CN104628698A

CN104628698A - 一种葡萄果中原花青素提取物的制备方法及应用

Info

Publication number: CN104628698A
Application number: CN201510074121.5A
Authority: CN
Inventors: 陈海佳; 王一飞; 葛啸虎; 池诗源; 王小燕
Original assignee: Guangzhou Saliai StemCell Science and Technology Co Ltd
Current assignee: Guangzhou Sailaila Biological Gene Engineering Co ltd
Priority date: 2015-02-11
Filing date: 2015-02-11
Publication date: 2015-05-20
Anticipated expiration: 2035-02-11
Also published as: CN104628698B

Abstract

本发明公开了一种葡萄果中原花青素提取物的制备方法，包括以下步骤：(1)准备葡萄皮和葡萄果肉：将葡萄果剔除葡萄籽得到葡萄皮和葡萄果肉；(2)萃取原花青素：配置甲醇、乙醇和水溶液成混合溶液，将混合溶液与步骤(1)准备的葡萄皮和葡萄果肉混合，反应；(3)将反应物进行固液分离得到提取液，在负压的条件下，对提取液用水冻溶，并浓缩；(4)微波提取原花青素：在550W微波条件下对提取液处理，离心；(5)浓缩：将离心后的上清液进行浓缩，得到浓缩的原花青素提取液。本发明提取效率更高，提取的原花青素化合物具有抗衰老等功效，应用于抗衰老美容行业中。

Description

一种葡萄果中原花青素提取物的制备方法及应用

技术领域

本发明属于生物美容领域，具体涉及一种葡萄果中原花青素提取物的制备方法及应用。

背景技术

葡萄，又称提子，是葡萄属的一种常见落叶木质藤本植物，是浆果类水果中营养价值极高的一种水果类物质，原产于亚洲西部地区。《神农本草经》中载文称，葡萄具有“久食，亲身不老延年”的功效，葡萄是一种具有抗贫血、抗炎和美容养颜功效的水果。葡萄中含有的花青素等多酚类化学成份，这些成分具有突出的抗氧化性，能够消除人体自由基，抑制体内脂质过氧化，达到增强皮肤免疫力、防止紫外线、美白、祛斑及减少皱纹、收敛毛孔和保湿的效果。目前现有的专利和技术的关注点都集中在葡萄籽中原花青素的提取，而葡萄皮和葡萄果肉以及葡萄籽中都有原花青素类物质的存在，而实际上葡萄皮和葡萄果实中的原花青素含量也不低，但由于葡萄果通常用来酿酒，该部分的原花青素基本被废弃，实际上原花青素的含量和价值不亚于酿酒。

目前针对原花青素的提取方法中主要有：一、水溶液浸泡法，在水溶液中利用加热浸泡，然后用非极性大孔树脂吸附，用乙醇洗脱、浓缩得到粗提物，粗提物蒸干得到粉末状结晶。然而本方法提取得到的产品纯度较低，回收率也较低，其使用受到一定的限制。二、有机溶剂萃取法，根据相似相溶原理，选用水、乙醇、乙酸乙酯和丙酮等萃取剂进行提取。然而本方法分离过程的工艺流程复杂，操作时间长，对化学结构相似的化合物分离纯化能力有限，而且使用的溶剂种类多、用量大，容易对环境造成污染。三、微波辅助提取法，根据物质组分不同的微波吸收能力差异使得基体物质的某些区域或萃取体系中的某些组分被选择性加热，从而使得萃取物质从基质活体系中分离，计入介电常数较小、微波吸收能力相对较差的萃取液中。四、超临界流体萃取法，利用超临界流体作为萃取剂液体和固体中提取某些成分，达到分离和提纯的目的。然而本方法需要特定的设备，设备运行及维护成本较高，而且对不同成分的提取率有着很大的差异。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供葡萄果中原花青素提取物的制备方法，该方法能够高效地提取葡萄果中原花青素，并应用于抗衰老美容化妆品中。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：

一种葡萄果中原花青素提取物的制备方法，包括以下步骤：

(1)准备葡萄皮和葡萄果肉：将葡萄果剔除葡萄籽得到葡萄皮和葡萄果肉；

葡萄籽自身带有一层外壳保护结构，在提取原花青素的过程中需要去除该部分结构，在去除的过程中可能导致部分原花青素损失，因此工艺相对复杂，不仅需要相应的设备，而且在去壳的过程有引进杂质的风险，而葡萄果实和葡萄皮由于自身结构不同，不存在该问题，因此原材料的初步处理工艺上不同，只需要进行一步的溶剂萃取，无需进行二次溶剂萃取，而且减少了萃取剂的应用就降低了引进杂质的风险。

(2)萃取原花青素：按体积比为(0.5-2):(0.5-2):(0.5-2)配置甲醇、乙醇和水溶液成混合溶液，将混合溶液与步骤(1)准备的葡萄皮和葡萄果肉混合，反应12-36小时；

本发明采用甲醇、乙醇和水的混合溶液来萃取原花青素，且为了更好的提高提取效率，甲醇、乙醇和水体积比为(0.5-2):(0.5-2):(0.5-2)，该比例的混合溶液对提取葡萄果实中的原花青素更加有效。

乙醇作为一种无毒萃取剂，在工业应用上范围较广，但是乙醇对原花青素的提取率相对没有甲醇等物质高，因此将甲醇和乙醇及水等混合一起既可以提高萃取率时又能降低甲醇的残留，同时又能够降低可能残留的甲醇对人体带来的毒副作用；经实验证明最佳比例为1：1，而现有对比技术中的其溶剂的成份较为复杂，容易引进杂质，而且其成份中醚类及烷烃类分子量较大，在萃取时会降低原花青素的萃取率。而且本发明跟现有技术相比不需要进行二次萃取，因此在溶剂成份和比例上，包括萃取效果和萃取次数上都相对现有技术更具优势。

(3)步骤(2)反应后，将反应物进行固液分离得到提取液，在(-0.30MPa)-(-0.05MPa)的条件下，对提取液用水冻溶，并浓缩；

在负压情况下，会产生强烈的空化效应和机械震动，造成葡萄细胞壁快速破碎，加速胞内物质的向介质释放、扩散和溶解，促进提取的过程，达到较好的提取效率。随着负压的增加，葡萄果实细胞和葡萄皮中的原花青素的提取率会有增加，但是随着负压达到一定的临界值后就会开始下降，所以要选择一个最佳的负压值。而冻溶是因为在低温情况下，细胞的一些生物活性能够得到保存，包括原花青素的生物化学结构能够更加的稳定，同时提取率更加的高。

本发明采用负压低温冻溶法结合非持续微波法提取葡萄中的原花青素。本发明在(-0.30MPa)-(-0.05MPa)的条件下，对提取液用小于等于0℃；这种非持续性的微波处理能够尽量降低葡萄果实和葡萄皮中细胞的细胞膜破碎速度，降低提取样品引入杂质的几率，再结合反应液的温度，提高提取效率。

(4)微波提取原花青素：在400-650W微波条件下对提取液处理6-15min，离心；

(5)浓缩：将步骤(4)离心后的上清液进行浓缩，得到浓缩的原花青素提取液。

优选的，步骤(1)中将所述葡萄皮和葡萄果肉捣碎。

优选的，步骤(2)中所述甲醇、乙醇和水的体积比为1:1:1，所述混合溶液与步骤(1)准备的葡萄皮和葡萄果肉混合后反应24小时。

优选的，步骤(3)中将所述固液分离得到提取液在-0.10MPa下用0℃以下的水冻溶；所述步骤(4)中在550W微波条件下对所述提取液处理。

优选的，步骤(4)中对所述提取液处理采用进行短时间多次微波处理方式，每次微波时间为0.3-0.8S，时间间隔为0.3-0.8S。

优选的，步骤(4)中每次微波时间为0.5S，时间间隔为0.5S，提取液温度超过设定的报警温度40-50℃则反应停止；所述微波处理过的提取液在2000-4000r/min下离心5-20min。这种非持续性的微波处理能够尽量降低葡萄果实和葡萄皮中细胞的细胞膜破碎速度，降低提取样品引入杂质的几率，再结合反应液的温度，在超过一定设定温度的情况下，可提前结束微波处理，因为较高的温度会破坏原花青素的化学结构，故要设置一定的温度，提前停止是因为在该温度下细胞膜的通透性已经很大，再高的温度可能会让细胞膜通透性活性完全死亡，释放大量的其它杂质类物质，增加了分离提取的难度。

本发明还提供了所述方法制得的葡萄果中原花青素提取物制成原花青素冻干粉的方法，包括以下步骤：

(1)过滤：收集浓缩的原花青素提取液，用孔径小于0.45μM的滤膜过滤；

(2)浓缩：浓缩上清液；

(3)过滤：将浓缩的上清液采用孔径小于0.22μM的滤膜过滤；

(4)冻干处理：冻干温度为(-20℃)-(-35℃)，真空度为50-200Pa，冻干时间为24-36小时，即得到原花青素冻干粉。

本发明提供了所述方法制得的原花青素冻干粉在抗衰老护肤品中应用。本发明将去籽后葡萄皮和葡萄果实中的原花青素化合物应用于抗衰老美容行业中，如面膜等化妆品，能够达到保持面部肌肤弹性、去皱等效果，同时也可以将其应用在保健品中。

优选的，所述抗衰老护肤品为面膜、爽肤水、面霜、乳液、眼霜、洗面乳。

优选的，所述原花青素冻干粉在抗衰老护肤品中的添加量为1-1000μg/ml。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例1

1.葡萄皮和葡萄果肉的准备

1)选取新鲜的葡萄(在市场上采购即可)，用自来水清洗干净后再用去离子水清洗一遍，然后剔除葡萄中的葡萄籽。

2)将剔除葡萄籽的葡萄果放在不锈钢容器中，然后用器械尽可能地捣碎彻底。

2.加入混合有机溶剂萃取原花青素

1)按照体积比为1：1：1的比例加入甲醇、乙醇和水溶液，充分搅拌混匀有机溶剂和捣碎后的去籽葡萄。

2)静置24小时后处理。

3.负压冻溶

1)静置结束后对其进行抽滤处理，进行固液分离。

2)在-0.10mPa的负压条件下，用0℃冷水冻溶，蒸发回收甲醇及乙醇溶剂，并浓缩提取液体。

4.微波辅助提取原花青素

1)在550W微波条件下进行微波处理，时间为10min，微波设置短时间多次破碎方式，每次微波时间为0.5s，间隔时间为0.5s。期间如反应液温度超过设定的报警温度(45℃)则微波停止。

2)离心处理：将经过微波处理过的提取液在3000r/min下离心10min。

5.真空浓缩

1)取离心后的上清液，在35℃下真空浓缩。

2)将得到的浓缩上清用0.45μM的滤膜进行过滤、浓缩。

6.制备葡萄原花青素冻干粉

1)将得到的浓缩上清用0.22μM过滤除菌。

2)除菌后进行冻干处理，冻干温度为-25℃，真空度为100Pa，冻干时间为28小时，即得到葡萄果原花青素成分冻干粉。将冻干粉分装成1ml/支。

7.原花青素含量的测定

1)测定原理：原花青素和儿茶素类单体的A环化学活性较高，在酸性条件下，其上的间苯二酚或间苯三酚与香草醛发生缩合反应，产物在浓酸作用下形成有色的正碳离子，样品的浓度与产生的颜色呈正相关，在500nm波长下测定其吸收光度。

2)测定方法：香草醛-硫酸法测定

A.标准曲线的建立：配制0.025～0.25μmol/ml儿茶素标准品甲醇溶液，依次加入0.5ml不同浓度标准品溶液、2.5ml的1％香草醛-甲醇溶液及2.5ml的30％H2SO4-甲醇溶液，混匀后于30℃水浴避光反应15min后于500nm处测定吸光值。以吸光值A为横坐标，原花青素浓度为纵坐标绘制标准曲线。

B.样液含量测定：将实施例1制得的原花青素浓缩液稀释到0.05～0.25μmol/ml，精密移取0.5ml待测液，加入2.5ml香草醛-甲醇溶液和及2.5ml的30％H₂SO₄-甲醇溶液，混匀后于30℃水浴避光反应15min。空白对照为无水甲醇。

C.原花青素含量的计算方式：

原花青素(％)＝(C×N×V÷M)×100％

C—稀释后提取液中原花青素浓度(mg/ml)；

N—提取液稀释倍数；

V—提取液体积，ml；

M—葡萄质量，mg。

结果表明：按照本发明的提取方法，并根据上述原花青素含量的计算公式可以得到葡萄果和葡萄皮中的原花青素提取率，其含量为42.67％，相对现有的技术方法，其提取率相对大大地提高。

8.原花青素的鉴定

1)鉴定原理：原花青素本身属于多酚类物质的一种，因而可以用鉴定多酚的方式，即使用薄层层析来鉴定原花青素。薄层层析法(吸附色谱)，吸附性薄层色谱法是将吸附剂在光洁的表面上均匀地铺成薄层，而后在在上面点上样品，以流动相开展，这样样品组分不断地被吸附剂吸附，而被流动相溶解，解吸而向前移动。由于吸附剂对不同组分有不同的吸附能力，流动相也有不同的解吸能力，因而流动相在向前移动的过程中，不同组分的物质将被分开。如果各组分本身有颜色则薄层板干燥后会出现一些列高低不同的斑点，如果本身没有颜色，则可用各种显色方法使之显色。

2)测定方法：制备所需的层析板，将实施例1制备的原花青素浓缩液在薄层上展开。

3)测定结果：在薄层层板上会出现一个淡黄色色斑，向其喷显色剂，出现蓝色，证明所分离得到的提取产物为多酚类原花青素。

实施例2

具体的制备方法与实施例1基本相同，不同的是：

步骤2中甲醇、乙醇和水溶液按体积比为0.5:1:2配制成混合溶液，步骤3中在-0.30mPa的条件下进行负压冻溶。步骤4中微波辅助提取原花青素时，首先，在550W微波条件下进行微波处理，时间为15min，微波设置短时间多次破碎方式，每次微波时间为0.8s，间隔时间为0.5s。期间如反应液温度超过设定的报警温度(45℃)则微波停止。最后，离心处理时将经过微波处理过的提取液在2000r/min下离心20min。

将实施例2制得的原花青素用于以下动物实验

取昆明种小鼠50只(每只体重在15g～20g)，随机分成5组：空白对照组、模型对照组、原花青素高、中、低三个剂量组，分别记为A、B、C、D、E组。对C、D、E组分别灌服用150、100、50mg/kg体重的原花青素，A组给予同体积蒸馏水。4周后处死动物，用生化的方法测定局部的SOD和HYP含量，其具体结果如下：

分组	数量	SOD(NU/mg port)	GSH-PX(nmol/mg port)
				模型对照组(B组)	10	20227.62±5569.77	10.94±4.98

低剂量对照组(E组)	10	24369.27±3854.48	15.99±7.02
				中剂量对照组(D组)	10	25524.61±4292.06	15.03±7.36
高剂量对照组(C组)	10	24894.37±4179.72	17.64±5.84
				空白对照组(A组)	10	20920.73±5509.35	9.97±5.03

上述结果显示：

A组与B组比较，P＜0.05，证明两者有显著性差异。

从上述数据可以看到C组和D组的小鼠红细胞SOD活力明显高于B组(P＜0.05)，并且D组小鼠灌胃4周后红细胞SOD活力和A组比较也有显著性的提高(P＜0.05)。而E组小鼠红细胞活力与B组比较SOD活力有提高，但提高无显著性差异(P＞0.05)，并且E组与C组小鼠灌胃30天后红细胞SOD活力及提高程度和空白对照组比较亦无显著性差别(P＞0.05)。

结果表明：采用中剂量的效果是最好的，其SOD的表达含量最高。所谓的SOD就是超氧化物歧化酶，是生物组织内的自由基清除剂，能够清除自由基O2(超氧阴离子自由基)，而O2具有细胞毒性，能够氧化脂质，损伤细胞膜，引起炎症，并促使机体衰老。而SOD含量的提高，能够让让机体清除这些有害物质，让机体延缓衰老。同理，GSH-PX是谷胱甘肽过氧化物酶，它的生理功能主要是催化GSH参与过氧化反应，清除在细胞呼吸代谢过程中产生的过氧化物和羟自由基，从而减轻细胞膜多不饱和脂肪酸的过氧化作用。因此以上实验表明：本发明提取的原花青素提取物不仅能够清除人体肌肤褶皱，同时保持肌肤水分充分、弹性，而且能够让人体皮肤抗氧化能力增强，保持皮肤光滑。

根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。

Claims

1.一种葡萄果中原花青素提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种葡萄果中原花青素提取物的制备方法，其特征在于，将步骤(1)中所述葡萄皮和葡萄果肉捣碎。

3.根据权利要求1所述的一种葡萄果中原花青素提取物的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述甲醇、乙醇和水的体积比为1:1:1，所述混合溶液与步骤(1)准备的葡萄皮和葡萄果肉混合后反应24小时。

4.根据权利要求1所述的一种葡萄果中原花青素提取物的制备方法，其特征在于，步骤(3)中将所述固液分离得到提取液在-0.10MPa下用0℃以下的水冻溶；步骤(4)中在550W微波条件下对所述提取液处理。

5.根据权利要求1所述的一种葡萄果中原花青素提取物的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述对提取液处理采用短时间多次微波处理的方式，每次微波时间为0.3-0.8S，时间间隔为0.3-0.8S。

6.根据权利要求5所述的一种葡萄果中原花青素提取物的制备方法，其特征在于，步骤(4)中每次微波时间为0.5S，时间间隔为0.5S，提取液温度超过40-50℃则反应停止；所述微波处理过的提取液在2000-4000r/min下离心5-20min。

7.一种将权利要求1所述的方法制得的葡萄果中原花青素提取物制成原花青素冻干粉的方法，其特征在于包括以下步骤：

(2)浓缩：浓缩上清液；

(3)过滤：将浓缩的上清液采用孔径小于0.22μM的滤膜过滤；

8.权利要求7所述的方法制得的原花青素冻干粉在抗衰老护肤品中应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述抗衰老护肤品为面膜、爽肤水、面霜、乳液、眼霜、洗面乳。

10.如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述原花青素冻干粉在抗衰老护肤品中的添加量为1-1000μg/ml。