CN111358722A

CN111358722A - 一种含葡萄皮渣提取物的护肤品及其制备方法

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Publication number: CN111358722A
Application number: CN202010289712.5A
Authority: CN
Inventors: 白长财; 任凤英; 崔承乾; 韩璐; 王文苹; 张莹; 陈丹; 王怡
Original assignee: Ningxia Medical University
Current assignee: Ningxia Medical University
Priority date: 2020-04-14
Filing date: 2020-04-14
Publication date: 2020-07-03
Anticipated expiration: 2040-04-14
Also published as: CN111358722B

Abstract

本发明公开了一种含葡萄皮渣提取物的护肤品及其制备方法，本发明将葡萄皮渣提取物加入到护肤品中，提高护肤品的抗氧化性，其中采用的葡萄皮渣提取物其主要成分为原花青素，采用特有的工艺提取而得，这种提取工艺采用DES(氯化胆碱：乳酸＝1∶2，n/n)为提取溶剂，该溶剂萃取能力强，对环境友好，组成相对简单，操作简单易行，提取方式容易实现，并且原花青素提取率高，不含刺激性成分，纯度较高。

Description

一种含葡萄皮渣提取物的护肤品及其制备方法

技术领域

本发明属于护肤品技术领域，具体涉及一种含葡萄皮渣提取物的护肤品及其制备方法。

背景技术

原花青素(Proanthocyanidins，PC)是植物中广泛存在的一大类多酚化合物的总称，具有极强的抗氧化、消除自由基的作用，可有效消除超氧阴离子自由基和羟基自由基，也参与磷酸、花生四烯酸的代谢和蛋白质磷酸化，保护脂质不发生过氧化损伤；是强有力的金属螯合剂，可螯合金属离子，在体内形成惰性化合物；保护和稳定维生素C，有助于维生素C的吸收和利用。原花青素分布广泛，存在于许多植物的皮、壳、籽、核、花、叶中，葡萄籽中原花青素含量最高，种类丰富。

欧洲人称原花青素为青春营养品，皮肤维生素，口服化妆品。因为它能恢复胶原蛋白活力，使皮肤平滑而有弹性。胶原蛋白是皮肤的基本成份，并且是一种使我们身体成为一个整体的胶状物质。原花青素连接在胶原蛋白上，可以阻止那些破坏胶原蛋白的酶的危害。原花青素不仅帮助胶原蛋白纤维形成交联结构，而且可以帮助恢复因受伤和自由基所引起的过度交联的损害。过度交联会使结缔组织窒息和硬化，从而使皮肤起皱纹和过早老化。花青素还保护人体免受阳光伤害，促进治愈牛皮癣和寿斑。原花青素也是局部施用的皮肤霜的极好添加剂，在护肤品中起到多重作用，如抗衰老、抗紫外线、抗辐射、增白、保湿等，对多种因素造成的皮肤老化都有独特的功效。因此，在护肤品中添加原花青素成了众多厂家的追求，但是目前添加原花青素的护肤品价格较高，并且稳定性较差，使用效果并不佳。如何找到一种价格低廉的原花青素来源及制备方法，以及如何提高其在化妆品中的适应性尤为重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种含葡萄皮渣提取物的护肤品及其制备方法，用以解决现有技术中存在的问题。

为实现上述目的，本发明采取如下技术方案：

一种含葡萄皮渣提取物的护肤品，所述护肤品中包括质量百分比为0.2％的葡萄皮渣提取物，所述护肤品为护肤霜或护肤水。

所述护肤霜由以下质量百分比的成分组成：A相：单硬脂酸甘油酯0.5％、肉豆蔻酸异丙酯3％、羊毛脂1％、十八醇1％、小麦胚芽油1％、羟苯甲酯0.1％、羟苯乙酯0.1％，B相：海藻糖2％、吡咯烷酮羧酸钠2％、尿囊素0.2％、透明质酸0.1％、EDTA二钠0.05％、丙二醇4％、丁二醇4％、甘油5％，C相：卡波姆0.1％、三乙醇胺0.2％、葡萄皮渣提取物0.2％、PEG40氢化蓖麻油1.41％、余量为水。

所述护肤水由以下质量百分比的成分组成：A相：吡咯烷酮羧酸钠2％、尿囊素0.2％、透明质酸0.1％、EDTA二钠0.05％、丁二醇4％，B相：丙二醇5％、甘油5％、葡萄皮渣提取物0.2％、C相：脱氢乙酸钠0.1％、余量为水。

所述护肤霜的制备方法为：

①.以制备得到的护肤品质量为100g计，分别称取处方量的卡波姆、透明质酸于不同烧杯中，分别加入10mL左右水溶胀待用；其中处方量表示的是按照上述的质量百分比称取。以下同；

②.将处方量甘油、丙二醇及葡萄皮渣提取物加入研钵中，研匀(研磨的过程为了提高提取物在赋形剂甘油等中的相容性，此过程有利于后续护肤品的制备)后加入适量水稀释备用；

③.称取处方量PEG40氢化蓖麻油以及A相各组分加入同一烧杯中，80℃水浴融化；处方量B相各组分置于装有溶胀后透明质酸的烧杯中，加入10mL左右水，90℃水浴融化；

④.磁力搅拌条件下将B相缓慢滴加至A相中，乳化30min后，降温至45℃，将②及处方量的羟苯甲酯、羟苯乙酯、三乙醇胺加至其中搅拌均匀；

⑤.将①中溶胀完全的卡波姆加入④中，搅拌降温至室温，即得。

所述护肤水的制备方法为：

①.以制备得到的护肤品质量为100g计，称取处方量透明质酸于烧杯中，加入10mL左右水溶胀待用；

②.称取处方量A相各组分置于装有溶胀后透明质酸的烧杯中，加入10mL左右水，90℃水浴融化后，降温至45℃；

③.称取处方量B相各组分至研钵中，研匀后加适量水稀释备用；

④.将③及处方量脱氢乙酸钠加至②中，搅拌10min后降温至室温，即得。

所述葡萄皮渣提取物的成分为原花青素，其中，从葡萄皮渣中提取原花青素的方法，包括如下步骤：

(1)提取：准确称取葡萄皮渣粉末，按照葡萄皮渣粉末与DES溶剂的料液比为1∶8-16的比例加入DES溶剂，所述料液比单位为g/ml，所述DES溶剂为氯化胆碱∶乳酸＝1∶2，两者比例为体积比，于20-60℃下磁力搅拌30-50min；

(2)分离：将提取液上D101大孔吸附树脂柱，提取液与D101大孔吸附树脂柱的体积比为1∶12.5，首先用纯化水洗脱，纯化水的用量为柱体积的5倍，然后加入45％乙醇缓慢洗脱至柱体无颜色，将洗脱液根据柱子上洗脱液颜色深浅分段收集，采用减压浓缩法回收其中的乙醇，浓缩后的洗脱液冷冻干燥24h以上，得到葡萄皮渣提取物。

优选地，所述DES溶剂的含水量10-30％。更加优选地，所述DES溶剂的含水量16.02％。

优选地，所述葡萄皮渣粉末与DES的料液比为1∶10.63。

优选地，采用在50℃磁力搅拌40min效果最佳。

优选地，所述减压浓缩法的压力范围为-0.07～-0.1MPa。

其中，所述葡萄皮渣粉末是由取自葡萄酒厂的葡萄皮籽渣晾晒干燥后，使用中草药粉碎机进行粉碎，过40目筛收集而得。

本发明具有如下优点：

本发明将葡萄皮渣提取物加入到护肤品中，提高护肤品的抗氧化性，其中采用的葡萄皮渣提取物其主要成分为原花青素，采用特有的工艺提取而得，这种提取工艺采用DES(氯化胆碱∶乳酸＝1∶2，n/n)为提取溶剂，该溶剂萃取能力强，对环境友好，组成相对简单，操作简单易行，提取方式容易实现，并且原花青素提取率高，不含刺激性成分，纯度较高。

附图说明

图1是不同DES提取葡萄皮渣原花青素对比；

图2是不同料液比提取葡萄皮渣原花青素的对比；

图3是不同提取方式提取葡萄皮渣原花青素对比；

图4是不同提取时间条件下葡萄皮渣原花青素含量对比；

图5是不同提取温度提取葡萄皮渣原花青素对比；

图6是不同含水量的DES提取葡萄皮渣原花青素对比；

图7是不同提取次数提取葡萄皮渣原花青素对比；

图8是避光与否提取葡萄皮渣原花青素对比；

图9是两种因素交互作用对葡萄皮渣原花青素含量影响的等高线；

图10是两种因素交互作用对葡萄皮渣原花青素含量影响的响应面图；

图11是加样量对吸附效果的影响；

图12是解吸液浓度对解吸效果的影响；

图13是各个流分原花青素含量对比；

图14是葡萄皮渣提取物的DPPH自由基清除活性对比；

图15是不同乳液的显微图；

图16是制备的到的护肤品的10*40倍显微镜图；图中，A：护肤水；B：护肤霜。

具体实施方式

下面将通过具体实施例对本发明进行详细的描述。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。

如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。

试验一葡萄皮渣提取物的制备方法(从葡萄皮渣中提取原花青素的方法)

本发明以葡萄皮渣为基础制备葡萄皮渣提取物，通过对其提取物中的主要成分原花青素为目标，来得到最佳的提取原花青素的工艺，具体地，发明人进行了如下试验，具体试验过程如下：

一、DES的筛选

发明人查阅文献，从众多可能形成低共熔溶剂的组分，将其组成中的HBA与HBD按特定摩尔比计算称量至50mL具塞锥形瓶中，置于水浴锅中，缓慢升温加热至融化。加热至80℃为止，确定可以形成的低共熔溶剂的组分，所选择的低共熔溶剂和性状如表1所示。

表1低共熔溶剂的制备及性状表述

根据表中描述，DES(氯化胆碱∶甘油和氯化胆碱∶丙二酸)形成的低共熔溶剂黏度过大，不利于葡萄皮渣的提取，可选择基于LA(乙酰丙酸)的5种DES(编号21，22，23，24，25)和基于ChCL(氯化胆碱)的3种DES(编，4，11，20)为提取溶剂。其中，TEAC为四乙基氯化铵，TEAB为四乙基溴化铵，TBAC为四丁基氯化铵，TBAB为四丁基溴化铵，CHCL为氯化胆碱。

然后对DES进行优化，具体如下：

准确称取处理后的葡萄皮渣粉末1g，按料液比1∶15加入不同的DES，55℃提取2h，提取液离心(3500RPM，5min)收集上清液，将上清液稀释10倍，取稀释液0.5mL，加入2％的硫酸铁铵溶液(2mol/L的盐酸溶液配制)0.2mL，正丁醇-盐酸(95∶5，v/v)溶液6mL，摇匀，60℃水浴40min，取出后立即置于冷水浴冷却15min，在550nm处测定吸光度，计算原花青素含量。计算结果见图1。

从图1可以看出，DES(氯化胆碱：甘油和氯化胆碱：丙二酸)黏度过大，不利于溶剂的渗透和活性成分的扩散，根据不同提取液中原花青素的含量测定结果(如图1)可知基于乙酰丙酸的DES(乙酰丙酸∶TBAB＝3∶1，v/v)和基于氯化胆碱的DES(氯化胆碱∶乳酸＝1∶2，v/v)提取原花青素含量相当，从经济和安全方面考虑，本实验最终选择基于氯化胆碱的DES(氯化胆碱∶乳酸＝1∶2，v/v)为原花青素的提取溶剂。

二、料液比的选择

准确称取葡萄皮渣粉末0.5g，按料液比1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16加入DES(氯化胆碱∶乳酸＝1∶2)，37℃水浴磁力搅拌提取30min，提取液3700RPM离心5min取上清液，稀释10倍。取稀释液0.5mL加入2％的硫酸铁铵溶液(2mol/L的盐酸溶液配制)0.2mL，正丁醇-盐酸(95∶5，v/v)溶液6mL，摇匀，60℃水浴40min，取出后立即置于冷水浴冷却15min，在550nm处测定吸光度，计算原花青素含量，结果见图2。

使用DES(氯化胆碱∶乳酸＝1∶2)提取葡萄皮渣原花青素，采取不同料液比进行提取，由图2可知，料液比为1∶10时，提取率最高，因此本实验采用料液比1∶10进行葡萄皮渣原花青素的提取。

三、提取方式的选择

准确称取葡萄皮渣粉末0.5g，按料液比1∶10加入DES(氯化胆碱∶乳酸＝1∶2)，分别采用37℃水浴磁力搅拌提取30min，37℃超声提取30min，37℃恒温培养摇床提取3h，提取液3700RPM离心5min取上清液，稀释10倍。取稀释液0.5mL加入2％的硫酸铁铵溶液(2mol/L的盐酸溶液配制)0.2mL，正丁醇-盐酸(95∶5，v/v)溶液6mL，摇匀，60℃水浴40min，取出后立即置于冷水浴冷却15min，在550nm处测定吸光度，计算原花青素含量，比较结果见图3。

使用DES(氯化胆碱∶乳酸＝1∶2)提取葡萄皮渣原花青素，采用不同提取方式辅助提取，由图3可知，采用磁力搅拌辅助提取时，提取率最高，因此本实验采用磁力搅拌辅助方式进行葡萄皮渣原花青素的提取。

四、提取时间的选择

准确称取葡萄皮渣粉末0.5g，按料液比1∶10加入DES(氯化胆碱∶乳酸＝1∶2)，37℃水浴磁力搅拌提取，分别在20min、30min、40min、50min、60min吸取提取液1mL，同时向其中加入1mL空白溶剂，提取液3700RPM离心5min取上清液，稀释10倍。取稀释液0.5mL加入2％的硫酸铁铵溶液(2mol/L的盐酸溶液配制)0.2mL，正丁醇-盐酸(95∶5，v/v)溶液6mL，摇匀，60℃水浴40min，取出后立即置于冷水浴冷却15min，在550nm处测定吸光度，计算原花青素含量，比较结果见图4。

使用DES(氯化胆碱∶乳酸＝1∶2)提取葡萄皮渣原花青素，采取不同提取时间进行提取，由图4可知，提取时间为40min和50min时提取率无显著性差异，60min时提取率稍有降低，原花青素属于多酚类化合物，提取时间过长可能会造成氧化或分解，因此本实验选择提取时间为40min，进行葡萄皮渣原花青素的提取。

五、提取温度的选择

准确称取葡萄皮渣粉末0.5g，按料液比1∶10加入DES(氯化胆碱∶乳酸＝1∶2)，分别在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃水浴磁力搅拌提取，提取液3700RPM离心5min取上清液，稀释10倍。取稀释液0.5mL加入2％的硫酸铁铵溶液(2mol/L的盐酸溶液配制)0.2mL，正丁醇-盐酸(95∶5，v/v)溶液6mL，摇匀，60℃水浴40min，取出后立即置于冷水浴冷却15min，在550nm处测定吸光度，计算原花青素含量，比较结果见表5。

在不同的温度使用DES(氯化胆碱∶乳酸＝1∶2)提取葡萄皮渣原花青素，由图5可知，提取温度为60℃时提取率最高，但50℃的提取率与60℃相比无显著性，考虑到原花青素对温度较为敏感，因此本实验采用提取温度为50℃进行葡萄皮渣原花青素的提取。

六、DES含水量的选择

准确称取葡萄皮渣粉末0.5g，按料液比1∶10加入不同含水量(10％，15％，20％，25％，30％)的DES(氯化胆碱∶乳酸＝1∶2)，在37℃水浴磁力搅拌提取40min，提取液3700RPM离心5min取上清液，稀释10倍。取稀释液0.5mL加入2％的硫酸铁铵溶液(2mol/L的盐酸溶液配制)0.2mL，正丁醇-盐酸(95∶5，v/v)溶液6mL，摇匀，60℃水浴40min，取出后立即置于冷水浴冷却15min，在550nm处测定吸光度，计算原花青素含量，结果见图6。

使用不同含水量的DES(氯化胆碱∶乳酸＝1∶2)37℃磁力搅拌40min提取葡萄皮渣原花青素，DES含水量为15％时其提取率最高，因此本实验采用含水量为15％的DES进行葡萄皮渣原花青素的提取。

七、提取次数的选择

准确称取葡萄皮渣粉末0.5g，按料液比1∶10加入DES(氯化胆碱∶乳酸＝1∶2)，37℃水浴磁力搅拌提取40min，提取液3700RPM离心5min取上清液，稀释10倍。同时向离心沉淀的部分按料液比1∶10加入DES((氯化胆碱∶乳酸＝1∶2)，依次提取5次，取稀释液0.5mL加入2％的硫酸铁铵溶液(2mol/L的盐酸溶液配制)0.2mL，正丁醇-盐酸(95∶5，v/v)溶液6mL，摇匀，60℃水浴40min，取出后立即置于冷水浴冷却15min，在550nm处测定吸光度，计算原花青素含量。

从图7可以看出，使用DES(氯化胆碱∶乳酸＝1∶2)37℃磁力搅拌40min提取葡萄皮渣原花青素，提取次数越多原花青素累积提取含量越高，前3次累积提取含量显著增加，之后提取含量无明显增加，因此本实验葡萄皮渣原料提取原花青素可以提取3次。

八、光照影响

准确称取葡萄皮渣粉末0.5g，按料液比1∶10加入DES(氯化胆碱∶乳酸＝1∶2)，37℃水浴磁力搅拌提取30min，避光条件下同法操作，提取液3700RPM离心5min取上清液，稀释10倍。取稀释液0.5mL加入2％的硫酸铁铵溶液(2mol/L的盐酸溶液配制)0.2mL，正丁醇-盐酸(95∶5，v/v)溶液6mL，摇匀，60℃水浴40min，取出后立即置于冷水浴冷却15min，在550nm处测定吸光度，计算原花青素含量。

使用DES(氯化胆碱∶乳酸＝1∶2)提取葡萄皮渣原花青素，比较避光与光照的条件下同时进行提取的原花青素含量，由上图可知，避光与否对原花青素含量无明显影响。

单因素筛选结果表明，不同料液比和DES含水量对葡萄皮渣原花青素的提取含量影响明显，因此选择料液比和DES含水量作为提取工艺优化的考察因素。

九、CCD(Central Composite Design)中心组合设计优化葡萄皮渣原花青素DES提取工艺

1.工艺优化

根据预实验结果，选择料液比(A)、DES含水量(B)两个因素，以提取液中原花青素含量为评价指标，优化提取工艺条件。CCD实验因素与水平设计见表2，利用Design-Expert8.06软件设计各组实验条件，提取葡萄皮渣计算原花青素含量测定结果见表3。

表2 CCD实验因素和水平表

以响应值(原花青素含量)最高为目标优化提取工艺条件。取葡萄皮渣粉末0.5g，按中心组合设计提取条件提取，测定并计算葡萄皮渣原花青素含量。

表3中心组合实验设计及结果

使用二次方程式的数学模型对试验数据进行拟合，原花青素含量的数学模型：R＝-362.18618+76.08223*A+12.59841*B-0.070246AB-3.52690*A²-0.36981*B²，方程相关系数R²和R² _Adj分别为0.9439和0.9038，说明模型拟合程度良好，回归方程能较好地描述各因素与响应值之间的关系。

表4葡萄皮渣原花青素提取率CCD模型方差分析

对响应曲面数据进行分析和显著性检验，结果见上表。由上表可知，该模型有显著性且失拟项无显著性，表明模型拟合程度良好、误差小。料液比与DES含水量对原花青素含量的影响都达到了显著性水平(P＜0.05)，各因素对原花青素含量的影响顺序为：A＞A²＞B＞B²。

等高线形状和三维响应曲面可以反应出交互效应的强弱，根据二次拟合模型的响应曲面和等高线模型评价料液比与DES含水量对葡萄皮渣原花青素提取含量的影响，结果见图9和10。

由拟合结果图可知：DES含水量与料液比过大或过小均会减少原花青素的提取含量；根据方差分析结果可知两者的交互作用对提取含量的影响并不显著，但两因素的二次项A²、B²对原花青素含量影响显著，根据Design-Export软件预测的最佳条件为料液比1∶10.63，DES含水量16.02％。

2.验证试验

根据二次回归方程绘制的两因素交互作用的三维立体图和等高线图，可以更加直观的观察料液比和DES含水量对原花青素含量的影响。经Design-Expert8.0.6软件预测所得的最优提取条件为料液比1∶10.63、DES含水量16.02％，此时预测的葡萄皮渣原花青素含量为142.994mg/g。根据模型预测的的最优提取条件下，同时提取3个样品，测定提取液中原花青素含量，验证实验求得预测值与实际值之间的误差[误差＝(预测值-实际值)/预测值]为0.3％，所得葡萄皮渣原花青素含量为143.53mg/g(RSD＝1.06％)与预测值基本一致。表明上述模型的预测准确度较高。

3.对比DES与乙醇提取葡萄皮渣原花青素的含量

根据文献，使用乙醇浸提法最优提取工艺(提取温度76℃，料液比1∶20，56％乙醇，提取74min)提取原花青素，乙醇浸提葡萄皮渣原花青素含量为62.03mg/g(RSD＝1.51％)。本文经过工艺优化后DES提取葡萄皮渣中原花青素的含量为143.53mg/g(RSD＝1.06％)，与乙醇提取原花青素含量相比提高了一倍以上。

十、葡萄皮渣提取物分离纯化

1.大孔吸附树脂的筛选

大孔吸附树脂预处理：大孔吸附树脂经无水乙醇浸泡过夜，湿法上柱，纯水冲至无醇味。再用5％HCL冲洗4倍柱体积，用纯水冲至中性后，用5％NaOH冲洗4倍柱体积，再用纯水洗至中性，用乙醇浸泡备用。

大孔吸附树脂的筛选：分别称取2g预处理过的大孔吸附树脂D101，AB-8，HPD400至50mL锥形瓶中，按料液比1∶5加入葡萄皮渣提取液，将锥形瓶置于恒温振荡器中，37℃，100RPM，震荡24h，用200目滤布过滤，收集滤液，用滤纸吸干残留液，测定滤液吸光度。将吸干残留液的三种大孔吸附树脂装回锥形瓶中，按料液比1∶5加入75％乙醇，同样条件下震荡24h，过滤后收集解吸液，测定解吸液吸光度，根据下面方程计算各树脂吸附率与解吸率，确定用于葡萄皮渣提取液分离的大孔吸附树脂。

C₀：吸附前溶液浓度；C₁：吸附后溶液浓度；C₂：解吸液浓度；V₁：吸附液体积；V2：解吸液体积。

表5不同大孔吸附树脂的吸附率和解吸率

根据吸附率与解吸率评价不同大孔吸附树脂对葡萄皮渣提取液的吸附和解吸附的效果，选择大孔吸附树脂D101作为分离纯化葡萄皮渣提取液的树脂。

2提取液上样量确定

经过预处理的大孔吸附树脂D101约500g湿法上柱，加入稀释后的葡萄皮渣提取液100mL，每10mL收集流分，紫外分光光度法测定吸光度，计算原花青素浓度，确定泄漏点。加样量对吸附效果的影响见图11。

在动态吸附开始时，树脂的吸附能力随着提取液的增加而增加，上样量过多会造成提取液浪费且会对树脂的再生造成影响，过少则会降低实验效率。根据上述实验结果，湿法上柱的提取液加样量(提取液与大孔树脂的柱体积的体积比)应为1∶12.5。

3、洗脱液的最佳浓度

将上面经过吸附饱和的大孔吸附树脂柱静置12h，使其充分吸附，设置乙醇浓度为0％，35％，45％，55％，65％，75％，首先用洗脱液0％乙醇洗脱5倍柱体积，以除去残留树脂床中未被树脂吸附的杂质，其余浓度洗脱液2倍柱体积进行梯度洗脱，收集洗脱液，测定吸光度，筛选最佳洗脱液浓度。

由图12可知，在乙醇浓度0％到45％范围内，随着乙醇浓度的增加，洗脱液中原花青素含量升高，在乙醇浓度45％时原花青素含量达到最大值，乙醇浓度大于45％之后，洗脱液中原花青素含量显著降低，即用45％的乙醇就可以将树脂中的原花青素解吸完全。

4、葡萄皮渣的洗脱过程

采用D101大孔吸附树脂湿法上柱，按照优化得到的最佳上样量比值将葡萄皮渣提取液湿法上柱，首先用纯化水洗脱5倍柱体积，然后加入45％乙醇缓慢洗脱至柱体无颜色。将各洗脱液分段收集并测定其吸光度，计算原花青素含量。

从图13可看出，第9流分原花青素含量最高，之后含量逐渐下降，第8流分之前和16流分之后的流分未检测到原花青素。因此，本实验收集8-16流分的洗脱液，减压浓缩回收洗脱液中的乙醇，冷冻干燥得到葡萄皮渣提取物。

根据上述结果，将洗脱液根据洗脱液颜色深浅分段收集，采用减压浓缩法回收其中的乙醇，浓缩后的洗脱液冷冻干燥24h以上，得到葡萄皮渣提取物。

十一、葡萄皮渣提取物的评价

然后对得到的提取物计算回收率，休止角，松密度与堆密度，具体如下：

准确称取提取物20mg至10mL容量瓶中，用90％乙醇溶液定容后，测定提取物中原花青素的含量，计算提取物的回收率。计算结果得出提取物中原花青素含量为615.19mg/g(RSD＝0.01％)，原花青素回收率60.77％。

采用固定漏斗法，将两只漏斗串联并固定于水平放置的坐标纸上方一定高度(约2cm)，将葡萄皮渣提取物从最上面的漏斗中缓缓加入，直至形成的堆积圆锥顶部与漏斗底部刚好接触，测定圆锥底部直径(2R)，以漏斗底高度(H)与圆锥半径比作为正切值计算休止角(tanα＝H/R)。本实验制备的葡萄皮渣提取物休止角为37.37°±2.13，小于40°，表明葡萄皮渣提取物流动性较好。

取适量葡萄皮渣提取物倒入25mL塑料量筒中，上下振动至体积不发生变化(约50次)，读取体积，计算松密度与堆密度。本实验制备的葡萄皮渣提取物松密度为0.40±0.02g/mL，堆密度为0.48±0.01g/mL。

十二、抗氧化活性

DPPH自由基清除活性测定：准确配制0.1mmol/L的DPPH溶液，避光保存。取不同浓度提取物溶液100μl与100μl DPPH溶液加入同一孔中，测定吸光度A_样，同时测定100μl提取物溶液与100μl无水乙醇加入同一孔中的吸光度A_对照，100μl DPPH溶液与100μl 90％乙醇加入同一孔中的吸光度A_空白。将样品放置于37℃保温箱中，50min后测定吸光度。以VC为阳性对照，按照下式计算DPPH自由基清除率。

自由基清除能力表示为：

清除率(％)＝[1-(A_样-A_对照)/A_空白]*100％

由图14可知，葡萄皮渣提取物浓度在5μg/mL～90μg/mL的范围内，随着提取物浓度的增加，DPPH自由基清除率增大。当提取物浓度达到90μg/mL时，DPPH自由基清除率达到83.09％。

实施例1

从葡萄皮渣中提取原花青素的方法，包括如下步骤：

(1)提取：准确称取葡萄皮渣粉末(由取自葡萄酒厂的葡萄皮籽渣晾晒干燥后，使用中草药粉碎机进行粉碎，过40目筛收集而得)，按照葡萄皮渣粉末与DES溶剂的料液比为1∶8-16(最佳比例为1∶10.63)的比例加入DES溶剂，所述料液比单位为g/ml，所述DES溶剂为氯化胆碱∶乳酸＝1∶2，两者比例为体积比，于20-60℃下磁力搅拌30-50min(50℃磁力搅拌40min效果最佳)；

(2)分离：将提取液上D101大孔吸附树脂柱，提取液与D101大孔吸附树脂柱的体积比为1∶12.5，首先用纯化水洗脱，纯化水的用量为柱体积的5倍，然后加入45％乙醇缓慢洗脱至柱体无颜色，将洗脱液根据柱子上洗脱液颜色深浅分段收集，采用减压(压力范围为-0.07～-0.1MPa)浓缩法回收其中的乙醇，浓缩后的洗脱液冷冻干燥24h以上，得到葡萄皮渣提取物。

实施例2

一种含葡萄皮渣提取物的护肤霜，所述护肤霜由以下质量百分比的成分组成：A相：单硬脂酸甘油酯0.5％、肉豆蔻酸异丙酯3％、羊毛脂1％、十八醇1％、小麦胚芽油1％、羟苯甲酯0.1％、羟苯乙酯0.1％，B相：海藻糖2％、吡咯烷酮羧酸钠2％、尿囊素0.2％、透明质酸0.1％、EDTA二钠0.05％、丙二醇4％、丁二醇4％、甘油5％，C相：卡波姆0.1％、三乙醇胺0.2％、葡萄皮渣提取物(采用实施例1中最佳制备方法得到)0.2％、PEG40氢化蓖麻油1.41％、余量为水。

所述护肤霜的制备方法为：

①.以制备得到的护肤品质量为100g计，分别称取处方量的卡波姆、透明质酸于不同烧杯中，分别加入10mL水溶胀待用；

②.将处方量甘油、丙二醇及葡萄皮渣提取物加入研钵中，研匀后加入10mL水稀释备用；

③.称取处方量PEG40氢化蓖麻油以及A相各组分加入同一烧杯中，80℃水浴融化；处方量B相各组分置于装有溶胀后透明质酸的烧杯中，加入10mL水，90℃水浴融化；

实施例3

一种含葡萄皮渣提取物的护肤水，所述护肤水由以下质量百分比的成分组成：A相：吡咯烷酮羧酸钠2％、尿囊素0.2％、透明质酸0.1％、EDTA二钠0.05％、丁二醇4％，B相：丙二醇5％、甘油5％、葡萄皮渣提取物0.2％、C相：脱氢乙酸钠0.1％、余量为水。

所述护肤水的制备方法为：

①.以制备得到的护肤品质量为100g计，称取处方量透明质酸于烧杯中，加入10mL水溶胀待用；

②.称取处方量A相各组分置于装有溶胀后透明质酸的烧杯中，加入10mL水，90℃水浴融化后，降温至45℃；

试验二护肤品各种主要成分的筛选

1、乳化剂的筛选

在护肤乳液中，乳化剂的含量一般为整个油相质量分数的10％-20％，设计实验对PEG40氢化蓖麻油；吐温80和司盘80复配乳化剂两种护肤产品的乳化剂进行筛选。根据下式计算司盘80和吐温80复配乳化剂的HLB值，HLB值应调节至与油相所需HLB值一致。

表6乳化剂的筛选结果

并且不同乳液的显微图如图15所示，A、B、C中液滴粒径较大，大小分布不均匀；D和F中呈小点团聚状，只有E中液滴粒径相对较小，分布较均匀，本实验最终选择15％PEG40氢化蓖麻油作为乳化剂。

继续对A-F进行离心试验，结果得知，A、B、C三个样离心前后无分层或沉淀析出现象，D、E、F三个样品离心后出现分层，且D、F两个样品底层有明显白色沉淀析出，E样品有明显分层。

耐热实验：A、B、C三个样品耐热实验前后无分层或沉淀析出现象，D、E、F三个样耐热实验前后比较有明显变稀，且有油相组分析出。

耐寒实验：A、B、C三个样品耐寒实验前后无分层或沉淀析出现象，D、E、F三个样耐热实验前后比较有分层现象，底部白色黏稠状物体，上层清液状。

根据上述实验结果，确定乳化剂为15％的PEG40氢化蓖麻油。

2、增稠剂的筛选

根据制备霜剂的表观特征，筛选护肤霜的油相增稠剂单硬脂酸甘油酯/十八醇的百分比，水相增稠剂卡波姆的型号及百分比。

表7增稠剂的筛选

注：卡波姆(A)指卡波姆940，卡波姆(B)指卡波姆934。

根据上表，确定油相增稠剂为0.5％单硬脂酸甘油酯，1％十八醇；水相增稠剂为0.1％卡波姆934。

试验3护肤品评价

1、护肤产品的稳定性考察

制备得到的护肤品显微图(10*40)见图16。制备得到的护肤水显微图无明显现象，护肤霜显微图有细小圆形状，呈现水包油型乳剂的特征形态。

离心实验：各个处方制备的样品取适量加至5mL离心管中，2000RPM，离心30min后取出，观察样品是否有分层、沉淀析出、色泽变化等现象。结果显示：霜剂与水剂离心前后均无分层、出水等现象出现，

耐热实验：各个处方制备的样品置于40℃烘箱中保存24h，取出后观察样品是否有分层、沉淀析出、色泽变化等现象。结果显示：霜剂与水剂耐热前后均无分层、出水等不稳定现象出现。

耐寒实验：各个处方制备的样品置于-20℃冰箱中保存24h，取出后观察样品是否有分层、沉淀析出、色泽变化等现象。结果显示：霜剂与水剂耐寒前后均无分层、出水等不稳定现象出现。

冷热循环实验：耐寒耐热实验循环考察3次，观察样品是否有分层、沉淀析出、色泽变化等现象。霜剂与水剂冷热循环结果显示：经过3次冷热循环后霜剂与水剂均无分层、出水等现象出现。

2、pH测定

护肤水：(直测法)根据GB/T 13531.1-2008，将已制备好的护肤水放置在小烧杯中，将已经校正后的pH电极插入试样中，使电极浸没，待pH计读数稳定，记录读数。护肤霜：(稀释法)称取制备的护肤霜1g，加入经煮沸；冷却后的纯化水9mL，加热至40℃，并不断搅拌至均匀，冷却至室温，将已经校正好的pH电极插入试液中，使电极浸没，待读数稳定，记录读数。

水剂的pH为6.62±0.23，霜剂的pH为6.68±0.10。人体皮肤为弱酸性，霜剂与水剂的pH均在6.6左右，为弱酸性护肤品，有利于皮肤吸收。

3黏度测定

使用流变仪进行测定，设置转速250转/分钟，使用63号转子对护肤水黏度进行测定。护肤霜因其黏度较大，无法采用流变仪测定，故采用倒置观察法。

护肤水：57.87±2.26厘泊，黏度适中。

护肤霜：制备霜剂放置到室温后，倒置后观察到非常缓慢流动，黏度较大。

4防晒效果评价

准确称取护肤水、霜各1g至10mL容量瓶中，甲醇定容，超声萃取10min后，3000RPM，离心5min。上清液用0.45um微孔滤膜过滤，弃去初滤液，取续滤液。使用紫外分光光度计，在290nm至320nm范围内，每隔5nm测定一次吸光度，未加提取物的空白护肤水、乳同法制备，作为空白对照。分别在0，7，21天测定吸光度，采用Mansur方程计算SPF值。

CF：校正系数(＝10)；EE(λ)：红斑效应谱；I(λ)：太阳强度光谱；Abs(λ)：测定样品的吸光度。

表8 SPF计算中EE(λ)*I(λ)参数常量

表9护肤产品的SPF值测定结果

从表9可以看出，护肤水和霜的SPF值在5.26-8.00范围内，均有一定的防晒效果，且在21天内稳定性良好，用于日常护肤中，可起到一定的防晒效果。

5保湿性测定

准确称量贴有胶布(模拟皮肤)的玻璃板质量，记为M₀，将一定量的护肤水、霜滴在玻璃板上，准确称重，记为M₁，将其放进装有饱和氯化钙[CaCl₂]、饱和碳酸钾[K₂CO₃]、饱和醋酸钾[CH3COOK]、饱和氯化钠[NaCl]、饱和氯化钾[KCL]溶液的干燥器中，在15min，30min，1h，2h，3h，5h，8h，12h，24h称重M，根据公式计算保湿率。其中饱和氯化钙溶液环境下相对湿度为31％，饱和碳酸钾溶液环境下相对湿度为43％，饱和醋酸钾溶液环境下相对湿度为62％，饱和氯化钠溶液环境下相对湿度为75％，饱和氯化钾溶液环境下相对湿度为85％。

根据查询全国城市不同月份湿度可知，全国城市最低湿度为30％左右，最高为80％左右，且大部分时间各城市湿度在40-60％(中国天气预报网)，本实验选择以上5个湿度环境测试水剂和乳剂保湿情况。实验结果如下所示。

在不同湿度条件下测定霜剂与水剂的保湿性结果显示，12h内霜剂在不同湿度条件下的保湿率达到85％以上，24h内保湿率达到80％以上。各湿度的保湿能力大小为：85％＞75％＞62％＞43％＞31％。水剂的保湿性在0-24h内缓慢下降，24h后31％湿度条件下保湿率下降至28.36％±0.64，85％和75％湿度条件保湿率在55％左右。总体来说，霜剂的保湿性优于水剂的保湿性，日常使用过程中护肤产品一般是协调使用。

6皮肤刺激性实验

模型制作：实验选取SPF级小鼠，于给药前24h，将实验动物背部脊柱两侧对称处毛剔去，剔去面积约3cm²，此后24h检查去毛皮肤是否受伤，如皮肤受伤，该实验动物不宜用作完好皮肤的皮肤刺激性试验^[i]。破损皮肤制作系采用一次性消毒针头将去毛部位划破口，以刺伤表皮，不伤真皮，有渗血为度。另选3只小鼠，刺伤表皮，实验过程中不涂抹任何护肤品，与皮肤破损组小鼠对照。

多次给药的皮肤刺激性实验：分为皮肤完整组和皮肤破损组，每组4只小鼠。采用同体自身左右对比。取护肤水、霜0.5mL(g)，均匀涂抹至去毛部位，采用两层纱布和玻璃纸覆盖，用纱布缠绕包扎，敷用4h，连续涂抹14天，从第二天开始。每次涂抹前应剪毛。去药24、48、72h后，用肉眼观察，按表10和11评分并判断刺激强度。评价结果见表12。

表10皮肤刺激性反应分值标准

表11皮肤刺激性强度评价标准

表12多次给药去药后小鼠皮肤反应

注：无“*”表示完好皮肤组；“*”表示破损皮肤组。

从表12可以得出，破损组小鼠在7天左右皮肤恢复结痂，与破损未给药小鼠结痂时间差异不大，破损皮肤和完好皮肤组小鼠在14天给药及去药24、48、72h过程中均无红斑和水肿出现，说明制备的护肤产品对小鼠皮肤无刺激性。

7、感官评价

选择合格受试者5名。前臂屈侧作为受试的部位，保持受试部位干燥，实验过程中不使用其他护肤产品。将护肤水和霜每天均匀地涂抹于受试部位，连续2周，观察皮肤的状态，按表13皮肤反应评价标准记录试用评价。人体试用试验感观评价评分结果见表14.

表13人体试用试验感观评价评分标准

表14人体试用试验感观评价评分结果

注：评分等级I至V为每个评价指标程度由低到高。

由人体试用试验感观评价评分结果可知，各受试者试用护肤水和霜后均无任何不良反应，表明护肤水和霜对人体皮肤基本没有刺激性。且其涂展性好、吸收性好、试用者接受程度高；所制霜剂黏度较高、油腻感轻，大部分受试者可接受；护肤水和霜气味适中。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种含葡萄皮渣提取物的护肤品，其特征在于，所述护肤品中包括质量百分比为0.2％的葡萄皮渣提取物，所述护肤品为护肤霜或护肤水。

2.根据权利要求1所述的含葡萄皮渣提取物的护肤品，其特征在于，所述护肤霜由以下质量百分比的成分组成：A相：单硬脂酸甘油酯0.5％、肉豆蔻酸异丙酯3％、羊毛脂1％、十八醇1％、小麦胚芽油1％、羟苯甲酯0.1％、羟苯乙酯0.1％，B相：海藻糖2％、吡咯烷酮羧酸钠2％、尿囊素0.2％、透明质酸0.1％、EDTA二钠0.05％、丙二醇4％、丁二醇4％、甘油5％，C相：卡波姆0.1％、三乙醇胺0.2％、葡萄皮渣提取物0.2％、PEG40氢化蓖麻油1.41％、余量为水。

3.根据权利要求1所述的含葡萄皮渣提取物的护肤品，其特征在于，所述护肤水由以下质量百分比的成分组成：A相：吡咯烷酮羧酸钠2％、尿囊素0.2％、透明质酸0.1％、EDTA二钠0.05％、丁二醇4％，B相：丙二醇5％、甘油5％、葡萄皮渣提取物0.2％、C相：脱氢乙酸钠0.1％、余量为水。

4.根据权利要求1所述的含葡萄皮渣提取物的护肤品，其特征在于，所述护肤霜的制备方法为：

①.以制备得到的护肤品质量为100g计，分别称取处方量的卡波姆、透明质酸于不同烧杯中，分别加入10mE水溶胀待用；

5.根据权利要求1所述的含葡萄皮渣提取物的护肤品，其特征在于，所述护肤水的制备方法为：

6.根据权利要求1-5任一项所述的含葡萄皮渣提取物的护肤品，其特征在于，所述葡萄皮渣提取物的成分为原花青素，其中，从葡萄皮渣中提取原花青素的方法，包括如下步骤：

(1)提取：准确称取葡萄皮渣粉末，按照葡萄皮渣粉末与DES溶剂的料液比为1∶8-16的比例加入DES溶剂，所述料液比单位为g/ml，所述DES溶剂为氯化胆碱∶乳酸＝1∶2，两者比例为摩尔比，于20-60℃下磁力搅拌30-50min；

(2)分离：将提取液上D101大孔吸附树脂柱，提取液与D101大孔吸附树脂柱的体积比为1∶12.5，首先用纯化水洗脱，纯化水的用量为柱体积的5倍，然后加入45％乙醇缓慢洗脱至柱体无颜色，将洗脱液分段收集，采用减压浓缩法回收其中的乙醇，浓缩后的洗脱液冷冻干燥24h以上，得到葡萄皮渣提取物。

7.根据权利要求6所述的含葡萄皮渣提取物的护肤品，其特征在于，所述DES溶剂的含水量10-30％。

8.根据权利要求7所述的含葡萄皮渣提取物的护肤品，其特征在于，所述DES溶剂的含水量16.02％。

9.根据权利要求6所述的含葡萄皮渣提取物的护肤品，其特征在于，所述料液比为1∶10.63。

10.根据权利要求6所述的含葡萄皮渣提取物的护肤品，其特征在于，50℃磁力搅拌40min。