KR102330845B1 - 아로니아 발효액 및 갈대순 추출물을 포함하는 항산화 및 항염증용 조성물 - Google Patents
아로니아 발효액 및 갈대순 추출물을 포함하는 항산화 및 항염증용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 아로니아 발효액 및 갈대순 추출물의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물은 총 폴리페놀, 플라보노이드 및 탄닌 함량 등이 높으며, 라디칼 소거능 및 전자공여능이 우수하여 항산화 효과가 있으며, NO 생성 및 염증성 사이토카인의 생성을 억제하여 항염증 효과가 있다. 또한 본 발명의 아로니아 발효액 및 갈대순 추출물은 세포 독성 및 피부 부작용이 없어 화장료, 약학적 및 식품 조성물에 안전하게 사용할 수 있다.
Description
본 발명은 아로니아 발효액 및 갈대순 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 항염증용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 갈대순 추출물 또는 갈대순 추출물 및 아로니아 발효액의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 항염증용 약학적 조성물, 식품 조성물 및 화장료 조성물에 관한 것이다.
최근 생활과 소득 수준이 향상되면서 삶의 질을 향상시키기 위해 많은 관심이 높아지고 있다. 특히 노화와 각종 염증질환, 암의 대처 방안으로 항산화 물질을 비롯한 체내 질병과 대사를 위한 생리활성물질 개발에 대해 관심이 증대되었다 (KB Kim, et al., Journal of Nutrition and Health. 50(5);415-425(2017)). 생체 내에서 필요한 에너지 공급을 위해 생화학적 산화 반응은 끊임없이 일어나며 이 과정 중에 발생하는 유해산소라 불리는 활성산소(Reactive Oxygen Species; ROS)는 가장 안정한 형태의 산소인 삼중항산소가 산화, 환원과정에서 생성되는 일중항산소인 수퍼옥사이드 음이온(Superoxide anion), 하이드록실 라디칼(hydroxyl radical)과 유리 라디칼(free radical) 및 과산화수소(H2O2)로 불안정하고 산화력이 높아져 생체물질과 쉽게 반응하기 때문에 인체 내에서 제거되지 못하면 산화적 스트레스 (oxidative stress)를 유발하게 된다. 이러한 산화적 스트레스는 염증반응과 연결되어 있으므로 여러 대사과정에서 지질과산화를 유도하고, 단백질, 세포막 및 DNA 등을 손상시켜 세포의 노화와 변형을 유도함으로써 뇌졸중, 암, 동맥경화, 알츠하이머병, 파킨슨병, 동맥경화증 등 다양한 질병을 유발한다 ([Valko M, et al., Int J Biochem Cell Biol. 39:44-84(2007)]; 및 [Halliwell B, et al., NY, USA. p.968(1999)]). 이렇게 생성된 유리 라디칼을 제거시켜 생체를 보호하는 생리학적 항산화 효소로는 수퍼옥사이드 디스무타제(superoxide dismutase; SOD), 카탈라제(catalase), 글루타치온-퍼옥시다제(glutathione-peroxidase; GSHpx) 및 글루타치온 S-트랜스퍼라제(glutathione S-transferase; GST) 등이 있으며, 저분자의 항산화제 혹은 유리 라디칼 소거역할을 하는 것으로 α-토코페롤, β-카로틴, 아스코브산 및 글루타치온 등이 알려져 있다 (Kim SM, et al., Life Sci. 90(21-22);874-882(2012)).
최근에는 이러한 활성산소(ROS)를 제거해줌으로써 생체 내에서 산화성 스트레스로 인하여 생성되는 산화물질들을 방어하는 항산화제의 활용이 증가하고 있고, 특히 천연물에 널리 분포되어 있는 천연 항산화제의 중요성과 이에 관한 연구가 증가하고 있다.
한편, 염증반응은 외부 물리적, 화학적 자극이나 세균감염에 대한 생체방어 반응으로 염증매개물질이라 불리는 산화질소(nitric oxide, NO), 종양괴사인자-α(tumor necrosis factor-α; TNF-α), 인터루킨(IL)-1β, 과립구 마크로파지 콜로니 자극인자(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor; GM-CSF), IL-6와 같은 다양한 염증성 사이토카인(cytokine) 등을 생산 및 분비한다 (YC Yoo, et al., Journal of Life Science. 26(3);338-345(2016)). 또한 염증 전사 인자인 핵 인자 카파 B(nuclear factor kappa B; NF-κB)를 활성화시켜 유도성 산화질소 합성효소(inducible nitric oxide synthase; iNOS)와 사이클로옥시제나제-2(cyclooxygenase-2; COX-2)를 발현시키고, 프로스타글란딘 E2 (Prostaglandin E2; PGE2)를 생성하고 분비된 염증성 사이토카인(cytokine)은 다시 NF-κB를 활성화시켜 사이토카인 캐스케이드(cytokine cascade)를 증폭하여 염증상태를 확장시킨다. 특히 NO는 항박테리아, 항종양 등의 효과를 나타낼 수 있지만, 병리적 원인에 의해 과량 생성되어 분비되면 과도한 혈관 확장에 의하여 패혈성 쇼크 및 신경조직의 손상 등의 위험을 초래할 수 있다 (S Han, et al., Immunopharmacol. Immunotoxicol. 35;34-42(2013)). 이러한 염증성 사이토카인(cytokine)과 염증 매개인자들은 염증과정에서 중요한 역할을 하고, 이들의 비정상적인 생성을 적절하게 조절하는 것이 염증성 질환의 치료법으로 제기되고 있다.
한편, 아로니아(Aronia melanocarpa)는 장미과에 속하는 베리류의 식물열매로 북아메리카에서 자생하며, 블랙 초크베리(black chokeberry)로도 불린다. 아로니아는 다량의 안토시아니과 그밖의 다른 플라보노이드류, 폴리페놀유, 탄닌을 함유하고 있으며 최근 항산화 효과, 항염증 효과, 항당뇨, 면역조절 기능 및 다양한 생리활성 효능이 있는 것으로 알려져 있다 (HM Lee, et al., J. Soc. Cosmet. Scientists Korea. 39(4);337-345 (2013)).
또한, 갈대(Phragmites communis Thin)는 외떡잎식물로 화본목 화본과로 분류되며, 갈대순은 갈대 식물의 어린 잎으로, 크기가 5~10cm이며, 5월부터 6월 사이에 채취한 것을 말한다. 옛날 중국에서는 갈대의 어린싹을 매우 귀한 요리 재료로 여겼으며 지금도 동남아시아 지방에는 갈대순으로 만든 요리가 있다. 어린 순은 식용으로 사용하고 성숙한 원줄기는 지붕, 자리를 만드는 데 쓰며, 근경 줄기, 잎, 꽃 등은 약용한다.
상기 아로니아와 관련한 특허문헌으로 대한민국 공개특허 제10-2016-0070393호는 아로니아 열매를 유산균인 루코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) 균주로 발효시킨 아로니아 열매 발효물의 항균 및 항산화 용도를 개시한 바 있다. 또한, 갈대와 관련한 특허문헌으로 대한민국 등록특허 제10-1800962호는 갈대 지상부 추출물의 유산균 발효액의 피부주름 개선효과를 개시하였다.
이에 본 발명자들은 상기 아로니아와 갈대순에 대한 항산화 및 항염증 활성을 보다 면밀히 연구한 결과, 갈대순 추출물 또는 아로니아의 효모 및 초산 발효액과 갈대순 추출물의 혼합물이 항산화 및 항염증 활성에 있어서 월등한 효과를 나타낸다는 사실을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명에서 해결하고자 하는 기술적 과제는 항산화 또는 항염증 효과를 가지면서 인체 안정성이 우수한 물질을 제공하기 위한 것이다.
상기한 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명에서는 갈대순 추출물 또는 아로니아 발효액과 갈대순 추출물의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 항산화 또는 항염증용 조성물을 제공한다.
바람직하게, 본 발명에서 상기 항산화 또는 항염증용 조성물은 약학적 조성물, 식품 조성물 또는 화장료 조성물일 수 있다.
바람직하게, 본 발명에서 아로니아 발효액과 갈대순 추출물은 0.5 내지 1.5: 0.5 내지 1.5의 중량비, 바람직하게는 0.8 내지 1.2: 0.8 내지 1.2의 중량비, 보다 바람직하게는 1: 1의 중량비로 혼합될 수 있다.
본 발명에 있어서, "갈대순 추출물"은 갈대순을 통상의 방법에 의하여 추출한 추출물로서, 갈대순으로부터 추출한 추출액뿐만 아니라 이의 건조 분말 또는 이를 이용하여 제형화된 모든 형태를 포함한다.
상기 갈대순 추출물은 물 또는 유기 용매를 사용하여 추출할 수 있는데, 추출한 액은 액체 형태로 사용하거나 또는 농축 및/또는 건조하여 사용할 수 있다. 상기 유기 용매는 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, N,N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합용매이며, 추출물의 유효 성분이 파괴되지 않거나 최소화된 조건에서 실온 또는 가온하여 추출할 수 있다.
하나의 구체적 실시에서, 갈대순 추출물은 주정(에탄올)을 이용하여 70 내지 95℃의 온도, 바람직하게는 80 내지 90℃에서 2 내지 4시간, 바람직하게는 3시간 동안 추출하거나, 또는 상온에서 20 내지 30시간, 바람직하게는 23 내지 26시간 동안 추출한 다음, 여과지로 여과하여 갈대순 추출물을 각각 수득할 수 있다.
상기 추출방법은 제한되지 않고, 예를 들어, 냉침추출, 초음파 추출, 환류 냉각 추출 등이 있다.
본 발명의 갈대순 추출물은 추출, 분획, 또는 정제(분리, 분획)의 각 단계에서 얻어지는 모든 추출액, 분획, 정제물, 그들의 희석액, 농축액, 또는 건조물일 수 있다
본 발명에 있어서, "아로니아 발효액"은 아로니아 열매를 착즙한 다음 여과하여 저온 숙성시킨 후 여과 및 농축하여 수득한 아로니아 농축액과 배 농축액을 혼합하여 효모 균주를 이용하여 알코올 발효시킨 후 초산 균주를 이용하여 초산 발효시켜 제조된 산물이다.
상기 아로니아 농축액은 아로니아 열매를 착즙한 다음 여과하여 저온 숙성시킨 후 정제수와 혼합하여 다시 저온 숙성시킨 다음 여과하여 제조될 수 있다.
상기 배 농축액은 배와 정제수를 혼합하여 추출한 다음 여과하여 제조될 수 있다.
본 발명의 하나의 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 상기 갈대순 추출물을 단독으로 포함하거나 또는 아로니아 발효액과 갈대순 추출물을 0.5 내지 1.5: 0.5 내지 1.5의 중량비, 바람직하게는 0.8 내지 1.2: 0.8 내지 1.2의 중량비, 보다 바람직하게는 1: 1의 중량비로 혼합하여 포함할 수 있다. 이 때 상기 범위를 벗어날 경우 항산화 및 항염증 효과를 수득하기 어렵다.
상기 갈대순 추출물 단독 또는 아로니아 발효액과 갈대순 추출물의 혼합물은 조성물의 총 중량을 기준으로 하여 0.001 내지 90 중량%, 바람직하게는 0.01 내지 90 중량%, 보다 바람직하게는 0.1 내지 80 중량%, 보다 더 바람직하게는 1 내지 80 중량%로 포함할 수 있다. 이 때 갈대순 추출물 단독 또는 아로니아 발효액과 갈대순 추출물의 혼합물의 함량이 0.001 중량% 미만일 경우 본 발명의 목적효과인 항산화 및 항염증 효과를 수득할 수 없으며, 90 중량%를 초과할 경우 함량의 증가에 따라 효과가 비례적이지 않아 비효율적일 수 있으며 제형상의 안정성이 확보되지 않는 문제점이 있다.
본 발명의 갈대순 추출물 또는 아로니아 발효액과 갈대순 추출물의 혼합물을 함유하는 조성물은 총 폴리페놀, 플라보노이드 및 탄닌 함량 등이 높으며, 라디칼 소거능 및 전자공여능이 우수하여 항산화 효과가 있으며, NO 생성 및 염증성 사이토카인의 생성을 억제하여 항염증 효과가 있며, 천연 물질로서 세포독성이 거의 없다.
본 발명의 하나의 구현예에 따르면, 갈대순 추출물 또는 아로니아 발효액 및 갈대순 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 갈대순 추출물 또는 아로니아 발효액과 갈대순 추출물의 혼합물 이외에 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 경구 또는 비경구 등의 다양한 경로로 투여할 수 있으며, 예컨대 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사에 의해 투여할 수 있다. 바람직하게는 경구 투여로 섭식 방식으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg 범위 내이다. 또한 외용제인 경우에는 성인 기준으로 1.0 내지 3.0 ml의 양으로 1일 1회 내지 5회 도포하여 1개월 이상 계속하는 것이 좋다. 다만, 상기 투여량은 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 당분야의 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이 때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑시르제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 하나의 구현예에 따르면, 갈대순 추출물 또는 아로니아 발효액과 갈대순 추출물의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 또는 염증의 예방 및 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 식품 조성물에는 유효성분으로서 갈대순 추출물 단독 또는 아로니아 발효액 및 갈대순 추출물의 혼합물뿐만 아니라 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 추가로 포함할 수 있다.
상기 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.
예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 갈대순 추출물 단독 또는 아로니아 발효액 및 갈대순 추출물의 혼합물 이외에 배농축액, 식물혼합 추출물, 예를 들어 황기, 계피, 당귀, 감초, 백출, 둥굴레, 영지버섯 추출물, 폴리덱스트로스, 비타민 C, 니코틴산 아미드, 구염산삼나트륨, 무수구연산 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
본 발명의 하나의 구현예에 따르면, 갈대순 추출물 또는 아로니아 발효액과 갈대순 추출물의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 또는 염증의 예방 및 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 화장료 조성물에는 유효성분으로서의 갈대순 추출물 또는 아로니아 발효액과 갈대순 추출물의 혼합물 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 첨가되는 성분, 예컨대 항산화제, 안정화제, 가용화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 및 담체를 추가로 첨가할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 영양 크림, 수렴 화장수, 유연 화장수, 로션, 에센스, 영양젤 또는 마사지 크림의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트 검, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 가용화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 검등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 막형성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온 봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 그리고, 상기의 성분들은 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.
한편, 본 발명의 아로니아 발효액 및 갈대순 추출물은 천연물질로서 인체에 무해하며, 독성 및 부작용이 거의 없으므로 장기간 사용시에도 안심하고 사용할 수 있으며, 특히 상기한 바와 같은 화장료, 약학적 및 식품 조성물에 안전하게 적용할 수 있다.
이와 같이, 본 발명의 갈대순 추출물 단독 또는 아로니아 발효액과 갈대순 추출물의 혼합물은 총 폴리페놀, 플라보노이드 및 탄닌 함량 등이 높으며, 라디칼 소거능 및 전자공여능이 우수하여 항산화 효과가 있으며, NO 생성 및 염증성 사이토카인의 생성을 억제하여 항염증 효과가 있다. 또한 본 발명의 아로니아 발효액 및 갈대순 추출물은 세포 독성 및 피부 부작용이 없어 화장료, 약학적 및 식품 조성물에 안전하게 사용할 수 있다.
도 1은 아로니아의 알코올 발효 시간에 따른 알코올 함량, 포도주, 전환당, pH 및 당도 변화를 나타낸 것이다.
도 2는 아로니아 알코올 발효액의 초산 발효 시간에 따른 산도를 나타낸 것이다.
도 3은 아로니아 발효액 및 갈대순 추출물의 혼합물의 전자공여능 측정결과를 나타낸 것이다.
도 4는 아로니아 발효액 및 갈대순 추출물의 혼합물의 양이온 라디칼 소거능 측정결과를 나타낸 것이다.
도 5는 아로니아 발효액 및 갈대순 추출물의 혼합물의 수퍼옥사이드 음이온 라디칼 소거능 측정결과를 나타낸 것이다.
도 6은 아로니아 발효액 및 갈대순 추출물의 혼합물의 FRAP 분석 측정결과를 나타낸 것이다.
도 7은 아로니아 발효액 및 갈대순 추출물의 혼합물의 Fe3+ → Fe2+ 환원력 측정결과를 나타낸 것이다.
도 8은 아로니아 발효액 및 갈대순 추출물의 혼합물의 Cu2+ 환원력 측정결과를 나타낸 것이다.
도 9는 아로니아 발효액 및 갈대순 추출물의 혼합물의 Fe2+ 킬레이트화 측정결과를 나타낸 것이다.
도 10은 아로니아 발효액, 갈대순 추출물, 및 아로니아 발효액 및 갈대순 추출물의 혼합물의 세포독성을 확인한 것이다.
도 11은 아로니아 발효액, 갈대순 추출물, 및 아로니아 발효액 및 갈대순 추출물의 혼합물의 NO 억제활성을 나타낸 것이다.
도 12는 아로니아 발효액, 갈대순 추출물, 및 아로니아 발효액 및 갈대순 추출물의 혼합물이 염증성 사이토카인 (Cytokine)에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 2는 아로니아 알코올 발효액의 초산 발효 시간에 따른 산도를 나타낸 것이다.
도 3은 아로니아 발효액 및 갈대순 추출물의 혼합물의 전자공여능 측정결과를 나타낸 것이다.
도 4는 아로니아 발효액 및 갈대순 추출물의 혼합물의 양이온 라디칼 소거능 측정결과를 나타낸 것이다.
도 5는 아로니아 발효액 및 갈대순 추출물의 혼합물의 수퍼옥사이드 음이온 라디칼 소거능 측정결과를 나타낸 것이다.
도 6은 아로니아 발효액 및 갈대순 추출물의 혼합물의 FRAP 분석 측정결과를 나타낸 것이다.
도 7은 아로니아 발효액 및 갈대순 추출물의 혼합물의 Fe3+ → Fe2+ 환원력 측정결과를 나타낸 것이다.
도 8은 아로니아 발효액 및 갈대순 추출물의 혼합물의 Cu2+ 환원력 측정결과를 나타낸 것이다.
도 9는 아로니아 발효액 및 갈대순 추출물의 혼합물의 Fe2+ 킬레이트화 측정결과를 나타낸 것이다.
도 10은 아로니아 발효액, 갈대순 추출물, 및 아로니아 발효액 및 갈대순 추출물의 혼합물의 세포독성을 확인한 것이다.
도 11은 아로니아 발효액, 갈대순 추출물, 및 아로니아 발효액 및 갈대순 추출물의 혼합물의 NO 억제활성을 나타낸 것이다.
도 12는 아로니아 발효액, 갈대순 추출물, 및 아로니아 발효액 및 갈대순 추출물의 혼합물이 염증성 사이토카인 (Cytokine)에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
재료 및 시약
DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl), ABTS (2,2-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diamonium salt), Iron (Ⅲ) chloride, Potassium ferricyanide, Trichloroacetic acid, Iron(Ⅱ) chloride, 2,2'-Bipyridyl, Copper (Ⅱ) chloride, Ammonium acetate, Pyrogallol, Quercetin, Folin & Ciocalteu's phenol reagent, Gallic acid, Vanillin, Catechin, TPTZ (2,4,6-tripyridyl-S-triazine), Ferric Chloride, Xanthine oxidase, Nitroblue tetrazolium 는 Sigma-Aldrich사 (St. Louis,Mo, USA)에서 각각 구입하여 사용하였다. Glacial acetic acid, Xanthine 는 Alfa Aesar에서 구입하여 사용하였으며 Sodium acetate trihydrate는 JUNSEI 에서 구입하여 사용하였다. 세포 배양에 사용된 RPMI Medium 1640, penicillin-streptomycin, phosphate buffered saline (PBS) 및 fetal bovine serum (FBS) 는 Hyclone제품을 구입하였고 Griess Reagent kir는 Promega Corporation에서 각각 구입하여 사용하였다. CCK-8 (Cell Counting Kit-8) 은 Dojindo 에서 구입하여 사용하였다. 그 외 연구에 사용된 용매 및 시약은 일급 및 특급 시약을 구입하여 사용하였다.
<제조예 1> 아로니아 농축액의 제조
아로니아 열매를 원료로 사용하여 이물질을 선별하고 세척한 후 착즙기를 이용하여 아로니아 껍질과 아로니아즙을 분리하였다. 수득된 아로니아 착즙액을 살균한 다음 아로니아 착즙액 100%를 저온 농축기를 통해 60Brix 이상으로 농축하였다.
<제조예 2> 배 농축액 제조
배 농축액은 배의 불순물 제거한 후 세척한 다음 배와 정제수 1: 5 비율로 혼합하고 95℃ 열수에서 3시간 동안 2회 반복 추출하였으며, 1차 여과장치로 원통 필터를 거쳐 배 잔여물을 제거하고 2차 세디먼트 필터(Sediment filter)를 사용하여 불순물을 완전히 제거하였다. 이어서, 농축기 온도를 75℃에 세팅하고 5배 농축한 최종 72Brix 이상의 배 농축액을 제조하였다.
<제조예 3> 아로니아 발효 조건 확립
3-1. 알코올 발효
상기 제조예 1에서 수득된 아로니아 농축액(60Brix)과 상기 제조예 2에서 제조된 배농축액(72Brix)을 1:1의 중량비로 배합한 후 21.8brix로 희석 조절하고 효모 발효탱크 28℃에서 효모균주(Saccharomyces cerevisiae) KSH-Y141029를 10 중량%의 양으로 접종하고 7일간 발효하여 아로니아 알코올 발효액을 제조하였다. 상기 제조된 알코올 발효액의 알코올 함량, 전환당, pH 및 당도 변화를 측정하였다.
도 1은 아로니아의 알코올 발효 시간에 따른 알코올 함량, 전환당, pH 및 당도 변화를 나타낸 것이다. 여기에서 보듯이, 알코올 함량, 전환당, pH 및 당도는 발효 4일째 급격히 증가하거나 감소하는 경향을 나타내었으며, 4-6일째에는 더이상 증가하거나 감소하지 않았다. 따라서, 6일째 더이상 감소하지 않는 경향으로 보아 아로니아 자체를 효모 균주를 이용하여 발효하는데 필요한 시간은 6일이 가장 적합한 것으로 판정하였다.
3-2. 초산 발효
상기 알코올 발효 6일차 발효액(알콜 함량 13.5%)을 초산발효를 위해 초기 알코올 함량을 9.0%로 희석한 다음 초산 발효탱크 30℃에서 초산균주(Gluconobacter intermedius) KSH-B141031을 10 중량%의 양으로 접종한 후 200rpm으로 72시간 배양하여 종초로 사용하였다. 이후 초기 산도를 1%로 조절한 후 2주간 28℃에서 300rpm에서 아로니아 초산 발효를 진행하였다.
도 2는 아로니아 알코올 발효액의 초산 발효 시간에 따른 산도를 나타낸 것이다. 여기에서 보듯이, 초기 산도 1%에서 발효 4일째까지 3.06%로 산도가 증가하여 발효 10일째 4.75%로 높게 나타났다. 이후 발효 14일째까지 산도가 조금씩 증가하여 5.19%로 나타났다. 반면 알코올 함량은 9.2%로 감소하여 발효 12일째 4.3%까지 감소하였으나, 발효 14일째 알코올 함량의 변화는 일어나지 않았다. 당도와 pH 또한 꾸준히 감소하는 경향을 나타내었으며, 발효 14일째 당도 7.98%, pH 3.19%로 나타났다. 따라서 아로니아 자체 초산 발효는 약 2주 정도 소요되며 최종 산도는 약 4.0%이상 정도 되는 것으로 확인되었다.
또한, 상기 제조된 아로니아 초산 발효액의 안전성 평가를 수행하였으며, 그 결과 아로니아 초산 발효액은 고유의 검붉은 색감과 식초의 향미를 가지며, 발효 특유의 발효취는 없었으며, 총산 함량은 5.19%이며, 초기 brix 21.8%에서 최종 brix 7.98%로 약 36.6% 정도의 고형분 함량이 있음을 확인하였다. 산도는 pH 3.0 이상으로 미생물에 대한 검사결과 세균수와 대장균수에 시험기준치 이하로 적합한 것으로 나타났다.
<제조예 4> 갈대순 추출물의 제조
순천만에서 수집된 갈대순을 수도물로 2회 세척한 다음 정제수를 이용하여 다시 1회 세척하였다. 세척 후 수분을 제거한 다음 100% 주정을 이용하여 실온에서 24시간 동안 환류 (3 L-rpm 600) 추출하였다. 이어서 추출물을 부직포 필터로 여과한 다음 가압 여과지(Advantec No. 2)를 이용하여 여과하여 갈대순 추출물(1g/L)을 수득하였다.
<제조예5> 아로니아 발효액 및 갈대순 추출물을 함유하는 조성물 제조
5-1. 아로니아 발효액 제조
상기 제조예 1에서 제조된 아로니아 농축액 10 중량%와 상기 제조예 2에서 제조된 배농축액 10 중량%를 배합하여 20 brix 내로 희석하고 효모 발효탱크 28℃에서 효모균주(Saccharomyces cerevisiae) KSH-Y141029를 10 중량%의 양으로 접종하고 6일간 발효하여 아로니아 알코올 발효액을 제조하였다.
상기 제조된 아로니아 알코올 발효액의 초기 산도를 1%로 조절한 다음 초산 발효탱크 30℃에서 초산균주(Gluconobacter intermedius) 10 중량% 접종하고 12일간 발효한 후 규조토 0.45㎛ 필터로 여과한 다음 여과된 아로니아 발효액(1ml/L)을 수득하였다.
5-2. 아로니아 발효액 및 갈대순 추출물의 혼합물 제조
상기 제조예 5-1에서 제조된 아로니아 발효액과 상기 제조예 4에서 제조된 갈대순 추출물을 1:1의 중량비율로 혼합하여 아로니아 발효액 및 갈대순 추출물의 혼합물을 제조하였다.
<
실시예
1> 혼합물의 총 폴리페놀, 플라보노이드,
탄닌
및 안토시아닌 함량 측정
1-1. 총 폴리페놀 함량 측정
총 폴리페놀 함량은 Thomas 등의 방법[JH Thomas, et al., J. Sci. Food Agric. 92;2326-2331(2012)]을 변형하여 측정하였다. 구체적으로, 시료에 Folin-ciocalteu's phenol reagent (Sigma, St. Louis, MO, USA)를 넣어 실온에서 3분간 반응한 후 1M Na2CO3 용액을 혼합하여 암실에서 90분간 반응시킨 다음 마이크로플레이트 리더를 사용하여 765nm에서 흡광도를 측정하였다. 페놀 화합물 함량은 표준물질 갈산(gallic acid)을 사용하여 작성된 표준 검량 곡선에 적용하였으며 gallic acid equivalents (GAE)로 나타내었다
1-2. 총 플라보노이드 함량 측정
총 플라보노이드 함량 분석은 Aluminum colorimetric method (Anna & Krystyna 2014)을 이용하여 측정하였다. 구체적으로, 시료 25 ㎕에 증류수 135 ㎕를 혼합한 후 5% 질산나트륨 10㎕를 추가한 후 5분간 반응시킨 다음 10% 염화알루미늄을 15 ㎕ 첨가하여 6분간 반응시킨 후 1M 수산화나트륨 50㎕와 증류수 50 ㎕를 첨가한 후 510 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질은 쿼세틴(Quercetin)을 이용하여 mg QE (Qatechin equivalents)로 나타내었다.
1-3. 총 탄닌 함량 측정
총 탄닌 함량은 Richard 등의 방법(BB Richard, et al., J. Sci. Food Agric. 29;788-794(1978))을 변형하여 측정하였다. 각 추출물 50 ㎕에 1% 바닐린(vanillin)과 7M H2SO4를 100㎕ 첨가한 다음 혼합하여 15분 후 500 nm에서 흡광도를 측정하였다. 카테친(Catechin)을 이용하여 mg CE (Catechin equivalents)로 나타내었다.
1-4. 총 안토시아닌 함량 측정
총 안토시아닌 함량을 측정하기 위해 0.1% HCl이 포함된 에탄올에 시료를 희석하여 준비하였다. 준비된 시료 10㎕에 0.025M 염화칼륨 완충액(pH1.0) 140㎕㎕를 가한 것과 동일하게 시료 10㎕에 0.4M 아세트산나트륨 완충액(pH4.5) 140㎕를 가해 상온에서 15분간 반응시켰다. 마지막으로 각기 다른 버퍼 별로 510nm와 700nm를 측정하여 측정값을 적용하여 총 안토시아닌 함량을 산출하였다. 시아니딘 클로라이드(Cyanidine cloride)을 이용하여 mg CCE (Cyanidine cloride equivalents)로 나타내었다.
1-5. 측정 결과
상기 1-1 내지 1-4의 실험 결과는 하기 표 1에 나타내었다.
| 희석배수 | ||||
| 아로니아 발효액 및 갈대순 추출물의 혼합물 | ||||
| X1000 | X100 | X10 | X1 | |
| Polyphenols (GAE)a |
N.D | N.D | N.D | 5.33±0.1 |
| Flavonoids (QE)b |
N.D | N.D | N.D | 4.93±0.2 |
| Tannins (CE)c |
N.D | N.D | N.D | 14.47±1.2 |
| Anthocyanin (CCE)d |
0.02 | 0.05 | 0.03 | 0.47 |
상기 표 1에서 보듯이, 아로니아 발효액 및 갈대순 추출물의 혼합물은 페놀 함량이 5.33±0.1 ㎍·GAE/㎎이었으며, 플라보노이드 함량이 4.93±0.2 ㎍·QE/㎎이었고, 축합형 탄닌 함량이 14.47±1.2 ㎍·CE/㎎이었고, 안토시아닌 함량이 0.47 ㎍·CCE/㎎였다. 그 결과 항산화력 강화에 긍정적 영향을 미칠 것으로 기대되었다.
<실시예 2> 항산화 효과
2-1. 전자공여능 측정
전자공여능 (EDA; electron donating ability) 은 Thomas 등의 방법을 응용하여 측정하였다. 각 시료용액 120㎕에 0.45mM의 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 60㎕를 넣고 15분간 방치한 다음 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 하기 수학식 1과 같이 전자공여능은 시료용액의 첨가군와 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.
수학식 1
저해율 (%) = ( 1 -시료첨가군의 흡광도 / 무첨가군의 흡광도) × 100
도 3은 아로니아 발효액 및 갈대순 추출물의 혼합물의 전자공여능 측정결과를 나타낸 것이다. 여기에서 보듯이, 아로니아 발효액 및 갈대순 추출물의 혼합물 원액은 약 55% 이상 소거능을 나타낸 것을 확인하였다. 양성대조군인 Vit.C의 경우 30 μg/mL 농도에서부터 90% 이상 소거능을 나타낸 것을 확인하였다. 이와 같은 결과는 총 폴리페놀 함량과 항산화 활성의 상관관계에서 총 폴리페놀 함량이 높을수록 DPPH 라디칼 소거활성도 높다는 보고와 일치한다.
2-2. ABTS 양이온 라디칼 소거능 측정
ABTS 양이온 라디칼을 이용한 항산화력 측정은 ABTS 양이온 라디칼 탈색 분석방법에 의하여 측정하였다. 7mM 2,2-azino-bis(3-ethyl-benthiazoline-6-sulfonic acid) 와 2.45mM 과황산칼륨을 혼합하여 실온에서 24시간 동안 방치하여 ABTS+을 형성시킨 후 에탄올로 희석하여 ABTS+ 100㎕에 시료 100㎕를 가하여 7분 동안 방치한 후 734nm에서 흡광도를 측정하였다.
수학식 2
소거능 (%) = (1 - 시료첨가군의 흡광도 / 무첨가군의 흡광도) × 100
도 4는 아로니아 발효액 및 갈대순 추출물의 양이온 라디칼 소거능 측정결과를 나타낸 것이다. 여기에서 보듯이, 아로니아 발효액 및 갈대순 추출물의 혼합물 원액은 약 70%이상 높은 ABTS 활성을 나타내었으며, 전자공여능의 결과와 유사한 경향을 나타내었다. 양성대조군인 Vit.C의 경우 농도 의존적인 패턴을 확인하였으며 10 μg/mL 농도에서부터 약 95% 이상의 활성효과를 확인하였다. 이러한 결과를 통해 페놀과 플라보노이드 함량이 비교적 높은 아로니아 발효액과 갈대순 추출물의 혼합물은 DPPH 라디칼 소거능과 유사한 ABTS 양이온 라디칼 소거능이 나타나는 것을 확인하였으며, 이러한 결과는 아로니아 발효액과 갈대순 추출물의 혼합물이 함유하고 있는 총 페놀 화합물의 함량이 증가하면서 항산화 활성도 증가한다는 보고와 유사하다.
2-3. 수퍼옥사이드 음이온 라디칼 소거능 측정
수퍼옥사이드 음이온 라디칼 소거능은 니트로 블루 테트라졸륨 (NBT) 환원방법에 의해 측정하였다. 아로니아 발효액과 갈대순 추출물의 혼합물 10㎕와 0.1M 인산칼륨 완충액 (pH 7.5) 40㎕에 잔틴 (0.4mM)과 NBT (0.24mM)를 녹인 기질 100㎕를 첨가하고 잔틴 옥시다제 (0.049U/mL) 100㎕를 가하여 37℃에서 20분간 반응시킨 후 반응액 중에 생성된 수퍼옥사이드 음이온 라디칼의 양을 560nm에서 흡광도를 측정하였다.
수학식 3
소거능 (%) = (1 - 시료첨가군의 흡광도 / 무첨가군의 흡광도) × 100
도 5는 아로니아 발효액 및 갈대순 추출물의 혼합물의 수퍼옥사이드 음이온 라디칼 소거능 측정결과를 나타낸 것이다. 여기에서 보듯이, 아로니아 발효액과 갈대순 추출물의 혼합물 원액에서 약 60%의 억제활성을 나타내는 것을 확인하였다.
2-4. FRAP 분석
아세테이트 완충액 (pH 3.6), 40 mM HCl에 용해한 10 mM TPTZ (2,4,6-tripyridyl-S-triazine) 용액 및 20 mM FeCl3·6H2O를 각각 10:1:1(v/v/v)의 비율로 미리 혼합한 다음 37℃ 수욕상에서 가온한 것을 사용하였다. 추출물 100 ㎕를 차례로 혼합하여 37℃에서 4분간 반응시킨 후 UV 분광광도계를 사용하여 593nm에서 흡광도를 측정하였다.
도 6은 아로니아 발효액 및 갈대순 추출물의 혼합물의 FRAP 분석 측정결과를 나타낸 것이다. 여기에서 보듯이, 아로니아 발효액 및 갈대순 추출물의 혼합물이 비타민C의 3㎍/㎖의 농도보다 조금 더 높은 환원력을 나타내었다.
2-5. Fe
3+
→ Fe
2+
환원력 측정
Fe3+ → Fe2+ 환원력의 측정은 Oyaizu의 방법 방법을 변형하여 측정하였다. 시료 1 mL에 200 mM 인산 완충액 (pH 6.6) 및 1%의 페리시안화 칼륨을 각각 1 mL씩 차례로 가하여 교반한 후 50℃의 수욕 상에서 20분간 반응시킨 뒤, 10% TCA 용액 1 mL 가하여 13,500xg에서 15분간 원심분리하였다. 그 후 상등액 증류수 및 염화 제2철(ferric chloride)을 각각 1 mL씩 혼합하여 700 nm에서 흡광도를 측정하였다.
도 7은 아로니아 발효액 및 갈대순 추출물의 혼합물의 Fe3+ → Fe2+ 환원력 측정결과를 나타낸 것이다. 여기에서 보듯이, FRAP 값과 마찬가지로 아로니아 발효액 및 갈대순 추출물의 혼합물의 환원력은 비타민C 3㎍/㎖의 농도보다 조금 더 높은 환원력을 나타내었다.
2-6. Cu
2+
환원력(CUPRAC) 측정
Cu2+ 환원력 측정은 Apak et al. (2006)의 방법을 변형하여 측정하였다. 시료 0.25 mL에 CuCl2 용액(0.25 mL, 0.01 M), 에탄올 네오크프로인 용액(ethanolic neocuproine solution) (0.25 mL, 7.5 ± 10-3 M) 및 NH4Ac 완충액 (0.25 mL,1.0 M), H2O 1mL을 차례로 가하여 30분간 반응 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
도 8은 아로니아 발효액 및 갈대순 추출물의 혼합물의 Cu2+ 환원력 측정결과를 나타낸 것이다. 여기에서 보듯이, 아로니아 발효액 및 갈대순 추출물의 혼합물은 FRAP 분석 및 Fe3+ → Fe2+ 환원력 측정결과와 마찬가지로 비타민 C의 3㎍/㎖ 농도보다 조금 더 높은 환원력을 나타내었으며, 항산화력을 가진 플라보노이드 성분에 의해 구리 킬레이팅 활성이 나타난 것으로 판단된다.
2-7 Fe
2+
킬레이트화 (chelating) 측정
Fe2+ 킬레이트화 측정은 Dinis et al. 의 방법을 변형하여 측정하였다. 아로니아 발효액 및 갈대순 추출물의 혼합물 0.4 mL에 FeCl2 용액 (0.1 mL, 0.6 mM), Bipyridyl solution (0.1 mL, 5mM)을 차례로 가하여 10분간 반응 후 562 nm에서 흡광도를 측정하였다.
도 9는 아로니아 발효액 및 갈대순 추출물의 혼합물의 Fe2+ 킬레이트화 측정결과를 나타낸 것이다. 여기에서 보듯이, 아로니아 발효액 및 갈대순 추출물의 혼합물은 원액에서 40%의 킬레이트화 활성을 나타내었고, 양성대조군은 EDTA는 30㎍/㎖의 농도에서 유사한 킬레이팅 활성을 나타내었다. 이에 아로니아 발효액 및 갈대순 추출물의 혼합물에 의한 지질 과산화 예방 효과가 가장 클 것으로 예상된다.
<실시예 3> 항염증 활성
3-1. 대식세포주 (RAW 264.7) 배양
실험에 사용한 대식세포주인 RAW 264.7세포는 한국세포주 은행(KTCC, Seoul, Korea)에서 분양받아 10% FBS (fetalbovine serum), 1% 항생제, 2-ME(2-mercaptoethanol)를 함유한 RPMI1640 배지를 이용하여 37℃, 4% CO2에서 조절된 배양기에서 배양하였다.
3-2. 실험시료의 세포독성 유무 확인
마우스의 대식세포주 (RAW264.7)를 96웰 플레이트에 웰당 5 X 104 cells/100 ㎕씩 분주한 뒤, 24 시간 동안 CO2 배양하였다. LPS (lipopolysaccharide)를 50 ㎍/㎖ 농도로 처리한 후 1시간 뒤, 각 시료를 50㎕ 씩 처리하고 24시간 동안 CO2 배양하였다. 그 다음 배양 상층액을 100 ㎕씩 제거하고, CCK-8 시약을 10 ㎕씩 처리하여 3시간 CO2 배양한 뒤에 마이크로 플레이트 리더기를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 이에 대한 결과를 하기 표 2 및 도 10에 나타내었다.
| Concentration (㎍/㎖) | ||||||
| Control | LPS | 아로니아 발효액 (X1000) |
갈대순 추출물 | 아로니아 발효액 및 갈대순 추출물의 혼합물 (X1000) |
||
| 100.00±1.9 | 104.12±0.1 | 98.16±1.4 | 200 | 96.37±1.1 | 200 | 95.01±0.5 |
| 400 | 94.52±1.6 | 400 | 94.69±1.4 | |||
| 600 | 94.99±1.4 | 600 | 93.59±0.7 | |||
| 800 | 93.59±1.8 | 800 | 82.23±0.1 | |||
| 1000 | 82.40±1.8 | 1000 | 81.07±0.5 | |||
표 2 및 도 10은 아로니아 발효액, 갈대순 추출물, 및 아로니아 발효액 및 갈대순 추출물의 혼합물의 세포독성을 확인한 것이다. 여기에서 보듯이, 양성대조군으로 LPS 그룹에서 독성을 나타내지 않았다. 1000배 희석한 아로니아 발효액의 경우 독성을 나타내지 않는 것을 확인하였다. 갈대순 추출물의 경우에도 실험에 사용한 5가지 농도 200, 400, 600, 800, 1000 ㎍/㎖에서 200, 400, 600, 800 ㎍/㎖에서 독성을 나타내지 않았지만, 1000 ㎍/㎖의 경우 17% 정도 세포 독성을 나타난 것을 확인하였다. 하지만 아로니아 발효액 및 갈대순 추출물의 혼합물의 경우 갈대순 추출물의 첨가량이 800 및 1000 ㎍/㎖의 농도에서 약 15% 이상인 것을 확인하였다. 이 때 갈대순 추출물의 경우 DMSO에 녹여 사용하였으며, DMSO에 영향을 받지 않음을 확인하였따.
3-3. 대식세포주 (RAW264.7)의 NO 억제활성 측정
안정화된 NO 산화물인 NO2 (Nitrite)는 Griess 반응을 이용하여 측정하였다. 먼저 마우스의 대식세포주(RAW264.7)를 96웰 플레이트에 웰당 5 X 104 cells/100 ㎕씩 분주한 뒤, 24 시간 동안 CO2 배양하였다. LPS (lipopolysaccharide)를 1 ㎍/㎖ 농도로 50㎕씩 처리하고 1시간 CO2 배양한 뒤 각 시료를 첨가하여 50 ㎕ 처리하여 24시간 CO2 배양하였다. 그 다음 조건당 배양 상층액을 96 well plate에 50 ㎕씩 넣고 여기에 동량의 Griess 시약 (0.1% N-1-naphtyl-ethylendiamine in H2O : 1% sulfanilamide in 5% H3PO4 = 1 : 1)을 첨가하여 10분간 반응시킨 후, 마이크로플레이트 리더로 550nm에서 흡광도를 측정하였다. NO2 (Nitrite)의 농도는 NaNO2 (sodium nitrite)를 100 μM에서부터 1.5 μM 까지 2배씩 희석하여 얻은 표준곡선과 비교하여 계산하였다. LPS를 양성대조군으로서 사용하였다. 그에 대한 결과를 하기 표 3 및 도 11에 나타내었다.
| Concentration (㎍/㎖) | ||||||
| Control | LPS | 아로니아 발효액 (X1000) |
갈대순 추출물 | 아로니아 발효액 및 갈대순 추출물의 혼합물 (X1000) |
||
| N.D | 12.79±0.3 | 12.14±0.9 | 200 | 10.78±0.7 | 200 | 10.70±0.3 |
| 400 | 9.26±0.5 | 400 | 8.91±0.2 | |||
| 600 | 8.30±0.1 | 600 | 7.47±0.2 | |||
| 800 | 6.16±0.4 | 800 | 2.89±0.3 | |||
| 1000 | 4.15±0.1 | 1000 | 3.19±0.3 | |||
표 3 및 도 11은 아로니아 발효액, 갈대순 추출물, 및 아로니아 발효액 및 갈대순 추출물의 혼합물의 NO 억제활성을 나타낸 것이다. 여기에서 보듯이, 아로니아 발효액은 NO 생성을 억제하는데 영향을 미치지 않았다. 갈대순 추출물의 경우, 실험에 사용한 5가지 농도 중 400, 600, 800, 1000 ㎍/㎖의 농도에서 각각 약 27.6%, 35.1%, 51.8%, 67.5% 억제율을 확인하였다. 또한, 아로니아 발효액 및 갈대순 추출물의 혼합물도 400, 600, 800, 1000 ㎍/㎖의 농도를 첨가한 그룹에서 각각 약 30.4%, 41.6%, 77.4%, 75.0% 억제율을 확인하였다. 이러한 결과를 통해 갈대순 추출물을 단독으로 처리하였을 때보다 아로니아 발효액과 혼합하였을 때 통계적으로 유의적으로 억제율이 높은 것을 확인하였다.
3-4. 대식세포주 (RAW264.7)의 사이토카인 (Cytokine) 생성량 측정
RAW264.7 대식세포를 24-well plate에 well당 5×105 cells/1㎖이 되도록 분주하고 24시간 CO2 배양하였다. 이후 well에 LPS (lipopolysaccharide)를 1㎍/㎖ 농도로 처리하고 각 시료를 처리한 뒤 24시간 CO2 배양하였다. 그 다음 세포배양 상층액을 수거하였다. 상층액에 포함된 사이토카인(cytokine)인 IL-6, GM-CSF, IL-1β를 효소항체법 (enzyme-linked immunosorbent assay : ELISA) 을 이용하여 측정하였다. 즉, plate-bottom micro-well에 1차 항체 (capture antibody)를 코팅 완충액(0.1 M sodium carbonate, pH 9.5)에 희석하여 100 ㎕/well로 분주하고 4℃에서 Overnight 후, 세척용액 (0.05% Tween 20/PBS)으로 세척하였다. 세척된 micro-well은 10% FBS가 첨가된 PBS로 블로킹하였으며, 실험에서 채취한 배양 상층액을 적당한 비율로 희석한 후 각 well에 분주하여 상온에서 반응시켰다. 그 다음, 비오틴(biotin)이 부착된 2차 항체 100㎕/well와 일정시간 상온에서 반응시킨 후, avidin-peroxidase (enzyme reagent) 100 ㎕/well을 첨가하였다. 마지막으로 기질 (3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine Liquid Substrate, H2O2)을 첨가하여 발색시킨 다음 마이크로플레이트 리더를 이용하여 620nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 IL-6, GM-CSF, IL-1β의 농도는 표준곡선을 이용하여 환산하였다. 이에 대한 결과를 표 4 및 도 12에 나타내었다.
| Concentration (μg/ml) | |||||||
| Cytokine |
Control | LPS | 아로니아 발효액 | 갈대순 추출물 | 아로니아 발효액 및 갈대순 추출물의 혼합물 | ||
| IL-1β | N.D | 229.08±27.2 | 221.38±5.4 | 200 | 229.08±16.3 | 200 | 279.08±32.6 |
| 400 | 563.69±32.6 | 400 | 394.46±0.0 | ||||
| 600 | 656.00±10.9 | 600 | 444.46±27.2 | ||||
| 800 | 748.31±10.9 | 800 | 559.85±16.3 | ||||
| 1000 | 729.08±16.3 | 1000 | 490.62±38.1 | ||||
| GM-CSF | N.D | 16.41±0.2 | 16.20±0.1 | 200 | 15.67±0.3 | 200 | 16.41±0.2 |
| 400 | 15.55±0.1 | 400 | 16.92±0.4 | ||||
| 600 | 16.61±0.1 | 600 | 16.42±0.0 | ||||
| 800 | 14.92±0.1 | 800 | 15.22±0.0 | ||||
| 1000 | 15.66±0.2 | 1000 | 15.78±0.3 | ||||
| IL-6 | N.D | 27.66±0.2 | 27.57±0.1 | 200 | 28.36±0.0 | 200 | 29.46±0.8 |
| 400 | 28.90±0.4 | 400 | 28.35±0.3 | ||||
| 600 | 29.09±0.4 | 600 | 28.89±0.2 | ||||
| 800 | 28.16±0.3 | 800 | 28.08±0.3 | ||||
| 1000 | 27.96±0.4 | 1000 | 27.54±0.6 | ||||
| TNF-α | N.D | 20.68±0.4 | 19.53±0.4 | 200 | 15.78±0.4 | 200 | 16.75±0.8 |
| 400 | 15.68±0.5 | 400 | 18.03±1.8 | ||||
| 600 | 17.81±0.1 | 600 | 15.48±0.5 | ||||
| 800 | 18.31±0.1 | 800 | 17.25±0.2 | ||||
| 1000 | 20.13±0.1 | 1000 | 16.58±4.9 | ||||
표 4 및 도 12는 아로니아 발효액, 갈대순 추출물, 및 아로니아 발효액 및 갈대순 추출물의 혼합물이 염증성 사이토카인 (Cytokine)에 미치는 영향을 나타낸 것이다. 여기에서 보듯이, 아로니아 발효액, 갈대순 추출물 및 아로니아 발효액 및 갈대순 추출물의 혼합물의 모든 시료가 모든 농도에서 다양한 염증성 사이토카인 (cytokine)에 영향을 미치지 않음을 확인하였다.
Claims (8)
- 아로니아 발효액과 갈대순 추출물의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 염증의 예방 및 개선용 화장료 조성물로서,
상기 아로니아 발효액은 아로니아 열매를 착즙한 다음 여과하여 저온 숙성시킨 후 여과 및 농축하여 수득한 아로니아 농축액과 배 농축액을 혼합하여 효모 균주를 이용하여 알코올 발효시킨 후 초산 균주를 이용하여 초산 발효시켜 제조된 것을 특징으로 하는 염증의 예방 및 개선용 화장료 조성물. - 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 갈대순 추출물은 갈대순 주정 추출물인 것을 특징으로 하는 항산화 또는 염증의 예방 및 개선용 화장료 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 아로니아 발효액 및 갈대순 추출물이 0.5 내지 1.5: 0.5 내지 1.5의 중량비로 혼합된 것을 특징으로 하는 항산화 또는 염증의 예방 및 개선용 화장료 조성물.
- 아로니아 발효액과 갈대순 추출물의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 염증의 예방 및 개선용 식품 조성물로서,
상기 아로니아 발효액은 아로니아 열매를 착즙한 다음 여과하여 저온 숙성시킨 후 여과 및 농축하여 수득한 아로니아 농축액과 배 농축액을 혼합하여 효모 균주를 이용하여 알코올 발효시킨 후 초산 균주를 이용하여 초산 발효시켜 제조된 것을 특징으로 하는 염증의 예방 및 개선용 식품 조성물. - 삭제
- 제5항에 있어서, 상기 갈대순 추출물은 갈대순 주정 추출물인 것을 특징으로 하는 항산화 또는 항산화 또는 염증의 예방 및 개선용 식품 조성물.
- 제5항에 있어서, 상기 아로니아 발효액 및 갈대순 추출물이 0.5 내지 1.5: 0.5 내지 1.5의 중량비로 혼합된 것을 특징으로 하는 항산화 또는 염증의 예방 및 개선용 식품 조성물.
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