KR102312525B1

KR102312525B1 - 항산화 효소와 진세노사이드 함량이 증진된 새싹삼 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR102312525B1
Application number: KR1020210094937A
Authority: KR
Inventors: 임영석; 정은주; 임정대; 무하마드 자히룰 이슬람; 류병렬
Original assignee: 강원대학교산학협력단
Priority date: 2021-07-20
Filing date: 2021-07-20
Publication date: 2021-10-13

Abstract

본 발명은 새싹삼 묘목을 염화나트륨(NaCl)과 퓨트레신(putrescine)을 처리하면서 재배하는 단계를 포함하는 항산화 활성 및 진세노사이드 함량이 증진된 새싹삼의 재배방법 및 상기 방법으로 재배된 새싹삼과 새싹삼의 항산화 활성 및 진세노사이드 함량을 증가시키는 방법에 관한 것이다.

Description

항산화 효소와 진세노사이드 함량이 증진된 새싹삼 및 그 제조방법{Sprout ginseng with enhanced antioxidant enzyme and ginsenoside content and manufacturing method thereof}

본 발명은 새싹삼 묘목을 염화나트륨(NaCl)과 퓨트레신(putrescine)을 처리하면서 재배하는 단계를 포함하는 항산화 활성 및 진세노사이드 함량이 증진된 새싹삼의 재배방법 및 상기 방법으로 재배된 새싹삼에 관한 것으로, 상기 재배한 새싹삼을 이용하여 다양한 소재로 유용하게 이용할 수 있는 효과가 있다.

염은 작물 성장, 수확량 및 품질에 영향을 미칠 수 있는 주요 비생물적 스트레스 요인이다. 염에 노출된 식물은 물 가용성과 이온 축적을 감소시켜 미네랄 불균형을 초래한다. 이러한 이온 축적의 불일치는 식물의 형태적, 생리적, 대사적 기능 장애로 인해 성장 지연을 초래한다. 염 스트레스는 인삼의 성장과 생산량에 영향을 미치는 중요한 비생물적 스트레스이다. 일반적으로 고농도의 염이온은 토양의 삼투압 가능성을 증가시켜 생리적 물부족을 초래하고 식물의 영양 흡수를 방해한다. 식물은 또한 새싹에서 높은 나트륨 이온에 의해 광합성률을 잃게된다. 염 스트레스에 대처하기 위해 다양한 전략을 따르지만, 대부분의 작물은 염 스트레스 조건에서 잘 자라지 못한다. 잎의 독성 이온 축적을 최소화하는 것이 식물의 성장과 발달에 필수적이기 때문에 염 스트레스 하에서 새싹 조직의 반응은 대부분의 연구에서 가장 주목을 받았다. 그러나 뿌리는 첫번째 기관으로서 염 스트레스에 노출되며 새싹보다 더 심각한 성장 지연을 보이는 경우가 많다.

식물은 삼투압 조절, 항산화 효소 활성 증가, 독성 이온 제거 및 구획화를 포함하여 염 스트레스를 처리하기 위한 형태학적 변화를 가져옴으로써 복잡한 전략을 채택한다. 이러한 적응 전략은 장기간의 진화 과정에서 염 스트레스와 싸우기 위한 스트레스 기간과 강도에 따라 동시에 또는 개별적으로 발생한다. 잎의 독성 이온 축적은 식물의 염 내성 메커니즘에 중요하지만 뿌리 성장 지연은 염 스트레스에 노출된 첫번째 기관이기 때문에 가장 중요한 변화이다.

또한, 염 스트레스를 받는 식물은 슈퍼옥사이드 음이온 라디칼(O₂ ^-·), 과산화수소(H₂O₂) 및 하이드록실 라디칼(OH)과 같은 활성 산소종(ROS) 풀을 생성한다. 이러한 ROS는 지질 과산화 또는 생물학적 분자의 산화적 손상을 통해 정상적인 신진대사 과정에 영향을 미쳐 성분량의 불균형과 대표적인 방어 시스템의 기능 장애를 초래한다. 다른 연구에서도 어린잎 세포가 더 취약하고 비생물적 스트레스 하에서 과도한 ROS를 생성하며 일련의 효소 및 비효소 활동에 의해 폐기된다는 사실이 입증되었다.

일반적으로 식물은 아스코르브산(AsA) 및 글루타티온(GSH)과 같은 저분자량 산화방지제와 결합되어 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD), 카탈라제(CAT), 아스코르베이트 퍼옥시다제(APX) 및 퍼옥시다제(GPX)와 같은 항산화 효소와 프롤린(Pro)과 같은 적합용질을 사용한다.

수용성 당(TSS) 및 총 수용성 탄수화물(TSC)을 사용하여 ROS의 강렬한 흐름을 억제한다. 따라서 효소적 항산화제와 비효소적 항산화제의 결합 작용에 의한 ROS 항상성은 식물의 염 내성을 향상시키는 데 중요한 역할을 한다.

고려 인삼(Panax ginseng Meyer)은 동아시아에서 가장 중요한 약재 중 하나로, 2,000년 이상 동안 강장제, 각성제, 스트레스 증상 완화제로 활용되어 왔다. 인삼에서 가장 일반적인 생리활성 성분은 진세노사이드, 다당류, 펩타이드, 폴리아세틸렌계알코올 및 지방산이다. 그 중에서도 트리테르펜 글리코시드 사포닌(triterpene glycoside saponin)으로도 알려진 진세노사이드는 항암, 항당뇨, 면역 조절, 신경 보호, 방사선 보호, 항건망증 및 항스트레스 치료제로 약리학 및 생리학 분야에서 가장 일반적이며 잘 알려져 있다. 이전의 연구에서는 인삼 식물의 진세노사이드 함량은 빛, 물, 온도, 전리 방사선, 토양, 위치, 식물 연령 등과 같은 요인에 따라 달라진다는 것이 잘 설명되었다. 최근 연구에서 진세노사이드의 양은 인삼 식물의 뿌리보다 잎에서 더 높게 나타났다. 인삼 새싹에 대한 소비자의 관심을 높이는 데 중요한 역할을 하는 인삼산업법 개정안 2015에 따라 인삼 새싹은 새로운 약용 채소가 되었다.

식물은 여러가지 생리적 역할에 참여하는 2차 대사 산물을 생산한다. 스트레스 조건 하에서 규제 및 생산과 방어 및 내성 메커니즘에서의 역할이 잘 설명되어 있다. 인삼의 주요 2차 대사 산물은 총칭하여 진세노사이드로 알려진 트리테르펜 사포닌 그룹에 속한다.

진세노사이드는 골격에 따라 dammarane과 oleanane 유형의 사포닌으로 나눌 수 있다. dammarane-type 진세노사이드는 성장 및 방어 목적의 수요를 충족시키기 위해 생산되는 PPD(protopanaxadiol)과 PPT(protopanaxatriol)의 두 그룹으로 나뉜다. 따라서 비생물적 스트레스 하에서 진세노사이드의 조절은 인삼 식물의 스트레스 반응에 결정적인 연관성을 가질 수 있다. 이와 관련하여, 엘리시터(elicitor)를 적용하여 진세노사이드를 상향 조절하는 것도 최근 선호하는 전략이다. 진세노사이드의 약리학적 효과에 대한 많은 보고서가 문서화되었지만 생합성 경로, 특히 스트레스 반응 호르몬에 의해 조절되는 경로에 대해서는 알려진 바가 거의 없다.

폴리아민(PA)은 두개 이상의 아미노기를 포함하는 보편적인 유기 폴리 양이온이며 성장, 발달 및 노화와 같은 식물의 기본적인 생리학적 과정과 관련이 있다. PA는 또한 세포로부터의 삼투압과 ROS 소거를 조절함으로써 생물적 및 비생물적 스트레스에 반응할 수 있으며, 따라서 식물의 정상적인 생리적 과정을 조절한다. 염분은 다양한 ROS를 축적하고 식물의 항산화 효소 활동을 억제함으로써 형태 생리학적 및 대사 과정에 영향을 미친다. Put을 포함한 외인성 PA는 MDA 및 기타 ROS를 제어하여 원형질막을 보호하고, Na⁺ 축적을 줄이고, 염분 영향을 받는 식물의 항산화 활성 및 광합성 능력을 증가시킨다. PA 생합성 경로에서 퓨트레신(Put)은 중심 산물이며 Spd(Spermidine)과 Spm(Spermine)의 합성 전구체 역할을 한다. 세 가지 다른 생합성 경로 중 1차 Put 합성은 Agm(Agmatine)에서 질소 원자를 제거하여 NCPA(N-carbamoyl Put)을 형성한다. 그 후 NCPA는 NCPAH(N-carbamoylputrescine amidohydrolase)에 의해 가수분해되어 퓨트레신(Putrescine)을 형성한다.

Put의 제어된 잎 적용은 생리적 과정을 유발하고 식물의 프롤린, 총 수용성 당 및 아미노산과 같은 삼투압 조절 분자를 유도할 수 있다. DNA, RNA 및 단백질의 생합성, 식물 성장 및 발달 유지, 노화 지속, 식물에서 자유 라디칼 제거를 통한 산화 손상으로부터 막 보호 등도 PA의 역할로 보고되었다. 비생물적 스트레스 내성을 부여하는 외인성 Put의 유익한 역할은 식물에서 잘 입증되었다. 그러나 Put 매개 염 스트레스 내성의 많은 측면은 아직 파악하기 어렵다.

한국등록특허 제1107263호에는 산양삼 새싹의 재배방법이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1942481호에는 이끼를 이용한 새싹삼의 재배방법이 개시되어 있으나, 본 발명의 염 스트레스 및 퓨트레신 처리에 의한 새싹삼의 재배방법과는 상이하다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명자는 새싹삼 재배 시 염 스트레스와 퓨트레신 처리에 의해, 염 스트레스 및 퓨트레신 처리하지 않거나, 염 스트레스 처리하여 재배한 새싹삼에 비해 항산화 효소 활성과 다양한 진세노사이드 함량이 증진되는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 새싹삼 묘목을 염화나트륨(NaCl)과 퓨트레신(putrescine)을 처리하면서 재배하는 단계를 포함하는 항산화 활성 및 진세노사이드 함량이 증진된 새싹삼의 재배방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 재배된 항산화 활성 및 진세노사이드 함량이 증진된 새싹삼을 제공한다.

또한, 본 발명은 새싹삼 묘목을 염화나트륨(NaCl)과 퓨트레신(putrescine)을 처리하면서 재배하는 것을 특징으로 하는, 새싹삼의 항산화 활성 및 진세노사이드 함량을 증가시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 염화나트륨(NaCl)과 퓨트레신(putrescine)을 유효성분으로 함유하는 새싹삼의 항산화 활성 및 진세노사이드 함량을 증가시키기 위한 조성물을 제공한다.

본 발명의 염 스트레스+퓨트레신 처리하여 재배한 새싹삼은 H₂O₂ 생성과 말론디알데히드 함량을 감소시켰고, SOD, CAT 및 GPX와 같은 항산화 효소 활성을 증진시킬 수 있다. 또한, 새싹삼의 일부 부위에서 F2, Rb1, Rb2, Rc, Rd 및 Rg3와 같은 PPD type 진세노사이드와 Re, Rh1, Rg1 및 Rg2와 같은 PPT type 진세노사이드 함량도 증진되어, 본 발명은 고품질의 새싹삼 재배에 유용하게 사용할 수 있을 것으로 판단된다.

도 1은 염화나트륨(NaCl)과 농도에 따른 퓨트레신(putrescine) 처리에 따른 새싹삼 잎의 총 엽록소(total chlorophylls, Tch) 함량, 50 μs에서 형광 강도(Fo), 최대 형광 강도(Fm), 최대 광합성 양자 수율(Fv/Fm) 및 산출된 PSII 성능 지수(Pi_abs) 및 소멸된 에너지 플럭스(DI₀/RC) 수치를 비교한 그래프이다.
도 2는 염화나트륨(NaCl)과 농도에 따른 퓨트레신(putrescine) 처리에 따른 새싹삼 잎, 줄기 및 뿌리의 프롤린(Proline), 총 수용성 탄수화물(TSC), 총 수용성 당(TSS) 및 총 수용성 단백질(TSP) 함량을 비교한 그래프이다.
도 3은 염화나트륨(NaCl)과 농도에 따른 퓨트레신(putrescine) 처리에 따른 새싹삼 잎, 줄기 및 뿌리의 H₂O₂ 생성과 말론디알데히드 함량을 비교한 그래프이다.
도 4는 염화나트륨(NaCl)과 농도에 따른 퓨트레신(putrescine) 처리에 따른 새싹삼 잎, 줄기 및 뿌리의 SOD(superoxide dismutase), CAT(catalase), APX(ascorbate peroxidase) 및 GPX(guaiacol peroxidase) 효소 활성을 비교한 그래프이다.
도 5는 염화나트륨(NaCl)과 농도에 따른 퓨트레신(putrescine) 처리에 따른 새싹삼 잎, 줄기 및 뿌리의 F2, Rb1, Rb2, Rb3, Rc, Rd 및 Rg3의 PPD type 진세노사이드 함량을 비교한 그래프이다.
도 6은 염화나트륨(NaCl)과 농도에 따른 퓨트레신(putrescine) 처리에 따른 새싹삼 잎, 줄기 및 뿌리의 Re, Rh1, Rg1 및 Rg2의 PPT type 진세노사이드 함량을 비교한 그래프이다.
도 7은 처리에 따른 새싹삼의 데이터를 사용하여 히트맵, 계층적 클러스터링 및 PCA 분석한 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 새싹삼 묘목을 염화나트륨(NaCl)과 퓨트레신(putrescine)을 처리하면서 재배하는 단계를 포함하는 항산화 활성 및 진세노사이드 함량이 증진된 새싹삼의 재배방법을 제공한다.

본 발명의 새싹삼의 재배방법에서, 상기 염화나트륨과 퓨트레신은 바람직하게는 100~200 mM 농도의 염화나트륨과 0.2~1.0 mM 농도의 퓨트레신일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 150 mM 농도의 염화나트륨과 0.3~0.9 mM 농도의 퓨트레신일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 새싹삼의 재배방법에서, 상기 새싹삼 묘목 재배 시 염화나트륨과 0.3 mM 농도의 퓨트레신을 처리할 경우, 새싹삼 뿌리에서 SOD(superoxide dismutase), CAT(catalase) 및 GPX(guaiacol peroxidase) 효소 활성과 Rb1, Rc, Rg3, Re 및 Rg2의 진세노사이드 함량이 증진되고, 새싹삼 잎에서 CAT 효소 활성과 Rb1, Rb2, Rc, Rd 및 Re의 진세노사이드 함량이 증진되고, 새싹삼 줄기에서 Re의 진세노사이드 함량이 증진되는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 새싹삼 묘목 재배 시 염화나트륨과 0.6 mM 농도의 퓨트레신을 처리할 경우, 새싹삼 잎에서 Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re 및 Rh1의 진세노사이드 함량이 증진되는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 새싹삼 묘목 재배 시 염화나트륨과 0.9 mM 농도의 퓨트레신을 처리할 경우, 새싹삼 뿌리에서 Rg3, Re, Rh1, Rg1 및 Rg2의 진세노사이드 함량이 증진되고, 새싹삼 잎에서 CAT 효소 활성과 F2 및 Re의 진세노사이드 함량이 증진되고, 새싹삼 줄기에서 Rb1, Re 및 Rg1의 진세노사이드 함량이 증진되는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 새싹삼의 재배방법에서, 상기 처리는 바람직하게는 하루에 1~2번씩 4~6일 동안 처리할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 하루에 1번씩 5일 동안 처리할 수 있다.

또한, 본 발명의 새싹삼의 재배방법에서, 상기 재배는 일반 비닐 온실 또는 유리 온실에 보조광의 밭 재배 또는 포트 재배, 밀폐형 실내 스마트팜 조건 또는 식물공장형 조건하에서 분무경 방식으로 수경재배 또는 포트재배할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 즉, 상기 재배는 담수경, 배지경, 분무경 등 영양액을 공급하는 모든 영양재배를 포함할 수 있다.

본 발명의 새싹삼의 재배방법은, 보다 구체적으로는 1년생 새싹삼 묘목을 수경재배기에서 분무경 방식으로 수경재배하면서, 100~200 mM 농도의 염화나트륨과 0.2~1.0 mM 농도의 퓨트레신을 하루에 1~2번씩 4~6일 동안 처리하면서 재배할 수 있으며,

더욱 구체적으로는 1년생 새싹삼 묘목을 수경재배기에서 분무경 방식으로 수경재배하면서, 150 mM 농도의 염화나트륨과 0.3~0.9 mM 농도의 퓨트레신을 하루에 1번씩 5일 동안 처리하면서 재배할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 방법으로 재배된 항산화 활성 및 진세노사이드 함량이 증진된 새싹삼을 제공한다.

본 발명은 또한, 새싹삼에 염화나트륨(NaCl)과 퓨트레신(putrescine)을 처리하면서 재배하는 것을 특징으로 하는, 새싹삼의 항산화 활성 및 진세노사이드 함량을 증가시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 새싹삼의 항산화 활성 및 진세노사이드 함량을 증가시키는 방법은, 보다 구체적으로는 1년생 새싹삼 묘목을 수경재배기에서 분무경 방식으로 수경재배하면서, 100~200 mM 농도의 염화나트륨과 0.2~1.0 mM 농도의 퓨트레신을 하루에 1~2번씩 4~6일 동안 처리하면서 재배할 수 있으며, 더욱 구체적으로는 1년생 새싹삼 묘목을 수경재배기에서 분무경 방식으로 수경재배하면서, 150 mM 농도의 염화나트륨과 0.3~0.9 mM 농도의 퓨트레신을 하루에 1번씩 5일 동안 처리하면서 재배할 수 있다.

본 발명은 또한, 염화나트륨(NaCl)과 퓨트레신(putrescine)을 유효성분으로 함유하는 새싹삼의 항산화 활성 및 진세노사이드 함량을 증가시키기 위한 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명의 실시예를 들어 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

1. 재료 및 방법

1.1 식물 재료 및 NaCl 처리

1년생 묘삼의 뿌리(Panax ginseng Meyer)를 배합 기질(상업용 원예토양:유기 분뇨 = 3:1)이 들어있는 발아 트레이(50 cm × 35 cm × 10 cm)에 넣었다. 그 다음 화분을 반관제 온실(semi-controlled greenhouse)에서 재배하였으며, 온도, 상대습도(RH), 환경조건은 각각 30/25℃(야간/일), 60-70% RH, 12시간로 기록되었다. 묘목은 매일 수돗물을 이용해 23일까지 밭용량까지 관개했다. 그 후 종묘들은 밀폐된 실내 수경 재배(스마트팜 에어로포닉)에 옮겨져, 묘목의 뿌리 영역에 영양분을 살포하였고, 사용된 영양액은 표 1과 같다. 모든 식물은 7일 동안 통제 조건 하에서 자란 다음, 통제(영양액만 해당) 및 염 스트레스 조건(150 mM NaCl을 포함하는 영양소 추가)을 위해 별도의 수경 용기로 옮겼다. 그 후, 5개의 처리, 즉 (i) 대조군(Control), (ii) 염(NaCl), (iii) 염 + 0.3 mM Put(퓨트레신), (iv) 염 + 0.6 mM Put 및 (v) 염 + 0.9 mM Put을 하루에 1번씩 5일 동안 처리하였다. 퓨트레신(putrescine)은 1%(v/v) Tween-20으로 처리된 식물의 잎 양쪽에 도포하였다. 추가 분석을 위해 처리된 각 묘목에서 완전히 형성된 가장 어린 잎을 수집하였다.

영양액 조성

화합물 이름	A 탱크(50 L)	B 탱크(50 L)
Ca(NO₃)	1.5 kg
KNO₃	3.79 kg	3.79 kg
(NH₄)₂HPO₄		1.6 kg
MgSO₄		4.3 kg
K₂SO₄
Fe-EDTA	460 g
MnSO₄		30.8 g
BH₃O₃		57.2 g
ZnSO₄		3.6 g
CuSO₄		1.3 g
(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O		0.4 g

1.2 식물 성장 매개 변수의 결정

데이터 수집을 위해 6개의 식물을 무작위로 선택하였다. 식물 성장률은 처리 적용 1일과 5일 사이의 키 차이를 기반으로 계산하였다. 처리를 시작한지 5일째 되는 날, 묘목을 60℃ 오븐에 48시간 동안 건조하여 건중량을 측정하였다.

1.3 엽록소 함량 및 형광 매개 변수의 결정

동결건조된 잎 샘플의 총 엽록소는 Lichtenthaler에 의해 기술된 방법에 따라 결정하였다. 광합성 형광 매개 변수는 20분 동안 어두운 적응 조건에서 OJIP 과도현상을 측정하여 Fluor Pen FP 100(Photon System Instruments, Czech Republic)을 사용하여 측정하였다.

1.4 삼투압 조절 분자의 추정

약 25 mg의 동결건조 식물 재료를 사용하여 프롤린 농도를 측정하였다. 흡광도는 UV-Vis 분광광도계(UV-1800240V, Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan)를 사용하여 520 nm에서 측정하고, 적절한 프롤린 표준 곡선을 사용하여 계산하였다.

TSC 및 TSS를 분석하기 위해 25 mg의 동결건조 시료를 5 mL의 에탄올(95 %)에서 균질화하였다. 그 후 균질화된 시료를 5000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액을 취하였다. 70% 에탄올로 전체 과정을 반복하고 분석을 위해 상층액을 냉장고(4℃)에 보관하였다. TSC 및 TSS 함량은 Khoyerdi et al. 및 Van Handel에 의해 설명된 방법에 따라 결정하였다.

1.5 말론디알데히드(Malondialdehyde) 및 H₂O₂ 함량 측정

신선 시료(200 mg)를 0.1% 트리클로로아세트산(5 mL)에 침연시켰다. 균질물을 12,000 xg에서 10분 동안 4℃에서 원심분리하고 상층액 분석을 위해 4℃에서 보관하였다. 인삼 묘목의 잎, 줄기 및 뿌리에서 말론디알데히드(MDA) 함량을 추정하여 지질과산화 여부를 결정하였다.

1.6 항산화 효소 활성 측정

처리된 모든 식물의 시료(잎, 줄기 및 뿌리)를 수집하고 즉시 액체 질소에 담근 후 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다. 200 mg 샘플을 미리 냉각된 막자 사발과 막자를 사용하여 5 mL의 50mM 인산나트륨 완충액(pH 7.8)에서 균질화한 다음 4℃에서 20분 동안 15,000 xg에서 원심분리하였다. 상층액을 채취한 후 효소 추출물을 분석을 위해 4℃에서 보관하였다. 항산화 효소는 SOD(superoxide dismutase; EC 1.15.1.1), GPX(guaiacol peroxidase; EC 1.11.1.7), CAT(catalase; EC 1.11.1.6) 및 APX(ascorbate peroxidase; EC 1.11.1.11)의 활성을 측정하였다.

1.7 단백질 함량

모든 효소 활성 계산을 위해, 단백질 함량은 595 nm에서 분광광도계로 측정하였다.

1.8 고성능 액체 크로마토그래피에 의한 진세노사이드 분석

동결건조된 시료를 80 메쉬로 분쇄하고 잎, 줄기, 뿌리 100 mg을 측정하고 70% 메탄올(Mallinckrodt Baker Inc., Phillipsburg, NJ, USA) 2 mL를 첨가하였다. 그런 다음 50℃에서 40분 동안 초음파처리기로 추출하였다. 추출액을 Whatman(Kent, England) No.6 여과지를 통해 여과하고 회전 증발기(Eyela, Tokyo, Japan)로 30℃ 수조에서 농축하였다. 고체 함량은 70% 메탄올에 용해하여 5,000 ppm(5,000 ㎍/ml)으로 만들었다.

HPLC 분리 시 처음에는 3 mL MeOH 및 3 mL H₂O는 Sep-pak Plus C18 카트리지(Waters Co., Milford, MA, USA)로 천천히 용출하였다. 추출물 1 mL를 카트리지에 넣고 10 mL dd-H₂O(Mallinckrodt Baker Inc., Phillipsberg, NJ, USA)로 용출하고 초고순도 등급 질소가스(Milsung Industrial Gas Co., Ltd., Hwaseong, Korea)를 흘려 건조시켰다. HPLC 분석 전에 0.45 ㎛ 멤브레인 필터를 통해 여과된 진세노사이드 성분을 용리시키기 위해 카트리지를 2 mL MeOH로 처리하였다.

증류수(JT baker)를 용매 A로 사용하고, 아세토니트릴(99.8%; JT baker)을 1.0 mL/min의 유속과 다음 구배로 이동상을 위한 용매 B로 사용하였다: 초기 조건 72% A, 28% B; 0-10분 72% A, 28% B; 10-45분 60% A, 40% B; 45-47분 100% A, 0% B; 47-68분 100% A, 0% B; 68-70분 72% A, 28% B; 70-75분 72% A, 28% B. 분리 과정 내내 오븐 온도를 40℃로 유지하고 주입량은 20 ㎕였다.

1.9 통계 분석

모든 데이터는 평균±표준편차이다. 표와 도면에 제시된 데이터는 완전 무작위 설계(CRD)에 따라 SAS 9.4(SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) 프로그램에 의해 분석되었으며, 평균 차이는 최소 유의(LSD) 테스트로 비교하였다(P value < 0.05). 히트맵 및 클러스터링 분석은 MetaboAnalyst 4.0 (www.metaboanalyst.ca)을 사용하여 정규화된 평균 값에서 준비되었다. 유클리드 디스턴스 알고리즘(Euclidean distance algorithm)을 사용하여 계층적 클러스터 분석을 수행하였다. 주성분 분석(PCA)은 OriginLab 10.0 소프트웨어(OriginLab, Northampton, MA, USA)를 사용하여 수행하였다.

실시예 1. 성장 매개 변수

염 처리된 인삼 묘목의 GR(Growth rate)은 크게 감소하였으나 퓨트레신(Put)의 적용으로 개선되었다. 0.6mM Put 처리된 식물은 염 처리에서 GR 개선에 가장 효과적이었다. SL, SFW, RFW 및 RDW에서도 유사한 결과가 관찰되었다. 반면, 염 스트레스나 Put 처리는 RL, RSR 및 SDW에서 유의한 차이를 보이지 않았다.

염 스트레스로 자란 새싹삼의 푸트레신(Put) 처리 시 성장률(GR), 새싹 길이(SL), 뿌리길이(RL), 뿌리-새싹 비율(RSR), 새싹 생체중(SFW), 뿌리 건중량(SDW), 뿌리 생체중(RFW) 및 뿌리 건중량(RDW)에 미치는 영향

Treatment	Growth rate (cm/day)	Shoot length (cm)	Root length (cm)	Root-shoot ratio	Shoot fresh weight (gm)	Shoot dry weight (gm)	Root fresh weight (gm)	Root dry weight (gm)
Control	0.321 ±0.11 a	11.72 ±1.17 a	11.72 ±1.48	1.00 ±0.12	0.502 ±0.10 a	0.082 ±0.01	0.967 ±0.14 a	0.129 ±0.02 a
Salinity	0.054 ±0.06 c	10.52 ±1.43 ab	11.73 ±2.75	1.15 ±0.38	0.326 ±0.02 c	0.074 ±0.02	0.730 ±0.08 b	0.087 ±0.01 b
S+0.3 mM Put	0.112 ±0.10 bc	9.97 ±1.65 b	10.77 ±2.05	1.10 ±0.24	0.370 ±0.05 bc	0.087 ±0.01	0.987 ±0.16 a	0.127 ±0.02 a
S+0.6 mM Put	0.162 ±0.04 b	11.30 ±1.17 ab	12.45 ±2.76	1.12 ±0.29	0.517 ±0.08 a	0.086 ±0.01	1.012 ±0.20 a	0.146 ±0.02 a
S+0.9 mM Put	0.116 ±0.07 bc	10.73 ±0.59 ab	12.98 ±2.45	1.21 ±0.22	0.413 ±0.05 b	0.086 ±0.01	1.029 ±0.19 a	0.136 ±0.03 a
LSD_0.05	0.092	1.49	NS	NS	0.078	NS	0.193	0.027

결과에서, 인삼 공중 부분과 RFW 및 RDW의 성장 상태는 염 스트레스의 영향을 많이 받는 것으로 나타났다. Put의 살포는 대부분의 경우 0.6mM 농도에서 우수한 회복률을 유지했다. 이 현상은 Put 적용시 인삼 식물의 내염성의 강한 증거를 반영한다. 그러나 RL과 RSR은 염 스트레스나 Put 적용 모두에서 유의한 차이를 보이지 않았다.

실시예 2. 엽록소 함량 및 형광 매개 변수의 변화

도 1에 제시된 데이터는 대조군(Control) 조건에 비해 염 스트레스 하에서 총 엽록소(total chlorophylls, Tch) 함량이 감소했음을 보여준다. 마찬가지로 최대 형광 강도(Fm), 최대 광합성 양자 수율(Fv/Fm) 및 산출된 PSII 성능 지수(Pi_abs)는 염조건에서 인삼 잎에서 낮은 것으로 나타났다. 반면, 염 스트레스 조건에서 50 μs에서 형광 강도(Fo) 및 소멸된 에너지 플럭스(DI₀/RC)는 증가하였다. 0.6 mM 농도에서 퓨트레신(Put)을 적용하면 Tch 함량, Fm, Fv/Fm 및 Pi_abs가 상당히 증가한 반면, F₀ 및 DI0/RC는 염 스트레스 조건에 비해 감소하였다.

본 실험에서 Tch 함량은 염 스트레스 조건에서 인삼 잎에서 뚜렷한 감소 추세를 보고, 다른 농도로 Put를 살포하면 인삼 잎의 Tch 농도가 향상되었으며, 0.6 mM 농도에서 가장 좋은 결과를 나타냈다.

Put 처리된 식물은 염 스트레스 조건에서 Tch뿐만 아니라 형광 매개 변수에서도 향상되었다. 이 두가지 긍정적인 효과는 Put 처리된 식물의 성장을 향상시켰을 수 있으며, 대부분은 아마도 염 스트레스 하에서 CO₂ 고정을 향상시켰을 것이다. 또한, 염 스트레스는 인삼 식물의 광합성 양자 수율(Fv/Fm)을 감소시켰고, 0.6 mM Put 적용에서 가장 개선되었다.

실시예 3. 삼투 조절 분자의 변화

프롤린(Pro), 총 수용성 탄수화물(TSC), 총 수용성 당(TSS) 및 총 수용성 단백질(TSP) 함량과 관련하여 잎, 줄기 및 뿌리에서 다른 반응이 관찰되었다(도 2). 염 스트레스 하에서 TSC와 TSS에 대해 인삼 식물의 다른 부분보다 잎과 줄기가 더 많이 영향을 받았다. 외인성 Put 처리는 TSC와 TSS를 증가시키는 경향을 나타내었다. 프롤린은 잎과 뿌리에서 염조건에서 증가하였으나, Put 처리 후 다시 감소하였다(잎에서 0.3 mM 제외). TSP의 경우 염 스트레스 조건에서 잎만 유의하게 감소하는 것으로 나타으나, Put 처리 시 TSP 함량이 증가하였다.

프롤린 축적은 스트레스 조건에서 그러한 손상으로부터 보호하기 위해 염 스트레스에 대한 식물 반응의 필수 지표이다. 염 스트레스를 받은 인삼 묘목의 잎과 줄기에 각각 0.3 mM, 0.6 mM Put를 살포하였을 때 유의미한 상승이 관찰되었다. 따라서 Put 처리된 묘목은 더 많은 Pro를 축적하여 염도에 대한 적응을 나타낸다. 아미노산은 단백질 생합성에서 중추적인 역할을 한다. 중요한 아미노산인 Pro는 세포의 팽팽함이나 삼투압 균형을 유지하고 전해질 누출을 방지하여 스트레스 내성을 부여한다. 본 연구는 또한 외인성 Put 처리에 의한 잎과 줄기 조직의 Pro와 TSP 축적 사이에 긍정적인 관계를 발견했다. 염 스트레스 하에서 잎과 줄기 모두에서 TSC의 현저한 감소가 관찰되었으며, 각각 잎에 0.3 mM 및 줄기에 0.6 mM Put의 분사로 인해 TSC가 증가하였다. TSS는 염 스트레스 하에서 잎과 줄기에서만 현저하게 감소한 반면, 식물의 모든 부분에 0.6 mM Put 처리로 증가하였다.

실시예 4. 말론디알데히드(Malondialdehyde) 및 H ₂ O ₂ 농도

염은 대조군에 비해 인삼 묘목의 잎(2.4배)과 줄기(1.76배)에서 H₂O₂(P≤0.05)의 농도를 유의미하게 변화시켰다(도 3A). H₂O₂ 수준은 염 스트레스 조건에서 잎과 줄기에 0.6 mM Put 처리시 가장 많이 감소했다. 반면에 염과 Put 모두 적용은 뿌리에서 부정적인 영향이 관찰되었다.

지질과산화 또는 세포 손상 지표(MDA)에 대한 염의 영향은 도 3B와 같다. MDA 수치는 염 스트레스 조건 하에서 잎(1.44배)에서 유의하게 증가(P≤0.05)한 반면, 줄기와 뿌리에서 각각 유의하게 감소하거나 변화가 없는 것으로 나타났다. MDA 수치는 잎과 뿌리의 경우에 낮은 수준(0.3mM)의 외인성 Put 적용으로 감소했다.

본 연구에서 염 스트레스로 인해 인삼 식물의 잎에서 H₂O₂와 MDA를 상당히 증가시켰다. 이는 줄기와 뿌리에 비해 인삼 묘목의 잎 조직에서 광합성 색소의 빠른 손상, 형광 활동 및 단백질 파괴 때문일 수 있다(도 3C).

실시예 5. 항산화 효소 활성

항산화 효소 활성에 대한 염 및 다양한 농도의 Put의 적용 효과는 도 4와 같다. 대조군과 비교하여 잎의 경우 염 스트레스 하에서 SOD, APX 및 GPX 활성이 크게 증가한(P≤0.05) 반면, CAT의 활성은 염 스트레스 하에서 현저히 감소하였고, 0.3 mM Put 처리구에서 증가하였다. 또한, SOD 및 GPX의 활성도 대조군에 비해 0.3 mM Put 적용에서 더 높게 나타났다.

줄기의 경우 염 스트레스 하에서 CAT 및 APX 효소의 활성이 유의하게 감소(P≤0.05)한 반면, 염 및 0.3 mM Put 모두 적용에서 GPX의 활성이 크게 증가하였다.

뿌리의 경우 염처리로 인해 SOD와 GPX의 활성이 유의하게 감소(P≤0.05)하였으며, 염 스트레스 하에서 CAT 및 APX는 감소하지 않았다. 또한 0.3mM 농도에서 Put을 적용하면 염 스트레스 조건에 비해 SOD 및 GPX의 활성이 크게 향상되었다.

0.3~0.6 mM 농도의 Put을 적용하면 MDA 및 H₂O₂ 수준이 감소하는 효과가 입증되었다(실시예 4). 이러한 ROS 생성 감소는 삼투질과 함께 SOD, CAT 및 GPX의 Put 매개 활동이 증가했기 때문인 것으로 보인다. 전반적으로 본 실험의 효소 활성은 줄기와 뿌리보다 염 스트레스를 받는 잎에서 상대적으로 더 높았다. 이러한 결과는 줄기와 뿌리 이외의 잎이 염 스트레스에 가장 잘 반응하고 인삼 식물에서 ROS를 제거하여 비생물적 스트레스로부터 보호하는 데 중요한 역할을 한다는 것을 나타낸다.

실시예 6. 진세노사이드 축적

잎, 줄기 및 뿌리에서 PPD(protopanaxadiol) 유형의 진세노사이드에 다른 농도의 Put와 염 적용의 영향은 도 5와 같다. 결과는 진세노사이드 기관 특이적 분포뿐만 아니라 다양한 처리에서 변동 패턴에서도 유사성을 보여주었다. F2, Rb2, Rb3, Rc 및 Rd는 잎에서 1차 진세노사이드로 나타났고, 염 스트레스 하에서 Rb2, Rc 및 Rd가 증가하고 F2 및 Rb3이 유의하게 감소했다.

Put 적용은 0.3 mM 및 0.6 mM 농도 수준에서 잎의 진세노사이드의 축적을 증가시켰다. Rb1과 Rc는 잎과 뿌리 모두의 1차 진세노사이드로 나타났고, 염 스트레스 하에서 훨씬 더 많은 축적이 관찰되었다. 또한, 염 처리된 식물에 0.3 mM Put을 살포할 때 Rb1 및 Rc가 가장 높게 나타났다.

한편, 인삼 식물의 잎, 줄기, 뿌리 모두에서 Rg3가 주요 진세노사이드로 나타났다. 염과 0.9 mM 농도의 Put 처리 시 모두 부위에서 Rg3를 증가시켰다. 0.3 mM~0.6 mM의 Put 농도에서는 Rg3를 감소(잎, 줄기)시켰으며 0.9 mM 농도에서는 반대의 결과가 관찰되었다.

잎, 줄기 및 뿌리에서 프로토파낙사트리올(PPT) 유형 진세노사이드의 염 및 다양한 농도의 Put 적용 효과는 그림 6과 같다. Rh1은 잎과 줄기 모두에서 주요 진세노사이드로 나타났고, 염 스트레스 조건에서 감소하였다. Re, Rg1 및 Rg2는 모든 부분, 즉 잎, 줄기 및 뿌리에서 주요 진세노사이드로 나타났다. 염은 잎과 줄기 모두에서 Rg1과 Rg2의 축적을 낮췄으며, Re는 잎에서만 감소하였다. 반면, 염 스트레스는 식물의 뿌리에서 이 3가지 진세노사이드를 증가시켰다. 게다가, Put 적용은 잎, 줄기 및 뿌리에서 Re의 축적을 개선하였고, 잎과 줄기에서 Rh1; 줄기에서 Rg1; 및 잎과 뿌리에서 Rg2가 증가하였다.

본 연구에서 염 스트레스는 진세노사이드 Rb1, Rc, Rd 및 Rg3 축적을 증가시켰다. 식물은 환경 스트레스에 대한 반응으로 2차 대사 산물을 축적한다. 진세노사이드는 식물, 병원균 및 해충에 대한 저해 효과가 있다. 또한 환경 스트레스에 대한 생물학적 내성 메커니즘에 관여한다. 이러한 결과는 식물의 진세노사이드 축적에 대한 염의 직접적인 영향을 나타낸다. 또한, Put 처리는 대부분의 경우 PPT 유형 진세노사이드를 상당히 강화했다.

실시예 7. 계층적 클러스터링 및 PCA 분석

모든 처리에서 인삼 묘목의 형태-생리학적 및 생화학적 데이터를 사용하여 히트맵, 계층적 클러스터링 및 PCA를 구성했다. 계층적 클러스터링은 모든 변수를 세 개의 클러스터(cluster-A, cluster-B 및 cluster-C)로 그룹화했다(도 6a).

클러스터 A의 모든 변수는 대조군에 비해 염 스트레스 하에서 유의하게 감소했다. 매개 변수 중 L CAT, L TSS, R GPX, R SOD는 0.3 mM 농도 Put을 적용하여 증가했으며, 여기서 식물 성장률, 새싹(shoot) 길이, Tch, Fv/Fm, Pi_abs, S TSC, S TSS, S CAT, S SOD 및 S APX는 0.6 mM 농도에서 크게 증가하였다.

클러스터 B에서 염도는 새싹 건중량, 뿌리 생체중, 뿌리 건중량, Fm, L TSC, L TSP 및 R TSP와 같은 변수를 크게 감소시켰으며, 여기서 R TSC, R MDA 및 뿌리-새싹 비율을 크게 증가시켰다. 반면, 0.6 및 0.9 mM의 Put는 모든 매개 변수를 증가시켰다.

클러스터 C에서 대부분의 매개 변수(F0, DIo / RC, L Pro, L H2O2, L MDA, L SOD, L APX, L GPX, S H2O2, R Pro, R CAT 및 R APX)는 염 스트레스 조건하에서 유의하게 증가하였고, 이때 Put 0.6 및 0.9 mM 처리 시 유의하게 감소하였다. 히트맵은 또한 잎과 줄기의 대부분의 생리학적 및 생화학적 매개 변수가 염 스트레스에 의해 뿌리보다 더 많이 영향을 받았다는 것을 나타낸다.

PCA 분석은 모든 처리 그룹과 다른 진세노사이드의 연결을 밝히기 위해 수행되었다(도 7b). PC1 및 PC2 요소를 함께 사용하면 데이터 변동성의 71.33%가 설명된다. 대조군과 염도는 잎, 줄기 및 뿌리에서 PPD 및 PPT 유형 진세노사이드가 5개 처리와 관련하여 분리된 반대 관계를 나타냈다. PPT형 진세노사이드의 경우 뿌리는 염 스트레스와 밀접한 관계가 있으며, 잎과 줄기는 Control 및 외인성 Put 처리와 밀접한 관계를 나타내었다. PPD형 진세노사이드의 경우 변수 L Rg3, S F2, S Rb2, S Rc, R F2, R Rb2, R Rb3, R Rc 및 R Rd는 Control 및 Put 처리, 염 스트레스와 상호 연결되어 있으며 나머지 변수는 밀접하게 연관되어 있다.

Claims

새싹삼 묘목을 염화나트륨(NaCl)과 퓨트레신(putrescine)을 처리하면서 재배하는 단계를 포함하는, 항산화 활성 및 진세노사이드 함량이 증진된 새싹삼의 재배방법.
제1항에 있어서, 상기 염화나트륨(NaCl)과 퓨트레신은 100~200 mM 농도의 염화나트륨과 0.2~1.0 mM 농도의 퓨트레신인 것을 특징으로 하는, 항산화 활성 및 진세노사이드 함량이 증진된 새싹삼의 재배방법.
제1항에 있어서, 상기 처리는 하루에 1~2번씩 4~6일 동안 처리하는 것을 특징으로 하는, 항산화 활성 및 진세노사이드 함량이 증진된 새싹삼의 재배방법.
제2항에 있어서, 새싹삼 묘목을 100~200 mM 농도의 염화나트륨(NaCl)과 0.2~1.0 mM 농도의 퓨트레신을 하루에 1~2번씩 4~6일 동안 처리하면서 재배하는 단계를 포함하는, 항산화 활성 및 진세노사이드 함량이 증진된 새싹삼의 재배방법.
제4항에 있어서, 새싹삼 묘목을 100~200 mM 농도의 염화나트륨(NaCl)과 0.2~0.4 mM 농도의 퓨트레신을 하루에 1~2번씩 4~6일 동안 처리하면서 재배하는 단계를 포함하는, 새싹삼 뿌리에서 SOD(superoxide dismutase), CAT(catalase) 및 GPX(guaiacol peroxidase) 효소 활성과 Rb1, Rc, Rg3, Re 및 Rg2의 진세노사이드 함량이 증진되고, 새싹삼 잎에서 CAT 효소 활성과 Rb1, Rb2, Rc, Rd 및 Re의 진세노사이드 함량이 증진되고, 새싹삼 줄기에서 Re의 진세노사이드 함량이 증진된 새싹삼의 재배방법.
제4항에 있어서, 새싹삼 묘목을 100~200 mM 농도의 염화나트륨(NaCl)과 0.5~0.7 mM 농도의 퓨트레신을 하루에 1~2번씩 4~6일 동안 처리하면서 재배하는 단계를 포함하는, 새싹삼 잎에서 Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re 및 Rh1의 진세노사이드 함량이 증진된 새싹삼의 재배방법.
제4항에 있어서, 새싹삼 묘목을 100~200 mM 농도의 염화나트륨(NaCl)과 0.8~1.0 mM 농도의 퓨트레신을 하루에 1~2번씩 4~6일 동안 처리하면서 재배하는 단계를 포함하는, 새싹삼 뿌리에서 Rg3, Re, Rh1, Rg1 및 Rg2의 진세노사이드 함량이 증진되고, 새싹삼 잎에서 CAT 효소 활성과 F2 및 Re의 진세노사이드 함량이 증진되고, 새싹삼 줄기에서 Rb1, Re 및 Rg1의 진세노사이드 함량이 증진된 새싹삼의 재배방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 방법으로 재배된 항산화 활성 및 진세노사이드 함량이 증진된 새싹삼.
새싹삼 묘목을 염화나트륨(NaCl)과 퓨트레신(putrescine)을 처리하면서 재배하는 것을 특징으로 하는, 새싹삼의 항산화 활성 및 진세노사이드 함량을 증가시키는 방법.
염화나트륨(NaCl)과 퓨트레신(putrescine)을 유효성분으로 함유하는 새싹삼의 항산화 활성 및 진세노사이드 함량을 증가시키기 위한 조성물.