CN108451798A

CN108451798A - 一种具有祛痘功效的植物发酵组合物的制备方法

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Publication number: CN108451798A
Application number: CN201810711357.9A
Authority: CN
Inventors: 胡喜芬
Original assignee: Foshan Vincent Intellectual Property Service Co Ltd
Current assignee: Jiangxi Dengyun health beauty industry Internet Ltd.
Priority date: 2018-07-01
Filing date: 2018-07-01
Publication date: 2018-08-28

Abstract

本发明提供一种由莳萝和桦褐孔菌为原料经酶解和发酵获得的植物发酵组合物，其富含多种有效活性成分，具有很强的激素分泌异常调节、抗氧化、防衰老、抑制5α‑还原酶活性的功效，适合在化妆品中应用，尤其适合于护发类产品中应用。

Description

一种具有祛痘功效的植物发酵组合物的制备方法

技术领域

本发明涉及化妆品领域,具体涉及一种具有祛痘功效的植物发酵组合物，即由莳萝和桦褐孔菌两种植物为原料的植物发酵组合物，及其制备方法，与其在化妆品，尤其是祛痘类产品中的应用。

背景技术

莳萝，拉丁学名为Anethum graveolens L.，为伞形科莳萝属单种植物，干燥果实入药，又名土茴香、野茴香、洋茴香。其植株外形与小茴香Anethum foeniculum L.相似，部分地区常与小茴香混用，曾经被误认为小茴香同属植物。莳萝原产欧洲南部，现在世界各地都有栽培，我国大部分地区均有分布，主产于东北、甘肃、四川等地。莳萝在我国的药用历史悠久，首载于宋代的《开宝本草》，有调中、止痛、止呕吐的功效。临床上用于脘腹气胀、两胁痞满、食欲不振的治疗。我国常以莳萝油作为食品添加剂或调味品，国外除将其作为食品添加剂之外，还用来制作奶酪、泡菜、色拉、汤、健胃药等。《英国药典》以及德国植物药专著均收载莳萝精油用于治疗消化不良。

莳萝茎叶及果实有茴香味，尤以果实较浓。嫩茎叶供作蔬菜食用，果实可提取芳香油，据记载，含挥发油2.8-4％，油中主要成分是香芹酮，为调和香精的原料。果实可入药，有驱风，健胃，散瘀，催乳等作用。

莳萝果实含葛缕酮、柠檬烯、莳萝油脑、佛手柑内酯、伞形花内酯金合欢醚即7-羟基香豆精金合欢醇醚、蜡、γ-谷甾醇等。

莳萝挥发油能抑制乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶活性，其中D-香芹酮和二氢香芹酮作用最强。

桦褐孔菌，拉丁学名为Inonotus obliquus(Fr.)Pilat，是一种生长在寒带的木腐菌,属于真菌门、担子菌纲、多孔菌目、多孔菌科、褐卧孔菌属。主要分布于北半球北纬45-50°之间,集中在俄罗斯的西伯利亚和远东地区、北欧的波兰和荷兰、中国的大小兴安岭和长白山地区、日本北海道，以及北美北部。从16世纪开始,俄罗斯、波兰、芬兰等国家的民间就开始食用桦褐孔菌,并且用于防治多种疾病。近年来,随着天然食品和药物热的兴起,人们对桦褐孔菌引起了极大的兴趣,研究人员利用现代科学技术对桦褐孔菌进行了广泛的研究。

桦褐孔菌含有大量的植物纤维类多糖体，桦褐孔菌素、桦褐孔菌醇、多种氧化三萜类化合物、栓菌酸、多种羊毛甾醇型三萜类化合物、叶酸衍生物、芳香族的香草酸、丁香酸及γ羟基苯甲酸,还有报道称已分离出单宁化合物、类固醇、生物碱类化合物、黑色素类、低分子多酚类及木质素类化合物。

桦褐孔菌是一种十分珍稀而名贵的药用真菌，动物实验及临床实验表明使用桦褐孔菌无任何毒副作用，具有抗癌、抗病毒、抗衰老、降血压、降血糖、复活免疫作用，可改善并预防过敏性皮质。被美国FDA认证称为草药之王。

桦褐孔菌对应用到护肤类化妆品中有非常高的价值。

常规的醇提水提法提取莳萝和桦褐孔菌得到的有效成分分子量高，难以透皮吸收；并且，常规提取莳萝和桦褐孔菌得到的对激素分泌异常调节、抑制5α-还原酶活性的有效成分非常少，功效性不强。

发酵是微生物在一定条件下进行生理活动，借助于酶的作用对有机物进行分解、转化取得C、N、维生素等各种营养及生长菌体，同时产生各种次级代谢产物，如：多糖、氨基酸等的过程。与其他加工方式相比，发酵能够产生新的活性物质，降低毒性，改变功效，同时可能由于微生物的水解作用，使发酵产物更易被吸收。

发明内容

本发明的首要目的是提供一种具有祛痘功效的植物发酵组合物的制备方法。

本发明的再一目的是提供由所述制备方法获得的植物发酵组合物，该发酵组合物具有激素分泌异常调节、抑制5α-还原酶的特效成分，易于透皮吸收，入毛囊深处,消除皮肤油脂和污垢,杀灭痤疮丙酸杆菌和其他痤疮相关菌群,对激素分泌异常调节,均衡毛囊内的生态平衡,从而达到长效祛痘,解决痤疮反复发作的问题。

本发明的第三目的在于提供所述植物发酵组合物在制备化妆品中的应用，以及含有所述植物发酵组合物的化妆品组合物。

在本发明中，植物发酵组合物是指以莳萝和桦褐孔菌为原料制得。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种具有祛痘功效的植物发酵组合物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(I)莳萝和桦褐孔菌的炮制预处理；

(II)步骤(I)获得的炮制预处理产物的酶解；

(III)步骤(II)获得的酶解产物的发酵。

根据本发明，步骤(I)中所述的莳萝和桦褐孔菌，以干燥后质量计，莳萝和桦褐孔菌的质量比为1:(1-3)，优选为1:(1-2)。

根据本发明，所述干燥是指采用本领域已知或常用的干燥方法，使莳萝和桦褐孔菌的含水量分别均≤1.5％，优选≤1.0％，例如≤0.9％，≤0.8％，≤0.6％等。

根据本发明，步骤(I)莳萝和桦褐孔菌的炮制预处理，其中莳萝的炮制过程：取净莳萝，加入定量米醋拌匀，闷润至醋被吸尽后，置炒制容器内，用文火加热，炒干，取出直接粉碎；其中桦褐孔菌的炮制过程：取净桦褐孔菌，喷洒定量黄酒拌匀，稍闷润，待酒被吸尽后，置炒制容器内，用文火加热，炒干，取出直接粉碎。

在本发明的一个实施方式中，每10kg莳萝，用米醋2-3kg。

在本发明的一个实施方式中，每10kg桦褐孔菌，用黄酒1-2kg。

根据本发明，在炮制处理后，可采用本领域中常用的粉碎方法，将莳萝和桦褐孔菌直接热态粉碎，可以提高炮制效果。所述粉碎方法包括但不限于，研磨、剪切、超声等。在本发明的一个实施方式中，莳萝和桦褐孔菌被粉碎为50-70目。

根据本发明，在炮制处理后，所得炮制产物可直接用于后续步骤。

发明人意外发现，炮制处理对后续酶解和发酵的效率有较大影响，尤其对获得的发酵组合物中的多糖和甾醇类化合物的得率有较大影响。不受特殊理论的限制，推测其可能的原因是炮制处理后直接热态粉碎有助于细胞壁的瓦解，从而有利于后续酶解和发酵，从而提高其有效成分的溶出率。

根据本发明，步骤(II)炮制处理产物的酶解，采用果胶酶、淀粉酶、纤维素酶和蛋白酶。

根据本发明，采用果胶酶和淀粉酶混合而成的复合酶A进行第一步酶解，之后采用纤维素酶和蛋白酶混合而成的复合酶B进行第二步酶解。

根据本发明，复合酶A中，果胶酶和淀粉酶的质量比为1:(1-2)；复合酶B中，纤维素酶和蛋白酶的质量比为1:(1-3)。

以步骤(I)炮制处理产物的干重计，复合酶A的质量为炮制处理产物的0.02-0.5％，复合酶B的质量为炮制处理产物的0.01-0.25％。

优选，以步骤(I)炮制处理产物的干重计，复合酶A的质量为炮制处理产物的0.1-0.5％。

优选，以步骤(I)炮制处理产物的干重计，复合酶B的质量为炮制处理产物的0.1-0.25％。

根据本发明，所述果胶酶、淀粉酶、纤维素酶和蛋白酶可以选用本领域中已商品化的各种果胶酶、淀粉酶、纤维素酶和蛋白酶。在本发明的一个实施方式中，所用果胶酶是诺维信公司的Pectinex BE XXL、Pectinex AFP XXL、Pectinex5XL、Pectinex SMASH XXL、Pectinex Ultra SP-L中的至少一种；所用淀粉酶是诺维信公司的Amylase AG XXL、Amylase AG 300L中的至少一种；所用纤维素酶是诺维信公司的Celluclast 1.5L；所用蛋白酶是诺维信公司的Protamex中性蛋白酶。

根据本发明，以步骤(I)炮制处理产物的干重计，酶解反应混合物中，炮制处理产物与水的质量比为：1:(5-20)，优选为1:(10-15)。

本领域技术人员可以根据所用酶的具体种类、用量等实际情况，调整每一步酶解反应的pH值、温度、时间等条件。

可以根据所用酶的酶活性最适宜的pH和温度，来调整酶解体系的pH和酶解温度。

根据本发明，采用复合酶A进行的第一步酶解，酶解温度为35-60℃，优选为40-55℃。

根据本发明，采用复合酶B进行的第二步酶解，酶解温度为55-75℃，优选为60-70℃。

可采用本领域常用的pH调节剂，调整酶解反应混合物的pH值，所述pH调节剂包括但不限于常用的各种有机酸、无机酸、有机碱、无机碱，例如：一乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、异丙醇胺、氨甲基丙醇、氢氧化钠、氢氧化钾、氨水中的一种或数种。在本发明的一个实施方式中，所述酶解反应混合物的pH值为6.5-8.0，优选为7.0-7.5。

可以通过监测酶解物中总多糖的含量来控制酶解时间。

步骤(II)的酶解处理有利于莳萝和桦褐孔菌细胞壁的瓦解，释放出原生质，并产生多糖、氨基酸或寡肽，利于后续发酵。

在本发明的一个实施方式中，将步骤(I)获得的炮制产物与水，按照料液质量比1:(10-15)加入酶解釜中，以pH调节剂调节pH至7.0-7.5；加入复合酶A，在40-55℃下反应4-8h；再加入复合酶B，在60-70℃下反应6-12h。酶解反应全程保持搅拌状态，酶解反应结束后，降温至室温，离心获得酶解液，酶解液灭酶灭菌后，获得酶解产物，也称为待发酵液。

在本发明的一个实施方式中，所述搅拌的速度为50-150rpm/min。

根据本发明，步骤(III)酶解产物的发酵，采用芽孢杆菌和乳酸杆菌。

所述的芽孢杆菌，优选为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus Bacillus)、纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megateriun)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)中的至少一种。

所述的乳酸杆菌，优选为嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、瑞士乳杆菌(lactobacillus helveticus)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)中的至少一种。

所述的芽孢杆菌的接种量为(2×10⁶-5×10⁸)CFU/ml。

所述的乳酸杆菌的接种量为(5×10⁶-10×10⁸)CFU/ml。

本领域技术人员可以根据需要，向酶解产物中添加碳源、氮源等发酵菌所需的培养基物质。在本发明的一个实施方式中，向酶解产物中添加葡萄糖作为碳源，葡萄糖的添加量为酶解产物质量的0.005-0.015％。在本发明的一个实施方式中，向酶解产物中添加尿素作为氮源，尿素的添加量为酶解产物质量的0.1-0.2％。

本领域技术人员可以根据所用发酵菌的种类和接种量，调整发酵的温度、时间等具体条件。

发酵温度没有特别限制，只要能进行发酵即可，通常为15-50℃，优选为20-45℃，更优选为30-40℃。发酵通常通过通气搅拌进行。在本发明的一个实施方式中，发酵温度为31-35℃，搅拌速度为30-50rpm/min。

步骤(III)的发酵有利于大分子物质的水解，生成易于透皮吸收的小分子营养物质，同时，可以把有害成分去除，极大提高发酵组合物中多糖和甾醇类化合物的得率。

在本发明的一个实施方式中，将步骤(II)获得的待发酵液加入发酵罐中，加入葡萄糖和尿素，灭菌，冷却至室温，在无菌条件下接种芽孢杆菌和乳酸杆菌复合菌，升温搅拌，发酵48-72h。

根据本发明，所述制备方法任选进一步包括步骤(IV)，对步骤(III)获得的发酵物的后处理。

本领域技术人员可采用本领域常用的固液分离方法，从步骤(III)发酵物中得到发酵原液。所述固液分离方法包括但不限于，离心、过滤等。

根据本发明，在得到发酵原液后，可采用本领域常用的精制方法，对所述发酵原液做进一步精制，例如采用离子交换树脂、活性炭柱或膜过滤等方法。精制后的产物可以直接作为原料用于后续的化妆品生产。

在本发明的一个实施方式中，采用膜过滤的方法，使用微滤膜分离获得分子量小于等于10000道尔顿，优选小于等于8000道尔顿，更优选小于等于5000道尔顿的物质。在本发明的一个实施方式中，所述的微滤膜分子量为8000道尔顿，截留分子量超过8000道尔顿的物质，获得所述的植物发酵组合物。在本发明的另一个实施方式中，所述的微滤膜分子量为5000道尔顿，截留分子量超过5000道尔顿的物质，获得所述的植物发酵组合物。

在本发明的一个实施方式中，将步骤(III)获得的发酵物固液分离，得到发酵原液，以分子量为5000～8000道尔顿的微滤膜过滤，紫外灭菌。

由上述制备方法获得的植物发酵组合物。

根据本发明，该植物发酵组合物具有激素分泌异常调节、抑制5α-还原酶的特效成分，有效成分易于透皮吸收，入毛囊深处,均衡毛囊内的生态平衡,长效祛痘的功效。

根据本发明，优选所述植物发酵组合物中，多糖含量为5-20mg/ml。

根据本发明，优选所述植物发酵组合物中，甾醇类化合物含量为10-25mg/ml。

根据本发明，所述植物发酵组合物中，还可以根据需要进一步含有防腐剂。所述防腐剂可以是本领域常用的防腐剂，例如包括但不限于羟苯甲酯、羟苯丙酯、苯氧乙醇、苯甲醇、苯乙醇、双(羟甲基)咪唑烷基脲、山梨酸钾、苯甲酸钠、氯苯甘醚、脱氢乙酸钠等中的一种或多种。在本发明的一个实施方式中，所用防腐剂为山梨酸钾。

根据本发明，优选所述植物发酵组合物的pH值为弱酸性，适于化妆品护发领域的应用。

在本发明的一个实施方式中，所述植物发酵组合物被配置成10％的水溶液时，pH值为4.5-6.5。

根据本发明，“多糖”是指许多相同或不同的单糖以α-或β-糖苷键组成的化合物。

根据本发明，“甾醇类化合物”包括其骨架分为麦角甾醇类和胆甾醇类两种类型，有麦角甾醇(ergosterol)，麦角甾醇棕榈酸酯(ergosta-palmitate)；麦角甾-7，22-二烯-3-酮(ergosta-7,22-dien-3-one)等。

根据本发明，由所述制备方法获得的植物发酵组合物，复合了莳萝和桦褐孔菌两种富含活性物质的植物，经本发明的制备方法加工后，发酵组合物含有丰富的莳萝油脑、佛手柑内酯、γ-谷甾醇、多糖、桦褐孔菌醇、栓菌酸、多种羊毛甾醇型三萜类化合物、低分子多酚类及多种氨基酸等营养成分，活性成分的透皮吸收性好，具有良好的激素分泌异常调节、抗氧化、防衰老、抑制5α-还原酶活性的特效成分，适用于化妆品，尤其是祛痘类化妆品的制造，可提供相应化妆品祛痘、抗氧化，促进皮肤新陈代谢的功效。

上述植物发酵组合物在制备化妆品中的应用。

在化妆品配制中，所述植物发酵组合物的用量没有特别的限定，可以根据化妆品的种类进行适当调整。所述植物发酵组合物的用量，在化妆品为100％质量时，可以为0.1-10wt％，尤其是2-8wt％。

可使用所述植物发酵组合物的化妆品种类为护肤类，例如，面膜，祛痘凝胶，美白霜、化妆水等。

一种化妆品组合物，其含有所述植物发酵组合物。这些化妆品组合物中，根据其种类，根据需要，还可以添加其他成分，例如，其他植物提取物、维生素、矿物质、防腐剂、乳化剂、增稠剂、色素、香料等。

在本发明的一个实施方式中，所述化妆品组合物是祛痘凝胶。以祛痘凝胶的质量为100％计，所述植物发酵组合物在其中的添加量为0.1-10wt％，优选为2-8wt％。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)莳萝和桦褐孔菌复配，莳萝含有丰富的葛缕酮、柠檬烯、莳萝油脑、佛手柑内酯、伞形花内酯金合欢醚即7-羟基香豆精金合欢醇醚、蜡、γ-谷甾醇等营养成分；桦褐孔菌含有植物纤维类多糖体，桦褐孔菌素、桦褐孔菌醇、多种氧化三萜类化合物、栓菌酸、多种羊毛甾醇型三萜类化合物、叶酸衍生物、芳香族的香草酸、丁香酸及γ羟基苯甲酸,还有单宁化合物、类固醇、生物碱类化合物、低分子多酚类及木质素类化合物等；采用莳萝和桦褐孔菌两种原料植物复配，结合两种植物化学成分的长处，使获得的功效物质更均衡，活性成分的透皮吸收性好，能够提供激素分泌异常调节、抗氧化、防衰老、抑制5α-还原酶活性的功效；

(2)以炮制、酶法和发酵多步骤联合处理，可极大提高最终发酵组合物中多糖和甾醇类化合物的得率，相较单一的方法或者溶剂提取法，在功效物质的组成和得率上更具有优势；

(3)制备工艺不采用有毒有害溶剂，酶解和发酵后获得的植物发酵组合物中不含有机溶剂，无需后续有机溶剂的脱除处理，可直接以水溶液的形式应用于产品配方中，不仅利于提高产品的安全性，也利于降低生产工艺的污染和能耗；

(4)本发明获得的植物发酵组合物，经过测试安全，在祛痘、促进皮肤新陈代谢,嫩肤防衰老等方面均有明显的效果，适合在化妆品中应用，尤其适合于护肤类产品中应用。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明实施方式作进一步地详细描述,但本发明的实施方式不限于此,对于未特别注明的工艺参数或条件,可参照常规技术进行。

以下实施例中所用试剂，如无特殊说明，均为可商购获得的常规常用试剂。

干燥植物的水含量测定方法参照《GB 5009.3-2010食品中水分的测定第一法直接干燥法》。

固形物的测定方法采用热重法，以鼓风干燥箱在(110±5)℃干燥3h后测定。

实施例1

(I)莳萝和桦褐孔菌的炮制处理

将5质量份莳萝(水分含量为0.7％)，加入1重量份的米醋拌匀，闷润至醋被吸尽后，置炒制容器内，用文火加热，炒干，取出直接粉碎至50目；取5质量份桦褐孔菌(水分含量为0.7％)，喷洒0.5重量份的黄酒拌匀，稍闷润，待酒被吸尽后，置炒制容器内，用文火加热，炒干，取出直接粉碎至50目；将莳萝粉末和桦褐孔菌粉末混合，得到约9.2质量份干粉，备用；

(II)酶解

取步骤(I)获得的8质量份炮制干粉与80质量份水，加入酶解釜中，以三乙醇胺调节pH至7.0；加入0.0016质量份复合酶A(0.0008质量份果胶酶Pectinex BE XXL和0.0008质量份淀粉酶Amylase AG XXL)，在40℃下反应4h；再加入0.0008质量份复合酶B(0.0004质量份纤维素酶Celluclast1.5L与0.0004质量份Protamex中性蛋白酶)，在60℃下反应6h。酶解反应全程保持50rpm/min搅拌状态，酶解反应结束后，降温至室温，离心获得酶解液，酶解液以90℃灭酶灭菌30min，得到66质量份酶解产物；

(III)发酵

将步骤(II)获得的66质量份酶解产物加入发酵罐中，加入0.0033质量份葡萄糖和0.066质量份尿素，121℃下进行蒸汽灭菌30min，冷却至室温，在无菌条件下接种纳豆芽孢杆菌，接种量为(2×10⁶)CFU/ml，和嗜酸乳杆菌，接种量为(5×10⁶)CFU/ml。升温至31℃，以30rpm/min搅拌，发酵48h；

(IV)后处理

将步骤(III)获得的发酵产物离心，得到60质量份发酵原液，以5000道尔顿微滤膜装置过滤，以90μw/cm²紫外灯辐照15min灭菌，加入0.36质量份山梨酸钾，获得60.36质量份植物发酵组合物1#。

经检测，植物发酵组合物1#的固形物含量3.5％，多糖浓度为5mg/ml，甾醇类化合物浓度为10mg/ml，10％水溶液的pH为4.5。

实施例2

(I)莳萝和桦褐孔菌的炮制处理

将2.5质量份莳萝(水分含量为0.6％)，加入0.75重量份的米醋拌匀，闷润至醋被吸尽后，置炒制容器内，用文火加热，炒干，取出直接粉碎至70目；取7.5质量份桦褐孔菌(水分含量为0.7％)，喷洒1.5重量份的黄酒拌匀，稍闷润，待酒被吸尽后，置炒制容器内，用文火加热，炒干，取出直接粉碎至70目；将莳萝粉末和桦褐孔菌粉末混合，得到约9.3质量份干粉，备用；

(II)酶解

取步骤(I)获得的9质量份炮制干粉与135质量份水，加入酶解釜中，以三乙醇胺调节pH至7.5；加入0.045质量份复合酶A(0.015质量份果胶酶Pectinex BE XXL和0.03质量份淀粉酶Amylase AG XXL)，在55℃下反应8h；再加入0.0225质量份复合酶B(0.005625质量份纤维素酶Celluclast1.5L与0.016875质量份Protamex中性蛋白酶)，在70℃下反应12h。酶解反应全程保持150rpm/min搅拌状态，酶解反应结束后，降温至室温，离心获得酶解液，酶解液以95℃灭酶灭菌15min，得到124质量份酶解产物；

(III)发酵

将步骤(II)获得的124质量份酶解产物加入发酵罐中，加入0.0186质量份葡萄糖和0.248质量份尿素，121℃下进行蒸汽灭菌30min，冷却至室温，在无菌条件下接种纳豆芽孢杆菌，接种量为(5×10⁸)CFU/ml，和嗜酸乳杆菌，接种量为(10×10⁸)CFU/ml。升温至35℃，以50rpm/min搅拌，发酵72h；

(IV)后处理

将步骤(III)获得的发酵产物离心，得到118质量份发酵原液，以5000道尔顿微滤膜装置过滤，以180μw/cm²紫外灯辐照5min灭菌，加入1.18质量份苯甲酸钠，获得119.18质量份植物发酵组合物2#。

经检测，植物发酵组合物2#的固形物含量5.5％，多糖浓度为20mg/ml，甾醇类化合物浓度为25mg/ml，10％水溶液的pH为6.5。

实施例3

(I)莳萝和桦褐孔菌的炮制处理

将4质量份莳萝(水分含量为0.5％)，加入1重量份的米醋拌匀，闷润至醋被吸尽后，置炒制容器内，用文火加热，炒干，取出直接粉碎至60目；取6质量份桦褐孔菌(水分含量为0.5％)，喷洒0.9重量份的黄酒拌匀，稍闷润，待酒被吸尽后，置炒制容器内，用文火加热，炒干，取出直接粉碎至60目；将莳萝粉末和桦褐孔菌粉末混合，得到约9.4质量份干粉，备用；

(II)酶解

将步骤(I)获得的9.4质量份炮制干粉与112.8质量份水，加入酶解釜中，以氨甲基丙醇调节pH至7.2；加入0.0094质量份复合酶A(0.00376质量份果胶酶Pectinex BE XXL和0.00564质量份淀粉酶Amylase AG XXL)，在45℃下反应6h；再加入0.0094质量份复合酶B(0.00376质量份纤维素酶Celluclast 1.5L与0.00564质量份Protamex中性蛋白酶)，在65℃下反应8h。酶解反应全程100rpm/min搅拌状态，酶解反应结束后，降温至室温，离心获得酶解液，酶解液以92℃灭酶灭菌20min，得到98.54质量份酶解产物；

(III)发酵

将步骤(II)获得的98.54质量份酶解产物加入发酵罐中，加入0.009854质量份葡萄糖和0.14781质量份尿素，121℃下进行蒸汽灭菌30min，冷却至室温，在无菌条件下接种纳豆芽孢杆菌，接种量为(3×10⁷)CFU/ml，和嗜酸乳杆菌，接种量为(5×10⁷)CFU/ml。升温至32℃，以40rpm/min搅拌，发酵56h；

(IV)后处理

将步骤(III)获得的发酵产物离心，得到91.5质量份发酵原液，以5000道尔顿微滤膜装置过滤，以120μw/cm²紫外灯辐照10min灭菌，加入0.732质量份山梨酸钾，获得92.232质量份植物发酵组合物3#。

经检测，植物发酵组合物3#的固形物含量4.0％，多糖浓度为15mg/ml，甾醇类化合物浓度为20mg/ml，10％水溶液的pH为5.0。

实施例4

(I)莳萝和桦褐孔菌的炮制处理

将3质量份莳萝(水分含量为0.65％)，加入0.66重量份的米醋拌匀，闷润至醋被吸尽后，置炒制容器内，用文火加热，炒干，取出直接粉碎至55目；取7质量份桦褐孔菌(水分含量为0.65％)，喷洒1.5重量份的黄酒拌匀，稍闷润，待酒被吸尽后，置炒制容器内，用文火加热，炒干，取出直接粉碎至55目；将莳萝粉末和桦褐孔菌粉末混合，得到约9.1质量份干粉，备用；

(II)酶解

将步骤(I)获得的9.1质量份炮制干粉与91质量份水，加入酶解釜中，以氢氧化钠调节pH至7.3；加入0.0182质量份复合酶A(0.0091质量份果胶酶PectinexBE XXL和0.0091质量份淀粉酶Amylase AG XXL)，在45℃下反应7h；再加入0.01365质量份复合酶B(0.00455质量份纤维素酶Celluclast 1.5L与0.0091质量份Protamex中性蛋白酶)，在68℃下反应8h。酶解反应全程保持120rpm/min搅拌状态，酶解反应结束后，降温至室温，离心获得酶解液，酶解液以92℃灭酶灭菌25min，得到78.5质量份酶解产物；

(III)发酵

将步骤(II)获得的78.5质量份酶解产物加入发酵罐中，加入0.00628质量份葡萄糖和0.0942质量份尿素，121℃下进行蒸汽灭菌30min，冷却至室温，在无菌条件下接种纳豆芽孢杆菌，接种量为(9×10⁶)CFU/ml，和嗜酸乳杆菌，接种量为(9×10⁶)CFU/ml。升温至32℃，以45rpm/min搅拌，发酵60h；

(IV)后处理

将步骤(III)获得的发酵产物离心，得到70质量份发酵原液，以5000道尔顿微滤膜装置过滤，以150μw/cm²紫外灯辐照8min灭菌，加入0.56质量份山梨酸钾，获得70.56质量份植物发酵组合物4#。

经检测，植物发酵组合物4#的固形物含量4.7％，多糖浓度为18mg/ml，甾醇类化合物浓度为22mg/ml，10％水溶液的pH为5.1。

对比实施例5

无炮制步骤，其余步骤和条件同实施例1。

得到植物发酵组合物5#，经检测，植物发酵组合物5#的固形物含量1.2％，多糖浓度为4mg/ml，甾醇类化合物浓度为2mg/ml，10％水溶液的pH为4.8。

对比实施例6

无酶解步骤，其余步骤和条件同实施例1。

得到植物发酵组合物6#，经检测，植物发酵组合物6#的固形物含量2.5％，多糖浓度为2mg/ml，甾醇类化合物浓度为1.5mg/ml，10％水溶液的pH为5.8。

对比实施例7

无发酵步骤，其余步骤和条件同实施例1。

得到组合物7#，经检测，组合物7#的固形物含量1.6％，多糖浓度为4mg/ml，甾醇类化合物浓度为3mg/ml，10％水溶液的pH为5.0。

对比实施例8

无炮制、酶解、发酵步骤，分别以水、水-乙醇(体积比1:1)、水-丙二醇(体积比1:1)为溶剂，采用5质量份莳萝和5质量份桦褐孔菌(水分含量皆为0.7％)，以料液比为1:10，按照常规工艺进行提取，同样以5000道尔顿微滤膜装置过滤，得到组合物8#、9#、10#。

经检测，8#的多糖浓度为0.4mg/ml，甾醇类化合物浓度为1.2mg/ml。

9#的多糖浓度为0.7mg/ml，甾醇类化合物浓度为2.9mg/ml。

10#的多糖浓度为1.2mg/ml，甾醇类化合物浓度为2.8mg/ml。

以上各实施例中所制备的组合物及其编号沿用于以下各实施例和实验中。

应用实施例9

在祛痘凝胶中的应用,如表1-2所示：

表1

表2

其中，本发明祛痘凝胶A-D所述的植物发酵组合物分别为实施例1-4所得的植物发酵组合物1#、2#、3#、4#，祛痘凝胶E所述的植物发酵组合物为实施例4所得的植物发酵组合物4#；祛痘凝胶a-f所述的组合物分别为对比实施例5-8所得的组合物5#、6#、7#、8#、9#、10#。

本发明的功效评估

1、植物发酵组合物的5α-还原酶抑制活性

步骤1：植物发酵组合物5α-还原酶的制备：

取3只雌性SD大鼠(体重300g左右)，禁食一夜后取肝脏，静脉灌流并浸入PBS 7.2液中，洗净后每份1g左右，在冰台上剪碎(2mm大小)，加10倍体积的PBS 7.2液，冰浴中用ULTRA-TURRAX匀浆机以12000rpm/min匀浆三次，每次5秒，间隔30秒。操作过程中应保持低温，所用试剂和用品也须低温。将匀浆液用高速离心机12000rpm/min×25min离心，小心提取上清液，得线粒体后上清液。将线粒体后上清液用超速离心机100000rpm/min×1h离心，倒掉上清，将沉淀重悬于PBS(含30％甘油，1∶5(v/v))，得微粒体悬浊液。置于-70℃冰箱保存备用.

步骤2：酶活性的测定：

5α-还原酶催化睾酮转变为二氢睾酮过程中需要辅酶NADPH的参与。还原型NADPH在340nm处有特征吸收，随着反应的进行NADPH将转变为氧化型NADP+，其340nm波长处的特征吸收消失。根据反应过程中NADPH在340nm波长处的特征吸收变化，可得知5α-还原酶的抑制效果。

(I)空白对照的测定：反应管中加入Buffer 2ml，睾酮100μl，PBS 200μl，辅酶NADPH15μl，最后加入15μl 5α-还原酶，混合后测定A340nm值，37℃孵育，反应10min后测定A340nm值。扣除NADPH空白对照下降本底值，测出DMSO空白下降值(ΔA0)。在实验开始和结束时各重复三次。

(II)组合物样品的测定：反应管中加入Buffer 2ml，睾酮100μl，组合物样品(初始浓度为10^-5mol/L，如果抑制率＞50％，则向下稀释)200μl，NADPH 15μl，最后加入15μl酶，混合后测定A340nm值，37℃孵育，反应10min后测定A340nm值。扣除NADPH空白对照下降本底值，测出抑制剂下降值(ΔAn)。以爱普列特为阳性药，计算酶的抑制率。实验重复三次。

计算公式：I(％)＝(ΔA0-ΔAn)/ΔA0×100％

(III)结果判断：如果在10^-5mol/L浓度下受试样品的抑制率.＞50％，可认为受试样品具有较强的5α-还原酶抑制活性，可进行下一步骤，则受试样品浓度稀释10倍，再次进行抑制活性的测定，依此类推。

步骤3：组合物样品对老鼠5α-还原酶的抑制活性

各受试组合物对老鼠5α-还原酶的抑制活性试验结果见下表3。

表3

本实验选爱普列特为参照物。

结果表明，各受试组合物均有不同程度的5α-还原酶抑制活性，其中组合物1#、2#、3#和4#在浓度为10^-5mol/L时对5α-还原酶的抑制率均大于50％，说明有较好的5α-还原酶抑制活性。组合物1#、2#、3#和4#在浓度为10^-5mol/L时对5α-还原酶的抑制率与爱普列特相当。

组合物5#、6#和7#是缺少炮制、酶解、发酵三个步骤中的一个步骤所制得的组合物，在浓度为10^-5mol/L时对5α-还原酶的抑制率均小于10％，抑制活性较弱。可见，炮制、酶解、发酵是三个关键步骤，经三个步骤得到的发酵组合物对5α-还原酶活性的抑制作用影响显著。

组合物8#、9#和10#是用常规水提醇提得到的组合物，在浓度为10^-5mol/L时对5α-还原酶活性的抑制率均小于10％，抑制活性较弱。可见本发明制备方法与常规提取方法相比，得到的组合物在功效方面有明显的提升。

2、本发明祛痘凝胶的人群测试

人群试用调查

为测试产品的实际使用效果,对祛痘凝胶A-E与祛痘凝胶a-f制得的样品分别进行了人群试用调查，派发样品给550名有痘患者试用，年龄15-36岁，受试者随机均分为11组，试用1个月,同时填写调查问卷,最后统计结果。

分级判定的标准：显著有效:痊愈或皮损消退>60％、有效:皮损消退20％～60％、无效:皮损消退<20％或加重、人群试用调查结果如表4所示：

表4

试用结果	显著有效/例	有效/例	无效/例
				祛痘凝胶A	41	9	0
祛痘凝胶B	46	4	0
				祛痘凝胶C	43	7	0
祛痘凝胶D	44	6	0
				祛痘凝胶E	44	6	0
祛痘凝胶a	1	26	23
				祛痘凝胶b	0	15	35
祛痘凝胶c	2	27	21
				祛痘凝胶d	0	17	33
祛痘凝胶e	0	14	36
				祛痘凝胶f	0	25	25

人群试用结果表明,祛痘凝胶A-E能显著地抑制和去除痘痘，这与5α-还原酶抑制活性试验结果相符。

由上述表4数据可知，受试者使用本发明的祛痘凝胶一个月，显著改善症状可达82.00％(41例/50例×100％)。经问卷得知，本发明祛痘凝胶经使用后，没有刺激性，安全，无毒副作用。

由祛痘凝胶A-E与祛痘凝胶a-c对比可见，经过炮制、酶解、发酵三个步骤得到的发酵组合物应用到祛痘凝胶中的效果(显著有效≥41例)，比缺少一个步骤得到的组合物应用到祛痘凝胶的效果(显著有效≤2例)要好，可见，炮制、酶解、发酵是三个关键步骤，经三个步骤得到的发酵组合物对祛痘的作用影响显著。

由祛痘凝胶A-E与祛痘凝胶d-f对比可见,经过炮制、酶解、发酵三个步骤得到的发酵组合物应用到祛痘凝胶中的效果(显著有效≥41例)，要比常规水提、醇提法得到的组合物应用到祛痘凝胶的效果(显著有效0例)要好，可见本发明制备方法与常规提取方法相比，得到的组合物在功效方面有明显的提升。

由以上分析得知，使用本发明制备方法制备而得的植物发酵组合物应用到祛痘凝胶中，能够显著祛除痘痘。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.一种具有祛痘功效的植物发酵组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(I)、莳萝和桦褐孔菌的炮制处理；(II)、步骤(I)获得的炮制产物的酶解；(III)、步骤(II)获得的酶解产物的发酵。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(I)中的莳萝和桦褐孔菌，以干燥后质量计，莳萝和桦褐孔菌的质量比为：1:（1-3），优选为1:（1-2）；

优选所述莳萝和桦褐孔菌的含水量分别均≤1.5％。

3.如权利要求1-2任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(II)的酶解，采用果胶酶、淀粉酶、纤维素酶和蛋白酶；

优选采用果胶酶和淀粉酶混合而成的复合酶A进行第一步酶解，之后采用纤维素酶和蛋白酶混合而成的复合酶B进行第二步酶解；

优选复合酶A中，果胶酶和淀粉酶的质量比为1:(1-2)，复合酶B中，纤维素酶和蛋白酶的质量比为1:(1-3)；

优选，以步骤(I)炮制产物的干重计，复合酶A的用量为炮制产物的0.02-0.5％，复合酶B的用量为炮制产物的0.01-0.25％；

优选，以步骤(I)炮制产物的干重计，优选复合酶A的质量为炮制产物的0.1-0.5％；

优选，以步骤(I)炮制产物的干重计，优选复合酶B的质量为炮制产物的0.1-0.25％；

优选，以步骤(I)炮制产物的干重计，酶解反应混合物中，炮制产物与水的质量比为：1:（5-20），优选为1:（10-15）。

4.如权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(III)的发酵，采用芽孢杆菌和乳酸杆菌；

优选所述的芽孢杆菌为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus Bacillus)、纳豆芽孢杆菌(Bacillusnatto)、巨大芽孢杆(Bacillus megateriun)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)中的至少一种；

优选所述乳酸杆菌为嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、瑞士乳杆菌(lactobacillus helveticus)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)中的至少一种；

优选所述芽孢杆菌的接种量为(2×10⁶-5×10⁸)CFU/ml；

优选所述乳酸杆菌的接种量为(5×10⁶-10×10⁸)CFU/ml。

5.由权利要求1-4任一项所述的制备方法制备的植物发酵组合物。

6.如权利要求5所述的植物发酵组合物，其特征在于，所述植物发酵组合物中，多糖含量为5 -20mg/ml，甾醇类化合物含量为10 -25mg/ml。

7.权利要求5-6任一项所述的植物发酵组合物在制备化妆品中的应用，其特征在于，所述的化妆品为祛痘凝胶；所述植物发酵组合物的添加量为0.1-10wt％，优选为2-8wt％，以祛痘凝胶的质量为100％计。

8.一种化妆品组合物，其特征在于，含有权利要求5-6任一项所述的植物发酵组合物；优选在化妆品组合物为100％质量时，所述植物发酵组合物的含量为0.1-10wt％，尤其是2-8wt％。

9.如权利要求8所述的化妆品组合物，其特征在于，所述化妆品组合物为祛痘凝胶；优选在化妆品组合物为100％质量时，所述植物发酵组合物的含量为0.1-10wt％，尤其是2-8wt％。

10.一种祛痘凝胶，其特征在于，所述祛痘凝胶中含有权利要求5-6任一项所述的植物发酵组合物，以祛痘凝胶的质量为100％计，所述植物发酵组合物的添加量为0.1-10wt％，优选为2-8wt％。