CN109381389A - 一种柿叶发酵提取液及制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提出涉及来源于纯天然材料的发酵提取物和制备方法及应用，具体地，涉及柿叶发酵提取液及其制备方法和用于化妆品领域的应用。所述柿叶发酵提取物包括多糖、黄酮、多酚、蛋白、维生素C组分，所述发酵提取液的制备方法包括柿叶的烘干、粉碎后，以离子水混合均匀灭菌，加入酿酒酵母菌发酵后，离心取得柿叶发酵提取液。本发明的发酵提取物能够通过添加不同的功能性材料实现不同的功能，使其在化妆品领域广泛应用，本发明的发酵提取物制备方法中无需添加有机溶剂、通过酵母菌发酵，由于无外源碳源和氮源，单纯利用柿叶本身成分发酵，因而使得反应体系纯净，节省原料成本，发酵时间短，制备过程简单，且提取液方便回收。

Description

一种柿叶发酵提取液及制备方法与应用
技术领域
本发明涉及来源于纯天然材料的发酵提取物，具体涉及一种柿叶发酵提取液及其制备方法和应用
背景技术
柿子叶(简称柿叶)为我国常见植物柿子树新鲜或干燥时的叶子，主要产地有我国华东、中南及辽宁、河北、山西、陕西、甘肃、台湾等地。柿叶的主要成分包含机酸类、黄酮类、维生素C、多糖、胡萝卜素、多酚类、脂肪酸、香豆素类、植物甾醇等，主要有治疗心脑血管疾病、抗氧化、抗癌、活血止血、抗菌、解热、抗老化、防晒等作用，使其在药品、食品、化妆品领域都有着巨大的市场价值和发展前景。
目前，在现有研究或市场中，将柿叶作为原材料进一步加工制备产品已有报道，例如，中国专利CN105779210A公开了柿叶酒的发酵制备方法，主要通过先将柿叶用80-90℃的热水烫漂，随后制成柿叶原浆，将蔗糖作为柿叶发酵的碳源，在7-12天厌氧发酵柿叶后，以明胶澄清处理后制得柿叶酒，然而这种方法的缺陷在于，热水烫漂容易使柿叶中的天然成份受到高温破坏，不能最大限度的保持柿叶中对人体有益的天然成份；中国专利CN101194921B公开了柿叶黄酮提取物的制备方法及其制备/预防糖脂代谢相关疾病的药物，主要通过将原料加热煎煮，过滤，乙醇沉淀后，以乙酸乙酯萃取，又通过大孔树脂吸附，乙醇洗脱得到黄酮提取物后将其应用。然而，虽然采用这些方法能够利用纯天然植物柿叶，发挥柿叶中成分的作用，得到更具备市场应用的产品，但是在制备方法中常常需要添加蔗糖或其他成分作为发酵的碳源，这些物质的加入，使制备成分复杂，成本增高；另外，在制备过程中，使用有机溶剂进行萃取，影响提取物的性能；而产品的的后处理回收中，明胶澄清处理，这也造成了工艺繁琐。
CN107468568A公开了一种具有美白防晒活性的柿叶多酚及其制备方法和应用，包含如下制备步骤：(1)将柿叶残渣经40～60℃干燥，过60～80目筛后，得到柿叶残渣粉末；(2)将柿叶残渣粉末，加入3倍重量份的蒸馏水，调节PH至5.5，加入蛋白酶后充分混匀，置于60℃恒温水浴保温1h后，加入有机提取剂静置8h，超声处理20min，3000r/min转速离心，得上清液，重复2次，合并上清液，减压回收有机提取剂，得浓缩液；(3)将浓缩液用有机萃取剂进行萃取，将混合后的萃取液静置10h，待其分层后弃去有机萃取剂层，减压浓缩，真空冷冻干燥，得柿叶多酚。本发明能够清除自由基，具有抗氧化作用，能够很好地吸收紫外线，抑制黑色素的生成，从而达到美白防晒的功效。然而，该方法在制备过程中加入了有机提取剂，众所周知，有机溶剂对于人体及皮肤均具有伤害，此类产品长期使用造成不良影响。
CN107440963A公开了一种具有美白抗衰老活性的柿叶黄酮及其制备方法和应用，包含以下制备步骤：(1)将柿叶残渣，经过干燥粉碎得到柿叶残渣粉末；(2)将柿叶残渣粉末，加入8倍重量份的无水乙醇，均匀分散后，在75℃水浴恒温煎煮2次，各1～2小时，过滤得滤液；(3)将滤液采用旋转蒸发仪回收液中乙醇溶液，得浓缩液；(4)将浓缩液置于分液装置中，加入有机萃取剂进行萃取，弃去有机层，减压浓缩，真空冷冻干燥，得柿叶黄酮。本发明具有抑制酪氨酸酶、清除自由基、减少活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)，同时增加过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)，起到美白抗衰老的功效。然而，该方法在制备过程中同样也加入了有机提取剂，众所周知，有机溶剂对于人体及皮肤均具有伤害，此类产品长期使用造成不良影响。
CN102846518A涉及一种利用微波萃取和膜分离联用技术，提取柿叶中的活性成分柿叶果酸的方法。将晾干的柿叶粉碎后，加入乙醇在常压和微波环境下萃取，再以膜分离技术去除叶绿素，鞣质，树脂，还原糖，多糖等非有机酸类物质，浓缩后依次加碱和酸处理，最后重结晶得到柿叶果酸。本发明所用的原料为天然柿子叶，不产生三废，工艺简单且绿色环保。所用萃取时间短，收率高，杂质含量较少，质量稳定，所得产品柿叶果酸已经达到作为化妆品原料所要求，经济效益显著。然而，该方法在制备过程中同样也加入了乙醇作为有机提溶剂，众所周知，有机溶剂对于人体及皮肤均具有伤害，此类产品长期使用造成不良影响。
目前较为常用的柿叶提取方法为热水浸提法、酸提取法、碱提取法、酶提取法，而单纯仅使用微生物发酵法提取柿叶活性物还未见报道。因此，开发一种能够不采用有机溶剂对柿叶进行提取的方法，是亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明正是为了克服现有技术中的上述缺陷，提供一种采用天然酵母菌液对柿叶进行处理的提取液，同时，还提供了相应的提取液制备方法及其应用，尤其是作为化妆品的应用。本发明的柿叶发酵提取物的制备方法工艺简单、操作容易、发酵速度快、无需添加额外的发酵碳源或氮源、回收方便，本发明的柿叶提取过程中中不添加有机溶剂，不影响健康，尤其能够突破性的解决现有技术中柿叶提取物在化妆品领域应用时，有机溶剂对于皮肤和人体健康产生负面影响的技术问题。
本发明提供一种柿叶发酵提取液的制备方法，所述发酵方法不使用有机溶剂，也不添加额外的碳源和氮源；包括如下步骤：
(1)将柿叶烘干至恒重，粉碎成柿叶粉末后备用；
(2)取所述柿叶粉末与去离子水按照重量比为1:5-25混合均匀后形成悬浊液，对所述悬浊液进行灭菌处理，得到灭菌后的悬浊液；
(3)以所述悬浊液为重量百分比基准，向所述悬浊液中加入1％-10％重量比的酿酒酵母菌液，在25℃--45℃温度下，以100-200r/min进行发酵，得到柿叶发酵液；
(4)将步骤(3)得到的所述柿叶发酵液进行离心，取离心后的上层清液即为柿叶发酵提取液。
优选地，所述灭菌处理为，在100-200℃高温下灭菌20-60mi n；更优选地，所述灭菌处理为，在121℃下高温灭菌30mi n。
优选地，所述酿酒酵母菌液的浓度为，在600nm条件下测吸光值(OD600)为0.5-1。更优选地，以所述悬浊液为重量百分比基准，向所述悬浊液中加入5％重量比的酿酒酵母菌液。
进一步地，所述制备方法中，发酵时间为12-60小时。
进一步地，所述制备方法中，所述柿叶粉末与去离子水的重量比为1:5、1：10、1:15、1:20或1:25。
进一步地，所述制备方法中，所述发酵温度为25℃、30℃、35℃、40℃或45℃。
进一步地，所述制备方法中，所述发酵时间为12h、24h、36h、48h或60h。
进一步地，所述制备方法中，所述柿叶粉末与去离子水的重量比为1:25、所述发酵温度为40℃、所述发酵时间为24h时，所述黄酮的提取率为5.57％。
进一步地，所述制备方法中，所述柿叶粉末与去离子水的重量比为1:25、所述发酵温度为40℃、所述发酵时间为36h时，所述黄酮的提取率为7.4％。
本发明前述方法制备得到的提取液，是一种不使用任何有机溶剂、不需要额外添加碳源和氮源的柿叶发酵提取液，该提取物的主要成份包括总糖、柿叶黄酮、多酚、蛋白质、维生素C组分。
进一步地，所述总糖含量为7-13mg/ml、所述蛋白质含量为34-44μg/ml、所述柿叶黄酮含量为4.2-5.3mg/ml、所述多酚含量为0.72-1.2mg/ml、所述维生素C含量为201-230mg/ml。
其中，所述黄酮包括山萘酚、黄芪苷、山萘酚3-O-β-D-葡萄糖苷、山萘酚3-O-α-L-鼠李糖苷、芦丁等物质。柿叶黄酮具有清除自由基的能力，是一种优良的抗氧化剂，其抗氧化能力明显优于芦丁。多酚类物质包括没食子酸、肉桂酸、咖啡酸、香豆酸、绿原酸、原儿茶酸、阿魏酸等。柿叶中的多酚类物质能够很好地吸收波长为200～300nm的紫外线，能有效地减少黑色素的生成，因此多酚具有抗老化和防晒作用。总糖类物质包括鼠李糖，阿拉伯糖，半乳糖，木糖和半乳糖醛酸等。多糖具有免疫调节等功效，因此被广泛地用于医疗和保健行业。蛋白质类物质包括粗蛋白、游离氨基酸。
发酵柿叶具有美白作用，其作用机理与柿叶中的柿叶黄酮、多酚和维生素C有关。柿叶黄酮、多酚、维生素C均为良好的抗氧化剂，其通过抑制黑色素形成过程的氧化步骤阻断黑色素合成，并对酪氨酸酶活性具有一定抑制作用，从而发挥美白祛斑的功效。
本发明的发酵过程使用微生物法，微生物法又可称为发酵法，是以细菌、霉菌等微生物为体系对外源底物进行结构修饰的化学反应，微生物转化不需要添加其它的催化剂，只需先培养出大量的微生物菌种，然后加入底物进行能实现的反应，所以微生物法比化学试剂的反应法更专一、更有效；反应条件温和，微生物发酵一般都是在常温和pH为7左右的条件下进行催化反应，不需要高温、高压等苛刻的条件；设备的运行操作也比较简单、安全，产生的公害较少，一般不会造成环境污染，后处理也相对简单。本发明的发酵方法不需要外加碳源和氮源，也不需要其他催化剂和有机溶剂，单纯依靠柿叶和酿酒酵母菌液通过发酵法得到柿叶发酵液由于不含有其他对人体和皮肤有害的成分，使得其美白功效更好，可作为天然的美白剂在化妆品中进行添加。
本发明还提供了一种前述柿叶发酵提取液的应用，尤其是直接将该柿叶发酵提取液应用于化妆品领域。
本发明的有益效果
与现有的柿叶加工及其制备方法相比，本发明的柿叶发酵提取液及其制备方法优势至少在于：
(1)本发明的柿叶发酵提取液包含总糖、柿叶黄酮、多酚、蛋白质、维生素C组分，能够通过添加不同的功能性材料实现不同的功能，使其在化妆品领域中使用；
(2)本发明的柿叶发酵提取液制备方法，通过纯天然发酵获得柿叶提取物，整个制备过程中都无需使用有机溶剂，使提取物纯净；
(3)本发明柿叶发酵提取液制备方法中不添加额外的碳源氮源，仅用纯植物原料和酵母发酵，且发酵时间仅需12-60h,发酵时间短，使得制备过程在节省了原料的成本基础上，还缩短生产时间，有利于工业化生产；
(4)本发明的柿叶发酵提取液制备方法得到的提取液的分离，仅需通过离心处理即可得到，无需复杂的明胶澄清处理，制备过程简单，方便回收。
附图说明
图1为本发明发酵过程中，料液比对柿叶黄酮提取率的影响曲线；
图2为本发明发酵过程中，发酵温度对柿叶黄酮提取率的影响曲线；
图3为本发明发酵过程中，发酵时间对柿叶黄酮提取率的影响曲线。
具体实施方式
实施例一
(1)将柿叶在60℃的烘箱内烘干至恒重，将干柿叶粉碎后过50目筛得到柿叶粉末后备用；
(2)取所述柿叶粉末与去离子水按照重量比为1:15混合均匀后形成悬浊液，将所述悬浊液在100℃进行高温灭菌处理20min，得到灭菌后的悬浊液；
(3)以所述悬浊液为重量百分比基准，向所述灭菌后的悬浊液中加入5％重量比的酿酒酵母菌液，得到混合反应液，将所述混合反应液在25℃下，以100r/min进行发酵，发酵时间为24h，得到柿叶发酵液原液；其中，所述这酿酒酵母菌液的浓度为，在600nm条件下测吸光值(OD600)为0.5；
(4)将步骤(3)得到的所述柿叶发酵液原液进行离心，取离心后的上层清液即为柿叶发酵提取液-样品1。
实施例二
(1)取自然干燥至恒重的柿叶，将干柿叶粉碎后过50目筛得到柿叶粉末后备用；
(2)取所述柿叶粉末与去离子水按照重量比为1:15混合均匀后形成悬浊液，将所述悬浊液在120℃进行高温灭菌处理30min，得到灭菌后的悬浊液；
(3)以所述悬浊液为重量百分比基准，向所述灭菌后的悬浊液中加入2％重量比的酿酒酵母菌液，得到混合反应液，将所述混合反应液在30℃下，以130r/min进行发酵，发酵时间为48h，得到柿叶发酵液原液；其中，所述这酿酒酵母菌液的浓度为，在600nm条件下测吸光值(OD600)为0.7；
(4)将步骤(3)得到的所述柿叶发酵液原液进行离心，取离心后的上层清液即为柿叶发酵提取液-样品2。
实施例三
(1)将柿叶有60℃的烘箱内烘干至恒重，将干柿叶粉碎后过50目筛得到柿叶粉末后备用；
(2)取所述柿叶粉末与去离子水按照重量比为1:20混合均匀后形成悬浊液，将所述悬浊液在180℃进行高温灭菌处理20min，得到灭菌后的悬浊液；
(3)以所述悬浊液为重量百分比基准，向所述灭菌后的悬浊液中加入10％重量比的酿酒酵母菌液，得到混合反应液，将所述混合反应液在25℃下，以200r/min进行发酵，发酵时间为24h，得到柿叶发酵液原液；其中，所述这酿酒酵母菌液的浓度为，在600nm条件下测吸光值(OD600)为0.5；
(4)将步骤(3)得到的所述柿叶发酵液原液进行离心，取离心后的上层清液即为柿叶发酵提取液-样品3。
实施例四
(1)将柿叶有60℃的烘箱内烘干至恒重，将干柿叶粉碎后过50目筛得到柿叶粉末后备用；
(2)取所述柿叶粉末与去离子水按照重量比为1:20混合均匀后形成悬浊液，将所述悬浊液在121℃进行高温灭菌处理30min，得到灭菌后的悬浊液；
(3)以所述悬浊液为重量百分比基准，向所述灭菌后的悬浊液中加入10％重量比的酿酒酵母菌液，得到混合反应液，将所述混合反应液在45℃下，以180r/min进行发酵，发酵时间为48h，得到柿叶发酵液原液；其中，所述这酿酒酵母菌液的浓度为，在600nm条件下测吸光值(OD600)为1；
(4)将步骤(3)得到的所述柿叶发酵液原液进行离心，取离心后的上层清液即为柿叶发酵提取液-样品4。
通过对发酵液成分的分析，得到不同发酵条件下发酵柿叶提取物中各成分的含量表，见表1。
表1不同发酵条件下酵母发酵柿叶中各成分含量
通过工艺优先试验我们发现，不同发酵条件下，所得柿叶发酵液中总糖类物质的含量始终是最多的，其次是柿叶黄酮，通过大量研究，我们发现柿叶黄酮类物质具有清除皮肤自由基、促进皮肤新陈代谢、减少色素沉积等功效，因此，在工艺条件方面我们优选考虑能够保证柿叶黄酮类物质含量最佳的方案。
通过大量实验，我们在摸索料液比与柿叶黄酮提取率的关系过程中，以发酵时间24h、发酵温度30℃为基准条件，通过检测料液比为1:5、1:10、1:15、1:20和1:25进行对比，得到了在该发酵条件下料液比与柿叶黄酮提取率的曲线，见图1。从图中我们可以看到，柿叶黄酮的提取率随着料液比的减小呈现先增后降的趋势，当料液比为1:20时，柿叶黄酮提取率降到最低，而后又开始显著上升，我们经过分析和研究，认为其原因可能是由于随着料液比的减小，使得发酵底物中菌、酶的浓度相对较大，从而使得柿叶黄酮的提取率升高。(实施例五-九)
实施例五
(1)将柿叶有60℃的烘箱内烘干至恒重，将干柿叶粉碎后过50目筛得到柿叶粉末后备用；
(2)取所述柿叶粉末与去离子水按照重量比为1:5混合均匀后形成悬浊液，将所述悬浊液在121℃进行高温灭菌处理30min，得到灭菌后的悬浊液；
(3)以所述悬浊液为重量百分比基准，向所述灭菌后的悬浊液中加入10％重量比的酿酒酵母菌液，得到混合反应液，将所述混合反应液在30℃下，以200r/min进行发酵，发酵时间为24h，得到柿叶发酵液原液；其中，所述这酿酒酵母菌液的浓度为，在600nm条件下测吸光值(OD600)为0.5；
(4)将步骤(3)得到的所述柿叶发酵液原液进行离心，取离心后的上层清液即为柿叶发酵提取液，黄酮提取率为3.11％。
实施例六
(1)将柿叶有60℃的烘箱内烘干至恒重，将干柿叶粉碎后过50目筛得到柿叶粉末后备用；
(2)取所述柿叶粉末与去离子水按照重量比为1:10混合均匀后形成悬浊液，将所述悬浊液在121℃进行高温灭菌处理30min，得到灭菌后的悬浊液；
(3)以所述悬浊液为重量百分比基准，向所述灭菌后的悬浊液中加入10％重量比的酿酒酵母菌液，得到混合反应液，将所述混合反应液在30℃下，以200r/min进行发酵，发酵时间为24h，得到柿叶发酵液原液；其中，所述这酿酒酵母菌液的浓度为，在600nm条件下测吸光值(OD600)为0.5；
(4)将步骤(3)得到的所述柿叶发酵液原液进行离心，取离心后的上层清液即为柿叶发酵提取液，黄酮提取率为2.91％。
实施例七
(1)将柿叶有60℃的烘箱内烘干至恒重，将干柿叶粉碎后过50目筛得到柿叶粉末后备用；
(2)取所述柿叶粉末与去离子水按照重量比为1:15混合均匀后形成悬浊液，将所述悬浊液在121℃进行高温灭菌处理30min，得到灭菌后的悬浊液；
(3)以所述悬浊液为重量百分比基准，向所述灭菌后的悬浊液中加入10％重量比的酿酒酵母菌液，得到混合反应液，将所述混合反应液在30℃下，以200r/min进行发酵，发酵时间为24h，得到柿叶发酵液原液；其中，所述这酿酒酵母菌液的浓度为，在600nm条件下测吸光值(OD600)为0.5；
(4)将步骤(3)得到的所述柿叶发酵液原液进行离心，取离心后的上层清液即为柿叶发酵提取液，黄酮提取率为4.49％。
实施例八
(1)将柿叶有60℃的烘箱内烘干至恒重，将干柿叶粉碎后过50目筛得到柿叶粉末后备用；
(2)取所述柿叶粉末与去离子水按照重量比为1:20混合均匀后形成悬浊液，将所述悬浊液在121℃进行高温灭菌处理30min，得到灭菌后的悬浊液；
(3)以所述悬浊液为重量百分比基准，向所述灭菌后的悬浊液中加入10％重量比的酿酒酵母菌液，得到混合反应液，将所述混合反应液在30℃下，以200r/min进行发酵，发酵时间为24h，得到柿叶发酵液原液；其中，所述这酿酒酵母菌液的浓度为，在600nm条件下测吸光值(OD600)为0.5；
(4)将步骤(3)得到的所述柿叶发酵液原液进行离心，取离心后的上层清液即为柿叶发酵提取液，黄酮提取率为2.62％。
实施例九
(1)将柿叶有60℃的烘箱内烘干至恒重，将干柿叶粉碎后过50目筛得到柿叶粉末后备用；
(2)取所述柿叶粉末与去离子水按照重量比为1:25混合均匀后形成悬浊液，将所述悬浊液在121℃进行高温灭菌处理30min，得到灭菌后的悬浊液；
(3)以所述悬浊液为重量百分比基准，向所述灭菌后的悬浊液中加入10％重量比的酿酒酵母菌液，得到混合反应液，将所述混合反应液在30℃下，以200r/min进行发酵，发酵时间为24h，得到柿叶发酵液原液；其中，所述这酿酒酵母菌液的浓度为，在600nm条件下测吸光值(OD600)为0.5；
(4)将步骤(3)得到的所述柿叶发酵液原液进行离心，取离心后的上层清液即为柿叶发酵提取液，黄酮提取率为5.72％。
通过对发酵液成分的分析，得到不同料液比条件下发酵柿叶提取物中柿叶黄酮提取率的含量表，见表2。
表2不同料液比下柿叶黄酮提取率
通过大量实验，我们在摸索发酵温度对柿叶黄酮提取率的关系过程中，以1:25的料液比、发酵24h为基准条件，通过改变发酵温度进行对比，得到了柿叶黄酮提取率与发酵温度的关系曲线，见图2。从图中我们可以看到，柿叶黄酮提取率在发酵温度为30℃后，随着发酵温度的升高而增加，到发酵温度为40℃时柿叶黄酮的提取率达到最高，为5.57％，而后又随着发酵温度的升高而下降。我们通过分析和研究认为，温度过高会影响酿酒酵母菌液的发酵活性，因此，发酵温度不易过高。(实施例十-十四)
实施例十
(1)将柿叶有60℃的烘箱内烘干至恒重，将干柿叶粉碎后过50目筛得到柿叶粉末后备用；
(2)取所述柿叶粉末与去离子水按照重量比为1:25混合均匀后形成悬浊液，将所述悬浊液在121℃进行高温灭菌处理30min，得到灭菌后的悬浊液；
(3)以所述悬浊液为重量百分比基准，向所述灭菌后的悬浊液中加入10％重量比的酿酒酵母菌液，得到混合反应液，将所述混合反应液在25℃下，以200r/min进行发酵，发酵时间为36h，得到柿叶发酵液原液；其中，所述这酿酒酵母菌液的浓度为，在600nm条件下测吸光值(OD600)为0.5；
(4)将步骤(3)得到的所述柿叶发酵液原液进行离心，取离心后的上层清液即为柿叶发酵提取液，黄酮提取率为5.28％。
实施例十一
(1)将柿叶有60℃的烘箱内烘干至恒重，将干柿叶粉碎后过50目筛得到柿叶粉末后备用；
(2)取所述柿叶粉末与去离子水按照重量比为1:25混合均匀后形成悬浊液，将所述悬浊液在121℃进行高温灭菌处理30min，得到灭菌后的悬浊液；
(3)以所述悬浊液为重量百分比基准，向所述灭菌后的悬浊液中加入10％重量比的酿酒酵母菌液，得到混合反应液，将所述混合反应液在30℃下，以200r/min进行发酵，发酵时间为36h，得到柿叶发酵液原液；其中，所述这酿酒酵母菌液的浓度为，在600nm条件下测吸光值(OD600)为0.5；
(4)将步骤(3)得到的所述柿叶发酵液原液进行离心，取离心后的上层清液即为柿叶发酵提取液，黄酮提取率为5.13％。
实施例十二
(1)将柿叶有60℃的烘箱内烘干至恒重，将干柿叶粉碎后过50目筛得到柿叶粉末后备用；
(2)取所述柿叶粉末与去离子水按照重量比为1:25混合均匀后形成悬浊液，将所述悬浊液在121℃进行高温灭菌处理30min，得到灭菌后的悬浊液；
(3)以所述悬浊液为重量百分比基准，向所述灭菌后的悬浊液中加入10％重量比的酿酒酵母菌液，得到混合反应液，将所述混合反应液在35℃下，以200r/min进行发酵，发酵时间为36h，得到柿叶发酵液原液；其中，所述这酿酒酵母菌液的浓度为，在600nm条件下测吸光值(OD600)为0.5；
(4)将步骤(3)得到的所述柿叶发酵液原液进行离心，取离心后的上层清液即为柿叶发酵提取液，黄酮提取率为5.28％。
实施例十三
(1)将柿叶有60℃的烘箱内烘干至恒重，将干柿叶粉碎后过50目筛得到柿叶粉末后备用；
(2)取所述柿叶粉末与去离子水按照重量比为1:25混合均匀后形成悬浊液，将所述悬浊液在121℃进行高温灭菌处理30min，得到灭菌后的悬浊液；
(3)以所述悬浊液为重量百分比基准，向所述灭菌后的悬浊液中加入10％重量比的酿酒酵母菌液，得到混合反应液，将所述混合反应液在40℃下，以200r/min进行发酵，发酵时间为36h，得到柿叶发酵液原液；其中，所述这酿酒酵母菌液的浓度为，在600nm条件下测吸光值(OD600)为0.5；
(4)将步骤(3)得到的所述柿叶发酵液原液进行离心，取离心后的上层清液即为柿叶发酵提取液，黄酮提取率为5.57％。
实施例十四
(1)将柿叶有60℃的烘箱内烘干至恒重，将干柿叶粉碎后过50目筛得到柿叶粉末后备用；
(2)取所述柿叶粉末与去离子水按照重量比为1:25混合均匀后形成悬浊液，将所述悬浊液在121℃进行高温灭菌处理30min，得到灭菌后的悬浊液；
(3)以所述悬浊液为重量百分比基准，向所述灭菌后的悬浊液中加入10％重量比的酿酒酵母菌液，得到混合反应液，将所述混合反应液在45℃下，以200r/min进行发酵，发酵时间为36h，得到柿叶发酵液原液；其中，所述这酿酒酵母菌液的浓度为，在600nm条件下测吸光值(OD600)为0.5；
(4)将步骤(3)得到的所述柿叶发酵液原液进行离心，取离心后的上层清液即为柿叶发酵提取液，黄酮提取率为5.33％。
通过对发酵液成分的分析，得到不同发酵温度条件下发酵柿叶提取物中柿叶黄酮提取率的含量表，见表3。
表3不同温度下柿叶黄酮提取率
通过大量实验，我们在摸索发酵时间对柿叶黄酮提取率的关系过程中，以发酵温度为40℃、料液比为1:25为基准条件，通过改变发酵时间进行对比，得到了柿叶黄酮提取率与发酵时间的关系曲线，具体见图3。从图中我们可以看到当发酵时间为36h时，柿叶黄酮的提取率最大，为7.4％，之后，随着发酵时间的增加，柿叶黄酮的提取率开始下降，我们通过分析和研究认为，造成这一现象的原因可能是随着发酵时间的增加，在发酵时间达到一定程度后，发酵液中的柿叶黄酮开始分解，产生了其他次级代谢产物，因此，发酵时间不易过长。(实施例十五-十九)
通过对发酵液成分的分析，得到不同发酵时间条件下发酵柿叶提取物中柿叶黄酮提取率的含量表，见表4。
表4不同发酵时间下柿叶黄酮提取率
实施例十五
(1)将柿叶有60℃的烘箱内烘干至恒重，将干柿叶粉碎后过50目筛得到柿叶粉末后备用；
(2)取所述柿叶粉末与去离子水按照重量比为1:25混合均匀后形成悬浊液，将所述悬浊液在121℃进行高温灭菌处理30min，得到灭菌后的悬浊液；
(3)以所述悬浊液为重量百分比基准，向所述灭菌后的悬浊液中加入10％重量比的酿酒酵母菌液，得到混合反应液，将所述混合反应液在40℃下，以200r/min进行发酵，发酵时间为12h，得到柿叶发酵液原液；其中，所述这酿酒酵母菌液的浓度为，在600nm条件下测吸光值(OD600)为0.5；
(4)将步骤(3)得到的所述柿叶发酵液原液进行离心，取离心后的上层清液即为柿叶发酵提取液，黄酮提取率为6.60％。
实施例十六
(1)将柿叶有60℃的烘箱内烘干至恒重，将干柿叶粉碎后过50目筛得到柿叶粉末后备用；
(2)取所述柿叶粉末与去离子水按照重量比为1:25混合均匀后形成悬浊液，将所述悬浊液在121℃进行高温灭菌处理30min，得到灭菌后的悬浊液；
(3)以所述悬浊液为重量百分比基准，向所述灭菌后的悬浊液中加入10％重量比的酿酒酵母菌液，得到混合反应液，将所述混合反应液在40℃下，以200r/min进行发酵，发酵时间为24h，得到柿叶发酵液原液；其中，所述这酿酒酵母菌液的浓度为，在600nm条件下测吸光值(OD600)为0.5；
(4)将步骤(3)得到的所述柿叶发酵液原液进行离心，取离心后的上层清液即为柿叶发酵提取液，黄酮提取率为7.31％。
实施例十七
(1)将柿叶有60℃的烘箱内烘干至恒重，将干柿叶粉碎后过50目筛得到柿叶粉末后备用；
(2)取所述柿叶粉末与去离子水按照重量比为1:25混合均匀后形成悬浊液，将所述悬浊液在121℃进行高温灭菌处理30min，得到灭菌后的悬浊液；
(3)以所述悬浊液为重量百分比基准，向所述灭菌后的悬浊液中加入10％重量比的酿酒酵母菌液，得到混合反应液，将所述混合反应液在40℃下，以200r/min进行发酵，发酵时间为36h，得到柿叶发酵液原液；其中，所述这酿酒酵母菌液的浓度为，在600nm条件下测吸光值(OD600)为0.5；
(4)将步骤(3)得到的所述柿叶发酵液原液进行离心，取离心后的上层清液即为柿叶发酵提取液，黄酮提取率为7.44％。
实施例十八
(1)将柿叶有60℃的烘箱内烘干至恒重，将干柿叶粉碎后过50目筛得到柿叶粉末后备用；
(2)取所述柿叶粉末与去离子水按照重量比为1:25混合均匀后形成悬浊液，将所述悬浊液在121℃进行高温灭菌处理30min，得到灭菌后的悬浊液；
(3)以所述悬浊液为重量百分比基准，向所述灭菌后的悬浊液中加入10％重量比的酿酒酵母菌液，得到混合反应液，将所述混合反应液在40℃下，以200r/min进行发酵，发酵时间为48h，得到柿叶发酵液原液；其中，所述这酿酒酵母菌液的浓度为，在600nm条件下测吸光值(OD600)为0.5；
(4)将步骤(3)得到的所述柿叶发酵液原液进行离心，取离心后的上层清液即为柿叶发酵提取液，黄酮提取率为6.33％。
实施例十九
(1)将柿叶有60℃的烘箱内烘干至恒重，将干柿叶粉碎后过50目筛得到柿叶粉末后备用；
(2)取所述柿叶粉末与去离子水按照重量比为1:25混合均匀后形成悬浊液，将所述悬浊液在121℃进行高温灭菌处理30min，得到灭菌后的悬浊液；
(3)以所述悬浊液为重量百分比基准，向所述灭菌后的悬浊液中加入10％重量比的酿酒酵母菌液，得到混合反应液，将所述混合反应液在40℃下，以200r/min进行发酵，发酵时间为60h，得到柿叶发酵液原液；其中，所述这酿酒酵母菌液的浓度为，在600nm条件下测吸光值(OD600)为0.5；
(4)将步骤(3)得到的所述柿叶发酵液原液进行离心，取离心后的上层清液即为柿叶发酵提取液，黄酮提取率为6.40％。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到其各种变化或替换，这些都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种柿叶发酵方法，其特征在于，所述发酵方法不使用有机溶剂，也不添加额外的碳源和氮源；所述发酵方法包括如下步骤：
(1)将柿叶烘干至恒重，粉碎成柿叶粉末后备用；
(2)取所述柿叶粉末与去离子水按照重量比为1:5-25混合均匀后形成悬浊液，对所述悬浊液进行灭菌处理，得到灭菌后的悬浊液；
(3)以所述悬浊液为重量百分比基准，向所述灭菌后的悬浊液中加入1％--10％重量比的酿酒酵母菌液，得到混合反应液，将所述混合反应液在25℃--45℃下，以100-200r/min进行发酵，得到柿叶发酵液原液；
(4)将步骤(3)得到的所述柿叶发酵液原液进行离心，取离心后的上层清液即为柿叶发酵提取液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中发酵时间为12-60小时。.
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中柿叶粉末与去离子水的重量比为1:5、1：10、1:15、1:20或1:25。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中的发酵温度为25℃、30℃、35℃、40℃或45℃。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中的发酵时间为12h、24h、36h、48h或60h。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述方法中，所述柿叶粉末与去离子水的重量比为1:25、所述发酵温度为40℃、所述发酵时间为24h时，所述黄酮的提取率为5.57％。
7.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述方法中，所述柿叶粉末与去离子水的重量比为1:25、所述发酵温度为40℃、所述发酵时间为36h时，所述黄酮的提取率为7.4％。
8.一种权利要求1-8任一项所述的方法制备得到的柿叶发酵提取液，其特征在于，所述柿叶发酵提取液，采用权利要求1-8任一项所述的方法制备得到。
9.一种权利要求1-8任一项所述的方法制备得到的柿叶发酵提取液的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，将所述柿叶发酵提取液用于制造化妆品。
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