강기능식품 조성물을 포함하는 것이 수 있다. 상기 건강기능식품 조성물은 식품 첨가물로서 사용될 수 있다. 상기 식품의 종류는 예를 들어, 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 또는 비타민 복합제가 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 식품이 음료인 경우, 향미제 또는 포도당, 과당, 말토스, 수크로오스, 덱스트린, 사이클로덱스트린, 사카린, 아스파탐과 같은 감미제를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 건강기능식품 조성물은, 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
본 발명의 새싹삼 발효물을 유효성분으로 함유하는 조성물은 피부 섬유아세포에서의 콜라겐 합성량을 현저히 증가시켜 피부 주름 밀 탄력 개선 효과를 갖는다. 또한, 상기 새싹삼 발효물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 조성물은 멜라닌형성세포의 멜라닌 생성량 감소 및 티로시나아제 활성 억제 효과를 나타내어 피부 미백에 우수한 효과를 갖는다. 이러한 조성물의 효능을 이용하여, 피부 미용, 건강기능식품, 색소침착 피부 질환 예방 또는 치료용 조성물로서 다양하게 적용할 수 있다. 또한, 본 발명의 발효 방법을 이용함으로써 새싹삼의 유효성분 함량을 현저히 높일 수 있고, 세포 독성과 같은 부작용은 적은 조성물을 효과적으로 제조할 수 있다. 본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
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도 1은 새싹삼의 발효 전, 후의 chromatogram 비교 데이터를 그래프로 도시한 것이다.
도 2는 새싹삼의 발효 전, 후 증가하는 대사체의 비교 막대그래프를 도시한 것이다.
도 3은 새싹삼의 발효 전, 후 증가하는 대사체로 선정된 Ginsenoside 5종에 대한 발효 전 후의 비교 분석 크로마토그램을 도시한 것이다.
도 4는 본 발명 새싹삼 발효물을 처리한 경우의 세포독성(MTT-assay) 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명 새싹삼 발효물을 처리한 경우의 멜라닌 합성 저해 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명 새싹삼 발효물을 처리한 경우의 티로시나아제 활성 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명 새싹삼 발효물을 처리한 경우의 색소침착 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명 새싹삼 발효물을 처리한 경우의 콜라겐 합성 증가 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 새싹삼의 발효 전, 후 증가하는 대사체의 비교 막대그래프를 도시한 것이다.
도 3은 새싹삼의 발효 전, 후 증가하는 대사체로 선정된 Ginsenoside 5종에 대한 발효 전 후의 비교 분석 크로마토그램을 도시한 것이다.
도 4는 본 발명 새싹삼 발효물을 처리한 경우의 세포독성(MTT-assay) 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명 새싹삼 발효물을 처리한 경우의 멜라닌 합성 저해 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명 새싹삼 발효물을 처리한 경우의 티로시나아제 활성 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명 새싹삼 발효물을 처리한 경우의 색소침착 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명 새싹삼 발효물을 처리한 경우의 콜라겐 합성 증가 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 새싹삼 발효물의 제조
1-1. 종균의 배양
락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) 및 락토바실러스 펜토서스(Laclactobacillus pentosus)를 종균 배양을 통해 37℃에서 3일 동안 교반하면서 배양하였다. 종균 배양시에는 균주 활성의 유도를 위하여 MRS 배지(DE MAN, ROGOSA and SHARPE broth)에 인삼 뿌리 및 새싹삼 추출물을 첨가하여 배지를 제조하였으며 이 배지에 균을 접종하여 종균으로 활용하였다.
1-2. 새싹삼 추출물의 제조 및 발효
새싹삼(Panax ginseng C.A. Meyer) 9kg에 50% EtOH 100L를 가하여 80℃ 조건으로 2회 환류 추출하였다. 추출된 새싹삼 추출물은 감압농축 후 정제수를 가하여 30brix농도로 맞추어 발효에 활용하였다. 30brix의 새싹삼 100g 및 락토오스(Lactose) 10g를 MRS 배지에 첨가하고 물 1,000ml을 가한 후, 상기 실시예 1-1의 종균을 1% v/v로 접종하여 발효를 수행하였다. 37℃에서 3일 동안 배양을 통해 만들어진 발효 배양물은 8000rpm, 20분 동안 원심 분리하여 균체를 제거한 다음, 필터 및 살균을 거쳐 새싹삼 발효물로 활용하였다.
실시예 2. 새싹삼 발효 전후의 유효물질 함량 변화 비교
2-1. 새싹삼의 시료 선정 및 전처리 방법
새싹인삼의 발효 전후 유효물질(대사체) 프로파일링 및 정량분석을 위하여 개체별 시료 10개체를 합쳐서 하나의 샘플로 분류하였으며, 이를 3개 부위(지상부, 뿌리, 전체)로 나누어서 동결건조 하였다.
상기 실시예 1-2의 새싹삼 발효물 또한 동결건조를 진행하여 수분을 제거하고, 볼밀(ballmill)을 통해 분쇄하였다.
동결건조된 새싹삼 100 mg을 1 mL의 70% 메탄올에 용해하여 50℃에서 볼텍싱(vortexing) 및 초음파처리(ultrasonication)하였다. 그 후 13,500 rpm으로 4℃에서 5분간의 원심분리 후 상등액을 취하여 0.22 μm PTFE filter로 필터링 후 메탄올로 희석하여 분석에 사용하였다.
새싹삼 발효물은 10% 아세토니트릴을 이용하여 용해 후, 동일용매로 희석하여 분석에 사용하였다.
2-2. UPLC-QTOF/MS를 이용한 새싹삼 발효 전, 후의 기능성물질 프로파일링
새싹삼의 발효 전후 크게 변화하는 기능성물질 프로파일링을 위하여 UPLC-Q-TOF/MS를 이용하여 분석하였다. 이때 사용한 컬럼은 Thermo Hypersil gold C18(100 x 2.1 mm, 1.9㎛)를 사용하였으며, 컬럼 온도는 40℃로 유지하고 시료 주입량은 2μL로 설정하였다. 유속은 0.5mL/min으로 설정하였으며, 이동상 용매 A는 water+0.1% formic acid (v/v), 용매 B는 acetonitrile+0.1% formic acid (v/v)를 사용하였다. 기울기 조건은 0~0.5분, 15% B; 0.5~1분, 20% B; 1~6분, 20% B; 6~13분, 30% B; 13~23분, 35% B; 23~24분, 38% B; 24~27분, 60% B; 27~31분, 90% B; 31~32분, 15% B; 32~34분, 15% B로 설정하였다.
UPLC-QTOF/MS를 이용하여 새싹삼의 부위별(지상부, 뿌리, 전체) 및 발효물 2종의 크로마토그램을 비교하였으며, 이 후 자체 보유하고 있는 in-house 라이브러리를 이용하여 대사체 프로파일링을 진행하였다. 그 결과, 새싹삼 지상부, 뿌리 및 전체는 각각 31개씩의 기능성 대사체를 확인하였으며, 발효 후는 36개의 대사체를 확인하였다.
또한, 발효 전과 후에 증가하는 대사체에 대하여 질량값을 확인할수 있는 프로그램 분석을 진행하였다. 그 결과, RT 4.11 min에서 977.533 m/z, 12.93 min에서 815.481 m/z, 14.16 min에서 683.438 m/z, 18.57min에서 991.549 m/z, 24.07 min에서 665.427 m/z, 24.5 min에서 811.485 m/z, 24.88 min에서 665.426 m/z, 25.43 min에서 829.495 m/z, 26.28 min에서 829.495 m/z, 27.63 min에서 811.485 m/z, 27.76 min에서 811.484 m/z로 11종의 대사체를 확인하였다(도 1).
확인되지 않는 unknown compound에서는 RT 2.83 min에서 287.057 m/z, RT 13.30 min에서 845.491 m/z, RT 16.8 min에서 1123.589 m/z, RT 22.25 min에서 961.541 m/z, RT 23.0 min에서 1033.558 m/z, RT 26.2 min에서 829.501 m/z로 6개의 대사체를 확인하였다.
In-house 라이브러리를 통하여 확인한 36종의 대사체 중에서, 발효 후 증가한 대사체를 확인하였다. 그 중, notoginsenoside R1(932 m/z), ginsenoside Rh1(638 m/z), ginsenoside Rd(946 m/z), ginsenoside Rg3(784 m/z), ginsenoside Rk1(766 m/z)으로 총 5종의 대사체를 선정하였다(도 2).
도 2에 나타난 바와 같이, 선정된 5종의 대사체는 발효 전에는 미량 또는극미량 존재하다가, 발효 후에는 현저히 많이 검출되어 발효 전후의 차이가 가장 도드라지는 대사체에 해당함을 확인하였다.
2-3. HPLC를 이용한 발효 후 가장 많이 증가하는 ginsenoside 5종의 정량분석
UPLC-Q-TOF/MS 프로파일링 결과로 선발된 ginsenoside 5종 notoginsenoside R1(932 m/z), ginsenoside Rh1(638 m/z), ginsenoside Rd(946 m/z), ginsenoside Rg3(784 m/z), ginsenoside Rk1(766 m/z)을 대상으로 HLPC를 이용한 정량 분석을 실시하였다.
구체적으로, 각각의 ginsenoside 1mg을 100% 메탄올 1mL에 녹여 0.22 ㎛ PTFE filter로 필터링 후 3.125 ~ 500ppm으로 희석하여 분석에 사용하였다.
새싹삼의 정량분석을 위하여 Agilent HPLC를 사용하였으며, 컬럼은 YMC C18 ODS-AM (250 mm x 4.6mm, 5 ㎛)를 사용하였다. 컬럼 온도는 35℃로 유지하였으며, 기울기 조건은 0~25분, 16% B; 25~30분 37% B; 30~50분, 42% B; 50~53분, 16% B; 53~65분, 16% B로 설정하였으며, UV 파장은 203nm에서 측정하였다. 새싹삼의 발효 전, 후 추출물에 대한 ginsenoside 5종의 비교 분석 결과, notoginsenoside R1의 RT는 18min, ginsenoside Rh1은 RT는 32.36min, ginsenoside Rd는 RT는 36.10min, ginsenoside Rg3는 RT는 41.284min, ginsenoside Rk1은 RT는 45.85min로 측정되었다. 새싹삼의 발효 전, 후 추출물에 대한 크로마토그램에서도 이들 5종의 ginsenoside를 확인하였다(도 3).
HPLC를 이용한 새싹삼 발효물의 정량분석 결과 notoginsenoside R1은 0.98 mg/g, ginsenoside Rh1은 1.2 mg/g, ginsenoside Rd는 15.7 mg/g, ginsenoside Rg3는 0.7 mg/g, ginsenoside Rk1은 2.09 mg/g으로 확인되었다.
실시예 3. 새싹삼 발효물의 세포 독성 평가
실시예 1의 새싹삼 발효물이 세포 독성을 갖는지 확인하기 위해 인체 피부 유래 섬유아세포인 CCD-986나 세포주를 이용하여 세포 생존율을 확인하였다.
살아있는 세포 내의 미토콘드리아에 존재하는 탈수소효소는 테트라졸리움 염 (Tetrazolium Salt, WST)에서 포르마잔(formazan)이라는 발색물질을 생성한다. 따라서 이를 측정하여 살아있는 세포의 수를 측정할 수 있다. 세포로는 인간 섬유아세포주인 CCD-986sk 세포를 사용하였다. 섬유아세포는 진피층을 구성하는 주요 세포로서, 피부에 도포하는 물질의 독성을 확인하는데 적합하다.
구체적으로, 96 웰 세포 배양 접시에 3x103 세포/웰 농도의 CCD-986sk 세포를 10% 태아 소 혈청(fetal bovine serum; FBS, 16000-044, Gibco), 1% 페니실린/스트렙토마이신(p/s)이 첨가된 IMDM 배양액(IMDM/High Glucose, LM004-01, Welgene)으로 24시간 배양한 뒤, 무혈청, 1% p/s가 첨가된 IMDM으로 배지를 교체하고 24시간 배양하였다. 시료로서 새싹삼 발효물이 농도 별로 포함된 IMDM(무혈청, P/S 1%)배지로 교체하여 48시간 배양하였다. 배양이 끝난 세포에 WST 시약인 EZ-CYTOX (EZ-1000, Daeil lab service, Korea)를 10% 함유한 IMDM(serum free, P/S 1%)배지로 교체하고 2시간 반응 후 생성된 프로마잔을 450nm에서 흡광도를 측정함으로써 세포생존율을 측정하였다.
[세포 생존율 (%) = (시료 첨가군의 흡광도/무처리군 흡광도)*100]
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이 1000 ppm 이하의 농도로 처리시 100 % 이상의 세포 생존율을 나타내며, 2%이하의 처리 농도에서 90 % 이상의 세포 생존율을 나타내어, 상기의 농도범위에서 CCD-986sk 세포의 생존율에 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다.
실시예 4. 새싹삼 발효물의 미백 효과 평가
4-1. 사람 멜라닌 세포에서의 멜라닌 생성 양 측정
사람 멜라닌 세포에 상기 실시예 1의 새싹삼 발효물을 처리한 후, 1.0Ci/ml [3H]Tyrosine, [14C]3,4-Dihydroxyphenylalanine(DOPA)을 첨가하여 24시간동안 배양하고 멜라닌의 양을 정량하였다.
멜라닌 양은 0.2 N NaOH로 멜라닌을 모두 용해시킨 후, synthetic melanin을 이용한 standard curve를 기준으로 하여 ELISA 리더기로 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 무처리군과 비교하여 새싹삼 발효물의 농도가 1%일 때 15% 정도의 멜라닌 합성 저해 효과가 확인되었으며, 2%에서는 40% 정도의 멜라닌 합성이 저해되는 것을 확인하였다.
4-2. 사람 멜라닌 세포에서의 티로시나아제 활성 저해효과 확인
사람 멜라닌 세포에서, 멜라닌 생성과정 중 DOPA에서 도파퀴논으로 전환될 때 참여하는 티로시나아제 효소의 활성을 측정하였다. 티로시나아제 효소의 활성을 억제하면 멜라닌 생성을 막을 수 있어 미백 효과가 있다.
구체적으로, 상기 사람 멜라닌 세포에 실시예 1의 새싹삼 발효물을 처리하고, 세포에 1mM의 L-DOPA를 넣고 1시간 동안 반응시킨 후, 분광광도계로 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이 무처리군과 비교하여 새싹삼 발효물의 농도가 1%일 때 19% 정도의 티로시나아제 활성 억제 효과가 확인되었으며, 2%에서는 45% 정도의 티로시나아제 활성 저해를 확인하였다.
4-3. 배양 피부를 이용한 표피 멜라닌색소 변화 확인
ex vivo에서의 표피 멜라닌 색소 변화여부를 확인하였다. 구체적으로, 수술시 얻은 피부조직을 3x3 mm로 자른 후, air liquid interface 방법으로 배양하고, 실시예 1의 새싹삼 발효물을 3일 배양 후에, 표본이 4% 완충 포름알데히드에 고정되었고, 파라핀 섹션으로 임베딩(embedding)되었다. 그 후, 현미경 관찰을 위하여 헤마토시린 및 에오신으로 염색되었다. 멜라닌 색소는 Fontana-Masson 염색을 이용하여 관찰하였다. 이미지 분석은 Image Pro Plus Version 4.5를 이용하여 수행되었으며, 상피 면적 대비 착색된 면적의 비율(pigmented area/epidermal area, PA/EA)이 측정되었다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이 1% 및 2%의 새싹삼 발효물이 배양된 피부의 표피색소침착을 억제하는 것을 확인하였다.
실시예 5. 새싹삼 발효물의 피부주름 개선 및 탄력 개선 효과 확인
사람 피부섬유아세포를 웰 플레이트(well plate)에 배양한 후, 실시예 1의 새싹삼 발효물을 각각 8, 9, 10%처리 처리하였다. 시료 처리 후, 사람 피부 섬유 아세포를 48시간 동안 배양하고 배지의 상층액을 취하여 합성된 콜라겐을 정량하였다. 콜라겐 정량은 타입 1 프로콜라겐 C-펩타이드 EIA 키트(Type I Procollagen C-Peptide EIA kit)(Takara, Japan)를 사용하였다.
그 결과는 도 8에 나타난 바와 같이, 8% 처리한 경우에는 컨트롤 대비 182.3%, 9% 처리한 경우에는 195.6%, 10% 처리한 경우에는 168.1% 증가하여, 해당 농도에서 새싹삼 발효물은 피부세포의 탄력 개선 및 주름개선을 유도하는 콜라겐 합성을 촉진하는 것을 확인하였다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (8)
- 새싹삼(Panax ginseng) 발효물을 유효성분으로 포함하는, 피부세포의 콜라겐 합성 증가로 인한 피부 주름 및 탄력 개선용 화장료 조성물에서,
상기 새싹삼 발효물은 새싹삼에 50% 에탄올을 가하여 80℃ 조건으로 2회 환류 추출하고, 이를 감압농축 후 정제수를 가하여 30brix 농도로 맞추어 제조한 새싹삼 추출물 100g 및 락토오스(Lactose) 10g를 MRS 배지에 첨가하고, 이에 정제수를 가한 후 37℃에서 3일 동안 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) 및 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus)로 발효시키고, 이후 발효 배양물을 8000rpm에서 20분 동안 원심분리하여 균체를 제거하고, 필터 및 살균을 거쳐 제조된 새싹삼 발효물인 것이고,
상기 새싹삼 발효물은 발효 전 대비 노토진세노사이드(notoginsenoside) R1, 진세노사이드(ginsenoside) Rh1, 진세노사이드(ginsenoside) Rd, 진세노사이드(ginsenoside) Rg3 및 진세노사이드(ginsenoside) Rk1의 5종의 진세노사이드가 증가된 것이며,
상기 새싹삼 발효물은 9%의 농도(w/v)로 포함되는 것인,
피부세포의 콜라겐 합성 증가로 인한 피부 주름 및 탄력 개선용 화장료 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 새싹삼(Panax ginseng) 발효물을 유효성분으로 포함하는, 피부세포의 콜라겐 합성 증가로 인한 피부 주름 및 탄력 개선용 식품 조성물에서,
상기 새싹삼 발효물은 새싹삼을 50% 에탄올을 가하여 80℃ 조건으로 2회 환류 추출하고, 이를 감압농축 후 정제수를 가하여 30brix 농도로 맞추어 제조한 새싹삼 추출물 100g 및 락토오스(Lactose) 10g를 MRS 배지에 첨가하고, 이에 정제수를 가한 후 37℃에서 3일 동안 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) 및 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus)로 발효시키고, 이후 발효 배양물을 8000rpm에서 20분 동안 원심분리하여 균체를 제거하고, 필터 및 살균을 거쳐 제조된 새싹삼 발효물인 것이고,
상기 새싹삼 발효물은 발효 전 대비 노토진세노사이드(notoginsenoside) R1, 진세노사이드(ginsenoside) Rh1, 진세노사이드(ginsenoside) Rd, 진세노사이드(ginsenoside) Rg3 및 진세노사이드(ginsenoside) Rk1의 5종의 진세노사이드가 증가된 것이며,
상기 새싹삼 발효물은 9%의 농도(w/v)로 포함되는 것인,
피부세포의 콜라겐 합성 증가로 인한 피부 주름 및 탄력 개선용 식품 조성물. - 삭제
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| KR1020210138665A KR102642545B1 (ko) | 2021-10-18 | 2021-10-18 | 새싹삼 발효물을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 및 탄력 개선용 조성물 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210138665A KR102642545B1 (ko) | 2021-10-18 | 2021-10-18 | 새싹삼 발효물을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 및 탄력 개선용 조성물 |
Publications (2)
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|---|---|
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Family
ID=86101915
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020210138665A KR102642545B1 (ko) | 2021-10-18 | 2021-10-18 | 새싹삼 발효물을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 및 탄력 개선용 조성물 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102642545B1 (ko) |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| KR102284711B1 (ko) * | 2019-09-27 | 2021-08-03 | 대봉엘에스 주식회사 | 새싹삼발효물을 포함하는 화장료 조성물 및 이의 제조방법 |
| KR20210069823A (ko) * | 2019-12-04 | 2021-06-14 | 최정원 | 화장품에 이용가능한 미백 기능성 새싹삼 발효추출물 |
| KR102312525B1 (ko) | 2021-07-20 | 2021-10-13 | 강원대학교산학협력단 | 항산화 효소와 진세노사이드 함량이 증진된 새싹삼 및 그 제조방법 |
-
2021
- 2021-10-18 KR KR1020210138665A patent/KR102642545B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 농촌진흥청 보도자료. 2018.05.11 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20230055219A (ko) | 2023-04-25 |
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|---|---|---|---|
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
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| X091 | Application refused [patent] | ||
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