KR20230036756A - 항산화 및 미백용 초고압 초음파 추출물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항산화 및 미백용 초고압 초음파 추출물 및 이를 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 나팔꽃씨 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 총 폴리페놀 함량과 총 플라보노이드 함량을 극대화하여 라디칼 소거활성, SOD(superoxide dismutase) 유사활성, 크산틴 산화효소 저해활성에 의한 항산화 효과와 미백 효과, 그리고 티로시나제 억제 및 멜라닌 생성 감소 효과를 동시에 구현하는 효과가 있다.

Description

항산화 및 미백용 초고압 초음파 추출물{ULTRAHIGH PRESSURE ULTRASONIC EXTRACT FOR ANTIOXIDATING, WHITENING AND KERATIN EXFOLIATION}

본 발명은 항산화 및 미백용 초고압 초음파 추출물 및 이를 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 나팔꽃씨(Ipomoea nil)를 포함하는 추출물을 유효성분으로 하여 항산화 및 미백 효과를 제공하는 화장료, 약학적 조성물 또는 식품 조성물에 관한 것이다.

피부는 인체의 외부 표면을 덮고 있는 기관으로서, 자외선, 온도 변화, 미세먼지, 습기, 대기오염으로부터 보호하는 기능과, 대사에 필요한 생화학적 기능을 갖고 있는 기관이다.

피부의 세포는 생체 내에서 필요한 에너지 공급을 위해 인간의 생체 내에서 필요한 에너지 공급을 위해 생화학 반응에서 발생하는 활성산소종에 의해 산화적 스트레스가 가해지게 되면, 세포 구성 성분들인 지질, 단백질, 탄수화물과 DNA 산화적 손상 및 효소활성을 변화시켜 각종 질병을 일으키는 원인이 되며, 노화를 촉진시킨다. 외적 노화의 원인 중에서 가장 큰 부분을 차지하는 것은 자외선에 의한 광노화로서 UV에 지속적인 노출을 통해 급성 또는 만성적 상해가 유발된다.

피부 표피의 기저층에는 사람의 피부색과 관계가 있는 멜라닌이 만들어지는 멜라닌 세포(Melanocyte)가 존재한다. 멜라닌(Melanin) 농도와 분포에 따라 피부색이 결정되는데, 유전적 요인, 자외선, 생활습관, 호르몬에 의해서도 영향을 받는다. 멜라닌의 생합성은 티로시나아제(Tyrosinase)에 의해 티로신(Tyrosine)이 도파(Dopa)와 도파퀴논으로 전환되고 지속적인 산화작용을 통해 이루어지며, 이렇게 생성된 멜라닌은 멜라노좀을 통해 케라티노사이트(Keratinocyte)라는 표피 세포로 이동되어 약 28일간의 각화 과정 이후에 소실된다. 이러한 멜라닌은 자외선에 의해 과도하게 합성되거나 노화로 피부의 생리기능이 떨어진 경우에 멜라닌이 침착되어 기미, 주근깨 등과 같은 다양한 색소 침착을 유발한다.

이러한 멜라닌의 과생산 및 이에 따른 색소 침착을 방지하기 위해 티로시나아제 작용 또는 생성을 억제하거나, 멜라닌 생성에 관여하는 중간 단계를 억제하는 등의 연구와 피부 미백용 조성물들의 개발이 활발히 진행되고 있다.

피부는 자외선에 노출됨으로써 항산화효소, 비타민 C와 E, 글루타치온과 같은 항산화제가 감소되어 반응성이 매우 큰 유해한 활성산소종(ROS; Reactive oxy gen species)을 생성한다. 활성산소종은 멜라닌 생성을 촉진시키고, 주름을 유발시키는 등 광노화의 원인물질로 알려져 있고, 또한 피부의 효소적/비효소적 항산화 방어체계를 손상시켜 DNA, 단백질 산화, 피부 면역을 억제하여 염증반응을 유발시키기도 한다. 이에 활성산소를 제거하여 피부 세포를 보호하고 피부노화를 완화할 수 있는 항산화제 개발에 대한 관심과 연구가 많이 진행되고 있다.

한편, 나팔꽃씨(Ipomoea nil)는 한해살이 풀꽃인 메꽃과 나팔꽃속(흑축 : Pharbitis nilchoisy)에 속하는 빛에 예민한 단일식물로서, 나팔꽃잎은 통꽃으로 3개로 깊이 갈라져 있고 연푸른색의 깔때기 모양을 하고 있으며 열매는 가을에 익고 검은색의 것을 흑축이라 한다.

나팔꽃씨(Ipomoea nil)는 일조시간과 화분화의 관계를 규명하기 위한 식물생리학적 공시재료로 이용되어 왔고, 유전학적 재료로도 널리 이용되어 왔으나, 항산화, 미백 성능과 관련하여 나팔꽃씨(Ipomoea nil)에 대해 개시되거나 공개된 바가 없다.

또한, 일본 공개특허 제2010-531816호는 월귤 추출물을 함유하는 조성물에 관한 것으로서, 폴리페놀을 함유하는 월귤 추출물이 미백, 주름, 보습 등에 효과가 있음이 기재되어 있다.

이에 본 발명자들은 항산화, 미백 효과를 촉진하는 조성물에 대한 연구를 하던 중, 나팔꽃씨(Ipomoea nil), 월귤나무(Arctostaphylos uva-ursi) 및 참당귀(Angelica gigas Nakai)를 사용한 혼합물로부터 항산화, 미백 효과를 발현할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 나팔꽃씨(Ipomoea nil)를 포함하는 추출물을 유효성분으로 하는 초음파 추출액의 초고압 추출물을 이용한 항산화, 미백능을 동시에 발현하는 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 상기 목적 및 기타 목적들은 하기 설명된 본 발명에 의하여 모두 달성될 수 있다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

나팔꽃씨(Ipomoea nil), 월귤나무(Arctostaphylos uva-ursi) 및 참당귀(Angelica gigas Nakai)를 이용한 고상의 건조물에 추출용매를 이용하여 초음파 추출하여 얻어진 초음파 추출액의 초고압 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 미백용 조성물을 제공한다.

상기 초음파 추출은 25 내지 75 kHz의 주파수에서 10 내지 120분간 추출한 것일 수 있다.

상기 추출용매는 클로로포름, 에탄올, 메탄올, 물, 에틸아세테이트, 핵산 및 디에틸에테르 중에서 선택된 1종 이상을, 상기 고상의 건조물 무게 대비 5 내지 20배로 포함할 수 있다.

상기 나팔꽃씨(Ipomoea nil), 월귤나무(Arctostaphylos uva-ursi) 및 참당귀(Angelica gigas Nakai)는 나팔꽃씨(a) : 월귤나무(b) : 참당귀(c)가 1:0.25~1.5:0.5~2 중량비를 만족할 수 있다.

상기 초고압 추출물은 1,000 내지 10,000 bar의 압력으로 1 내지 60분간 고압처리한 다음 리플럭스 하에 60 내지 70℃ 에서 2 내지 3 시간 동안 추출한 것일 수 있다.

상기 항산화, 미백은 미백, 잡티제거, 검버섯제거, 주근깨제거, 또는 기미제거능일 수 있다.

본 발명에 따르면, 총 폴리페놀 함량과 총 플라보노이드 함량을 극대화하여 라디칼 소거활성, SOD(superoxide dismutase) 유사활성, 크산틴 산화효소 저해활성에 의한 항산화 효과와 미백 효과, 그리고 티로시나제 억제 및 멜라닌 생성 감소 효과를 동시에 발현하는 나팔꽃씨 유래 초음파 추출액의 초고압 추출물을 유효성분으로 하는 미백, 잡티제거, 검버섯, 주근깨, 기미를 예방 및 치료하기 위한 조성물을 제공할 수 있다.

도 1은 실시예 1에서 수득된 샘플(IAA-4)과 비교예 1 내지 3에서 수득된 샘플(IAA-1 내지 IAA-3)의 4종에 대해 총 폴리페놀 함량과 총 플라보노이드 함량 측정결과를 대비한 그래프이다.
도 2는 실시예 1에서 수득된 샘플(IAA-4)과 비교예 1 내지 3에서 수득된 샘플(IAA-1 내지 IAA-3)의 4종에 대한 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거활성을 대비한 그래프이다.
도 3은 실시예 1에서 수득된 샘플(IAA-4)과 비교예 1 내지 3에서 수득된 샘플(IAA-1 내지 IAA-3)의 4종에 대한 티로시나제 효소 활성을 대비한 그래프이다.
도 4는 실시예 1에서 수득된 샘플(IAA-4)과 비교예 1 내지 3에서 수득된 샘플(IAA-1 내지 IAA-3)의 4종에 대한 멜라닌 생성정도를 대비한 그래프이다.
도 5는 실시예 1에서 수득된 샘플(IAA-4)과 비교예 1 내지 3에서 수득된 샘플(IAA-1 내지 IAA-3)의 4종에 대한 세포독성을 대비한 그래프이다.

이하 본 발명에 대한 이해를 돕기 위하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니되며, 발명자는 발명을 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 점을 감안하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야 한다.

본 발명은 아래의 실시예 및 실험예에서 확인되는 바와 같이, 나팔꽃씨(Ipomoea nil), 월귤나무(Arctostaphylos uva-ursi) 및 참당귀(Angelica gigas Nakai)를 이용한 고상(solid phase)의 건조물을 제조하고 여기에 추출용매를 이용하여 초음파 추출하여 얻어진 추출액을 초고압 처리하는 방식으로 추출물을 제조할 경우 총 폴리페놀 함량과 총 플라보노이드 함량을 극대화하여 라디칼 소거활성, SOD(superoxide dismutase) 유사활성, 크산틴 산화효소 저해활성에 의한 항산화 효과와 미백 효과, 그리고 티로시나제 억제 및 멜라닌 생성 감소 효과를 동시에 발현함으로써, 미백, 잡티제거, 검버섯, 주근깨, 기미를 예방 및 치료하기 위한 조성물을 제공할 수 있다.

에탄올 상온 추출물, 에탄올 환류 추출물, 혹은 에탄올 초고압 추출물 등은 총 폴리페놀 함량과 총 플라보노이드 함량을 극대화하여 라디칼 소거활성, SOD(superoxide dismutase) 유사활성, 크산틴 산화효소 저해활성에 의한 항산화 효과와 미백 효과, 그리고 티로시나제 억제 및 멜라닌 생성 감소 효과를 동시에 나타내지 않았으며, 또한 아래의 실험예에서 제시되어 있지 않지만, 나팔꽃씨(Ipomoea nil)의 함량, 월귤나무(Arctostaphylos uva-ursi)의 함량, 및 참당귀(Angelica gigas Nakai)의 합량이 1:0.25~1.5:0.5~2의 중량비를 만족하지 못하는 경우에도 총 폴리페놀 함량과 총 플라보노이드 함량을 극대화하여 라디칼 소거활성, SOD(superoxide dismutase) 유사활성, 크산틴 산화효소 저해활성에 의한 항산화 효과와 미백 효과, 그리고 티로시나제 억제 및 멜라닌 생성 감소 효과를 동시에 나타내지 않거나 효과가 감소하였다.

본 발명의 총 폴리페놀 함량과 총 플라보노이드 함량을 극대화하여 라디칼 소거활성, SOD(superoxide dismutase) 유사활성, 크산틴 산화효소 저해활성에 의한 항산화 효과와 미백 효과, 그리고 티로시나제 억제 및 멜라닌 생성 감소 효과를 동시에 구현하는 조성물은 이러한 실험 결과에 기초하여 제공되는 것으로, 본 발명의 항산화 및 미백용 조성물은 나팔꽃씨(Ipomoea nil)에 월귤나무(Arctostaphylos uva-ursi) 및 참당귀(Angelica gigas Nakai)의 1:0.25~1.5:0.5~2의 중량비로 혼합한 다음 수득한 고상물(solid phase product)에 추출용매를 이용하여 초음파 처리하여 얻어진 초음파 추출액의 초고압 추출물을 유효성분으로 포함함을 특징으로 한다.

본 발명의 항산화 및 미백용 조성물은 바람직하게는 나팔꽃씨(Ipomoea nil)에 월귤나무(Arctostaphylos uva-ursi) 및 참당귀(Angelica gigas Nakai)를 1:0.25~1.5:0.5~2의 중량비로 혼합한 다음 수득한 고상물(solid phase product)에 추출용매를 이용하여 초음파 처리하여 얻어진 초음파 추출액의 초고압 추출물을 유효성분으로 포함함을 특징으로 한다.

본 기재에서 유효성분은 달리 특정하지 않는 한, 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.

본 기재에서 추출물은 달리 특정하지 않는 한, 추출 대상인 그 고상물 자체를 추출용매를 이용하여 얻어진 추출물 또는 그 추출물을 분획하여 얻어진 분획물을 의미하며, 추출 방법은 활성물질의 극성, 추출 정도, 보존 정도를 고려하여 냉침, 환류, 가온, 초음파 방사, 초임계 추출, 초고압 추출 등의 방법을 적용할 수 있다. 분획된 추출물의 경우 추출물을 특정 용매에 현탁시킨 후 극성이 다른 용매와 혼합, 정치시켜 얻은 분획물, 조추출물을 실리카겔 등이 충진된 칼럼에 흡착시킨 후 소수성 용매, 친수성 용매 또는 이들의 혼합 용매를 이동상으로 하여 얻은 분획물을 포함하는 의미이다.

본 기재에서, 상기 고상물의 형상은 특별히 제한하지 않으며, 환(pills) 형태, 과립 형태, 가루 형태 등일 수 있다.

상기 고상물은 나팔꽃씨(Ipomoea nil)와, 월귤나무(Arctostaphylos uva-ursi) 그리고 참당귀(Angelica gigas Nakai)을 깨끗이 세정한 다음 고상물 형태로 얻어질 수 있다. 깨끗이 세정한 후에는 자연건조(음건), 열풍건조 등 임의의 방식으로 건조됨으로써 수분의 일부가 제거된 후에 파쇄한 다음 초음파 처리에 사용될 수 있다.

본 발명에서, 월귤나무와 참당귀는 달리 특정하지 않는 한, 다양한 기관 또는 부분(예 잎, 가지, 꽃, 뿌리, 줄기, 열매 등)으로부터 추출하여 얻은 것을 의미하고, 바람직하게는 각각의 잎 또는 열매 또는 뿌리로부터 얻은 추출물이고, 가장 바람직하게는 각각의 열매 및 뿌리로부터 얻은 추출물을 의미한다.

월귤(Vaccinium vitis-idaea)은 속씨식물인 진달래과의 작은 상록수의 관목으로 과실수를 맺는다. 월귤나무의 잎과 열매는 모두 약으로 사용하여 특히 류마티스 또는 통풍에 열매를 달인 물을 사용한다. 옛날에는 항생제 대용으로 사용하였다. 최근에는 링곤베리라고 불리면서 비타민이 풍부하다고 알려져 있다.

또한 참당귀(Angelica gigas Nakai)는 미나리과(Apiaceae)에 속하는 다년생 식물로서, 뿌리를 이용하여 한방에서 보혈(補血), 화혈지통(和血止痛), 윤장(潤腸) 등의 효능으로 심간혈허(心肝血虛) 등의 병증에 주로 사용되었다. 최근 연구에 따르면 세포내 혈관생성의 억제를 통한 항암효과, 항염증작용, 관절연골 소실 억제작용, 혈당강화 및 멜라닌색소 생성 억제를 통한 미백효능 등의 효능이 알려져 있다.

또한, 분쇄물 형태 그대로, 또는 단계별 증숙한 후 건조시킨 상태로 사용될 수 있으며, 단계별 증숙한 후 건조시킨 상태로 사용할 경우 보관의 유용성 및 유효성분의 증대 효과를 제공할 수 있다.

상기 초음파 처리는 초음파 진동에 의해 발생되는 에너지를 이용하는 처리법으로, 초음파가 추출용매 속에서 시료에 포함된 불용성인 용매를 파괴시킬 수 있으며, 이때 발생되는 높은 국부온도로 인하여 주위에 위치하는 반응물 입자들의 운동에너지를 크게 하기 때문에 반응에 필요한 충분한 에너지를 얻게 되고, 초음파 에너지의 충격 효과로 높은 압력을 유도하여 시료에 함유된 물질과 용매의 혼합 효과를 높여주어 추출 효율을 증가시킬 수 있다.

초음파 추출법에 사용할 수 있는 추출용매는 일례로 클로로포름, 에탄올, 메탄올, 물, 에틸아세테이트, 핵산 및 디에틸에테르 중에서 선택된 1종 또는 2종 이상의 혼합물을 사용할 수 있다.

상기 추출용매는 상기 고상 건조물 무게 대비 일례로 5 내지 20배, 구체적인 예로 8 내지 15배로 투입하고 초음파 처리하는 것이 반응 효율을 극대화할 수 있어 바람직하다.

초음파 처리시 용매로 알코올을 사용하는 것이 초음파 처리 이후 알코올 추출하는 경우보다 개선된 성능을 제공할 수 있어 바람직하다.

또한, 상기 알코올로는 50 내지 90%(v/v) 에탄올을 사용하는 것이, 높은 항균력과 극성을 제공할 수 있어 바람직하며, 특히 70%(v/v) 에탄올의 경우에 농도가 더 높은 에탄올을 사용하는 것보다 살균력이 개선될 수 있다.

즉, 상기 초음파 추출물은 나팔꽃씨(Ipomoea nil), 월귤나무(Arctostaphylos uva-ursi) 및 참당귀(Angelica gigas Nakai)를 이용한 고상의 건조물의 70% 에탄올 초음파 추출물일 수 있다.

상기 초음파 추출은 일례로 25 내지 75 kHz의 주파수에서 10 내지 120분간 추출을 수행할 수 있다. 이 경우에 유효물질 추출효율 증대를 제공할 수 있다. 구체적으로, 상기 초음파 추출은 35 내지 60 kHz의 주파수에서 30 내지 90분간 수행할 수 있다.

그런 다음 본 기재에서는 상기 초음파 처리액을 초고압 추출하는 것이 최적의 유효성분을 추출하기에 적절하다.

상기 초고압 추출은 불순물을 제거하고 고순도로 유효 성분을 추출해낼 수 있어 효율이 우수한 것으로 공지되어 있으나, 고압 장치를 사용하여야 하므로 시설비 및 유지비가 많이 드는 단점이 있어 초고압 추출은 고효율로 이루어져야만 경제성이 있는 것으로 알려져 있다.

또한, 추출의 온도 및 압력 조건에 따라 유효성분의 성질 변화가 가능하다. 예를 들어 초음파 추출액을 저압조건으로 추출한 경우, 유효성분에 대한 용해력이 떨어져 추출물 중 당의 농도가 높아지게 되고, 유효성분 추출조건에 적합한 고압조건으로 추출하는 경우에도 추출 초반부의 추출물을 분획하여 별도 구분하면 후반부 추출물에 비해 유효성분 농도가 높아지게 된다. 이런 추출 방법에서 분획시점을 조정하여 유리지방산 함량과 유효성분 함량의 조절이 가능한데, 유리지방산 함량이 낮은 즉, 산가가 낮은 추출물을 얻기 위해서는 원료의 유리지방산 함량이 낮거나 유효성분의 함유량이 높은 분획구간을 섞어 농축 정도를 낮추는 방법이 있다.

원료의 유리지방산 함량은 원산지나 작황에 따라 차이가 발생하며 보통 낮은 산가의 원료는 높은 가격으로 형성되어 있기 때문에 원료 경쟁력에서 떨어지게 된다. 게다가 유리지방산이 없는 원료는 없기 때문에 추출물 농축 분획구간에는 유리지방산이 농축되어 낮은 산가의 원료를 사용하는 규격을 설정하고 제품을 만든다고 해도 어느 농도 이상의 유효성분 함량을 충족하면서 산가 규격을 충족시키는 것이 쉬운 일은 아니다. 이에 초음파 추출액을 이용하여 고농도 분획물을 만드는 공정이 산업적 안정성을 갖기 위해서는 초고압 추출 분획물에서 유리지방산을 제거하는 기술이 필요하다.

본 발명에 따르면, 유효성분 함량을 극대화하고 유리지방산의 함량을 낮춘 추출물을 제공하도록, 상기 초고압 추출은 일례로 1,000 내지 10,000 bar의 압력, 또는 3,000 내지 7,000 bar의 압력으로 1 내지 60분간, 또는 5 내지 30분간 고압 처리하는 것이 바람직하다.

상기 초고압 추출 후 리플럭스 하에 추가 추출을 수행할 수 있다.

상기 추가 추출은 열처리 없이 실온에서 12시간 이하, 또는 1 내지 6시간 동안 반복하여 추출할 수 있다. 상기 반복 추출 횟수는 5회 이하, 구체적인 예로 2 내지 3회일 수 있다.

전술한 유리지방산은 제거하되 유효성분 손실은 없으며 효능에 영향을 주지 않는 정제 공정이 필요하며, 이를 위하여 미세 여과막을 사용하여 여과한 다음 감압 농축하여 유리지방산을 제거하는 방법이 바람직하고, 보다 우수한 효능효과를 제공하도록 미세 여과막은 1.0 ㎛ 이하, 바람직하게는 0.45 ㎛ 이하의 여과막을 사용하는 것이 더욱 바람직하다.

전술한 정제 공정을 거쳐 유효 추출물을 수득할 수 있다.

본 기재에서 유효 추출물은 동결건조, 진공건조, 열풍건조, 분무건조, 감압농축 등의 방식으로 초음파 추출에 앞서 투입된 추출용매가 제거된 농축된 액상의 추출물 또는 고상의 추출물이 포함된다.

본 기재에서, 결과 추출물의 형태는 특별히 제한되지 않으며, 환(pills) 형태, 과립 형태, 가루 형태를 비롯한 분말 또는 기타 추출물 형태일 수 있다.

본 기재에 따른 추출물 제조방법은, 일례로 나팔꽃씨(Ipomoea nil)와, 월귤나무(Arctostaphylos uva-ursi) 및 참당귀(Angelica gigas Nakai)를 깨끗이 세정한 다음 수득된 고상물 또는 그 건조물로부터 초음파 추출물을 추출하는 단계; 및 초음파 추출물을 초고압 추출하는 단계;를 포함할 수 있다.

본 기재에서 상기 나팔꽃씨(Ipomoea nil)와, 월귤나무(Arctostaphylos uva-ursi) 그리고 참당귀(Angelica gigas Nakai)를 깨끗이 세정한 다음 고상물 형태로 얻어질 수 있다. 깨끗이 세정한 후에는 자연건조(음건), 열풍건조 등 임의의 방식으로 건조됨으로써 수분의 일부가 제거된 후에(고상물의 수분 함량이 10%(w/w) 이하가 되도록 분쇄물 형태로) 10 내지 50 메쉬, 구체적으로는 30 내지 50 메쉬로 파쇄하여 표면적을 높인 다음 초음파 전처리에 사용될 수 있다.

필요에 따라서는 95℃ 이하, 또는 50 내지 90℃에서 36시간 이상, 또는 48시간 이상 건조한 다음 분쇄할 수 있다.

상기 고상물은 초고압 추출하기에 앞서 사전추출 단계를 수행할 수 있다.

본 기재에서 사용되는 고상물에는 특별한 제한이 없으며, 해당 사전추출 단계는 고상물 또는 그 건조물('고상의 건조물'이라고도 함)의 표면에 있는 미생물, 잔류농약, 보존제 등의 유해물질을 제거하기 위한 처리, 초음파의 접촉 면적을 증가시키기 위한 처리 등을 포함할 수 있다.

상기 사전추출 방법은 특별히 제한되지 않으나, 초음파 처리, 자외선 조사, 열처리, 박피, 분쇄, 배전 중 1 이상을 사용할 수 있으며, 추가 부산물의 생성을 방지하면서 고순도로 분쇄할 수 있는 초음파 처리가 가장 바람직하다.

초음파 처리할 경우, 고상의 건조물에 추출용매를 공급하여 처리 효율을 높이는 것이 바람직하며, 이때 사용가능한 추출용매는 클로로포름, 에탄올, 메탄올, 물, 에틸아세테이트, 핵산 및 디에틸에테르 중에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다. 이때 추출용매를 상기 고상의 건조물의 무게 대비 5 내지 20배로 포함할 수 있다.

상기 초음파 처리는 일례로 25 내지 75 kHz의 주파수에서 10 내지 120분간 추출을 수행하는 것이 처리효율을 증대시킬 수 있어 바람직하다.

이어서, 초음파 처리액(초음파 추출액이라고도 함)을 초고압 추출기에 충진하고, 초고압 조건 하에 초고압 추출물을 추출할 수 있다.

상기 초고압 조건은 1,000 내지 10,000 bar의 압력, 또는 3,000 내지 7,000 bar의 압력일 수 있다. 상기 범위 내에서 초고압추출의 효율이 향상될 수 있다.

상기 초고압 추출은 일례로 1 내지 60분간, 또는 5 내지 30분간 수행될 수 있다. 상기 범위 내에서 초고압추출의 효율이 향상될 수 있다.

초고압 추출한 다음 리플럭스 하에 후추출을 수행할 수 있다. 이때 별도의 가열 없이 실온에서 12시간 이하, 구체적인 예로 1 내지 6시간 동안 반복 추출할 수 있다. 상기 반복 추출 횟수는 5회 이하, 구체적인 예로 2 내지 3회일 수 있다.

상기 초고압 추출물은 앞서 설명한 정제 및 감압 농축하여 초음파 처리시 제공된 추출용매를 제거하고 유효 추출물을 분리해낼 수 있다.

본 발명의 조성물은 그 유효성분 이외에 피부 관련 활성을 보강 또는 추가하기 위하여 당업계에 공지된 피부 미백 성분, 피부 주름 개선 성분, 피부 탄력 개선 성분, 자외선 보호 성분, 피부 보습 성분 등을 포함하여 제조될 수 있다.

상기 피부 미백 성분으로 알부틴, 나이아신아마이드, 아스코빌글루코사이드, 알파-비사보롤, 유용성 감초 추출물 등을 들 수 있다.

상기 피부 주름 개선 성분으로 레티놀, 레티닐 팔미테이트, 아데노신, 폴리에톡실레이티드아마이드 등을 들 수 있다.

상기 자외선 보호 성분으로서는 드로메트리졸, 드로메트리졸트리실록산, 디갈로일트리올리에이트, 디메치코디에칠벤잘말로네이트, 디에칠헥실부타미도트리아존, 소나무 껍질 추출물 등의 복합물, 포스파티딜세린, 핑거루트 추출 분말, 홍삼과 산수유 등의 복합 추출물 등을 들 수 있다.

상기 보습 성분으로 AP 콜라겐 효소 분해 펩타이드, 콜라겐 펩타이드, N-아세틸글루코사민, 곤약 감자 추출물, 민들레 등의 복합 추출물, 쌀겨 추출물, 옥수수 배아 추출물, 저분자 콜라겐 펩타이드, 지초 추출 분말, 포스파티딜세린, 히알루론산 등을 들 수 있다.

기타 피부 미백 성분, 주름 개선 성분, 자외선 보호 성분, 피부 보습 성분들에 대해서는 화장품법에 따른 기능성화장품공전(식약처고시 "기능성화장품 기준 및 시험방법"), 건강기능식품에 관한 법률의 건강기능식품공전(식약처고시 "건강기능식품 기준 및 규격)을 참조할 수 있다. 이러한 성분들은 본 발명의 조성물에 그 유효성분과 함께 하나 이상 포함될 수 있다.

본 발명의 조성물은 그 유효성분을 제품 유형, 제품의 제형 등에 따라 항산화 효과, 미백 효과 등을 나타낼 수 있는 한 임의의 함량 (유효량)으로 포함할 수 있는데, 해당 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 0.001 내지 15 wt% 범위 내에서 결정될 수 있다.

본 발명에서 유효량은, 달리 특정하지 않는 한 그 적용 대상인 포유동물, 바람직하게는 사람에게 의료 전문가 등의 제언에 의한 투여 기간 동안 본 발명의 조성물이 투여될 때, 항산화 효과, 미백 효과 등 의도한 의료적/화장품학적 효과 등을 나타낼 수 있는, 본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.

본 발명의 조성물은 구체적인 양태에 있어서, 화장료 조성물로 파악할 수 있다.

본 발명의 조성물이 화장료 조성물로 파악될 경우에도 그 화장료 조성물은 그 용도상, 법률상 임의의 제품 구분을 띨 수 있으며, 구체적으로 피부 미백 등의 용도를 가진 기능성 화장품, 비기능성 일반 화장품 등일 수 있다.

제품 형태에 있어서도 임의의 제품 형태를 띨 수 있는데, 구체적으로 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 젤, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 스프레이 등으로 제형화될 수 있다. 구체적인 제품 형태에 있어서는 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형 등일 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 그 유효성분 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들, 예컨대, 안정화제, 용해화제, 계면활성제, 비타민, 색소 및 항료와 같은 보조제, 및 담체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 젤인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜, 소르비탄의 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 피부 주름 개선 활성, 피부 탄력 개선 활성 등을 나타내는 그 유효성분을 포함하는 것을 제외하고는 당업계에 통상적으로 수행되는 화장료 조성물의 제조방법에 따라 제조할 수 있다.

본 발명의 조성물은 다른 구체적인 양태에 있어서, 식품 조성물로 파악할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 어떠한 형태로도 제조될 수 있으며, 예컨대 차, 쥬스, 탄산음료, 이온음료 등의 음료류, 우유, 요구루트 등의 가공 유류, 껌류, 떡, 한과, 빵, 과자, 면 등의 식품류, 정제, 캡슐, 환, 과립, 액상, 분말, 편상, 페이스트상, 시럽, 겔, 젤리, 바 등의 건강기능식품 제제류 등으로 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 식품 조성물은 기능상의 구분에 있어서 제조/유통 시점의 시행 법규에 부합하는 한 임의의 제품 구분을 띨 수 있다. 예컨대 건강기능식품에 관한 법률에 따른 건강기능 식품이거나, 식품위생법의 식품공전(식약처 고시, 식품의 기준 및 규격)상 각 식품유형에 따른 두유류, 발효음료류, 특수용도식품 등일 수 있다.

본 발명의 식품 조성물에는 그 유효성분 이외에 식품첨가물이 포함될 수 있다. 식품첨가물은 일반적으로 식품을 제조, 가공 또는 보존함에 있어 식품에 첨가되어 혼합되거나 침윤되는 물질로서 이해되는데, 식품과 함께 매일 그리고 장기간 복용되므로 그 안전성이 보장되어야 한다. 식품위생법에 따른 식품첨가물공전(식약처 고시, 식품첨가물 기준 및 규격)에는 안전성이 보장된 식품첨가물이 화학적 합성품, 천연 첨가물, 혼합 제제류로 구분하여 한정적으로 규정되어 있다.

이들 식품첨가물은 기능적 측면에 있어서는 감미제, 풍미제, 보존제, 유화제, 산미료, 점증제 등으로 구분될 수 있다.

감미제는 식품이 적당한 단맛을 나게 하는 양으로 사용될 수 있으며, 천연의 것이거나 합성된 것일 수 있다. 바람직하게는 천연 감미제를 사용하는 경우인데, 천연 감미제로서는 옥수수 시럽 고형물, 꿀, 수크로오스, 프룩토오스, 락토오스, 말토오스 등의 당 감미제를 들 수 있다.

풍미제는 맛이나 향을 좋게 하기 위하여 사용될 수 있는데, 천연의 것과 합성된 것 모두 사용될 수 있다. 바람직하게는 천연의 것을 사용하는 경우이다. 천연의 것을 사용할 경우에 풍미 이외에 영양 강화의 목적도 병행할 수 있다. 천연 풍미제로서는 사과, 레몬, 감귤, 포도, 딸기, 복숭아 등에서 얻어진 것이거나 녹차잎, 둥굴레, 대잎, 계피, 국화 잎, 자스민 등에서 얻어진 것일 수 있다. 또 인삼(홍삼), 죽순, 알로에 베라, 은행 등에서 얻어진 것을 사용할 수도 있다. 천연 풍미제는 액상의 농축액이나 고형상의 추출물일 수 있다.

합성 풍미제도 사용될 수 있는데, 합성 풍미제는 에스테르, 알콜, 알데하이드, 테르펜 등이 이용될 수 있다.

보존제로는 소듐 소르브산칼슘, 소르브산나트륨, 소르브산칼륨, 벤조산칼슘, 벤조산나트륨, 벤조산칼륨, EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) 등이 사용될 수 있고, 또 유화제로서는 아카시아검, 카르복시메틸셀룰로스, 잔탄검, 펙틴 등을 들 수 있다.

산미료로는 연산, 말산, 푸마르산, 아디프산, 인산, 글루콘산, 타르타르산, 아스코르브산, 아세트산, 인산 등이 사용될 수 있다. 산미료는 맛을 증진시키는 목적 이외에 미생물의 증식을 억제할 목적으로 식품 조성물이 적정 산도로 되도록 첨가될 수 있다.

점증제로는 현탁화 구현제, 침강제, 겔형성제, 팽화제 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 전술한 식품첨가물 이외에, 기능성과 영양성을 보충, 보강할 목적으로 당업계에 공지되고 식품첨가물로서 안정성이 보장된 생리활성 물질이나 미네랄류를 포함할 수 있다.

그러한 생리활성 물질로서는 녹차 등에 포함된 카테킨류, 비타민 B1, 비타민 C, 비타민 E, 비타민 B12 등의 비타민류, 토코페롤, 디벤조일티아민 등을 들 수 있으며, 미네랄류로서는 구연산 칼슘 등의 칼슘 제제, 스테아린산마그네슘 등의 마그네슘 제제, 구연산철 등의 철 제제, 염화 크롬, 요오드칼륨, 셀레늄, 게르마늄, 바나듐, 아연 등을 들 수 있다.

본 발명의 식품 조성물에는 전술한 식품첨가물이 제품 유형에 따라 그 첨가 목적을 달성할 수 있는 적량으로 포함될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물에 포함될 수 있는 기타 식품첨가물과 관련하여서는 식품공전이나 식품첨가물 공전을 참조할 수 있다.

본 발명의 조성물은 구체적인 양태에 있어서, 약제학적 조성물로 파악할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하여 당업계에 공지된 통상의 방법으로 투여 경로에 따라 경구용 제형 또는 비경구용 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명에서 약제학적으로 허용이란, 달리 특정하지 않는 한 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 것을 의미한다.

본 발명의 약제학적 조성물이 경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 제형으로 제조될 수 있다.

약제학적으로 허용되는 적합한 담체로는, 일례로 락토스, 글루코스, 슈크로스, 덱스트로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨 등의 당류, 옥수수 전분, 감자 전분, 밀 전분 등의 전분류, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 등의 셀룰로오스류, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 맥아, 젤라틴, 탈크, 폴리올, 식물성유 등을 들 수 있다. 필요에 따라 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 및/또는 부형제를 포함하여 제제화할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물이 비경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 주사제, 경피 투여제, 비강 흡입제 및 좌제의 형태로 제제화될 수 있다.

주사제로 제제화할 경우 적합한 담체로서는 멸균수, 에탄올, 글리세롤이나 프로필렌 글리콜 등의 폴리올 또는 이들의 혼합물을 들 수 있으며, 바람직하게는 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline)나 주사용 멸균수, 5% 덱스트로스 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다.

경피 투여제로 제제화할 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태로 제제화될 수 있다.

비강 흡입제의 경우 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 등의 적합한 추진제를 사용하여 에어로졸 스프레이 형태로 제제화될 수 있다.

좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 폴리에틸렌글리콜류, 카카오지, 라우린지, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르류, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트류, 소르비탄 지방산 에스테르류 등이 사용될 수 있다.

약제학적 조성물의 제제화와 관련하여서는 당업계에 공지되어 있으며, 구체적으로 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)] 등을 참조할 수 있다. 상기 문헌은 본 명세서의 일부로서 간주된다.

본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 성별, 연령, 환자의 중증도, 투여 경로에 따라 1일 0.001 mg/kg 내지 10 g/kg 범위, 바람직하게는 0.001 mg/kg 내지 1 g/kg 범위일 수 있다. 투여는 1일 1회 또는 수회로 나누어 이루어질 수 있다. 이러한 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다.

본 발명의 화장료 조성물, 식품 조성물, 약제학적 조성물은 해당 분야에 공지된 유효성분을 포함하는 것을 제외하고는 당업계에서 통상적으로 행하여지는 해당 조성물의 제조방법에 따라 제조할 수 있다.

본 기재의 항산화 및 미백용 조성물을 설명함에 있어서, 명시적으로 기재하지 않은 다른 조건이나 장비 등은 당업계에서 통상적으로 실시되는 범위 내에서 적절히 선택할 수 있고, 특별히 제한되지 않음을 명시한다.

이하, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정하는 것은 아니다.

[실시예]

<실시예 1> 초고압초음파 나팔꽃씨 추출물의 제조

(1) 나팔꽃씨(Ipomoea nil), 월귤나무(Arctostaphylos uva-ursi) 열매 및 참당귀(Angelica gigas Nakai) 뿌리를 깨끗이 세정한 후 70 ℃에서 48 시간 건조하여 40 mesh 이하 사이즈로 분쇄하였다. 분쇄한 원료를 일정한 중량(100 g : 100 g : 100 g)으로 혼합하였다.

(2) 상기 혼합한 고상 건조물 총 무게의 10배의 70% 에탄올을 넣고 초음파추출기를 사용하여 주파수 50 kHz 로 60분간 처리하였다.

(3) 그런 다음 초고압 추출기(CIP-L2-100-300, Ilshinautoclave Co., Ltd., Korea)에 충진하고 5,000 bar의 압력으로 15 분간 추출한 다음 70 ℃에서 3시간동안 3회 반복하여 환류 추출을 수행하였다.

(4) 수득된 추출물을 0.45 ㎛ membrane filter로 여과한 다음 감압 농축기로 에탄올을 제거하여 초고압초음파 나팔꽃씨 추출물(샘플 IAA-4)을 제조하였다.

<비교예>

<비교예 1> 교반 나팔꽃씨 추출물의 제조

(1) 나팔꽃씨(Ipomoea nil), 월귤나무(Arctostaphylos uva-ursi) 열매 및 참당귀(Angelica gigas Nakai) 뿌리를 깨끗이 세정한 후 70 ℃에서 48 시간 건조하여 40 mesh 이하 사이즈로 분쇄하였다. 분쇄한 원료를 일정한 중량(100 g : 100 g : 100 g)으로 혼합하였다.

(2') 상기 혼합한 고상 건조물 총 무게의 10배의 70% 에탄올을 넣고 상온에서 200 rpm으로 12시간, 3회 반복 추출하였다.

(4) 수득된 추출물을 0.45 ㎛ membrane filter로 여과한 다음 감압 농축기로 에탄올을 제거하여 교반 나팔꽃씨 추출물(샘플 IAA-1)을 제조하였다.

<비교예 2> 환류 나팔꽃씨 추출물의 제조

(1) 나팔꽃씨(Ipomoea nil), 월귤나무(Arctostaphylos uva-ursi) 열매 및 참당귀(Angelica gigas Nakai) 뿌리를 깨끗이 세정한 후 70 ℃에서 48 시간 건조하여 40 mesh 이하 사이즈로 분쇄하였다. 분쇄한 원료를 일정한 중량(100 g : 100 g : 100 g)으로 혼합하였다.

(2") 상기 혼합한 고상 건조물 총 무게의 10배의 70% 에탄올을 넣었다.

(3') 그런 다음 70 ℃에서 3시간 동안 3회 반복하여 환류 추출을 수행하였다.

(4) 수득된 추출물을 0.45 ㎛ membrane filter로 여과한 다음 감압 농축기로 에탄올을 제거하여 환류 나팔꽃씨 추출물(샘플 IAA-2)을 제조하였다.

<비교예 3> 초고압 나팔꽃씨 추출물의 제조

(1) 나팔꽃씨(Ipomoea nil), 월귤나무(Arctostaphylos uva-ursi) 열매 및 참당귀(Angelica gigas Nakai) 뿌리를 깨끗이 세정한 후 70 ℃에서 48 시간 건조하여 40 mesh 이하 사이즈로 분쇄하였다. 분쇄한 원료를 일정한 중량(100 g : 100 g : 100 g)으로 혼합하였다.

(2") 상기 혼합한 고상 건조물 총 무게의 10배의 70% 에탄올을 넣었다.

(3) 그런 다음 초고압 추출기(CIP-L2-100-300, Ilshinautoclave Co., Ltd., Korea)에 충진하고 5,000 bar의 압력으로 15 분간 초고압 추출을 수행한 다음 70 ℃에서 3시간 동안 3회 반복 환류 추출을 수행하였다.

(4) 수득된 추출물을 0.45 ㎛ membrane filter로 여과한 다음 감압 농축기로 에탄올을 제거하여 초고압 나팔꽃씨 추출물(샘플 IAA-3)을 제조하였다.

<실험예>

<실험예 1> 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량실험

상기 실시예 1에서 수득한 샘플과 비교예 1 내지 3에서 수득한 샘플에 대한 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량 실험을 수행하였다.

(1-1) 총 폴리페놀 함량

샘플들(IAA-1 내지 IAA-4)을 각각 100 mg씩 취한 후 80 % 에탄올을 이용하여 100 mL로 희석하여 검액으로 한다. 따로 갈릭산(gallic acid) 100 mg을 취한 후 80 % 에탄올을 이용하여 100 mL로 한다. 이 액을 0.1, 0.2, 0.5, 1.0 mL을 취하여 5 mL로 희석한 액을 표준액으로 한다. 검액 및 표준액을 e-tube에 100 ㎕와 10 % sodium carbonate 100 ㎕를 가한 뒤 Folin-Ciocalteu 시약 100 ㎕를 넣고 30초간 vortex를 이용하여 섞어준 뒤 30분간 암소에 방치한 후 반응액의 흡광도 값을 750 nm에서 측정하였다. 측정된 흡광도를 표준액의 검량선을 그려 총 폴리페놀 함량을 mg GAE/g으로 하기 도 1에 나타내었다.

(1-2) 총 플라보노이드 함량

샘플들(IAA-1 내지 IAA-4)을 각각 100 mg씩 취한 후 80 % 에탄올을 이용하여 100 mL로 희석하여 검액으로 한다. 따로 quercetin 100 mg을 취한 후 80 % 에탄올을 이용하여 100 mL로 한다. 이액을 0.1, 0.2, 0.5, 1.0 mL을 취하여 5 mL로 희석한 액을 표준액으로 한다. 검액 및 표준액을 e-tube에 500 ㎕와 10 % aluminum nitrate 100 ㎕와 1 M potassium acetate 100 ㎕를 넣어 혼합한다. 혼합 40분 후 UV-vis spectrophotometer를 이용하여 415 nm 흡광도를 측정하여 흡광도를 측정한다. 측정된 흡광도를 표준액의 검량선을 그려 총 플라보노이드 함량을 mg QE/g 으로 하기 도 1에 함께 나타내었다.

하기 도 1에서 보듯이, 실시예 1에 따른 샘플(IAA-4)의 경우 폴리페놀 함량 분석 결과 3.53 mgGAE/g으로 가장 높게 확인되었고, 다음으로 비교예 3에 따른 샘플(IAA-3)의 경우 3.42 mgGAE/g, 비교예 2에 따른 샘플(IAA-2)의 경우 3.02 mgGAE/g, 비교예 1에 따른 샘플(IAA-1)의 경우 2.24 mgGAE/g의 폴리페놀 함량을 각각 나타내었다.

또한, 실시예 1에 따른 샘플(IAA-4)의 경우 플라보노이드 함량 분석 결과 3.14 mgGAE/g으로 가장 높게 확인되었고, 다음으로 비교예 3에 따른 샘플(IAA-3)의 경우 2.91 mgGAE/g, 비교예 2에 따른 샘플(IAA-2)의 경우 2.11 mgGAE/g, 비교예 1에 따른 샘플(IAA-1)의 경우 1.71 mgGAE/g의 플라보노이드 함량을 각각 나타내었다.

따라서 초음파초고압 처리를 하였을 때, 폴리페놀 함량과 플라보노이드 함량 모두 증가하는 것을 확인할 수 있다.

<실험예 2> 항산화활성 시험1

상기 실시예 1에서 수득한 샘플과 비교예 1 내지 3에서 수득한 샘플에 대한 항산화 시험으로 시료의 라디칼 소거능을 평가할 수 있는 ABTS법 및 DPPH법 radical 소거능 실험을 수행하였다.

(2-1) ABTS 라디칼 소거활성

샘플들(IAA-1 내지 IAA-4)을 각각 물에 희석하여 100 ㎍/mL, 250 ㎍/mL, 500 ㎍/mL 농도의 검액을 조제한다. 7 mM ABTS와 2.45 mM potassium persulfate를 혼합하여 암실에서 12시간동안 상온에서 반응시켜 ABTS 양이온을 형성시킨다. 이후 734 nm에서 흡광도 값이 0.70 ± 0.02가 되도록 에탄올을 넣어 조절하였다.

96 웰 플레이트에 검액 100 ㎕와 조제한 ABTS 용액 100 ㎕를 가하여 7 분간 실온에서 반응하여 734 nm에서 측정한다. 공시험액과 비교하여 ABTS 소거율을 다음과 같이 백분율(%)로 구하고 하기 도 2에 나타내었다.

ABTS radical 소거능 (%) = [Control - (Sample - Blank)]/Control Х 100

(단, Control : ABTS reagent의 흡광도, Sample : Sample + ABTS reagent의 흡광도, Blank : Sample + Blank의 흡광도)

(2-2) DPPH 라디칼 소거활성

샘플들(IAA-1 내지 IAA-4)을 각각 물에 희석하여 100 ㎍/mL, 250 ㎍/mL, 500 ㎍/mL 농도의 검액을 조제한다. 96 웰 플레이트에 검액 100 ㎕와 0.2 mM DPPH 100 ㎕를 넣고 30분 후 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정한다. 공시험액과 비교하여 DPPH radical 소거율을 다음과 같이 백분율(%)로 구하고 하기 도 2에 나타내었다.

DPPH radical 소거능 (%) = [Control - (Sample - Blank)]/Control Х 100

(Control : DPPH reagent의 흡광도, Sample : Sample + DPPH reagent의 흡광도, Blank : Sample + Blank의 흡광도)

하기 도 2에서 보듯이, ABTS radical 분석 결과 대조군인 아스코르브산이 500 ㎍/mL에서 98.5%로 가장 높게 확인되었고, 다음으로 실시예 1에 따른 샘플(IAA-4)의 경우 500 ㎍/mL에서 64.8%로 높게 확인되었고, 다음으로 비교예 3에 따른 샘플(IAA-3), 비교예 2에 따른 샘플(IAA-2), 그리고 비교예 1에 따른 샘플(IAA-1)의 경우에 500 ㎍/mL에서 각각 60.6%, 55.5%, 54.1%를 나타내었다.

또한, DPPH radical 분석 결과, 전술한 ABTS 분석결과와 같은 경향을 나타내었다. 구체적으로, 실시예 1에 따른 샘플(IAA-4), 비교예 3에 따른 샘플(IAA-3), 비교예 2에 따른 샘플(IAA-2), 그리고 비교예 1에 따른 샘플(IAA-1)의 경우에 500 ㎍/mL에서 각각 62.8%, 60.7%, 55.9%, 52.7%를 나타내었다. 이때 대조군인 아스코르브산은 500 ㎍/mL에서 97.7%로 분석되었다.

<실험예 3> 항산화활성 시험2

상기 실시예 1에서 수득한 샘플과 비교예 1 내지 3에서 수득한 샘플에 대한 항산화 시험으로 SOS 유사활성 및 크산틴 산화효소(Xanthine oxidase) 저해 활성 실험을 수행하였다.

(3-1) SOS 유사활성

샘플들(IAA-1 내지 IAA-4)을 각각 물에 희석하여 100 ㎍/mL, 250 ㎍/mL, 500 ㎍/mL 농도의 검액을 조제한다. 검액 0.2 mL에 pH 8.5로 보정한 tris-HCl buffer 2.6 mL와 7.2 mM pyrogallol 0.2 mL를 첨가하여 25 ℃에서 10분간 반응한다. 1 N HCl 0.1 mL를 반응시킨 액에 가하여 정지시킨다. 산화된 pyrogallol의 양을 420 nm에서 흡광도를 측정하여 구한다. 공시험액과 비교하여 SOD 유사활성을 백분율(%)로 구하고 하기 표 1에 나타내었다.

(3-2) 크산틴 산화효소 저해활성

샘플들(IAA-1 내지 IAA-4)을 각각 물에 희석하여 100 ㎍/mL, 250 ㎍/mL, 500 ㎍/mL 농도의 검색을 조제한다. 검액 1.0 mL에 0.1 M potassium phosphate buffer(pH 7.5) 0.6 mL, 1 mM xanthine 0.2 mL를 첨가한다. 이후 0.2 U/mL xanthine oxidase 0.1 mL를 가하여 반응을 정지시킨다. 생성된 uric acid를 292 nm에서 흡광도를 측정하여 구한다. 공시험액과 비교하여 Xanthine oxidase 저해활성을 백분율(%)로 구하고 하기 표 1에 함께 나타내었다.

Extract	SOD-like activity(%)				Xanthin oxidase Inhibition(%)
	100 ㎍/mL	250 ㎍/mL	500 ㎍/mL		100 ㎍/mL	250 ㎍/mL	500 ㎍/mL
Control	93.6±3.6	95.7±4.5	97.5±4.4		95.3±4.8	97±3.3	98.9±4.9
IAA-1	12.4±2.8	16.9±1.6	22.4±3.2		12.6±1.7	17.2±0.9	25.5±3.0
IAA-2	13.9±3.1	17.7±2.0	26.6±3.4		13.6±0.9	18.0±2.1	28.3±2.8
IAA-3	16.8±1.7	20.1±2.3	32.8±2.9		17.1±1.3	22.8±2.4	30.0±2.6
IAA-4	17.2±1.8	21.9±3.4	36.0±2.8		19.4±1.7	23.5±1.0	32.9±2.5

*대조군: 아스코르브산

상기 표 1에서 보듯이, SOD 유사활성 분석결과, 실시예 1에 따른 샘플(IAA-4)의 경우 500 ㎍/mL에서 36.0 %로 가장 높게 확인되었고, 다음으로 비교예 3에 따른 샘플(IAA-3), 비교예 2에 따른 샘플(IAA-2), 그리고 비교예 1에 따른 샘플(IAA-1)의 경우에 500 ㎍/mL에서 32.8 %, 26.6 %, 22.4 %를 나타내었다. 모든 실험물질은 농도의존성으로 소거활성이 분석되었으며, 대조군인 ascorbic acid보다는 모두 낮은 것으로 분석되었다.

또한, 크산틴 산화효소 저해활성 분석결과, 실시예 1에 따른 샘플(IAA-4)의 경우 500 ㎍/mL에서 32.9 %로 가장 높게 확인되었고, 다음으로 비교예 3에 따른 샘플(IAA-3), 비교예 2에 따른 샘플(IAA-2), 그리고 비교예 1에 따른 샘플(IAA-1)의 경우에 500 ㎍/mL에서 30.0 %, 28.3 %, 25.5 %를 나타내는 것으로 분석되어, 전술한SOD 유사활성의 분석 결과와 동일한 경향성을 확인할 수 있었다.

<실험예 4> 미백활성 시험1

상기 실시예 1에서 수득한 샘플과 비교예 1 내지 3에서 수득한 샘플에 대한 미백시험으로 melanin 생합성에 관여하는 효소, 티로시나제 활성실험을 수행하였다.

구체적으로, 샘플들(IAA-1 내지 IAA-4)을 물에 희석하여 100 ㎍/mL, 250 ㎍/mL, 500 ㎍/mL 농도의 검액을 조제한다. 악성흑색종 세포(B16F10, ATCC)를 1Х10⁴ cell/ml 씩 분주하고 37 ℃, 5 % CO₂ 조건하에 24 hr 전배양 후 100 nM α-MSH가 포함된 배지로 교환하였다.

이후 농도별 샘플 검액들과 대조군(물)을 각각 첨가하여 3일간 배양하고 10 mM PBS로 세척하였으며, 1% Triton X-100을 함유한 10 mM PBS에 현탁시킨 후, 5분간 원심 분리하여 상층액을 활성측정 효소액으로 사용한다. 96 well plate에 이 효소액을 40 ㎕ 넣고 기질인 2 mg/mL 농도의 3,4-Dihydroxyphenylalanine(L-dopa) 100 ㎕를 첨가하였다. 37℃에서 1시간 동안 반응을 진행시킨 뒤, ELISA reader를 이용하여 405 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 티로시나제 활성도를 대조군의 흡광도에 대한 백분율로 구한 다음 하기 도 3에 나타내었다.

하기 도 3에서 보듯이, 티로시나제 활성 분석결과, 실시예 1에 따른 샘플(IAA-4)의 경우 500 ㎍/mL에서 56.7 %로 가장 낮게 확인되었고, 다음으로 비교예 3에 따른 샘플(IAA-3), 비교예 2에 따른 샘플(IAA-2), 그리고 비교예 1에 따른 샘플(IAA-1)의 경우에 500 ㎍/mL에서 57.6 %, 61.8 %, 66.5 %를 나타내었다. 모든 실험물질은 농도의존성으로 티로시나제 활성을 저해하였고, 대조군인 ascorbic acid보다는 활성이 모두 낮은 것으로 분석되었다.

<실험예 5> 미백활성 시험2

상기 실시예 1에서 수득한 샘플과 비교예 1 내지 3에서 수득한 샘플에 대한 미백시험으로 멜라민 생성 정도를 확인하는 실험을 수행하였다.

멜라닌은 자외선에 노출 되거나 외부 자극에 의하여 생성되며 기지, 주근깨, 검버섯 등 피부장애 및 노화를 유발시킨다. 멜라닌은 티로시나제 효소의 생합성을 통하여 생성되며, 티로시나제의 활성을 억제하는 것으로 멜라닌 생성을 억제할 수 있으므로, 전술한 <실험예 4>의 미백활성 시험1과 동일한 경향성을 보일 것으로 예측된다.

구체적으로, 샘플들(IAA-1 내지 IAA-4)을 물에 희석하여 100 ㎍/mL, 250 ㎍/mL, 500 ㎍/mL 농도의 검액을 조제한다. 악성흑색종 세포(B16F10, ATCC)를 1Х10⁴ cell/ml 씩 분주하고 37 ℃, 5 % CO₂ 조건하에서 24 hr 전배양 후 100 nM α-MSH가 포함된 배지로 교환하였다. 이후 농도별 샘플 검색들과 대조군(물)을 각각 첨가하여 3일간 배양하고 10 mM PBS로 세척하였으며, 1% Triton X-100을 함유한 10 mM PBS에 현탁시킨 후, 5분간 원심 분리하여 상등액을 제거한다. 이후 1 N NaOH 200 ㎕를 첨가하고 55 ℃에서 2 hr 방치하여 멜라닌을 녹여내어 405 nm에서 흡광도를 측정하여 멜라닌 생성량(%)을 계산한 다음 하기 도 4에 나타내었다.

하기 도 4에서 보듯이, 멜라닌 생성 분석결과, 실시예 1에 따른 샘플(IAA-4)의 경우 500 ㎍/mL에서 대조군 대비 41.8 %로 가장 낮게 확인되었고, 다음으로 비교예 3에 따른 샘플(IAA-3), 비교예 2에 따른 샘플(IAA-2), 그리고 비교예 1에 따른 샘플(IAA-1)의 경우에 500 ㎍/mL에서 44.3 %, 47.5 %, 48.6 %를 나타내었다.

상기 분석결과는 전술한 티로시나제 저해활성의 경향성과 일치하였으며, 티로시나제가 감소할수록 멜라닌 함량 또한 감소하는 것으로 확인되었다.

<실험예 6> 안전성 시험

상기 실시예 1에서 수득한 샘플과 비교예 1 내지 3에서 수득한 샘플에 대한 에 대한 안전성을 평가하기 위하여 멜라닌세포 자극호르몬(α-MSH)이 처리된 마우스흑색종 세포에 실험물질(IAA-1~4)의 세포독성을 확인하기 위하여 MTS 분석을 진행하였다. 실험물질의 농도는 100 내지 500 ㎍/mL로 설정하였으며, 마우스흑색종 세포(B16F10, ATCC) 세포를 배양하여 시험물질의 세포독성을 확인하였다.

구체적으로는, 마우스흑색종 세포(B16F10, ATCC)를 1Х10⁴ cell/ml씩 분주하고 37 ℃, 5 % CO₂ 조건하에서 24 h 전 배양 후 100 nM 멜라닌세포 자극 호르몬(α-MSH)과 100 내지 500 ㎍/mL 농도의 샘플들과 대조군(물)을 첨가하여 24시간 동안 추가 배양하였다. 이후 MTS 시약 20 ㎕를 넣고 2시간 동안 배양 후, microplate reader를 이용하여 570 nm에서 ELISA reader (Epoch^TM 2, BioTek, USA)로 흡광도를 측정하였다.

세포생존율(cell viability)을 하기 식 1을 사용하여 계산하고, 하기 도 5에 결과를 나타내었다.

[식 1]

세포 생존율(%) = [(Exp. - Blank)/Control] Х 100

(상기 식 1에서, Exp: 세포를 포함한 추출물의 흡광도, Blank: 세포를 포함하지 않은 추출물의 흡광도, Control: 세포를 포함한 증류수의 흡광도이다.)

하기 도 5에서 보듯이, 마우스흑색종 세포에서 세포독성 분석 결과, 모든 농도에서 세포생존율이 95 % 이상인 것을 확인하였다.

따라서, 실시예 1에 따른 샘플(IAA-4), 비교예 3에 따른 샘플(IAA-3), 비교예 2에 따른 샘플(IAA-2), 비교예 1에 따른 샘플(IAA-1)에서는 100 내지 500 ㎍/mL농도에서 모두 세포독성이 없는 것을 알 수 있다.

결론적으로, 나팔꽃씨(Ipomoea nil), 월귤나무(Arctostaphylos uva-ursi) 및 참당귀(Angelica gigas Nakai)를 이용한 고상의 건조물에 추출용매를 이용하여 얻어진 초음파 추출물의 초고압 추출물을 유효성분으로 포함하는 경우, 수득된 조성물은 ABTS, DPPH 자유 라디칼 소거활성과 SOD 슈퍼활성이 우수하여 항산화 효과가 탁월하며, 티로시나제 저해효과에 의해 미백 효과를 발휘하여 항산화, 미백 효과를 필요로 하는 적용처에 적합함을 확인할 수 있었다.

Claims (6)

1. 나팔꽃씨(Ipomoea nil), 월귤나무(Arctostaphylos uva-ursi) 및 참당귀(Angelica gigas Nakai)를 이용한 고상의 건조물에 추출용매를 이용하여 초음파 추출하여 얻어진 초음파 추출액의 초고압 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 미백용 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 초음파 추출은 25 내지 75 kHz의 주파수에서 10 내지 120분간 추출한 것인 항산화 및 미백용 조성물.
3. 제1항에 있어서,
   상기 추출용매는 클로로포름, 에탄올, 메탄올, 물, 에틸아세테이트, 핵산 및 디에틸에테르 중에서 선택된 1종 이상을, 상기 고상의 건조물 무게 대비 5 내지 20배로 포함하는 것인 항산화 및 미백용 조성물.
4. 제1항에 있어서,
   상기 나팔꽃씨(Ipomoea nil), 월귤나무(Arctostaphylos uva-ursi) 및 참당귀(Angelica gigas Nakai)는 나팔꽃씨(a) : 월귤나무(b) : 참당귀 (c)가 1:0.25~1.5:0.5~2 중량비를 만족하는 것인 항산화 및 미백용 조성물.
5. 제1항에 있어서,
   상기 초고압 추출물은 1,000 내지 10,000 bar의 압력으로 1 내지 60분간 고압처리 후, 리플럭스 하에 60 내지 70℃ 에서 2 내지 3 시간 동안 추출한 것인 항산화 및 미백용 조성물.
6. 제1항 내지 제5항에 있어서,
   상기 항산화, 미백은 미백, 잡티제거, 검버섯제거, 주근깨제거, 기미제거 효능을 제공하는 것인 항산화 및 미백용 조성물.

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