KR20150143106A - 혼합 생약재 추출물을 유효성분으로 포함하는 노화방지, 피부미백용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 흑송잎, 흑송껍질, 사매열매 및 포도껍질의 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 노화방지 또는 피부미백용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 흑송잎, 흑송껍질, 사매열매 및 포도껍질의 혼합 추출물은 크나틴 옥시다제 저해활성, 티로시나제 저해활성, NO 생성억제 활성, 및 SOD(superoxide dismutase)유사 활성이 우수하여, 항산화, 노화방지, 피부미백, 및 항아토피, 여드름 치료 등 피부관련 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

혼합 생약재 추출물을 유효성분으로 포함하는 노화방지, 피부미백용 조성물{Composition comprising mixed herbal mixture extract for improving anti-aging or skin whitening}

본 발명은 흑송잎, 흑송껍질, 사매열매 및 포도껍질의 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 노화방지 또는 피부미백용 조성물에 관한 것이다.

피부는 외부 환경과 직접 접하면서 인체를 보호하며 생화학적 및 물리적인 기능을 갖는 중요한 조직이다. 이 조직은 크게 3가지 즉, 표피, 진피 및 피하조직으로 나뉜다. 사람의 피부색은 주로 피부 세포 속에 들어있는 멜라닌을 함유하는 멜라노좀의 숫자, 크기, 종류 및 분포도에 따라 다르게 나타난다. 멜라노좀은 멜라닌 세포에 의해 생산되고, 표피에서 생성되는 검은 색소인 멜라닌은 멜라노사이트라는 세포에서 생산된다. 멜라닌은 햇빛 중 자외선의 빛에너지를 흡수하여 더 깊숙이 있는 세포들이 자외선에 의해 손상되는 것을 막아주는 역할을 한다. 이러한 멜라닌이 비정상적으로 적게 생산되면 백반증과 같은 피부병변이 유발되고 반대로 자외선 등에 의해 멜라닌이 과도하게 합성되면 피부에 손상을 줄 뿐만 아니라 기미, 주근깨를 형성하게 되고, 더 나아가 피부암의 원인이 되기도 한다. 또한, 멜라닌 색소의 과다한 생성 및 침착은 피부의 흑화, 기미, 주근깨 등의 피부질환을 유발하며 이에 따라 피부의 흑화, 기미, 주근깨 등의 피부질환을 유도한다. 멜라닌 형성과정에서 가장 중요한 역할을 하는 것은 티로시나아제로 알려져 있으며, 이 효소는 조직 중에 존재하는 티로신이라고 하는 아미노산에 작용하는 도파퀴논을 생성시키고, 상기 도파퀴논으로부터 여러 단계의 자동 산화과정을 거쳐 흑색색소인 멜라닌이 생성된다. 멜라닌 생성을 억제할 수 있는 단계의 어떤 과정 중에 작용하느냐에 따라서 하기와 같은 방법으로 미백용 조성물을 만들 수 있다. 첫 번째로는 멜라닌 생성의 주원인인 자외선을 차단할 수 있는 성분을 함유 시키는 것으로, 이 방법에 의한 조성물은 광 산란제 또는 광 차단제를 함유함으로써 자외선에 의한 DNA 손상 또는 염증을 줄여 글루코사민과 같은 티로시나아제가 활성을 나타내기 위해 필요한 코어 탄수화물의 합성을 저해함으로써 멜라닌 생성으로 억제시킬수 있다. 두 번째는 효소산, 루미놀, 에릭산 또는 알부틴과 같이, 멜라닌 생성에 관여하는 티로시나아제의 기능을 방해하는 물질을 사용하는 것이다. 세 번째는 도파크롬을 안정화하여 흑색 멜라닌인 유-멜라닌으로의 진행을 저지할 수 있는 방법이 있다. 네 번째는 티로신이 도파와 도파크롬을 거쳐 복잡한 산화와 축합반응을 거치는 동안, 강한 항산화 효과를 발휘하여 미백효과를 낼 수 있는 비타민 C와 같은 물질을 사용하는 것이다.

또한, 피부 노화의 원인 중 하나인 활성산소는 지질의 과산화, DNA 장해, 단백질 변성, 대사 이상 등의 광산화 장애와 함께 급성, 만성 염증, 세포외 기질의 변성을 일으키고, 주름 및 탄력성 저하를 유발한다. 활성산소 및 자유 라디칼은 직접적으로 세포기질 성분을 분해 또는 중합시켜 변성 및 단편화를 유발하고, 메일라드 반응(maillard reation)을 개시하여 콜라겐 섬유에 노화가료를 형성시키는 작용이 있다.

최근 소득 수준의 향상과 라이프 스타일의 변화로 웰빙에 대한 관심이 증대되면서, 소비자들은 현재 널리 사용되고 있는 화학 합성물질이 아닌 천연자원을 이용한, 고품질의 제품을 선호하는 현상이 두드러지고 있으며, 이러한 소비자의 요구에 부합하여 화장품 및 건강식품 시장에서도 기능성 화장품 및 기능성 식품과 같은 화장품과 의약품의 중간 단계의 약학적 치료 효능을 가진 천연 자원을 바탕으로 하는 기능성 화장품에 대한 개발이 각광받고 있다.

한편, 동의보감에서는 송엽이 풍습창을 다스리고 머리털이 나게 하며, 오장을 편하게 하고 곡식 대용으로 한다고 하였으며, 본초강목에서는 솔잎을 오랫동안 복용하면 몸이 가벼워지고 늙지 않는다고 하였다. 송엽에는 각종 비타민, 엽록소, 칼슘, 철분 등이 들어 있으며, 살균력이 뛰어난 발삼향 테르펜이 콜레스테롤 수치를 낮추고 말초신경을 확장시켜 호로몬의 분비를 왕성하게 하는 등, 몸의 조직을 일깨워 고혈압과 심근경색을 개선시킨다. 신경을 안정시키며 감기를 예방하거나 치료하는 효과도 있다. 송엽의 글리코키닌성분은 당뇨병 개선에 좋고, 비타민 C와 철분은 빈혈, 루틴은 모세혈관을 튼튼하게 하는 효과가 있으며, 수지와 탄닌성분은 소화기능을 높이는 작용이 있다. 인체의 단백질을 형성하는데 꼭 필요한 필수아미노산은 체내에서 합성이 불가능하기 때문에 외부에서 섭취해야만 되는데, 글라이신, 타이로신, 시스틴 등 필수아미노산 20 여종이 함유되어 있는 솔잎은 매우 중요한 양질의 단백질원이다.

한편, 육천본초(陸川本草)에서 포도는 자양강장, 보혈, 강심이뇨의 효과가 있어서 허리가 아픈 증상, 위가 아픈 증상, 신경쇠약, 피가 허하여 심장이 뛰는 현상을 개선한다고 되어 있다. 포도에는 비타민 A와 비타민 C가 많이 들어있으므로, 눈의 기능을 향상시켜주어서 시력을 보호해주고, 항산화작용으로 노화도 방지해주며 피부미용에도 좋은 효능이 있다. 포도에는 비타민 D도 함유하고 있어서, 인체에서 칼슘의 흡수를 도와주므로, 성장기 어린아이의 골격을 튼튼히 해주고, 노인들의 골다공증을 발생을 예방하며 플라보노이드 성분은 혈관에서 혈전(血栓)이 형성되는 것을 억제해주어, 혈압을 내려준다. 또한 심장병의 발병을 예방하며, 동맥경화의 완화와 개선에 효능이 있다. 포도껍질에서 추출된 폴리페놀은 항산화 활성이 높은 것으로 보고 되었으며(Bioresource Tech. 97(1), 41-44, 2003), 포도씨와 껍질추출물이 구강종양세포에 선택적으로 세포독성효과를 보이므로 암예방에 활용가능한 것으로 보고된 바 있다(Anticancer Res. 20(1A), 423-426, 2000). 또한, 포도껍질추출물의 항치매 효과에 대하여 보고된 바 있으며(J. Hygiene Res. 35(3), 300-303, 2006), 어린아이의 구강알러지 증상이 호전되는 결과도 발표되었다.(Pediatric Allergy and Immunology, 12(5), 289-90, 2001)

사매(뱀딸기)는 민간에서 가슴과 배가 아프고 열이 심할 때 해열제로 쓰며, 창독, 머리피부질병에 사매전초의 즙을 내어 바른다. 사매 전초 10~30g을 물에 달여서 하루 2-3번씩 나누어 마시면 위암, 폐암, 자궁경부암, 디프테리아세균성 이질에 효과가 있으며(일원건강, 약초의 성분과 이용. P.293), 사매는 청열, 해독, 소염, 항종양, 월경통, 진해작용이 있다(육창수, 원색한국약용식물도감 3판, P.599, 아카데미). 사매전초의 핵산과 에테르 추출물이 높은 항균성을 보인다는 보고(Arch. Pharm. Res., 9, 1-7, 1986)와 수용성 분획이 Sarcoma 180 세포에 대한 항암효과를 가진다는 보고가 있다(J. Kor. Res, 35, 129, 1986). 또한, 사매 전초의 5% 에탄올 추출물이 사람의 적혈구를 응집시키고, 생쥐의 비장세포를 증식시키는 활성효과가 있는 것으로 보고된 바 있다(Kor. J. Immunol. Abstract, 1990). 이상 조사된 선행기술 내용들과 한방문헌들은 사매전초에 대한 여러 가지 효능을 검증하여 보고한 것이며, 특히, 사매열매에 관한 내용이 보고된 예는 거의 없다.

이에 본 발명자들은 새로운 천연 자원 유래 화장료 조성물을 개발하기 위한 연구를 계속한 결과, 상기 혼합 추출물이 세포 독성을 가지지 않으면서도, 우수한 항산화 및 미백 효과를 보임을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 흑송잎, 흑송껍질, 사매열매 및 포도껍질의 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하는, 항산화, 노화방지 또는 피부미백용 조성물을 제공함에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 흑송잎, 흑송껍질, 사매열매 및 포도껍질의 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공함에 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 흑송잎, 흑송껍질, 사매열매 및 포도껍질의 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하는, 항산화, 노화방지 또는 피부미백용 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 흑송잎, 흑송껍질, 사매열매 및 포도껍질의 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하는, 항산화, 노화방지 또는 피부미백용 식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 흑송잎, 흑송껍질, 사매열매 및 포도껍질의 혼합 추출물을 유효성분으로 하는, 피부질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 흑송잎, 흑송껍질, 사매열매 및 포도껍질의 혼합 추출물을 유효성분으로 하는, 피부질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 흑송잎, 흑송껍질, 사매열매 및 포도껍질의 혼합 추출물은 크나틴 옥시다제 저해활성, 티로시나제 저해활성, NO 생성억제 활성, 및 SOD(superoxide dismutase)유사 활성이 우수하여, 항산화, 노화방지, 피부미백, 및 항아토피, 여드름 치료 등 피부관련 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 화장료 조성물이 피부 거칠기에 미치는 영향을 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 흑송잎, 흑송껍질, 사매열매 및 포도껍질의 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 노화방지, 피부미백용 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 화장료 조성물 또는 식품 조성물을 포함한다.

본 발명의 흑송잎, 흑송껍질, 사매열매 및 포도껍질의 혼합 추출물은 하기와 같이 수득될 수 있다. 흑송잎, 흑송껍질, 사매열매 및 포도껍질을 물로 세척하여 이물질을 제거한다. 흑송잎, 흑송껍질, 사매열매 및 포도껍질은 재배한 것 또는 시판되는 것 등을 제한없이 사용할 수 있다. 상기 흑송잎, 흑송껍질, 사매열매 및 포도껍질 각각에 적당한 양의 용매를 첨가하여 추출한다. 추출용매로는 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 및 이들의 혼합용매로부터 선택된 1 종 이상의 용매가 바람직하다. 상기 과정을 통해 수득한 각각의 추출물을 여과 및 농축한 후, 농축액을 증류수에 현탁시키고, 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물로 순차적으로 분획하여 분획물을 수득한다. 상기 과정을 통해 수득한 분획물을 혼합하여 최종적으로 혼합 추출물을 수득한다.

본 발명에서 흑송잎, 흑송껍질, 사매열매 및 포도껍질의 혼합 추출물은 바람직하게는 흑송잎, 흑송껍질, 사매열매 및 포도껍질 추출물을 10~50:10~30:10~50:10~30의 중량비로 혼합한 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 30:20:30:20의 중량비로 혼합한 것이다.

상기 흑송잎 추출물은 에틸 아세테이트 추출물 또는 핵산 추출물을 포함한다.

상기 흑송껍질 추출물은 흑송껍질의 열수 추출물을 핵산, 에틸아세테이트 및 부탄올로 순차 분획하여 얻은 에틸아세테이트 분획물 또는 부탄올 분획물을 포함한다.

상기 사매열매 추출물은 사매열매의 열수 추출물을 핵산, 에틸아세테이트 및 부탄올로 순차 분획하여 얻은 에틸아세테이트 분획물 또는 부탄올 분획물을 포함한다.

상기 포도껍질 추출물은 60 내지 90%의 에탄올 추출물을 포함한다.

본 발명에 따른 흑송잎, 흑송껍질, 사매열매 및 포도껍질의 혼합 추출물은 크나틴 옥시다제 저해활성, 티로시나제 저해활성, NO 생성억제 활성, 및 SOD(superoxide dismutase)유사 활성이 우수하여, 항산화, 노화방지 또는 피부미백용 화장품 및 식품 등에 유용하게 사용될 수 있다.

상기한 바와 같이, 본 발명의 흑송잎, 흑송껍질, 사매열매 및 포도껍질의 혼합 추출물은 항산화, 노화방지 또는 피부미백을 위한 기능성 화장품으로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조할 수 있다. 유화 제형의 화장품으로는 영양화장수, 크림, 에센스 등이 있으며, 가용화 제형의 화장품으로는 유연화장수가 있다. 본 발명에 적합한 화장료 조성물의 제형으로는 예를 들면 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온 봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 그리고, 상기의 성분들은 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.

또한, 본 발명의 흑송잎, 흑송껍질, 사매열매 및 포도껍질의 혼합 추출물은 항산화, 피부노화 개선 및 피부미백의 목적으로 건강기능식품에 첨가될 수 있다. 본 발명의 혼합 추출물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 혼합 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 추출물들에 대하여 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.

본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당 및 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스 및 수크로오스와 같은 디사카라이드, 덱스트린 및 시클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 및 자일리톨, 소르비톨 및 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100당 일반적으로 약 0.01~0.20g, 바람직하게는 약 0.04~0.10g 이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01~0.20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

또한, 본 발명은 흑송잎, 흑송껍질, 사매열매 및 포도껍질의 혼합 추출물을 유효성분으로 하는, 피부질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 약학적 조성물 또는 식품 조성물을 포함한다.

상기 피부질환은 아토피 피부염, 접촉성 피부염, 지루성 피부염 및 기미로 이루어진 군 중 선택된 하나 이상의 피부질환인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 조성물은 상기 혼합 추출물과 함께 피부질환의 예방, 개선 또는 치료 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 더 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로오스 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 개체의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 상기 혼합 추출물의 일일 투여량은 약 0.1~1000 mg/kg, 바람직하게는 약 10~100 mg/kg이며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물은 피부질환의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

아울러, 본 발명의 조성물은 피부질환에 대한 외용제로 사용할 수 있다. 본 발명의 피부질환에 대한 외용제로 사용하는 경우, 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 피부용 외용제에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 관련분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 또한 상기 성분들은 관련분야에서 통상적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다. 상기 외용제는 크림, 로션, 연고, 겔, 점액, 스프레이 및 습포제로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 형태인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

이하, 본 발명을 실시예, 실험예 및 제조예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예, 실험예 및 제조예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예, 실험예 및 제조예에 의해 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] 흑송잎, 흑송껍질, 사매열매 및 포도껍질의 혼합 추출물의 제조

1.흑송잎 추출물의 제조

한국 미륵산(익산지역)에서 직접 채취한 흑송잎을 음지에서 말리고 분쇄한 분말을 하기의 표 1의 조건에 따라 가압 열수 방법으로 1차 추출물을 얻었다.

온도	압력	용매	시간	시료양	수율(%)
80	5기압	증류수 1L	6시간	100g	20~25

상기의 1차 추출물을 용매극성에 따라 핵산(C₆H₄), 클로로포름(CHCl₃), 에틸아세테이트(EA), 부탄올(BuOH)의 순서로 순차 분획하고, 각 용매 분획물에 대하여 자유라디칼 소거(DPPH)법으로 항산화 활성을 측정하였다(표 2 참조). 강한 항산화 활성을 나타낸 EA 용매 분획물을 회전 진공 증발기로 농축한 다음, 실리카겔 60(230~400 메쉬)이 채워진 컬럼에서 EA:BuOH(9:0→0:9)의 농도기울기에 따라 용출시키면서 3개의 소분획을 얻었으며, 이들의 황산화활성을 DPPH 방법으로 측정하였다. DPPH 법의 EC50 값이 가장 낮은 EA 소분획을 GC-mass에서 표준 인데스(index) 비교방법으로 조사한 결과, 주성분은 캠프페롤(kaempferol), 펜타옥사노나데칸올(pentaoxanonadecanol), 캄펜(camphene), α-큐베벤(α-cubebene), 카디넨(cadinene), β-테트라하이드로피란(β-tetrahydropyran)등이었으며, 회전 진공증발기에서 용매를 날려 보내고, 핵산층에서 얻어진 비극성 유효성분과 혼합하여 이후 화장료 조성물 제조에 활용하였다. 상기 핵산층은 흑송잎 분말시료를 따로 준비하여 핵산에 분산시킨 후, 초음파 수조에서 3시간 이상 추출하였다. 물 층과 잔류물은 걸러내고, 회전 진공증발기에서 핵산 용매를 증발시켜서 물에 녹지 않는 비극성 유효성분을 수득하였다.

2. 흑송껍질 추출물의 제조

잘 말린 흑송가루 일정량을 고압 열수(80℃)로 추출하여, 1차 흑송껍질 수 추출물을 얻었다. 1차 흑송껍질 수 추출물을 회전 진공증발기로 농축한 후, 핵산, EA, BuOH의 순서로 분획물 별로 항산화 활성을 측정하였다(표 3 참조). 항산화 활성이 큰 EA 분취액을 실리카겔 60이 채워진 칼럼에서 칼럼 분리시키는 방법으로 2차, 3차 분취하여 핵심 유효물질을 수득하였으며, 카테친에피카테친, 쾌르세친 및 훼루릭산이 포함되어 있음을 확인하였다. 이후 실험에서는 흑송껍질의 EA 분획물을 이용하였다.

3. 사매 열매 추출물의 제조

충남 서천지역 해안가에서 채취한 자생 사매 열매를 음지에서 건조하고 분말로 만들었다. 사매 열매 분말을 80% 에탄올로 24-36시간 추출하고, 추출액을 에틸아세테이트(EA)로 용매 분획하였다. EA 분획물을 감압농축하여 엘라직 산(ellagic aicd), 캄페리트린(Kaempferitrin), 캄페롤(Kaempferol), 토코페롤퀴논 등을 포함하는 혼합물을 얻었다. 이후 실험에서는 사매 열매의 EA 분획물을 이용하였다.

4. 포도껍질 추출물의 제조

포도알은 검보라색으로 잘 숙성된 Campbell early 종을 구입하여 포도알로부터 포도껍질과 씨를 분리하고, 포도껍질을 갈아 교반하고 실온에 보관하였다. 12시간 후 80% 에탄올로 추출하고 감압증류하여 안토시아닌, 프로안토시아닌, 탄닌, 레스베라트롤 등이 함유된 폴리페놀 혼합물을 얻었다.

5. 흑송잎, 흑송껍질, 사매열매 및 포도껍질의 혼합 추출물의 제조

상기 1 내지 4에서 얻은 흑송잎 추출물, 흑송껍질 추출물, 사매열매 추출물및 포도껍질 추출물의 건조 분말을 3:2:3:2의 중량비로 혼합하고, 이 혼합물 총 중량의 10-100배에 해당하는 물로 희석하여 하기 실험에 사용하였다.

[실시예 2] 본 발명의 흑송잎, 흑송껍질, 사매열매 및 포도껍질의 혼합 추출물을 포함하는 화장료 조성물의 제조

상기 실시예 1에서 제조한 혼합 추출물을 50% 에탄올에 1:10의 중량비로 희석하여 표준 천연 화장료 조성물(이하 SNCC ; standard natural cosmetical composition)을 만들었으며, 이를 화장원료로 활용하였다.

[실험예 1] 각 추출물의 항산화 효과와 총 페놀 함량 측정실험

자유 라디칼 소거(항산화)효과는 DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl)시약을 사용하는 Fujikawa 방법을 개선하여 측정하였다. 보다 구제척으로, 0.5 mM DPPH 에탄올 용액 1mL에 0.05M Tris-HCl 완충액 (pH 7.4) 1mL을 가하였다. 상기 혼합물에 여러 가지 농도(0.5ppm~ 250ppm)의 상기 실시예 1에서 수득한 각 추출물 또는 혼합 추출물 1mL를 가하고 실온에서 격렬하게 흔들었다. 대조군으로는 에탄올을 이용하였다. 30분 동안 반응시킨 후 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료의 상대효과를 비교하기 위해 합성 항산화 물질로 알려진 BHA 및 α-토코페롤의 항산화 효과를 측정하여 비교하였다.

또한, 총 페놀 함량은 Folin-ciocalteau 시약을 사용하는 Osawa 방법을 이용하여 산화-환원 반응에 의한 색(파장)의 변화를 분광광도계로 측정하였다. Folin-ciocalteau 시약은 환원제와 반응하여 인-몰리브덴산 블루 착체를 형성하여 청색을 나타내므로 750nm에서 흡광도를 측정하였으며, 갈릭산(gallic acid)을 표준물질로 하여 표준 검정곡선을 얻었다. 이로부터 각 시료의 총 페놀량을 구하였다.

이상의 실험 결과를 표 2 내지 표 4에 나타내었다.

흑송잎 추출물의 DPPH 및 총 페놀 함량

	시료무게(100g)		DPPH 측정	총페놀
	추출양(g)	%	IC50(g/ml)	mg, GAE/g
가압열수(5기압,80)	20.18	20.18	52.370.58	132.50.3
핵산	0.27	1.34	>200	28.71.1
EA	2.39	11.84	11.390.56	98.20.1
BuOH	4.95	24.53	16.420.83	61.60.2
물(잔류층)	12.57	62.29	150.331.37	5.20.9
소계	20.18	100.00

흑송껍질 추출물의 DPPH 및 총 페놀 함량

	흑송껍질분말(176g)		DPPH 측정	총페놀
	추출양(g)	%	IC50(g/ml)	mg, GAE/g
가압열수(5기압,80)	6.65	3.78	15.88
핵산	0.00	0.00
EA	1.17	17.60	6.59	428.3
BuOH	1.83	27.52	11.56	359.2
물(잔류층)	3.65	54.88	168.75	93.2
소계	6.65	100.00

사매열매 및 포도껍질 추출물의 DPPH 및 총 페놀 함량

	사매열매		포도껍질
	DPPH(IC50) IC50(μg/mL)	총페놀 mg, GAE/g	DPPH IC50(μg/ml)	총페놀 mg, GAE/g
1차 추출물	37.2±1.7	226.1±0.2	25.9±1.3	371±0.7
핵산	>100	25.3±0.8	>100	9.7±0.6
에틸아세테이트	5.57±0.82	377.2±0.6	7.72±0.47	445.3±1.4
부탄올	6.65±1.19	451.7±0.4	9.32±0.73	478.5±1.7
물(잔류층)	15.36±2.82	405.4±0.4	21.23±1.21	420.3±1.5
BHA	4.67±0.29	19.2±0.1
α-토코페놀	13.23±3.51	7.2±0.4

표 2, 3, 4에 나타난 바와 같이, 흑송잎의 경우에는 EA와 n-BuOH 분획에서 총 페놀 성분이 높지 않아도 항산화 효과는 크게 나타났으며, 흑송껍질, 사매열매와 포도껍질의 경우에는 총 페놀 성분이 매우 높게 함유되었고, 항산화 효과도 매우 크게 나타남을 확인하였다.

[실험예 2] 본 발명의 흑송잎, 흑송껍질, 사매열매 및 포도껍질의 혼합 추출액의 활성측정

1. 크산틴 옥시다제(Xanthine oxidase) 저해 활성 확인

본 발명의 혼합 추출물의 항노화 효과를 확인하기 위하여, 크산틴 옥시다제 저해활성을 확인하였다. 보다 구체적으로, 0.1M 포타슘 인산염 완충액(potassium phosphate buffer; pH 7.5) 0.5mL에 2mM 크산틴을 녹인 기질액 1.0mL와 시료 용액 0.1mL를 첨가하고 크산틴 옥시다제(40 units/mL)를 가하여 37℃에서 15분간 반응시켰다. 이 후, 1N HCl 1.0mL를 가하여 반응을 종료시킨 다음, 반응액 중에 생성된 요산(uric acid)의 양을 292nm에서 측정하였다. 그 결과를 표 5에 나타내었다.

	시료액 첨가량(μg/mL:ppm)
	10	50	200	900
흑송잎	8.17±0.40	13.90±0.69	35.71±1.28	68.81±2.44
흑송껍질	10.52±0.52	18.37±0.91	47.53±1.37	75.63±2.78
사매열매	6.72±0.33	9.15±0.45	15.32±0.67	35.31±1.27
적포도 껍질	9.53±0.47	13.13±0.65	32.30±1.16	59.15±1.59
SNCC(본 발명의 혼합 추출물)	10.97±0.53	21.51±0.97	52.53±1.62	78.81±2.49

표 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 혼합 추출물은 단독 성분의 추출물에 비해 우수한 항노화 활성을 나타냄을 확인하였다.

2. 티로시나제(Tyrosinase) 저해 활성 확인

본 발명의 혼합 추출물의 미백 효과를 확인하기 위하여, 티로시나제 저해 활성을 확인하였다. 보다 구체적으로, 37℃ 수조에서 미리 온도를 조정한 0.6M 인산염 완충액(phosphate buffer; pH6.8) 1mL, 10mM L-DOPA 용액 0.5mL, 시료 용액 1mL의 용액에 버섯의 티로시나제(mushroom tyrosinase; 110 units/mL) 0.5mL를 가하여, 37℃에서 2분 동안 반응시킨 후, 475nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 표 6에 나타내었다.

	시료액 첨가량(μg/mL:ppm)
	10	50	200	900
흑송잎	16.50±0.58	23.34±0.95	38.17±1.50	57.21±2.06
흑송껍질	10.35±0.51	15.74±0.58	28.53±1.03	48.35±1.65
사매열매	18.07±0.59	28.35±1.02	40.24±1.53	73.90±2.69
적포도 껍질	5.98±0.29	10.51±0.43	19.53±0.75	35.57±1.58
SNCC	20.12±0.85	31.15±1.06	43.30±1.42	83.72±3.18

표 6에 나타난 바와 같이, 본 발명의 혼합 추출물은 200ppm에서 43.3%, 900ppm에서 83.72%의 티로시나제 활성 저해 효과를 나타내었으며, 단독 성분의 추출물에 비해 우수한 미백 효과를 나타냄을 확인하였다.

3. 세포 독성 확인

본 발명의 혼합 추출물의 세포독성을 확인하기 위하여, MTT 어쎄이를 수행하였다. MTT 어쎄이란 노란색의 수용성 기질인 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide)가 살아있는 세포의 미토콘드리아 탈수소화효소(mitochondria dehydrogenase)에 의해서 진청색의 비수용성인 포르마잔(formazan)으로 환원되는 것을 이용한 방법이다. 보다 구체적으로, RAW 264.7 세포를 RPMI 1640 배지(10% 소태아 혈청(fetal bovine serum), 5% 항생제)에서 배지 1mL 당 5×10⁵개 정도 포함되게 배양시킨 후, 1mL 당 1×10⁶개로 희석하여 96 웰 플레이트에 200㎕(약 2×10⁵)씩 넣었다. 이 후, 24시간 동안 배양하여 세포가 부착되도록 하고, 부착된 세포 배양액에 각각 시료를 10㎕씩 넣은 후 다시 24시간 동안 배양하였다. 그 후 새로운 배지로 교체하고, 미리 제조한 MTT의 최종농도가 0.5mg/mL가 되도록 가한 후, 보라색으로 생성된 포르마잔의 양을 정량하였다. 생성된 포르마잔의 양은 살아있는 세포 수에 비례하므로 이를 통해 세포의 생존율을 계산하였다. 그 결과를 표 7에 나타내었다.

	시료액 첨가량(μg/mL:ppm)
	10	20	50	100
흑송잎	99.7±2.85	98.8±2.84	98.2±2.81	96.3±2.64
흑송껍질	99.7±2.83	99.2±2.84	96.7±2.72	94.8±2.57
사매열매	99.8±2.83	98.3±2.83	82.3±2.12	78.5±1.85
적포도 껍질	99.8±2.83	99.5±2.85	98.8±2.82	92.7±2.56
SNCC	99.3±2.83	97.6±2.81	91.3±2.65	89.3±2.21

표 7에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 혼합 추출물은 세포독성이 미미하여 세포 증식에 많은 영향을 미치지 않음을 확인하였다.

4. NO(Nitric oxide) 생성에 미치는 영향 확인

본 발명의 혼합 추출물이 RAW 264.7의 대식세포에서 LPS에 유도에 의한 NO 생성에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위하여, RAW 264.7의 대식세포에 각각의 시료를 1~30/mL의 농도로 2시간 동안 전 처리 한 후, LPS (1/mL)를 처리하여 24시간 배양하였다. 배양액 중 100mL를 취하고 여기에 동량의 Griess 시약(1% sulfanilamide, 0.1% N-(1-naphthyl)-ethylenediamine dihydrochloride in 2.5% phosphoric acid)을 넣고, 실온에서 10분간 방치한 다음 ELISA 플래이트 리더(plate reader)를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. NO₂는 아질산 나트륨(sodium nitrite)을 표준용액으로 하여 측정하였고, 각 측정치는 5-8M의 NO_2ㄹ를 함유하는 세포 없는 배양액의 흡광도 값으로 보정하였다. 그 결과를 표 8에 나타내었다.

	무처리	LPS (1μg/mL)	시료액 첨가량(μg/mL:ppm)
			10	20	50	100
대조군	12.3±0.5	29.3±0.7
흑송잎			24.1±0.9	21.3±0.6	17.3±0.5	15.7±0.6
흑송껍질			20.3±0.7	18.7±0.6	15.3±0.5	13.8±0.4
사매열매			25.8±0.9	23.5±0.7	18.5±0.6	15.1±0.4
적포도 껍질			23.5±0.8	21.8±0.6	17.2±0.5	15.3±0.4
SNCC			18.3±0.7	17.4±0.5	15.1±0.5	12.7±0.3

* LPS : Lipopoly saccharide, RAW 264.7 대식세포 3차 실험(평균 오차, P<0.05)

표 8에 나타난 바와 같이, LPS로 자극한 대조군은 NO 생성이 29.3/mL으로 촉진되었으나, 본 발명의 혼합 추출물(SNCC) 50-100/mL를 가하면 NO 생성이 15/mL 이하로 억제되어 정상에 가까워지는 결과를 보임을 확인하였다. 상기 결과를 통해, 본 발명의 혼합 추출물의 항염 작용이 우수함을 확인하였다.

5. SOD(superoxide dismutase) 유사 활성 확인

본 발명의 혼합 추출물의 SOD 유사 활성을 측정하기 위하여, Marklund의 방법에 따라 시료를 트리스 완충용액에 녹이고 피로갈롤(pyrogallol)을 첨가하여 420nm에서 흡광도를 측정하였다. 하기의 수학식 1을 이용하여 SOD 유사활성(%)을 구하였다. 그 결과를 표 9에 나타내었다.

	시료액 첨가량(μg/mL:ppm)
	10	50	200	500
흑송잎	16.5	25.8	53.8	83.2
흑송껍질	17.0	27.5	57.2	87.1
사매열매	17.2	31.3	62.5	95.7
적포도 껍질	12.3	18.3	98.8±2.82	58.5
SNCC	21.5	35.2	65.7	97.3

표 9에 나타난 바와 같이, 본 발명의 혼합 추출물은 SOD 유사 활성이 다른 단독 추출물에 비하여 우수함을 확인하였다.

6. 피부 표면거칠기(노화)와 피부트러블에 대한 효과

40세 이상의 여성 50명의 손등피부에 본 발명의 혼합 추출물을 포함하는 로션형 제제(제제예 2)를 도포하고 30분 후 그 효과를 측정하였다. 효과는 총 3회 측정하여 평균 결과를 구하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 혼합 추출물이 포함되지 않았을 때는 피부 표면 거칠기가 34.2% 개선되었으나, 본 발명의 혼합 추출물이 포함된 로션형 제제를 도포하였을 경우 55.7%가 개선됨을 확인하였다.

이하 본 발명의 조성물의 제제예를 설명하나, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 화장료 제제

1. 크림형 제제 (단위: 중량%)

하기의 표와 같이, 크림형 제제를 제조하였다(단위:중량%).

실시예 1의 혼합 추출물	1.00
폴리에틸렌글리콜모노스테아레이트	2.00
자기유화형 모노스테아르산글리세린	5.0
길경홈삼 숙성엑기스	0.5
세티릴알코올	4.0
멜리틴	0.01
스쿠알렌	6.00
프로폴리스	0.5
트리2-에틸헥산글리세릴	5.0
스핑고당지질	1.0
1,3-부틸렌글리콜	7.0
정제수	잔량

2. 로션형 제제 (단위: 중량%)

하기의 표와 같이, 로션형 제제를 제조하였다.

실시예 1의 혼합 추출물	1.00
멜리틴프로폴리스 혼합액	0.5
L-아스코르빈산-2-인산마그네슘염	1.0
수용성 콜라겐(1%수용액)	1.00
시트르산 나트륨	0.10
시쿠알렌	3.00
시트르산	0.5
β-글루칸	0.5
황금감초엑기스	0.5
1,3 부틸렌글리콜	3.00
정제수	잔량

3.팩형 제제(단위:중량 %)

하기의 표와 같이, 팩형 제제를 제조하였다.

실시예 1의 혼합 추출물	1.00
폴리비닐알코올	13.00
L-아스코르빈산-2-인산마그네슘염	1.0
수용성 콜라겐(1%수용액)	2.00
라우릴히드록시프롤린	1.00
스쿠알렌	3.00
멘톨	0.10
살리신살	1.00
송피 EA 추출물	0.03
1,3 부틸렌글리콜	3.00
에탄올	5.00
정제수	잔량

4.액상형 제제(단위:중량 %)

하기의 표와 같이, 액상형 제제를 제조하였다.

실시예 1의 혼합추출물	1.00
히드록시에틸렌셀롤로오스(2% 수용액)	12.00
길경 홍삼 숙성엑기스	0.05
크라탄검(2%수용액)	2.00
1,3-부틸렌글리콜	6.00
글리세릴스테아레이트	4.00
알루미늄클로로하이드레이트	1.00
하알루론산나트륨(1% 수용액)	3.00
멜라틴?프로폴리스	1.00
정제수	잔량

제제예 2. 식품 제제예

본 발명의 혼합 추출물을 포함하는 식품 조성물은 다음 각각의 제제예와 같은 조성으로 통상의 액제 제조방법으로 제조하였다. 최종 부피는 각 액제에 100mL이다. 본 제제예는 액제 뿐만 아니라 정제, 산제, 과립제등으로 통상의 제조방법으로 제조가 가능하다.

성분	함량(중량%)
실시예 1의 혼합추출물	100mg
벌꿀	150mg
비타민C	50mg
비타민B6	10mg
니코틴산아미드	10mg
로얄젤리	80mg
방부제, 향	미량
정제수	잔량
합계	100mg

제제예 3. 약학적 조성물의 제제

1. 정제의 제조

본 발명의 혼합 추출물 5mg

유당 20mg

전분 20mg

스테아린산 마그네슘 적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 정제의 제조방법에 따라서 50mg의 정제로 타정한다.

2. 캡슐제의 제조

본 발명의 혼합 추출물 5mg

유당 20mg

전분 19mg

탈크 1mg

스테아린산 마그네슘 적량

상기 성분을 혼합하고 통상의 캡슐제 제조방법에 따라서 50mg의 젤라틴 캅셀에 충전한다.

3. 주사제의 제조

본 발명의 혼합 추출물 5mg

용해보조제 적량

주사용멸균증류수 적량

상기의 성분을 통상의 주사제의 제조방법에 따라서 2ml의 앰픔에 충진하고 밀봉한 다음 멸균하여 주사제를 제조한다.

4. 연고제의 제조

본 발명의 혼합 추출물 5mg

디에탄올아민 1.5g

폴리비닐피롤리돈 5g

프로필렌글리콜 30g

증류수를 가하여 전체 100ml로 함

상기의 성분을 통상의 연고제의 제조방법에 따라서 연고제를 제조한다.

Claims (10)

1. 흑송잎, 흑송껍질, 사매열매 및 포도껍질의 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 또는 노화방지용 화장료 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 혼합 추출물은 흑송잎, 흑송껍질, 사매열매 및 포도껍질의 추출물을 10~50:10~30:10~50:10~30의 중량비로 혼합한 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
3. 제 1항에 있어서, 상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 및 이들의 혼합용매로부터 선택된 1 종 이상의 용매로 추출한 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
4. 제 1항에 있어서, 상기 추출물은 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물 순으로 계통분리하여 수득된 분획물임을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
5. 흑송잎, 흑송껍질, 사매열매 및 포도껍질의 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 또는 노화방지용 식품 조성물.
6. 흑송잎, 흑송껍질, 사매열매 및 포도껍질의 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물.
7. 흑송잎, 흑송껍질, 사매열매 및 포도껍질의 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 식품 조성물.
8. 흑송잎, 흑송껍질, 사매열매 및 포도껍질의 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
9. 제 8항에 있어서, 상기 피부질환은 아토피 피부염, 접촉성 피부염, 지루성 피부염 및 기미로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 피부질환인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
10. 흑송잎, 흑송껍질, 사매열매 및 포도껍질의 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
    
    

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