CN107184464A

CN107184464A - 一种具有美白功效的复合黑植物发酵组合物及其制备方法与在面膜类产品中的应用

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Publication number: CN107184464A
Application number: CN201710380865.9A
Authority: CN
Inventors: 张目; 黄琴
Original assignee: SHANGHAI YUEMU COSMETICS Co Ltd
Current assignee: SHANGHAI YUEMU COSMETICS Co Ltd
Priority date: 2017-05-25
Filing date: 2017-05-25
Publication date: 2017-09-22
Anticipated expiration: 2037-05-25
Also published as: CN107184464B

Abstract

本发明提供一种由黑加仑和黑莓为原料经酶解和发酵获得的复合黑植物发酵组合物，其富含多酚、多糖和黄酮类物质等活性成分，具有很强的抗氧化、防衰老和美白的功效，适合在化妆品中应用，尤其适合于面膜类产品中应用。

Description

一种具有美白功效的复合黑植物发酵组合物及其制备方法与在面膜类产品中的应用

技术领域

本发明属于生物技术及化妆品技术领域，具体涉及一种复合黑植物发酵组合物，即由黑加仑和黑莓两种植物为原料的植物发酵组合物，及其制备方法，与其在化妆品，尤其是面膜类产品中的应用。

背景技术

黑穗醋栗，又名黑加仑、黑豆果。为虎耳草科、茶镳子属的一种落叶小灌木，在栽培学中属小浆果类。构成现有黑穗醋栗品种的种质资源主要有四个种，即黑穗醋栗(R.nigrum)、吉菩萨(R.dikuscha)、乌苏里茶镳(R.ussuriense)。和加洲茶镳(R.bracteosum)。黑穗醋栗分布在北欧/北美、俄罗斯等一些高纬度地区和国家，在北欧栽培己有400～500年的历史。20世纪初俄国侨民从西伯利亚沿海将黑穗醋栗带入中国东北地区栽培。目前我国的黑加仑主要种植区分布在黑龙江、吉林、辽宁、新疆等地。在欧洲，黑加仑一直是果汁生产的重要原料之一。此外它也用于生产果酱、果子冻、利口酒、乳制品和果酒的风味剂或着色剂。目前国内也开始开发黑加仑市场。

国内对黑加仑的营养成分和生理作用做了大量的研究。结果表明，黑加仑含有丰富的营养物质，如葡萄糖、果糖、蛋白质、维生素、有机酸和果胶、矿物质等，尤其是维生素的含量比其它水果高出许多倍。此外，黑加仑果实中还含有多种花青素苷，黄酮类及酯类、醇类物质。其中，总花青素含量为350mg/100g鲜果重，是草莓的8.8倍。正是这些物质的存在，赋予黑加仑丰富的营养物质和鲜艳光亮的蓝宝石红色。

黑莓系蔷薇科悬钩子属实心莓亚属，又称黑莓亚属，该亚属种类多达几百种。实心莓亚属以北美最为集中，其次为欧洲。黑莓是欧美地区广泛栽培的四大小果类果树的重要种类之一，我国是亚洲地区种植黑莓的主要国家。黑莓果肉中含有人体必需的17种氨基酸和维生素，果实中还含有丰富的抗衰老物质SOD，维生素C含量为苹果5倍，葡萄6倍，食之消暑生津，止咳祛痰，醒酒提神。常食用可延年益寿，是风靡全球的第三代水果的代表品种，被称为生命之果。

目前对黑加仑和黑莓的利用主要是集中在食品行业，在化妆品行业的应用较少，主要有以下几个原因：首先黑加仑或黑莓主要做为保健食品，通常整个果实应用，以提取工艺获得黑加仑或黑莓中的主要功效成分的产业化应用几乎没有；其次，由于黑加仑或黑莓中含有的主要花青素的分子量通常较高，简单的水提物或醇/水提物不容易获得，即便通过水提或醇提获得了，也是高分子量的花青素，难以透皮吸收；最后，黑加仑或黑莓提取物在化妆品行业的应用缺少功效性及安全性等数据支撑。

发酵是微生物在一定条件下进行生理活动，借助于酶的作用对有机物进行分解、转化取得C、N、维生素等各种营养以生长菌体，同时产生各种次级代谢产物，如：多糖、氨基酸等的过程。与其他加工方式相比，发酵能够产生新的活性物质，降低毒性，改变功效，同时可能由于微生物的水解作用，使发酵产物更易被吸收。

发明内容

本发明的首要目的是提供一种复合黑植物发酵组合物的制备方法。

本发明的再一目的是提供由所述制备方法获得的复合黑植物发酵组合物，该植物发酵组合物具有优异的抗氧化、防衰老和美白功效。

本发明的再一目的在于提供所述复合黑植物发酵组合物在制备化妆品中的应用，以及含有所述植物发酵组合物的化妆品组合物。

在本发明中，“复合黑”是指黑加仑和黑莓的组合形式。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种复合黑植物发酵组合物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(I)黑加仑和黑莓的脱脂处理；

(II)步骤(I)获得的脱脂产物的酶解；

(III)步骤(II)获得的酶解产物的发酵。

根据本发明，步骤(I)中所述的黑加仑和黑酶，以干燥后质量计，黑加仑和黑酶的质量比为1:1～4，优选为1:1～3。

根据本发明，所述干燥是指采用本领域已知或常用的干燥方法，使黑加仑和黑莓的含水量分别均≤1.5％，优选≤1.0％，例如≤0.9％，≤0.8％，≤0.6％等。

根据本发明，步骤(I)黑加仑和黑莓的脱脂处理，可以采用本领域中常用有机溶剂作为脱脂剂。所述有机溶剂或脱脂剂包括但不限于，卤代烃类、芳香烃类、醇类、醚类、酮类、酯类等，例如：二氯甲烷、甲苯、甲醇、乙醇、丙醇、丙二醇、乙醚、石油醚、丙酮、乙酸乙酯、N,N-二甲基甲酰胺等。为安全目的，优选有机溶剂或脱脂剂是无毒或无害的，可用于化妆品领域的，例如：二氯甲烷、甲醇、乙醇、石油醚、丙酮、乙酸乙酯、N,N-二甲基甲酰胺中的一种或几种的混合物。在本发明的一个实施方式中，所用脱脂剂为无水乙醇。

本领域技术人员可根据所用脱脂剂的种类，调整脱脂剂的用量。在本发明的一个实施方式中，脱脂剂的质量为黑加仑和黑莓质量的5～8倍。

本领域技术人员可根据所用脱脂剂的种类、用量等实际情况，调整脱脂的温度、时间等条件。在本发明的一个实施方式中，脱脂温度为20～30℃，时间为24～48h，搅拌速度为50～150rpm/min。

根据本发明，在脱脂处理前，可采用本领域中常用的粉碎方法，将黑加仑和黑莓粉碎，以提高脱脂效率。所述粉碎方法包括但不限于，研磨、剪切、超声等。在本发明的一个实施方式中，黑加仑和黑莓被粉碎为60～80目。

根据本发明，在脱脂处理后，可采用本领域中常用的分离方法，去除脱脂剂。所述分离方法包括但不限于，离心、过滤、蒸发、挥干等。

根据本发明，去除脱脂剂后，所得脱脂产物可直接用于后续步骤，或者采用本领域常用的干燥方法，经干燥后用于后续步骤。所述干燥方法，包括但不限于，冷冻干燥、真空干燥、喷雾干燥等。在本发明的一个实施方式中，采用冷冻干燥，在-1.5～-0.5MPa下干燥10～15h。

发明人意外发现，脱脂处理对后续酶解和发酵的效率有较大影响，尤其对获得的发酵组合物中分子量小于等于10000道尔顿的总多酚和多糖的得率有较大影响。不受特殊理论的限制，推测其可能的原因是脱脂处理后，黑加仑和黑莓植物中的脂肪、脂肪酸以及脂蛋白等物质减少，避免了这些物质对后续酶解反应和发酵菌生长的抑制；还有可能，脱脂处理有助于细胞膜的瓦解。

在本发明的一个具体实施方式中，将干燥后的黑加仑和黑莓粉碎，采用脱脂剂进行脱脂；脱脂结束后，分离脱脂剂，滤渣冷冻干燥，得到黑加仑和黑莓的脱脂干粉，用于后续步骤。

根据本发明，步骤(II)脱脂产物的酶解，采用果胶酶、淀粉酶、纤维素酶和蛋白酶。

根据本发明，采用果胶酶和淀粉酶混合而成的复合酶A进行第一步酶解，之后采用纤维素酶和蛋白酶混合而成的复合酶B进行第二步酶解。

根据本发明，复合酶A中，果胶酶和淀粉酶的质量比为1:(1～2)；复合酶B中，纤维素酶和蛋白酶的质量比为1:(1～3)。

以步骤(I)脱脂产物的干重计，复合酶A的质量为脱脂产物的0.02～0.5％，复合酶B的质量为脱脂产物的0.01～0.25％。

优选，以步骤(I)脱脂产物的干重计，复合酶A的质量为脱脂产物的0.1～0.5％。

优选，以步骤(I)脱脂产物的干重计，复合酶B的质量为脱脂产物的0.1～0.25％。

根据本发明，所述果胶酶、淀粉酶、纤维素酶和蛋白酶可以选用本领域中已商品化的各种果胶酶、淀粉酶、纤维素酶和蛋白酶。在本发明的一个实施方式中，所用果胶酶是诺维信公司的Pectinex BE XXL、Pectinex AFP XXL、Pectinex5XL、Pectinex SMASH XXL、Pectinex Ultra SP-L中的至少一种；所用淀粉酶是诺维信公司的Amylase AG XXL、Amylase AG 300L中的至少一种；所用纤维素酶是诺维信公司的Celluclast 1.5L；所用蛋白酶是诺维信公司的Protamex中性蛋白酶。

根据本发明，以步骤(I)脱脂产物的干重计，酶解反应混合物中，脱脂产物与水的质量比为：1:5～20，优选为1:10～15。

本领域技术人员可以根据所用酶的具体种类、用量等实际情况，调整每一步酶解反应的pH值、温度、时间等条件。

可以根据所用酶的酶活性最适宜的pH和温度，来调整酶解体系的pH和酶解温度。

根据本发明，采用复合酶A进行的第一步酶解，酶解温度为35～60℃，优选为40～55℃。

根据本发明，采用复合酶B进行的第二步酶解，酶解温度为55～75℃，优选为60～70℃。

可采用本领域常用的pH调节剂，调整酶解反应混合物的pH值，所述pH调节剂包括但不限于常用的各种有机酸、无机酸、有机碱、无机碱，例如：一乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、异丙醇胺、氨甲基丙醇、氢氧化钠、氢氧化钾、氨水中的一种或数种。在本发明的一个实施方式中，所述酶解反应混合物的pH值为6.5～8.0，优选为7.0～7.5。

可以通过监测酶解物中总多糖的含量来控制酶解时间。

步骤(II)的酶解处理有利于黑加仑和黑莓细胞壁的瓦解，释放出原生质，并产生糖、氨基酸或寡肽，利于后续发酵。

在本发明的一个实施方式中，将步骤(I)获得的脱脂干粉与水，按照料液质量比1:10～15加入酶解釜中，超声，以pH调节剂调节pH至7.0～7.5；加入复合酶A，在40～55℃下反应4～8h；再加入复合酶B，在60～70℃下反应6～12h。酶解反应全程保持搅拌状态，酶解反应结束后，降温至室温，离心获得酶解液，酶解液灭酶灭菌后，获得酶解产物，也称为待发酵液。

在本发明的一个实施方式中，所述超声的条件优选为80～120Hz超声15～45min。

在本发明的一个实施方式中，所述搅拌的速度为50～150rpm/min。

根据本发明，步骤(III)酶解产物的发酵，采用芽孢杆菌和乳酸杆菌。

所述的芽孢杆菌，优选为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus Bacillus)、纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megateriun)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)中的至少一种。

所述的乳酸杆菌，优选为嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、瑞士乳杆菌(lactobacillus helveticus)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)中的至少一种。

所述的芽孢杆菌的接种量为(2×10⁶～5×10⁸)CFU/ml。

所述的乳酸杆菌的接种量为(5×10⁶～10×10⁸)CFU/ml。

本领域技术人员可以根据需要，向酶解产物中添加碳源、氮源等发酵菌所需的培养基物质。在本发明的一个实施方式中，向酶解产物中添加葡萄糖作为碳源，葡萄糖的添加量为酶解产物质量的0.005～0.015％。在本发明的一个实施方式中，向酶解产物中添加尿素作为氮源，尿素的添加量为酶解产物质量的0.1～0.2％。

本领域技术人员可以根据所用发酵菌的种类和接种量，调整发酵的温度、时间等具体条件。

发酵温度没有特别限制，只要能进行发酵即可，通常为15～50℃，优选为20～45℃，更优选为30～40℃。发酵通常通过通气搅拌进行。在本发明的一个实施方式中，发酵温度为31～35℃，搅拌速度为30～50rpm/min。

步骤(III)的发酵有利于大分子量花青素等物质的水解，生成水解原花青素等降解产物，极大提高发酵组合物中分子量小于等于10000道尔顿的总多酚的含量，也有利于进一步提高分子量小于等于10000道尔顿的多糖和总黄酮的含量。

在本发明的一个实施方式中，将步骤(II)获得的待发酵液加入发酵罐中，加入葡萄糖和尿素，灭菌，冷却至室温，在无菌条件下接种芽孢杆菌和乳酸杆菌复合菌，升温搅拌，发酵48～72h。

根据本发明，所述制备方法任选进一步包括步骤(IV)，对步骤(III)获得的发酵物的后处理。

本领域技术人员可采用本领域常用的固液分离方法，从步骤(III)发酵物中得到发酵原液。所述固液分离方法包括但不限于，离心、过滤等。

根据本发明，在得到发酵原液后，可采用本领域常用的精制方法，对所述发酵原液做进一步精制，例如采用离子交换树脂、活性炭柱或膜过滤等方法。精制后的产物可以直接作为原料用于后续的化妆品生产。

在本发明的一个实施方式中，采用膜过滤的方法，使用微滤膜分离获得分子量小于等于10000道尔顿，优选小于等于8000道尔顿，更优选小于等于5000道尔顿的物质。在本发明的一个实施方式中，所述的微滤膜分子量为8000道尔顿，截留分子量超过8000道尔顿的物质，获得所述的植物发酵组合物。在本发明的另一个实施方式中，所述的微滤膜分子量为5000道尔顿，截留分子量超过5000道尔顿的物质，获得所述的植物发酵组合物。

在本发明的一个实施方式中，将步骤(III)获得的发酵物固液分离，得到发酵原液，以分子量为5000～8000道尔顿的微滤膜过滤，紫外灭菌。

由上述制备方法获得的植物发酵组合物。

根据本发明，该植物发酵组合物具有美白、抗氧化、防衰老的功效，尤其是具有良好的美白功效。

根据本发明，优选所述植物发酵组合物中，分子量小于等于10000道尔顿的总多酚含量为5mg/ml～15mg/ml。优选分子量小于等于8000道尔顿的总多酚含量为5mg/ml～15mg/ml。更优选分子量小于等于5000道尔顿的总多酚含量为5mg/ml～15mg/ml。

根据本发明，优选所述植物发酵组合物中，分子量小于等于10000道尔顿的多糖含量为5mg/ml～20mg/ml。优选分子量小于等于8000道尔顿的多糖含量为5mg/ml～20mg/ml。更优选分子量小于等于5000道尔顿的多糖含量为5mg/ml～20mg/ml。

根据本发明，优选所述植物发酵组合物中，分子量小于等于10000道尔顿的总黄酮含量为10mg/ml～35mg/ml。优选分子量小于等于8000道尔顿的总黄酮含量为10mg/ml～35mg/ml。更优选分子量小于等于5000道尔顿的总黄酮含量为10mg/ml～35mg/ml。

根据本发明，所述植物发酵组合物中，还可以根据需要进一步含有防腐剂。所述防腐剂可以是本领域常用的防腐剂，例如包括但不限于：辛甘醇、己二醇、戊二醇、乙基己基甘油、馨鲜酮、Euro-NApre中的一种或数种。在本发明的一个实施方式中，所用防腐剂为馨鲜酮或Euro-NApre。

根据本发明，优选所述植物发酵组合物的pH值为弱酸性，适于化妆品领域的应用。在本发明的一个实施方式中，所述植物发酵组合物被配置成10％的水溶液时，pH值为4.5～6.5。

根据本发明，“总多酚”、“多酚”和“多酚类化合物”的含义相同，是指分子结构中有若干个酚羟基的植物成分的总称，包括黄烷醇类、黄酮醇类、花色苷类、单宁类、酚酸类等。

根据本发明，“总黄酮”、“黄酮”、“黄酮类化合物”和“生物类黄酮”的含义相同，是具有色酮环与苯环为基本结构的一类化合物的总称，属于植物次级代谢产物，包括黄酮、类黄酮、异黄酮、查尔酮等等。

根据本发明，“多糖”是指许多相同或不同的单糖以α-或β-糖苷键组成的化合物。

根据本发明，由所述制备方法获得的植物发酵组合物，复合了黑加仑和黑莓两种富含花青素等活性物质的“黑色”植物，经本发明的制备方法加工后，活性成分的透皮吸收性好，因低分子量的总多酚含量高，例如分子量小于等于10000道尔顿，优选小于等于8000道尔顿，更优选小于等于5000道尔顿的总多酚，从而具有良好的美白、抗氧化和防衰老的活性，适用于化妆品，尤其是护肤类化妆品的制造，特别是适合于面膜类产品的制造，可提供相应化妆品美白、防衰老的功效。进一步，所述植物发酵组合物中，低分子量的多糖和总黄酮的含量也很高，例如分子量小于等于10000道尔顿，优选小于等于8000道尔顿，更优选小于等于5000道尔顿的多糖和总黄酮，增强了美白和抗氧化的活性。

上述植物发酵组合物在制备化妆品中的应用。

所述植物发酵组合物含有丰富的水解原花青素、多糖、多酚、黄酮类物质、无机电解质等物质，具有优异的抗氧化、防衰老和美白的功效，可用于制备化妆品。

在化妆品配制中，所述植物发酵组合物的用量没有特别的限定，可以根据化妆品的种类进行适当调整。所述植物发酵组合物的用量，在化妆品为100％质量时，可以为0.001～100质量％，尤其是0.01～50质量％。

可使用所述植物发酵组合物的化妆品的种类没有特别的限定。作为化妆品，可以包括护肤类化妆品、彩妆类化妆品和洗涤类化妆品，列举例如，剥撕式面膜、片状面膜、敷面剥落式面膜、化妆水、乳液、粉、口红、腮红、粉底、洗面奶、洗面膏等。这些化妆品中，根据其种类，根据需要，还可以添加其他成分，例如，其他植物提取物、维生素、矿物质、防腐剂、乳化剂、增稠剂、色素、香料等。优选的化妆品为护肤类化妆品，例如，各种类型的面膜，包括但不限于剥撕式面膜、片状面膜、敷面剥落式面膜；化妆水；乳液等。

在本发明的一个实施方式，所述植物发酵组合物用于制备面膜类产品。

根据本发明，所述面膜类产品包括但不限于，可以直接涂覆于脸部的面膜膏；以无纺布等为载体的面膜，载体浸泡在面膜液中而饱含面膜液等。

所述植物发酵组合物在面膜类产品中的添加量为3～50质量％，优选为5～30质量％，以面膜液或面膜膏的质量为100％计。

一种化妆品组合物，其含有所述植物发酵组合物。

在化妆品组合物为100％质量时，所述植物发酵组合物的含量可以为0.001～100质量％，尤其是0.01～50质量％。

根据本发明，所述化妆品组合物，可以包括护肤类化妆品、彩妆类化妆品和洗涤类化妆品，列举例如，剥撕式面膜、片状面膜、敷面剥落式面膜、化妆水、乳液、粉、口红、腮红、粉底、洗面奶、洗面膏等。优选的化妆品组合物为护肤类化妆品，例如，各种类型的面膜，包括但不限于剥撕式面膜、片状面膜、敷面剥落式面膜；化妆水；乳液等。

这些化妆品组合物中，根据其种类，根据需要，还可以添加其他成分，例如，其他植物提取物、维生素、矿物质、防腐剂、乳化剂、增稠剂、色素、香料等。

在本发明的一个实施方式中，所述化妆品组合物是面膜液或面膜膏。以面膜液或面膜膏的质量为100％计，所述植物发酵组合物在其中的添加量为3～50质量％，优选为5～30质量％。

一种面膜，其特征在于包含面膜液和浸泡于面膜液中的载体，所述面膜液中含有所述植物发酵组合物，以面膜液的质量为100％计，所述植物发酵组合物的添加量为3～50质量％，优选为5～30质量％。所述面膜可以是每一个载体和相应量的面膜液制成一个独立包装，也可以是多个载体一同浸泡于相应量的面膜液中组成一个包装。

根据本发明，所述载体为吸含面膜液，敷于面部的片状材料，其材质可以是本领域已知的各种适用于面膜纸的材质，包括但不限于无纺布、棉、蚕丝、麻等。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)黑加仑和黑莓含有丰富的花青素及多酚类物质，同时黑加仑还含有丰富的黑加仑多糖、维生素C、维生素P、维生素PP等，黑莓还含有丰富的维生素A、维生素E、尼克酸、绿原酸等，采用黑加仑和黑莓两种原料植物，结合两种植物化学成分的长处，使获得的功效物质更均衡，保证了最终发酵组合物中低分子量的总多酚、多糖和总黄酮的高含量，以提供很好的美白、抗氧化、防衰老的功效；

(2)以脱脂、酶法和发酵多步骤联合处理，可极大提高最终发酵组合物中低分子量的总多酚、多糖和总黄酮的含量，相较单一的方法或者溶剂提取法，在功效物质的组成和含量上更具有优势；

(3)制备工艺可不采用有毒有害溶剂，酶解和发酵后获得的植物发酵组合物中不含有机溶剂，无需后续有机溶剂的脱除处理，可直接以水溶液的形式应用于产品配方中，不仅利于提高产品的安全性，也利于降低生产工艺的污染和能耗；

(4)本发明获得的植物发酵组合物，经过测试安全，在美白、保湿、抗衰老等方面均有明显的效果，适合在化妆品中应用，尤其适合于面膜类产品中应用。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

以下实施例中所用试剂，如无特殊说明，均为可商购获得的常规常用试剂。

以下实施例中所用的实验方法，如无特殊说明，均为本领域常规的操作方法。

干燥植物的水含量测定方法参照《GB 5009.3-2010食品中水分的测定第一法直接干燥法》

固形物的测定方法采用热重法，以鼓风干燥箱在(105±1)℃干燥3h后测定。

总多酚含量的测定采用Folin-Ciocalteu法测定(娄在祥,王洪新,吕文平,等.微波辅助提取牛蒡叶多酚及其抗氧化、抗菌活性研究[J].食品与发酵工业,2010,36(1):161-165.)。

总黄酮含量的测定采用NaNO₂-AlCl₃法测定(Gonzalez R,Ballester I,Lopez-Posada R,et al.Effects of Flavonoids and other Polyphenols on Inflammation[J].Critical Reviews In Food Science And Nutrition,2011,51(4):331-362.)。

多糖含量的测定采用苯酚-硫酸比色法测定(张青,张天民.苯酚-硫酸比色法测定多糖含量[J].中国药学会全国生化新药研究与临床应用学术会议,2004:56-56.)

实施例1

(I)黑加仑和黑莓的脱脂处理

将5质量份黑加仑和5质量份黑莓(水分含量皆为0.7％)，粉碎至60目，在20℃，采用50质量份无水乙醇进行脱脂24h，搅拌速度为50rpm/min。脱脂结束后，分离脱脂剂，滤渣在-1.5MPa下冷冻干燥10h，得到约8.5质量份脱脂干粉，备用；

(II)酶解

将步骤(I)获得的8质量份脱脂干粉与80质量份水，加入酶解釜中，80Hz超声15min，以三乙醇胺调节pH至7.0；加入0.0016质量份复合酶A(0.0008质量份果胶酶Pectinex BE XXL和0.0008质量份淀粉酶Amylase AG XXL)，在40℃下反应4h；再加入0.0008质量份复合酶B(0.0004质量份纤维素酶Celluclast1.5L与0.0004质量份Protamex中性蛋白酶)，在60℃下反应6h。酶解反应全程保持50rpm/min搅拌状态，酶解反应结束后，降温至室温，离心获得酶解液，酶解液以90℃灭酶灭菌30min，得到64质量份酶解产物；

(III)发酵

将步骤(II)获得的64质量份酶解产物加入发酵罐中，加入0.0032质量份葡萄糖和0.064质量份尿素，121℃下进行蒸汽灭菌30min，冷却至室温，在无菌条件下接种纳豆芽孢杆菌，接种量为(2×10⁶)CFU/ml，和嗜酸乳杆菌，接种量为(5×10⁶)CFU/ml。升温至31℃，以30rpm/min搅拌，发酵48h；

(IV)后处理

将步骤(III)获得的发酵产物离心，得到60质量份发酵原液，以5000道尔顿微滤膜装置过滤，以90μw/cm²紫外灯辐照15min灭菌，加入0.36质量份辛甘醇，获得60.36质量份植物发酵组合物1#。

经检测，植物发酵组合物1#的固形物含量2.5％，总多酚浓度为5mg/ml，多糖浓度为5mg/ml，总黄酮浓度为10mg/ml，10％水溶液的pH为4.5。

实施例2

(I)黑加仑和黑莓的脱脂处理

将2.5质量份黑加仑和7.5质量份黑莓(水分含量皆为0.6％)，粉碎至80目，在30℃，采用80质量份无水乙醇进行脱脂48h，搅拌速度为150rpm/min。脱脂结束后，分离脱脂剂，滤渣在-0.5MPa下冷冻干燥15h，得到约9质量份脱脂干粉，备用；

(II)酶解

将步骤(I)获得的9质量份脱脂干粉与135质量份水，加入酶解釜中，120Hz超声45min，以三乙醇胺调节pH至7.5；加入0.045质量份复合酶A(0.015质量份果胶酶PectinexBE XXL和0.03质量份淀粉酶Amylase AG XXL)，在55℃下反应8h；再加入0.0225质量份复合酶B(0.005625质量份纤维素酶Celluclast 1.5L与0.016875质量份Protamex中性蛋白酶)，在70℃下反应12h。酶解反应全程保持150rpm/min搅拌状态，酶解反应结束后，降温至室温，离心获得酶解液，酶解液以95℃灭酶灭菌15min，得到121.5质量份酶解产物；

(III)发酵

将步骤(II)获得的121.5质量份酶解产物加入发酵罐中，加入0.018225质量份葡萄糖和0.243质量份尿素，121℃下进行蒸汽灭菌30min，冷却至室温，在无菌条件下接种纳豆芽孢杆菌，接种量为(5×10⁸)CFU/ml，和嗜酸乳杆菌，接种量为(10×10⁸)CFU/ml。升温至35℃，以50rpm/min搅拌，发酵72h；

(IV)后处理

将步骤(III)获得的发酵产物离心，得到115质量份发酵原液，以5000道尔顿微滤膜装置过滤，以180μw/cm²紫外灯辐照5min灭菌，加入1.15质量份馨鲜酮，获得116.15质量份植物发酵组合物2#。

经检测，植物发酵组合物2#的固形物含量5.0％，总多酚浓度为15mg/ml，多糖浓度为20mg/ml，总黄酮浓度为35mg/ml，10％水溶液的pH为6.5。

实施例3

(I)黑加仑和黑莓的脱脂处理

将4质量份黑加仑和6质量份黑莓(水分含量皆为0.5％)，粉碎至70目，在25℃，采用60质量份无水乙醇进行脱脂30h，搅拌速度为100rpm/min。脱脂结束后，分离脱脂剂，滤渣在-1.0MPa下冷冻干燥12h，得到约8.8质量份脱脂干粉，备用；

(II)酶解

将步骤(I)获得的8.8质量份脱脂干粉与105.6质量份水，加入酶解釜中，100Hz超声20min，以氨甲基丙醇调节pH至7.2；加入0.0088质量份复合酶A(0.00352质量份果胶酶Pectinex BE XXL和0.00528质量份淀粉酶Amylase AG XXL)，在45℃下反应6h；再加入0.0088质量份复合酶B(0.00352质量份纤维素酶Celluclast 1.5L与0.00528质量份Protamex中性蛋白酶)，在65℃下反应8h。酶解反应全程保持100rpm/min搅拌状态，酶解反应结束后，降温至室温，离心获得酶解液，酶解液以92℃灭酶灭菌20min，得到89.76质量份酶解产物；

(III)发酵

将步骤(II)获得的89.76质量份酶解产物加入发酵罐中，加入0.008976质量份葡萄糖和0.13464质量份尿素，121℃下进行蒸汽灭菌30min，冷却至室温，在无菌条件下接种纳豆芽孢杆菌，接种量为(3×10⁷)CFU/ml，和嗜酸乳杆菌，接种量为(5×10⁷)CFU/ml。升温至32℃，以40rpm/min搅拌，发酵56h；

(IV)后处理

将步骤(III)获得的发酵产物离心，得到80质量份发酵原液，以5000道尔顿微滤膜装置过滤，以120μw/cm²紫外灯辐照10min灭菌，加入0.64质量份Euro-NApre，获得80.64质量份植物发酵组合物3#。

经检测，植物发酵组合物3#的固形物含量3.0％，总多酚浓度为8mg/ml，多糖浓度为15mg/ml，总黄酮浓度为20mg/ml，10％水溶液的pH为5.0。

实施例4

(I)黑加仑和黑莓的脱脂处理

将3质量份黑加仑和7质量份黑莓(水分含量皆为0.65％)，粉碎至65目，在25℃，采用70质量份无水乙醇进行脱脂32h，搅拌速度为120rpm/min。脱脂结束后，分离脱脂剂，滤渣在-0.8MPa下冷冻干燥12h，得到约9质量份脱脂干粉，备用；

(II)酶解

将步骤(I)获得的9质量份脱脂干粉与90质量份水，加入酶解釜中，90Hz超声25min，以氢氧化钠调节pH至7.3；加入0.018质量份复合酶A(0.009质量份果胶酶PectinexBE XXL和0.009质量份淀粉酶Amylase AG XXL)，在45℃下反应7h；再加入0.0135质量份复合酶B(0.0045质量份纤维素酶Celluclast 1.5L与0.009质量份Protamex中性蛋白酶)，在68℃下反应8h。酶解反应全程保持120rpm/min搅拌状态，酶解反应结束后，降温至室温，离心获得酶解液，酶解液以92℃灭酶灭菌25min，得到76.5质量份酶解产物；

(III)发酵

将步骤(II)获得的76.5质量份酶解产物加入发酵罐中，加入0.00612质量份葡萄糖和0.0918质量份尿素，121℃下进行蒸汽灭菌30min，冷却至室温，在无菌条件下接种纳豆芽孢杆菌，接种量为(9×10⁶)CFU/ml，和嗜酸乳杆菌，接种量为(9×10⁶)CFU/ml。升温至32℃，以45rpm/min搅拌，发酵60h；

(IV)后处理

将步骤(III)获得的发酵产物离心，得到70质量份发酵原液，以5000道尔顿微滤膜装置过滤，以150μw/cm²紫外灯辐照8min灭菌，加入0.56质量份辛甘醇，获得70.56质量份植物发酵组合物4#。

经检测，植物发酵组合物4#的固形物含量3.2％，总多酚浓度为12mg/ml，多糖浓度为12mg/ml，总黄酮浓度为20mg/ml，10％水溶液的pH为5.1。

对比实施例5

无脱脂步骤，其余步骤和条件同实施例1。

得到植物发酵组合物5#，经检测，植物发酵组合物5#的固形物含量1.5％，总多酚浓度为3mg/ml，多糖浓度为2mg/ml，总黄酮浓度为6mg/ml，10％水溶液的pH为4.8。

对比实施例6

无酶解步骤，其余步骤和条件同实施例1。

得到植物发酵组合物6#，经检测，植物发酵组合物6#的固形物含量3.0％，总多酚浓度为1mg/ml，多糖浓度为3mg/ml，总黄酮浓度为5mg/ml，10％水溶液的pH为5.8。

对比实施例7

无发酵步骤，其余步骤和条件同实施例1。

得到组合物7#，经检测，组合物7#的固形物含量1.8％，总多酚浓度为0.8mg/ml，多糖浓度为4mg/ml，总黄酮浓度为6mg/ml，10％水溶液的pH为5.0。

对比实施例8

无脱脂、酶解、发酵步骤，分别以水、水-乙醇(体积比1:1)、水-丙二醇(体积比1:1)为溶剂，采用5质量份黑加仑和5质量份黑莓(水分含量皆为0.7％)，以料液比为1:10，按照常规工艺进行提取，同样以5000道尔顿微滤膜装置过滤，得到组合物8#、9#、10#。

经检测，8#的总多酚浓度为0.2mg/ml，多糖浓度为2mg/ml，总黄酮浓度为2mg/ml。

9#的总多酚浓度为0.8mg/ml，多糖浓度为0.5mg/ml，总黄酮浓度为4mg/ml。

10#的总多酚浓度为0.6mg/ml，多糖浓度为5mg/ml，总黄酮浓度为6mg/ml。

以上各实施例中所制备的组合物及其编号沿用于以下各实施例和实验中。

应用实施例9

在乳化型面膜液中的应用

制备工艺：

1、预配D相：D相混合，充分搅拌至溶解透明，备用；

2、预配G相：G相混合，充分搅拌至溶解均匀，备用；

3、边弱均质，边将A相中的粉料依次缓慢地洒入冷的去离子水中，再边搅拌边加热，期间可进行多次短时间的均质，至60-65℃，均质5-8分钟至完全分散均匀，加入浸润完全的B相、C相，继续加热至82-85℃，再均质2-5分钟至完全分散均匀，乳化前加入预配好的D相，充分搅拌均匀后，保温至少15-20分钟消毒，消泡，备用；

4、E相，加热至85-88℃，保温搅拌至完全熔成液体后，再降温至80-82℃，依次加入F相，保温搅拌至完全熔成液体，备用；

5、真空下，中速搅拌，弱-中速均质，E+F相缓慢加入A+B+C+D相中，加完后，提速至中-强速，均质5-8分钟至完全乳化均匀，保温15分钟，消泡后降温；

6、降温至45℃以下，加入预配好的G相，充分搅拌至均匀；

7、加入预先混合均匀的H相，充分搅拌至均匀，再依次加入I相物料，充分搅拌均匀；

8、取样，检测合格后，过滤出料，得到含有植物发酵组合物的面膜液。

应用实施例10

在透明型面膜液中的应用

制备工艺：

1、预配B相：将B相预混合，加热至75-80℃，充分搅拌至完全溶解，保温，备用；

2、预配C相：C相混合，充分搅拌至溶解透明，备用；

3、预配D相：将D相中的香精和PEG-40氢化蓖麻油、丙二醇预混合均匀后，搅拌均匀(香精影响，此时可能会有点混浊状态)，再加入去离子水，充分搅拌至完全溶解透明后，备用；

4、预配E相：E相混合，充分搅拌至溶解均匀，备用；

5、边弱均质，边将卡波姆缓慢地洒入去离子水中，再边搅拌边加热，期间可进行多次短时间的均质，至82-85℃，均质5-8分钟至完全分散均匀，加入预配好的B相，搅拌至完全溶解均匀后，至少15-20分钟消毒，消泡后，降温；

6、降温至60-65℃，加入预配好的C相，充分搅拌至完全溶解透明；

7、降温至45℃以下，加入预配好的D相，充分搅拌至完全溶解透明；

8、加入预配好的E相，充分搅拌至完全溶解透明；

9、依次加入F相，分别充分搅拌至完全溶解透明；

10、取样，检测合格后，过滤出料，得到含有植物发酵组合物的面膜液。

稳定性检测

耐热试验：将样品放入(40±1)℃的电热恒温培养箱中24h，恢复室温后观察是否有变稀、变色、分层及硬度变化等现象，以判断样品的耐热性能。

耐寒试验：将样品放入(-5～-10)℃±1℃的电冰箱中24h，恢复室温后观察是否有变稀、变色、分层及硬度变化等现象，以判断样品的耐寒性能。

离心试验：将样品置于离心机中，以(2000～4000)r/min的转速试验30min，观察样品的分离、分层状况。

稳定性检测结果记录表

从稳定性检测结果可以看出，对比实施例8获得的组合物8～10#是不稳定，由于其未经过脱脂等步骤，所提取出物质分子量大，在高低温都容易出现不稳定的情况。

安全性测试

1.多次给药的皮肤刺激性测试

采用动物实验，试验动物采用健康日本大耳朵白色家兔，取家兔8只，雌雄各半，按性别和体重随机分为2组：完整皮肤组和破损皮肤组，每组4只。给药前24小时，用8％硫化钠将家兔背部两侧脱毛，去毛面积约为150cm²。试验时，用手术刀片在破损皮肤脱毛区消毒皮肤左侧上下区域，右侧中间区域各划一“井”字破口，破口横竖各约2cm，以渗血为度。两组动物均在左侧脱毛上下区均匀涂抹本发明实施例1植物发酵组合物1#0.1g及实施例2植物发酵组合物2#0.1g，右侧涂抹1ml生理盐水作对照，每日上、下午各涂一次，连续7天。涂药期间动物分笼以全营养饲料喂养。记录1、2、3、4、5、6、7天用肉眼观察和进行病理组织学检查并记录涂药部位皮肤有无红斑和水肿情况，进行皮肤刺激性反应评分和强度评价。

按同样的方法测定实施例3和4的植物发酵组合物3#和4#。

皮肤刺激性反应评分标准如下：

红斑	分值	水肿	分值
				无红斑	0	无水肿	0
勉强可见	1	勉强可见	1
				明显可见	2	可见(边缘高出皮肤)	2
中毒或严重红斑	3	皮肤隆起约1mm，轮廓清楚	3
				紫红色红斑并有焦痂形成	4	水肿隆起≥1mm以上并范围扩大	4

皮肤刺激性强度评价标准如下：

反应平均值	评价
		0～0.49	无刺激性
0.5～2.99	轻度刺激性
		3.0～5.99	中度刺激性
6.0～8.0	强刺激性

反应平均分值＝(红斑形成总分+水肿形成总分)/合计动物数对家兔皮肤刺激性反应结果如下：

试验结果表明，使用本发明实施例1～4制备植物发酵组合物对家兔完整皮肤及破损皮肤无刺激性，表明本发明的植物发酵组合物对皮肤无刺激性，安全可靠。

2.人体皮肤斑贴试验

选用30名志愿受试者，年龄25～40岁，男性女性各半，受试者皮肤健康，无皮肤病过敏史，符合受试者志愿入选标准，进行斑贴试验。选用合格的斑贴器，以封闭式斑贴试验方法，将受试物1#、2#、3#、4#各约0.05g均匀涂抹于斑贴器内，外用专用胶带贴覆于受试者前臂，24小时后去除受试物，分别在去除后0.5、6、12、24、48小时观察皮肤反应，按照《化妆品卫生规范》中皮肤反应分级标准记录其结果。

人体皮肤斑贴试验结果显示：30名受试者通过本发明所述的1#～4#的斑贴试验，在0.5、6、12、24、48小时观察皮肤反应，其中0例出现皮肤不良反应，说明本发明所述的植物发酵组合物是安全的。

功效测试

1、清除羟基自由基能力测试

1.1实验方法

利用H₂O₂和Fe²⁺混合发生Fenton反应，生成具有很高反应活性的羟基自由基，羟基自由基能被水杨酸有效地捕捉，并生成有色物质，若加入具有清除自由基的物质，便会和水杨酸竞争而减少有色物生成。

10ml体系，加入0.5ml 9.1mmol/L水杨酸-乙醇溶液，0.5ml 9mmol/L Fe²⁺溶液，0.5ml样品，3.5ml水，最后加入5ml 88mmol/L H₂O₂溶液，摇匀，于510nm处测定吸光度A₁。A₂为取0.5ml水替代Fe²⁺溶液所得吸光度，A₃为取0.5ml水替代样品所得的吸光度。

清除率P＝[1-(A₁-A₂)/A₃]*100％

1.2测试结果

以VB3(烟酰胺，来自DSM公司)作对照品，将VB3和各组合物配制成不同浓度的水溶液，测试不同浓度下，实施例获得植物发酵组合物、对比实施例和VB3的清除羟基自由基能力，结果表1。

表1不同浓度下植物发酵组合物和VB3的清除羟基自由基的能力

清除羟基自由基的实验表明，实施例1、2获得的植物发酵组合物在清除羟基自由基方面比对比实施例都好，也强于VB3。

发明人发现，虽然从分子量小于等于5000的多酚、多糖和黄酮的浓度来看，1#和2#的浓度接近于5#的2倍，但1#和2#的1％的水溶液的活性，比5#2％的水溶液的活性高；1#和2#的2％的水溶液的活性，比5#4％的水溶液的活性又高出很多，随着水溶液浓度的增加，这种差异越明显，1#和2#的5％的水溶液的活性甚至是5#10％的水溶液活性的2倍多。

发明人推测可能是分子量小于等于5000的多酚、多糖和黄酮的浓度高，连带的相关其他水解和代谢产物的浓度也比较高，功效物质之间还可能存在相互协同作用，产生了高于浓度比例差异的活性差异。

2、清除DPPH自由基能力测试

2.1实验方法

DPPH在有机溶剂中是一种稳定自由基，在517nm处有吸收峰，呈紫色，当有自由基清除剂存在时，DPPH会被配对，颜色变浅。

加入5ml DPPH溶液(1mg DPPH溶于20ml 95％乙醇，超声5min，于517nm处测吸光度，吸光度为1.2-1.3间最佳)，0.2ml样品摇匀，于517nm处测定吸光度A₁。A₂为取5ml 95％乙醇溶液替代DPPH溶液所得吸光度，A₃为取0.2ml水替代样品所得的吸光度。

清除率P＝[1-(A₁-A₂)/A₃]*100％

2.2测试结果

以0.5％的光甘草定的丙二醇溶液作对照品，将0.5％的光甘草定的丙二醇溶液和各组合物进一步配制成不同浓度的水溶液，测试不同浓度下，植物发酵组合物和光甘草定的清除DPPH自由基能力，结果如表2。

表2不同浓度下植物发酵组合物和光甘草定的清除DPPH自由基的能力

3、抑制酪氨酸酶能力测试

酪氨酸酶是黑色素形成过程中主要的限速酶，该酶的活性大小决定着黑色素形成的数量，当前化妆品市场上的美白产品绝大多数以酪氨酸酶抑制剂为主。L-酪氨酸酶与其底物L-酪氨酸可以发生催化反应，当在反应体系中添加有L-酪氨酸酶活性抑制作用的试剂后，对催化反应可以产生抑制作用，通过测定添加有L-酪氨酸酶活性抑制作用的试剂前后475nm处吸光度值的变化，来评价该有L-酪氨酸酶活性抑制作用的试剂对L-酪氨酸酶活性的抑制率。

实验方法采用多巴速率法测定样品对酪氨酸酶活性的抑制作用，具体参考文献(Chen Q X,Kubo I.Kinetics of mushroom tyrosinase inhibition by quercetin[J].JAgric Food Chem,2002,50(14):4108-4112.)。

将被试各样品配置成1％的水溶液，测定其酪氨酸酶抑制活性，结果见下表。

表3不用样品对酪氨酸酶的抑制情况

从表3可以看出，实施例1、2获得的植物发酵组合物对酪氨酸酶具有极好的抑制效果，其抑制率达到了脱氧熊果苷的水平，而对比实施例所获得的组分效果差很多。

4、实施例9美白面膜的美白功效测试

以市售面膜无纺布为载体，分别浸泡各面膜液，制成面膜用于以下测试。

空白组：一种面膜，其面膜液原料除了不含植物发酵组合物，其他原料的种类和用量均与实施例9中面膜液的相同；

对照组1：一种面膜，用市售脱氧熊果苷和VC乙基醚替代植物发酵组合物作为美白原料，其他面膜液原料的种类和用量均与实施例9中面膜液的相同；

对照组2：一种面膜，在实施例9的面膜液配方中，以5#代替1#；

对照组3：一种面膜，在实施例9的面膜液配方中，以8#代替1#；

实验组：实施例9美白面膜液。

对比试验：

1)试验方法：志愿者90人(年龄25-40岁)，按平行对照的原则随机分为5组，分别使用空白组、对照组和实验组面膜，试验志愿者早晚洁面后各取一片敷于面部，使用2个月。

2)仪器：德国COURAGE+KHAZAKA(CK)公司生产的MPA10多探头测试系统。

3)试验结果：

①使用8周后：空白组、对照组和实验组自评皮肤美白改善程度：

表4志愿者功效测试评价结果

实验结果表明，含有实施例1获得的植物发酵组合物的面膜，较之于含有相同浓度的熊果苷和VC乙基醚的面膜，对皮肤的美白效果显著提高，说明含本发明植物发酵组合物的面膜具有显著的美白作用。同时，实施例1的1#相较对比实施例有更加显著的提升。

发明人发现，虽然在体外实验中，1#和脱氧熊果苷抑制酪氨酸酶的能力相当，但在人体皮肤上实验时，1#的美白效果要远好于脱氧熊果苷和VC乙基醚的组合，可能的原因是1#中组分的透皮吸收性好，各组分可能还通过其他作用机理，例如抗氧化损伤等，带来了美白效果。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种复合黑植物发酵组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(I)黑加仑和黑莓的脱脂处理；(II)步骤(I)获得的脱脂产物的酶解；(III)步骤(II)获得的酶解产物的发酵。

2.如权利要求1所述的制备方法，所述步骤(I)中的黑加仑和黑莓，以干燥后质量计，黑加仑和黑酶的质量比为：1:1～4，优选为1:1～3；

优选所述黑加仑和黑莓的含水量分别均≤1.5％。

3.如权利要求1-2任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(II)的酶解，采用果胶酶、淀粉酶、纤维素酶和蛋白酶；

优选采用果胶酶和淀粉酶混合而成的复合酶A进行第一步酶解，之后采用纤维素酶和蛋白酶混合而成的复合酶B进行第二步酶解；

优选复合酶A中，果胶酶和淀粉酶的质量比为1:(1～2)，复合酶B中，纤维素酶和蛋白酶的质量比为1:(1～3)；

优选，以步骤(I)脱脂产物的干重计，复合酶A的用量为脱脂产物的0.02～0.5％，复合酶B的用量为脱脂产物的0.01～0.25％；

优选，以步骤(I)脱脂产物的干重计，优选复合酶A的质量为脱脂产物的0.1～0.5％；

优选，以步骤(I)脱脂产物的干重计，优选复合酶B的质量为脱脂产物的0.1～0.25％；

优选，以步骤(I)脱脂产物的干重计，酶解反应混合物中，脱脂产物与水的质量比为：1:5～20，优选为1:10～15。

4.如权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于：步骤(III)的发酵，采用芽孢杆菌和乳酸杆菌；

优选所述的芽孢杆菌为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus Bacillus)、纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megateriun)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)中的至少一种；

优选所述乳酸杆菌为嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、瑞士乳杆菌(lactobacillus helveticus)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)中的至少一种；

优选所述芽孢杆菌的接种量为(2×10⁶～5×10⁸)CFU/ml；

优选所述乳酸杆菌的接种量为(5×10⁶～10×10⁸)CFU/ml。

5.由权利要求1-4任一项所述的制备方法制备的复合黑植物发酵组合物。

6.如权利要求5所述的植物发酵组合物，其中，分子量小于等于10000道尔顿的总多酚含量为5mg/ml～15mg/ml；优选分子量小于等于8000道尔顿的总多酚含量为5mg/ml～15mg/ml；更优选分子量小于等于5000道尔顿的总多酚含量为5mg/ml～15mg/ml；

优选所述植物发酵组合物中，分子量小于等于10000道尔顿的多糖含量为5mg/ml～20mg/ml；优选分子量小于等于8000道尔顿的多糖含量为5mg/ml～20mg/ml；更优选分子量小于等于5000道尔顿的多糖含量为5mg/ml～20mg/ml；

优选所述植物发酵组合物中，分子量小于等于10000道尔顿的总黄酮含量为10mg/ml～35mg/ml；优选分子量小于等于8000道尔顿的总黄酮含量为10mg/ml～35mg/ml；更优选分子量小于等于5000道尔顿的总黄酮含量为10mg/ml～35mg/ml。

7.权利要求5-6任一项所述的复合黑植物发酵组合物在制备化妆品中的应用；优选所述植物发酵组合物的用量，在化妆品为100％质量时，为0.001～100质量％，尤其是0.01～50质量％。

8.如权利要求7所述的应用，所述的化妆品为面膜；优选所述植物发酵组合物的添加量为3～50质量％，优选为5～30质量％，以面膜液或面膜膏的质量为100％计。

9.一种化妆品组合物，含有权利要求5-6任一项所述的复合黑植物发酵组合物；优选在化妆品组合物为100％质量时，所述植物发酵组合物的含量为0.001～100质量％，尤其是0.01～50质量％。

10.如权利要求9所述的化妆品组合物，所述化妆品组合物为面膜液或面膜膏；优选以面膜液或面膜膏的质量为100％计，所述植物发酵组合物在其中的添加的量为3～50质量％，优选为5～30质量％。

11.一种面膜，其特征在于，包含面膜液和浸泡于面膜液中的载体，所述面膜液中含有权利要求5-6任一项所述的复合黑植物发酵组合物，以面膜液的质量为100％计，所述植物发酵组合物的添加量为3～50质量％，优选为5～30质量％；优选所述面膜是独立包装，每个独立包装中含有一片载体；优选所述面膜是组合包装，每个包装中含有多片载体。