CN108743476A - 一种具有去红血丝功效的复合植物发酵组合物及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有去红血丝功效的复合植物发酵组合物的制备方法，包括以下步骤：(I)大花紫薇和凤尾草的脱脂处理；(II)步骤(I)获得的脱脂产物的酶解；(III)步骤(II)获得的酶解产物的发酵。本发明复合发酵组合物具有优异的去红血丝和抗氧化功效。

Description

一种具有去红血丝功效的复合植物发酵组合物及制备方法
技术领域
本发明涉及化妆品领域，具体涉及一种具有去红血丝功效的复合植物发酵组合物及制备方法。
背景技术
大花紫薇L.sPeciosa(Linn.)Pers.亦作L.flos一ergina`Retz.又名大叶紫薇、大果紫薇,系一种分布于马来西亚、印度、斯里兰卡、中国、越南、菲律宾及澳大利亚等国的热带落叶高大乔木。大花紫薇是东南亚各国的民间药,俗称baanba,印度用其根作收敛剂,马来西亚用叶捣敷治疟疾、脚部骨折等。其叶制成的茶饮料用于治疗和预防糖尿病,被誉为“天然植物胰岛素”,口服有效且无副作用, 能减轻体重却不影响食欲,有望成为21世纪有助于健康的功能食品。其敛疮，解毒，凉血止血；根用于痈疮肿毒；树皮、叶作泻药；种子具有麻醉作用。大花紫薇叶有降血糖、抗氧化和抗真菌的活性，而其主要的活性为降血糖活性。
从中国台湾、菲律宾、印尼、日本冲绳等地采集的大花紫薇叶中分得缩醛、鞣酸类、三萜类、生物碱类、黄酮类、多酚类、皂苷类、甾醇、有机酸、烯烃、氨基酸等化合物。
凤尾草为凤尾蕨科(Pteridaceae)凤尾蕨属(Pteris L.)植物凤尾草(Pterismultifida Poir.)的全草或根，又名井栏边草，广泛分布于我国各省区，作为一种中草药使用已经有很久的历史，始载于唐朝陈藏品的《本草拾遗》。以全草入药，性凉，味微苦，归肝、肾、大肠经，具有清热利湿、凉血止血、消肿解毒等功效，用于治疗痢疾、肠炎、黄疸型肝炎、吐血、便血、尿血等病症。凤尾草含倍半萜、二萜类、植物甾醇类、黄酮类、挥发油、多糖、多酚、生物碱、苯丙素类等成分。
发酵是微生物在一定条件下进行生理活动，借助于酶的作用对有机物进行分解、转化取得C、N、维生素等各种营养以生长菌体，同时产生各种次级代谢产物，如：多糖、氨基酸等的过程。与其他加工方式相比，发酵能够产生新的活性物质，降低毒性，改变功效，同时可能由于微生物的水解作用，使发酵产物更易被吸收。
面部红血丝是发生于人面部的毛细血管扩张症，也就是面颊上的毛细血管呈细丝状、星状、网眼状扩张，使面部皮肤呈红色。
面部毛细血管扩张,俗称为面部红血丝,是由于面部毛细血管壁的弹性降低, 脆性增强,血管持续性、不均匀的扩张甚至破裂,严重的还会导致血管增生,从而出现面部皮肤泛红,肉眼可见的扩张的毛细血管,常伴有红色或紫红色斑状、点状、线状或星状等现象。
本发明旨在提供一种具有去红血丝功效的复合植物发酵组合物及其制备方法。
发明内容
本发明的首要目的是提供一种复合植物发酵组合物的制备方法。
本发明的再一目的是提供由所述制备方法获得的复合植物发酵组合物，该植物发酵组合物具有优异的去红血丝功效。其能够增加角质层厚度,恢复血管壁弹性以及增强胶原蛋白弹性。
本发明的再一目的在于提供所述复合植物发酵组合物在制备化妆品中的应用，以及含有所述植物发酵组合物的化妆品组合物。
在本发明中，“复合植物发酵组合物”是指大花紫薇和凤尾草的组合形式。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种复合植物发酵组合物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(I)大花紫薇和凤尾草的脱脂处理；
(II)步骤(I)获得的脱脂产物的酶解；
(III)步骤(II)获得的酶解产物的发酵。
根据本发明，步骤(I)中所述的大花紫薇和凤尾草，以干燥后质量计，大花紫薇和凤尾草的质量比为1:1-4，优选为1:1-3。
根据本发明，所述干燥是指采用本领域已知或常用的干燥方法，使大花紫薇和凤尾草的含水量分别均≤1.5％，优选≤1.0％，例如≤0.9％，≤0.8％，≤0.6％等。
根据本发明，步骤(I)大花紫薇和凤尾草的脱脂处理，可以采用本领域中常用有机溶剂作为脱脂剂。所述有机溶剂或脱脂剂包括但不限于，卤代烃类、芳香烃类、醇类、醚类、酮类、酯类等，例如：二氯甲烷、甲苯、甲醇、乙醇、丙醇、丙二醇、乙醚、石油醚、丙酮、乙酸乙酯、N,N-二甲基甲酰胺等。为安全目的，优选有机溶剂或脱脂剂是无毒或无害的，可用于化妆品领域的，例如：二氯甲烷、甲醇、乙醇、石油醚、丙酮、乙酸乙酯、N,N-二甲基甲酰胺中的一种或几种的混合物。在本发明的一个实施方式中，所用脱脂剂为无水乙醇。
本领域技术人员可根据所用脱脂剂的种类，调整脱脂剂的用量。在本发明的一个实施方式中，脱脂剂的质量为大花紫薇和凤尾草质量的5-8倍。
本领域技术人员可根据所用脱脂剂的种类、用量等实际情况，调整脱脂的温度、时间等条件。在本发明的一个实施方式中，脱脂温度为20-30℃，时间为 24-48h，搅拌速度为50-150rpm/min。
根据本发明，在脱脂处理前，可采用本领域中常用的粉碎方法，将大花紫薇和凤尾草粉碎，以提高脱脂效率。所述粉碎方法包括但不限于，研磨、剪切、超声等。在本发明的一个实施方式中，大花紫薇和凤尾草被粉碎为60-80目。
根据本发明，在脱脂处理后，可采用本领域中常用的分离方法，去除脱脂剂。所述分离方法包括但不限于，离心、过滤、蒸发、挥干等。
根据本发明，去除脱脂剂后，所得脱脂产物可直接用于后续步骤，或者采用本领域常用的干燥方法，经干燥后用于后续步骤。所述干燥方法，包括但不限于，冷冻干燥、真空干燥、喷雾干燥等。在本发明的一个实施方式中，采用冷冻干燥，在-1.5--0.5MPa下干燥10-15h。
发明人意外发现，脱脂处理对后续酶解和发酵的效率有较大影响，尤其对获得的发酵组合物中分子量小于等于10000道尔顿的总黄酮和多酚的得率有较大影响。不受特殊理论的限制，推测其可能的原因是脱脂处理后，大花紫薇和凤尾草植物中的脂肪、脂肪酸以及脂蛋白等物质减少，避免了这些物质对后续酶解反应和发酵菌生长的抑制；还有可能，脱脂处理有助于细胞膜的瓦解。
在本发明的一个具体实施方式中，将干燥后的大花紫薇和凤尾草粉碎，采用脱脂剂进行脱脂；脱脂结束后，分离脱脂剂，滤渣冷冻干燥，得到大花紫薇和凤尾草的脱脂干粉，用于后续步骤。
根据本发明，步骤(II)脱脂产物的酶解，采用果胶酶、淀粉酶、纤维素酶和蛋白酶。
根据本发明，采用果胶酶和淀粉酶混合而成的复合酶A进行第一步酶解，之后采用纤维素酶和蛋白酶混合而成的复合酶B进行第二步酶解。
根据本发明，复合酶A中，果胶酶和淀粉酶的质量比为1:(1-2)；复合酶B 中，纤维素酶和蛋白酶的质量比为1:(1-3)。以步骤(I)脱脂产物的干重计，复合酶A的质量为脱脂产物的0.02-0.5％，复合酶B的质量为脱脂产物的 0.01-0.25％。
优选，以步骤(I)脱脂产物的干重计，复合酶A的质量为脱脂产物的 0.1-0.5％。
优选，以步骤(I)脱脂产物的干重计，复合酶B的质量为脱脂产物的 0.1-0.25％。
根据本发明，所述果胶酶、淀粉酶、纤维素酶和蛋白酶可以选用本领域中已商品化的各种果胶酶、淀粉酶、纤维素酶和蛋白酶。在本发明的一个实施方式中，所用果胶酶是诺维信公司的Pectinex BE XXL、Pectinex AFP XXL、 Pectinex5XL、Pectinex SMASH XXL、Pectinex Ultra SP-L中的至少一种；所用淀粉酶是诺维信公司的Amylase AG XXL、Amylase AG 300L中的至少一种；所用纤维素酶是诺维信公司的Celluclast 1.5L；所用蛋白酶是诺维信公司的 Protamex中性蛋白酶。
根据本发明，以步骤(I)脱脂产物的干重计，酶解反应混合物中，脱脂产物与水的质量比为：1:5-20，优选为1:10-15。
本领域技术人员可以根据所用酶的具体种类、用量等实际情况，调整每一步酶解反应的pH值、温度、时间等条件。可以根据所用酶的酶活性最适宜的 pH和温度，来调整酶解体系的pH和酶解温度。
根据本发明，采用复合酶A进行的第一步酶解，酶解温度为35-60℃，优选为40-55℃。
根据本发明，采用复合酶B进行的第二步酶解，酶解温度为55-75℃，优选为60-70℃。可采用本领域常用的pH调节剂，调整酶解反应混合物的pH值，所述pH调节剂包括但不限于常用的各种有机酸、无机酸、有机碱、无机碱，例如：一乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、异丙醇胺、氨甲基丙醇、氢氧化钠、氢氧化钾、氨水中的一种或数种。
在本发明的一个实施方式中，所述酶解反应混合物的pH值为6.5-8.0，优选为7.0-7.5。可以通过监测酶解物中总多酚的含量来控制酶解时间。
步骤(II)的酶解处理有利于大花紫薇和凤尾草细胞壁的瓦解，释放出原生质，并产生糖、氨基酸或寡肽，利于后续发酵。
在本发明的一个实施方式中，将步骤(I)获得的脱脂干粉与水，按照料液质量比1:10-15加入酶解釜中，超声，以pH调节剂调节pH至7.0-7.5；加入复合酶A，在40-55℃下反应4-8h；再加入复合酶B，在60-70℃下反应6-12h。酶解反应全程保持搅拌状态，酶解反应结束后，降温至室温，离心获得酶解液，酶解液灭酶灭菌后，获得酶解产物，也称为待发酵液。
在本发明的一个实施方式中，所述超声的条件优选为80-120Hz超声 15-45min。
在本发明的一个实施方式中，所述搅拌的速度为50-150rpm/min。
根据本发明，步骤(III)酶解产物的发酵，采用芽孢杆菌和乳酸杆菌。所述的芽孢杆菌，优选为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、地衣芽孢杆菌 (Bacilluslicheniformis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus Bacillus)、纳豆芽孢杆菌 (Bacillus natto)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megateriun)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)中的至少一种。
所述的乳酸杆菌，优选为嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、瑞士乳杆菌(lactobacillus helveticus)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)中的至少一种。
所述的芽孢杆菌的接种量为(2×106-5×108)CFU/ml。
所述的乳酸杆菌的接种量为(5×106-10×108)CFU/ml。
本领域技术人员可以根据需要，向酶解产物中添加碳源、氮源等发酵菌所需的培养基物质。
在本发明的一个实施方式中，向酶解产物中添加葡萄糖作为碳源，葡萄糖的添加量为酶解产物质量的0.005-0.015％。
在本发明的一个实施方式中，向酶解产物中添加尿素作为氮源，尿素的添加量为酶解产物质量的0.1-0.2％。
本领域技术人员可以根据所用发酵菌的种类和接种量，调整发酵的温度、时间等具体条件。发酵温度没有特别限制，只要能进行发酵即可，通常为 15-50℃，优选为20-45℃，更优选为30-40℃。发酵通常通过通气搅拌进行。
在本发明的一个实施方式中，发酵温度为31-35℃，搅拌速度为 30-50rpm/min。
步骤(III)的发酵极大提高发酵组合物中分子量小于等于10000道尔顿的总黄酮的含量，也有利于进一步提高分子量小于等于10000道尔顿的总多酚和甾醇的含量。
在本发明的一个实施方式中，将步骤(II)获得的待发酵液加入发酵罐中，加入葡萄糖和尿素，灭菌，冷却至室温，在无菌条件下接种芽孢杆菌和乳酸杆菌复合菌，升温搅拌，发酵48-72h。
根据本发明，所述制备方法任选进一步包括步骤(IV)，对步骤(III)获得的发酵物的后处理。
本领域技术人员可采用本领域常用的固液分离方法，从步骤(III)发酵物中得到发酵原液。所述固液分离方法包括但不限于，离心、过滤等。
根据本发明，在得到发酵原液后，可采用本领域常用的精制方法，对所述发酵原液做进一步精制，例如采用离子交换树脂、活性炭柱或膜过滤等方法。精制后的产物可以直接作为原料用于后续的化妆品生产。
在本发明的一个实施方式中，采用膜过滤的方法，使用微滤膜分离获得分子量小于等于10000道尔顿，优选小于等于8000道尔顿，更优选小于等于5000 道尔顿的物质。
在本发明的一个实施方式中，所述的微滤膜分子量为8000道尔顿，截留分子量超过8000道尔顿的物质，获得所述的植物发酵组合物。
在本发明的另一个实施方式中，所述的微滤膜分子量为5000道尔顿，截留分子量超过5000道尔顿的物质，获得所述的植物发酵组合物。
在本发明的一个实施方式中，将步骤(III)获得的发酵物固液分离，得到发酵原液，以分子量为5000-8000道尔顿的微滤膜过滤，紫外灭菌。
由上述制备方法获得的植物发酵组合物。
根据本发明，该植物发酵组合物具有去红血丝、抗氧化的功效，尤其是具有良好的去红血丝功效。
根据本发明，优选所述植物发酵组合物中，分子量小于等于10000道尔顿的总黄酮含量为5mg/ml-15mg/ml。优选分子量小于等于8000道尔顿的总黄酮含量为5mg/ml-15mg/ml。更优选分子量小于等于5000道尔顿的总黄酮含量为 5mg/ml-15mg/ml。
根据本发明，优选所述植物发酵组合物中，分子量小于等于10000道尔顿的总多酚含量为5mg/ml-20mg/ml。优选分子量小于等于8000道尔顿的总多酚含量为5mg/ml-20mg/ml。更优选分子量小于等于5000道尔顿的总多酚含量为 5mg/ml-20mg/ml。
根据本发明，优选所述植物发酵组合物中，分子量小于等于10000道尔顿的甾醇含量为10mg/ml-35mg/ml。优选分子量小于等于8000道尔顿的甾醇含量为10mg/ml-35mg/ml。更优选分子量小于等于5000道尔顿的甾醇含量为 10mg/ml-35mg/ml。
根据本发明，所述植物发酵组合物中，还可以根据需要进一步含有防腐剂。所述防腐剂可以是本领域常用的防腐剂，例如包括但不限于：辛甘醇、己二醇、戊二醇、乙基己基甘油、馨鲜酮、Euro-NApre中的一种或数种。在本发明的一个实施方式中，所用防腐剂为馨鲜酮或Euro-NApre。
根据本发明，优选所述植物发酵组合物的pH值为弱酸性，适于化妆品领域的应用。
在本发明的一个实施方式中，所述植物发酵组合物被配置成10％的水溶液时，pH值为4.5-6.5。
根据本发明，由所述制备方法获得的植物发酵组合物，复合了大花紫薇和凤尾草两种植物，经本发明的制备方法加工后，活性成分的透皮吸收性好，因低分子量的总黄酮含量高，例如分子量小于等于10000道尔顿，优选小于等于 8000道尔顿，更优选小于等于5000道尔顿的总黄酮，从而具有良好的去红血丝、抗氧化的活性，适用于化妆品，尤其是护肤类化妆品的制造，特别是适合于精华类产品的制造，可提供相应化妆品去红血丝、抗氧化的功效。
进一步，所述植物发酵组合物中，低分子量的总多酚和甾醇的含量也很高，例如分子量小于等于10000道尔顿，优选小于等于8000道尔顿，更优选小于等于5000道尔顿的总多酚和甾醇，增强了去红血丝和抗氧化的活性。
上述植物发酵组合物在制备化妆品中的应用。
所述植物发酵组合物含有丰富的黄酮、多酚、甾醇类物质、无机电解质等物质，具有优异的去红血丝、抗氧化的功效，可用于制备化妆品。
在化妆品配制中，所述植物发酵组合物的用量没有特别的限定，可以根据化妆品的种类进行适当调整。
所述植物发酵组合物的用量，在化妆品为100％质量时，可以为0.1-10质量％，尤其是1-5质量％。
可使用所述植物发酵组合物的化妆品的种类没有特别的限定。作为化妆品，可以包括护肤类化妆品、彩妆类化妆品和洗涤类化妆品，列举例如，剥撕式面膜、片状面膜、敷面剥落式面膜、化妆水、乳液、粉、口红、腮红、粉底、洗面奶、洗面膏等。这些化妆品中，根据其种类，根据需要，还可以添加其他成分，例如，其他植物提取物、维生素、矿物质、防腐剂、乳化剂、增稠剂、色素、香料等。优选的化妆品为护肤类化妆品，例如，各种类型的面膜，包括但不限于剥撕式面膜、片状面膜、敷面剥落式面膜；化妆水；乳液等。
在本发明的一个实施方式，所述植物发酵组合物用于制备精华类产品。
所述植物发酵组合物在精华类产品中的添加量为0.1-10质量％，优选为1-5 质量％，以精华的质量为100％计。
一种化妆品组合物，其含有所述植物发酵组合物。
在化妆品组合物为100％质量时，所述植物发酵组合物的含量可以为0.1-10 质量％，尤其是1-5质量％。
根据本发明，所述化妆品组合物，可以包括护肤类化妆品、彩妆类化妆品和洗涤类化妆品，列举例如，剥撕式面膜、片状面膜、敷面剥落式面膜、化妆水、乳液、粉、口红、腮红、粉底、洗面奶、洗面膏等。优选的化妆品组合物为护肤类化妆品，例如，各种类型的面膜，包括但不限于剥撕式面膜、片状面膜、敷面剥落式面膜；化妆水；乳液等。这些化妆品组合物中，根据其种类，根据需要，还可以添加其他成分，例如，其他植物提取物、维生素、矿物质、防腐剂、乳化剂、增稠剂、色素、香料等。
在本发明的一个实施方式中，所述化妆品组合物是精华。以精华的质量为 100％计，所述植物发酵组合物在其中的添加量为0.1-10质量％，优选为1-5 质量％。
一种去红血丝精华，含有如下重量百分比的组分：复合植物发酵组合物 0.1-10％、角鲨烷1-8％、PEG-60杏仁甘油酯类0.1-1％、生育酚乙酸酯0.1-0.5％、聚甘油-2油酸酯0.1-0.5％、PEG-7甘油椰油酸酯0.1-0.3％、氢化卵磷脂0.1-0.5％、卡波姆0.1-0.3％、黄原胶0.1-0.2％、精氨酸0.1-0.3％、EDTA 二钠0.01-0.05％、透明质酸钠0.01-0.05％、水解透明质酸钠0.01-0.1％、珍珠粉0.1-1％、1,3-丙二醇1-5％、甲基葡糖醇聚醚-10 0.1-3％、双-PEG-18甲基醚二甲基硅烷0.1-0.5％、珍珠提取物0.1-1％、甘油聚醚-26 0.1-2％、泛醇0.1-1％、水余量。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)大花紫薇和凤尾草含有丰富的黄酮、多酚及甾醇类物质，同时大花紫薇还含有丰富的缩醛、鞣酸类、三萜类、生物碱类、皂苷类、有机酸、烯烃、氨基酸等化合物，凤尾草还含有丰富的倍半萜、二萜类、植挥发油、多糖、生物碱、苯丙素类等，采用大花紫薇和凤尾草两种原料植物，结合两种植物化学成分的长处，使获得的功效物质更均衡，保证了最终发酵组合物中低分子量的总黄酮、总多酚和甾醇的高含量，以提供很好的去红血丝、抗氧化的功效；
(2)以脱脂、酶法和发酵多步骤联合处理，可极大提高最终发酵组合物中低分子量的总黄酮、总多酚和甾醇的含量，相较单一的方法或者溶剂提取法，在功效物质的组成和含量上更具有优势；
(3)制备工艺不采用有毒有害溶剂，酶解和发酵后获得的植物发酵组合物中不含有机溶剂，无需后续有机溶剂的脱除处理，可直接以水溶液的形式应用于产品配方中，不仅利于提高产品的安全性，也利于降低生产工艺的污染和能耗；
(4)本发明获得的植物发酵组合物，经过测试安全，在去红血丝、抗氧化等方面均有明显的效果，适合在化妆品中应用，尤其适合于精华类产品中应用。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施方式作进一步地详细描述，但本发明的实施方式不限于此，对于未特别注明的工艺参数或条件，可参照常规技术进行。
以下实施例中所用试剂，如无特殊说明，均为可商购获得的常规常用试剂。
以下实施例中所用的实验方法，如无特殊说明，均为本领域常规的操作方法。
干燥植物的水含量测定方法参照《GB 5009.3-2010食品中水分的测定第一法直接干燥法》固形物的测定方法采用热重法，以鼓风干燥箱在(105±1)℃干燥 3h后测定。
总黄酮含量的测定采用NaNO2-AlCl3法测定(Gonzalez R,Ballester I,Lopez-Posada R,et al.Effects of Flavonoids and other Polyphenols on Inflammation[J].Critical Reviews In Food Science And Nutrition,2011,51(4):331-362.)。
总多酚含量的测定采用Folin-Ciocalteu法测定(娄在祥,王洪新,吕文平,等. 微波辅助提取牛蒡叶多酚及其抗氧化、抗菌活性研究[J].食品与发酵工业,2010,36(1):161-165.)。
甾醇含量的测定采用HPLC法测定(刘京晶，黄文华.HPLC法测定不同品种及段木栽培灵芝子实体中麦角甾醇含量[J].中药材,Journal of Chinese Medicinal Materials,2011年02期.)
实施例1
(I)大花紫薇和凤尾草的脱脂处理
将5质量份大花紫薇和5质量份凤尾草(水分含量皆为0.7％)，粉碎至60 目，在20℃，采用50质量份无水乙醇进行脱脂24h，搅拌速度为50rpm/min。脱脂结束后，分离脱脂剂，滤渣在-1.5MPa下冷冻干燥10h，得到约8.5质量份脱脂干粉，备用；
(II)酶解
将步骤(I)获得的8质量份脱脂干粉与80质量份水，加入酶解釜中，80Hz 超声15min，以三乙醇胺调节pH至7.0；加入0.0016质量份复合酶A(0.0008 质量份果胶酶Pectinex BE XXL和0.0008质量份淀粉酶Amylase AG XXL)，在40℃下反应4h；再加入0.0008质量份复合酶B(0.0004质量份纤维素酶 Celluclast1.5L与0.0004质量份Protamex中性蛋白酶)，在60℃下反应6h。酶解反应全程保持50rpm/min搅拌状态，酶解反应结束后，降温至室温，离心获得酶解液，酶解液以90℃灭酶灭菌30min，得到64质量份酶解产物；
(III)发酵
将步骤(II)获得的64质量份酶解产物加入发酵罐中，加入0.0032质量份葡萄糖和0.064质量份尿素，121℃下进行蒸汽灭菌30min，冷却至室温，在无菌条件下接种纳豆芽孢杆菌，接种量为(2×106)CFU/ml，和嗜酸乳杆菌，接种量为 (5×106)CFU/ml。升温至31℃，以30rpm/min搅拌，发酵48h；
(IV)后处理
将步骤(III)获得的发酵产物离心，得到60质量份发酵原液，以5000道尔顿微滤膜装置过滤，以90μw/cm2紫外灯辐照15min灭菌，加入0.36质量份辛甘醇，获得60.36质量份植物发酵组合物1#。
经检测，植物发酵组合物1#的固形物含量2.5％，总黄酮浓度为5mg/ml，总多酚浓度为5mg/ml，甾醇浓度为10mg/ml，10％水溶液的pH为4.5。
实施例2
(I)大花紫薇和凤尾草的脱脂处理
将2.5质量份大花紫薇和7.5质量份凤尾草(水分含量皆为0.6％)，粉碎至 80目，在30℃，采用80质量份无水乙醇进行脱脂48h，搅拌速度为150rpm/min。脱脂结束后，分离脱脂剂，滤渣在-0.5MPa下冷冻干燥15h，得到约9质量份脱脂干粉，备用；
(II)酶解
将步骤(I)获得的9质量份脱脂干粉与135质量份水，加入酶解釜中，120Hz 超声45min，以三乙醇胺调节pH至7.5；加入0.045质量份复合酶A(0.015质量份果胶酶PectinexBE XXL和0.03质量份淀粉酶Amylase AG XXL)，在55℃下反应8h；再加入0.0225质量份复合酶B(0.005625质量份纤维素酶Celluclast 1.5L与0.016875质量份Protamex中性蛋白酶)，在70℃下反应12h。酶解反应全程保持150rpm/min搅拌状态，酶解反应结束后，降温至室温，离心获得酶解液，酶解液以95℃灭酶灭菌15min，得到121.5质量份酶解产物；
(III)发酵
将步骤(II)获得的121.5质量份酶解产物加入发酵罐中，加入0.018225质量份葡萄糖和0.243质量份尿素，121℃下进行蒸汽灭菌30min，冷却至室温，在无菌条件下接种纳豆芽孢杆菌，接种量为(5×108)CFU/ml，和嗜酸乳杆菌，接种量为(10×108)CFU/ml。升温至35℃，以50rpm/min搅拌，发酵72h；
(IV)后处理
将步骤(III)获得的发酵产物离心，得到115质量份发酵原液，以5000道尔顿微滤膜装置过滤，以180μw/cm2紫外灯辐照5min灭菌，加入1.15质量份馨鲜酮，获得116.15质量份植物发酵组合物2#。
经检测，植物发酵组合物2#的固形物含量5.0％，总黄酮浓度为15mg/ml，总多酚浓度为20mg/ml，甾醇浓度为35mg/ml，10％水溶液的pH为6.5。
实施例3
(I)大花紫薇和凤尾草的脱脂处理
将4质量份大花紫薇和6质量份凤尾草(水分含量皆为0.5％)，粉碎至70 目，在25℃，采用60质量份无水乙醇进行脱脂30h，搅拌速度为100rpm/min。脱脂结束后，分离脱脂剂，滤渣在-1.0MPa下冷冻干燥12h，得到约8.8质量份脱脂干粉，备用；
(II)酶解
将步骤(I)获得的8.8质量份脱脂干粉与105.6质量份水，加入酶解釜中， 100Hz超声20min，以氨甲基丙醇调节pH至7.2；加入0.0088质量份复合酶 A(0.00352质量份果胶酶Pectinex BE XXL和0.00528质量份淀粉酶Amylase AG XXL)，在45℃下反应6h；再加入0.0088质量份复合酶B(0.00352质量份纤维素酶Celluclast 1.5L与0.00528质量份Protamex中性蛋白酶)，在65℃下反应8h。酶解反应全程保持100rpm/min搅拌状态，酶解反应结束后，降温至室温，离心获得酶解液，酶解液以92℃灭酶灭菌20min，得到89.76质量份酶解产物；
(III)发酵
将步骤(II)获得的89.76质量份酶解产物加入发酵罐中，加入0.008976质量份葡萄糖和0.13464质量份尿素，121℃下进行蒸汽灭菌30min，冷却至室温，在无菌条件下接种纳豆芽孢杆菌，接种量为(3×107)CFU/ml，和嗜酸乳杆菌，接种量为(5×107)CFU/ml。升温至32℃，以40rpm/min搅拌，发酵56h；
(IV)后处理
将步骤(III)获得的发酵产物离心，得到80质量份发酵原液，以5000道尔顿微滤膜装置过滤，以120μw/cm2紫外灯辐照10min灭菌，加入0.64质量份 Euro-NApre，获得80.64质量份植物发酵组合物3#。
经检测，植物发酵组合物3#的固形物含量3.0％，总黄酮浓度为8mg/ml，总多酚浓度为15mg/ml，甾醇浓度为20mg/ml，10％水溶液的pH为5.0。
实施例4
(I)大花紫薇和凤尾草的脱脂处理
将3质量份大花紫薇和7质量份凤尾草(水分含量皆为0.65％)，粉碎至65 目，在25℃，采用70质量份无水乙醇进行脱脂32h，搅拌速度为120rpm/min。脱脂结束后，分离脱脂剂，滤渣在-0.8MPa下冷冻干燥12h，得到约9质量份脱脂干粉，备用；
(II)酶解
将步骤(I)获得的9质量份脱脂干粉与90质量份水，加入酶解釜中，90Hz 超声25min，以氢氧化钠调节pH至7.3；加入0.018质量份复合酶A(0.009质量份果胶酶PectinexBE XXL和0.009质量份淀粉酶Amylase AG XXL)，在 45℃下反应7h；再加入0.0135质量份复合酶B(0.0045质量份纤维素酶 Celluclast 1.5L与0.009质量份Protamex中性蛋白酶)，在68℃下反应8h。酶解反应全程保持120rpm/min搅拌状态，酶解反应结束后，降温至室温，离心获得酶解液，酶解液以92℃灭酶灭菌25min，得到76.5质量份酶解产物；
(III)发酵
将步骤(II)获得的76.5质量份酶解产物加入发酵罐中，加入0.00612质量份葡萄糖和0.0918质量份尿素，121℃下进行蒸汽灭菌30min，冷却至室温，在无菌条件下接种纳豆芽孢杆菌，接种量为(9×106)CFU/ml，和嗜酸乳杆菌，接种量为(9×106)CFU/ml。升温至32℃，以45rpm/min搅拌，发酵60h；
(IV)后处理
将步骤(III)获得的发酵产物离心，得到70质量份发酵原液，以5000道尔顿微滤膜装置过滤，以150μw/cm2紫外灯辐照8min灭菌，加入0.56质量份辛甘醇，获得70.56质量份植物发酵组合物4#。
经检测，植物发酵组合物4#的固形物含量3.2％，总黄酮浓度为12mg/ml，总多酚浓度为12mg/ml，甾醇浓度为20mg/ml，10％水溶液的pH为5.1。
对比实施例5
无脱脂步骤，其余步骤和条件同实施例1。
得到植物发酵组合物5#，经检测，植物发酵组合物5#的固形物含量1.5％，总黄酮浓度为3mg/ml，总多酚浓度为2mg/ml，甾醇浓度为6mg/ml，10％水溶液的pH为4.8。
对比实施例6
无酶解步骤，其余步骤和条件同实施例1。
得到植物发酵组合物6#，经检测，植物发酵组合物6#的固形物含量3.0％，总黄酮浓度为1mg/ml，总多酚浓度为3mg/ml，甾醇浓度为5mg/ml，10％水溶液的pH为5.8。
对比实施例7
无发酵步骤，其余步骤和条件同实施例1。
得到组合物7#，经检测，组合物7#的固形物含量1.8％，总黄酮浓度为 0.8mg/ml，总多酚浓度为4mg/ml，甾醇浓度为6mg/ml，10％水溶液的pH为 5.0。
对比实施例8
无脱脂、酶解、发酵步骤，分别以水、水-乙醇(体积比1:1)、水-丙二醇(体积比1:1)为溶剂，采用5质量份大花紫薇和5质量份凤尾草(水分含量皆为 0.7％)，以料液比为1:10，按照常规工艺进行提取，同样以5000道尔顿微滤膜装置过滤，得到组合物8#、9#、10#。
经检测，8#的总黄酮浓度为0.2mg/ml，总多酚浓度为2mg/ml，甾醇浓度为2mg/ml。
9#的总黄酮浓度为0.8mg/ml，总多酚浓度为0.5mg/ml，甾醇浓度为 4mg/ml。
10#的总黄酮浓度为0.6mg/ml，总多酚浓度为5mg/ml，甾醇浓度为6mg/ml。
以上各实施例中所制备的组合物及其编号沿用于以下各实施例和实验中。
应用实施例11-15
在精华中的应用如表1所示：
表1 一种去红血丝精华，含有如下重量百分比的组分：
1、稳定性检测
耐热试验：将样品放入(40±1)℃的电热恒温培养箱中24h，恢复室温后观察是否有变稀、变色、分层及硬度变化等现象，以判断样品的耐热性能。
耐寒试验：将样品放入(-5～-10)℃±1℃的电冰箱中24h，恢复室温后观察是否有变稀、变色、分层及硬度变化等现象，以判断样品的耐寒性能。
离心试验：将样品置于离心机中，以(2000～4000)r/min的转速试验30min，观察样品的分离、分层状况。
稳定性检测结果记录如表2所示：
表2
耐热试验 耐寒试验 离心试验
植物发酵组合物1# 无异常 无异常 无异常
植物发酵组合物2# 无异常 无异常 无异常
植物发酵组合物3# 无异常 无异常 无异常
植物发酵组合物4# 无异常 无异常 无异常
组合物5# 无异常 无异常 无异常
组合物6# 无异常 无异常 无异常
组合物7# 无异常 无异常 无异常
组合物8# 变色 析出 析出
组合物9# 变色 析出 析出
组合物10# 变色 析出 析出
应用实施例11 无异常 无异常 无异常
应用实施例12 无异常 无异常 无异常
应用实施例13 无异常 无异常 无异常
应用实施例14 无异常 无异常 无异常
应用实施例15 无异常 无异常 无异常
从稳定性检测结果可以看出，对比实施例8获得的组合物8～10#是不稳定，由于其未经过脱脂等步骤，所提取出物质分子量大，在高低温都容易出现不稳定的情况。
2、人体皮肤斑贴试验
选用30名志愿受试者，年龄25～40岁，男性女性各半，受试者皮肤健康，无皮肤病过敏史，符合受试者志愿入选标准，进行斑贴试验。选用合格的斑贴器，以封闭式斑贴试验方法，将受试物1#、2#、3#、4#各约0.05g均匀涂抹于斑贴器内，外用专用胶带贴覆于受试者前臂，24小时后去除受试物，分别在去除后0.5、6、12、24、48小时观察皮肤反应，按照《化妆品卫生规范》中皮肤反应分级标准记录其结果。
人体皮肤斑贴试验结果显示：30名受试者通过本发明所述的1#～4#的斑贴试验，在0.5、6、12、24、48小时观察皮肤反应，其中0例出现皮肤不良反应，说明本发明所述的植物发酵组合物是安全的。
3、改善微循环
评估参数:血流量，仪器：DOPPLER-POWER多普勒能量超声。
结果如表3所示：
时间(天) 实施例11 实施例12 实施例13 实施例14 实施例15 阳性对照(烟酸甲酯)
T0 14.5 14.2 13 14.1 14.3 23.54
T2 7.8 7.5 7.3 7.4 7.6 15.43
T3 5.1 4.9 4.7 5.2 4.8 11.29
T4 2.1 2.1 1.6 1.9 1.8 10.65
由表3可见，本发明实施例11-15的去红血丝精华有很好的改善微循环效果，能够提升血管壁弹性，改善红血丝症状。
4、人群试用测试
本发明实施例11-15和对比例11-16(其中，对比例11除了采用实施例5 的5#外，其他同实施例13；对比例12除了采用实施例6的6#外，其他同实施例13；对比例13除了采用实施例7的7#外，其他同实施例13；对比例14除了采用实施例8的8#外，其他同实施例13；对比例15除了采用实施例9的9# 外，其他同实施例13；对比例16除了采用实施例10的10#外，其他同实施例 13；)的去红血精华经550名面部红血丝患者试用，年龄15-26岁。550名受试者随机均分为11组，分别试用实施例11-15和对比例11-16的去红血丝精华。使用方法为：受试者在清洁完皮肤后直接使用受试产品，每日使用两次，坚持使用1个月，检验该去红血丝精华治疗红血丝的效果。疗效的评价标准为：
痊愈：面部红血丝完全消失；
好转：面部红血丝减少；
无效：面部红血丝症状无变化或加重。
统计结果如下表4：
表4
痊愈 好转 无效 有效率
实施例11 8 35 7 86％
实施例12 7 34 9 82％
实施例13 14 34 2 96％
实施例14 12 33 5 90％
实施例15 10 36 4 92％
对比例11 1 8 41 18％
对比例12 1 9 40 20％
对比例13 0 7 43 14％
对比例14 0 4 46 8％
对比例15 0 2 48 4％
对比例16 0 3 47 6％
由上述表4数据可知，本发明的去红血精华缓解治疗面部红血丝有效率可达82％以上，疗效显著，且所有受试者均无不良反应和症状加重的情况产生。
由实施例11-15与对比例11-16对比可知，本发明复合植物发酵组合物的制备方法制备得到的复合植物发酵组合物应用到去红血丝精华中，具有优异的去红血丝效果。
实施例2-4的应用实施例与实施例1的应用实施例效果较接近，在此不再累述。
5、清除DPPH自由基能力测试
实验方法
利用H2O2和Fe2+混合发生Fenton反应，生成具有很高反应活性的羟基自由基，羟基自由基能被水杨酸有效地捕捉，并生成有色物质，若加入具有清除自由基的物质，便会和水杨酸竞争而减少有色物生成。
10ml体系，加入0.5ml 9.1mmol/L水杨酸-乙醇溶液，0.5ml 9mmol/L Fe2+溶液，0.5ml样品，3.5ml水，最后加入5ml 88mmol/L H2O2溶液，摇匀，于510nm 处测定吸光度A1。A2为取0.5ml水替代Fe2+溶液所得吸光度，A3为取0.5ml 水替代样品所得的吸光度。
清除率P＝[1-(A1-A2)/A3]*100％
1.2测试结果
以VB3(烟酰胺，来自DSM公司)作对照品，将VB3和各组合物配制成不同浓度的水溶液，测试不同浓度下，实施例获得植物发酵组合物、对比实施例和 VB3的清除羟基自由基能力，结果表5。
表5不同浓度下植物发酵组合物和VB3的清除羟基自由基的能力
清除羟基自由基的实验表明，实施例1、2获得的植物发酵组合物在清除羟基自由基方面比对比实施例都好，也强于VB3。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，故凡未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种复合植物发酵组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(I)、大花紫薇和凤尾草的脱脂处理；(II)、步骤(I)获得的脱脂产物的酶解；(III)、步骤(II)获得的酶解产物的发酵。
2.如权利要求1所述的制备方法，所述步骤(I)中的大花紫薇和凤尾草，以干燥后质量计，大花紫薇和凤尾草的质量比为：1:1～4，优选为1:1～3；优选所述大花紫薇和凤尾草的含水量分别均≤1.5％。
3.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(II)的酶解，采用果胶酶、淀粉酶、纤维素酶和蛋白酶；优选采用果胶酶和淀粉酶混合而成的复合酶A进行第一步酶解，之后采用纤维素酶和蛋白酶混合而成的复合酶B进行第二步酶解；优选复合酶A中，果胶酶和淀粉酶的质量比为1:(1～2)，复合酶B中，纤维素酶和蛋白酶的质量比为1:(1～3)；优选，以步骤(I)脱脂产物的干重计，复合酶A的用量为脱脂产物的0.02～0.5％，复合酶B的用量为脱脂产物的0.01～0.25％；优选，以步骤(I)脱脂产物的干重计，优选复合酶A的质量为脱脂产物的0.1～0.5％；优选，以步骤(I)脱脂产物的干重计，优选复合酶B的质量为脱脂产物的0.1～0.25％；优选，以步骤(I)脱脂产物的干重计，酶解反应混合物中，脱脂产物与水的质量比为：1:5～20，优选为1:10～15。
4.如权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于：步骤(III)的发酵，采用芽孢杆菌和乳酸杆菌；优选所述的芽孢杆菌为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus Bacillus)、纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megateriun)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)中的至少一种；优选所述乳酸杆菌为嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)、瑞士乳杆菌(lactobacillus helveticus)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)中的至少一种；优选所述芽孢杆菌的接种量为(2×106～5×108)CFU/ml；优选所述乳酸杆菌的接种量为(5×106～10×108)CFU/ml。
5.由权利要求1-4任一项所述的制备方法制备的复合植物发酵组合物。
6.如权利要求5所述的植物发酵组合物，其中，分子量小于等于10000道尔顿的总多酚含量为5mg/ml～15mg/ml；优选分子量小于等于8000道尔顿的总多酚含量为5mg/ml～15mg/ml；更优选分子量小于等于5000道尔顿的总多酚含量为5mg/ml～15mg/ml；优选所述植物发酵组合物中，分子量小于等于10000道尔顿的多糖含量为5mg/ml～20mg/ml；优选分子量小于等于8000道尔顿的多糖含量为5mg/ml～20mg/ml；更优选分子量小于等于5000道尔顿的多糖含量为5mg/ml～20mg/ml；优选所述植物发酵组合物中，分子量小于等于10000道尔顿的总黄酮含量为10mg/ml～35mg/ml；优选分子量小于等于8000道尔顿的总黄酮含量为10mg/ml～35mg/ml；更优选分子量小于等于5000道尔顿的总黄酮含量为10mg/ml～35mg/ml。
7.权利要求5-6任一项所述的复合植物发酵组合物在制备化妆品中的应用，所述的化妆品为精华，优选所述植物发酵组合物的添加量为0.1-10质量％，优选为1～5质量％，以面膜液或面膜膏的质量为100％计。
8.一种化妆品组合物，含有权利要求5-6任一项所述的复合黑植物发酵组合物；优选在化妆品组合物为100％质量时，所述植物发酵组合物的含量为0.1-10质量％，尤其是1-5质量％。
9.如权利要求8所述的化妆品组合物，所述化妆品组合物为精华；优选以精华的质量为100％计，所述植物发酵组合物在其中的添加的量为0.1-10质量％，优选为1-5质量％。
10.一种去红血丝精华，其特征在于，含有如下重量百分比的组分：权利要求5-6任一项所述的复合植物发酵组合物0.1-10%、角鲨烷1-8%、PEG-60 杏仁甘油酯类0.1-1%、生育酚乙酸酯0.1-0.5%、聚甘油-2 油酸酯0.1-0.5%、PEG-7 甘油椰油酸酯0.1-0.3%、氢化卵磷脂0.1-0.5%、卡波姆0.1-0.3%、黄原胶0.1-0.2%、精氨酸0.1-0.3%、EDTA 二钠0.01-0.05%、透明质酸钠0.01-0.05%、水解透明质酸钠0.01-0.1%、珍珠粉0.1-1%、1,3-丙二醇1-5%、甲基葡糖醇聚醚-10 0.1-3%、双-PEG-18 甲基醚二甲基硅烷0.1-0.5%、珍珠提取物0.1-1%、甘油聚醚-26 0.1-2%、泛醇0.1-1%、水余量。
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