CN108553391A - 一种具有祛皱功效的植物发酵组合物的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种由黑老虎和粉萆薢为原料经酶解和发酵获得的植物发酵组合物，其富含多种有效活性成分，具有能够增加纤维母细胞对维生素C的吸收，刺激胶原蛋白的合成；抑制金属蛋白酶(MMP‑2和MMP‑9)活性，防止细胞外基质成分的降解；中和自由基，具有良好的抗氧化性能；减缓皱纹深度，增加皮肤弹性，起到抗皱防皱的作用，适合在化妆品中应用，尤其适合于护发类产品中应用。

Description

一种具有祛皱功效的植物发酵组合物的制备方法
技术领域
本发明涉及化妆品领域,具体涉及一种具有祛皱功效的植物发酵组合物，即由黑老虎和粉萆薢两种植物为原料的植物发酵组合物，及其制备方法，与其在化妆品，尤其是祛皱类产品中的应用。
背景技术
黑老虎，为五味子科南五味子属常绿攀援藤本植物，拉丁学名为Kadsuracoccinea(Lem.)A.C.Smith，别名过山龙、钻地风等，主要分布于我国江西、湖南、福建、广西、四川、云南等地。果入药，味辛、微苦，性温。具有行气止痛、散瘀通络的功效，主要用于治疗风湿痹痛、跌打损伤、胃病及妇科病等。现代医学研究表明黑老虎具有抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、抗肝纤维化等作用。近年来，随着对其化学成分、药理活性等方面研究的逐步展开，发现其活性成分丰富，在抗肿瘤、抗病毒等方面显示出重要的潜在药用价值。
在1985年以前几乎没有关于黑老虎化学成分方面的文献报道，在此之后，国内外学者对黑老虎的化学成分进行了一系列研究，已经发现的化学成分主要包括木脂素类和三萜类，其次还有单萜类、倍半萜类、甾体类、氨基酸等成分，其中黑老虎中的木脂素类和三萜类化合物是近年来的研究热点。
黑老虎具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化、保肝、抗HIV、调节血脂等作用，黑老虎中维生素C含量丰富可促进胶原蛋白的形成，使皮肤光滑、美白、有弹性，防止皮肤出现皱纹老化，还具有抗氧化、抗衰老的作用，能够增加纤维母细胞对维生素C的吸收，从而刺激胶原蛋白的合成；抑制金属蛋白酶(MMP-2和MMP-9)活性，防止细胞外基质成分的降解；中和自由基，具有良好的抗氧化性能；减缓皱纹深度。
采用DPPH法测试黑老虎果实提取物中的花青素和多酚类成分的抗氧化作用，抗氧化能力：果皮总多酚提取物＞花色素提取物＞果肉多酚提取物。
粉萆薢，别名大萆薢、山畚箕、山薯，拉丁学名为Dioscorea tokoro Makino，为中亚热带植物，主要分布在福建龙岩、河南商城,贵州大方、浙江宁海一带。根状茎入药，味苦，性平，归肝、胃、膀胱经。
粉萆薢的根茎具较为广泛的药用价值,更重要的是其所含的薯蓣皂苷元是半合成体激素类药物的重要原料，在薯蓣皂苷元原料日趋紧缺的情况下，粉萆薢的开发利用价值亦变得越来越大。粉萆薢中含有薯蓣皂苷元，在人的肿瘤变化过程的初期发挥了重要作用。
粉萆薢，主要含有甾体类化合物，也有二芳基庚烷类，木脂素类，有机酸及脂类等化学成分。具有降压、降尿酸、抗炎镇痛、抗菌、提高免疫、抗肿瘤等药理作用。薯蓣皂苷元对黄金葡萄球菌、绿脓杆菌均有较强的抑制作用。
粉萆薢对应用到护肤类化妆品中有非常高的价值。
常规的醇提水提法提取黑老虎和粉萆薢得到的有效成分分子量高，难以透皮吸收，只能停留在皮肤表层作杀菌用，不能真正进入真皮层，无法达到促进胶原蛋白形成，也无法发挥其使皮肤光滑、美白、有弹性、防止皮肤出现皱纹老化的作用。
发酵是微生物在一定条件下进行生理活动，借助于酶的作用对有机物进行分解、转化取得C、N、维生素等各种营养及生长菌体，同时产生各种次级代谢产物，如：多糖体、氨基酸等的过程。与其他加工方式相比，发酵能够产生新的活性物质，降低毒性，改变功效，同时可能由于微生物的水解作用，使发酵产物更易被吸收。
发明内容
本发明的首要目的是提供一种具有祛皱功效的植物发酵组合物的制备方法。
本发明的再一目的是提供由所述制备方法获得的植物发酵组合物，该发酵组合物具有抗氧化、抗衰老的作用，能够增加纤维母细胞对维生素C的吸收，从而刺激胶原蛋白的合成；抑制金属蛋白酶(MMP-2和MMP-9)活性，防止细胞外基质成分的降解；中和自由基，具有良好的抗氧化性能；减缓皱纹深度,增加皮肤弹性，起到抗皱防皱的作用。
本发明的第三目的在于提供所述植物发酵组合物在制备化妆品中的应用，以及含有所述植物发酵组合物的化妆品组合物。
在本发明中，植物发酵组合物是指以黑老虎和粉萆薢为原料发酵制得。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种具有祛皱功效的植物发酵组合物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(I)黑老虎和粉萆薢的分段真空微波处理；
(II)步骤(I)获得的分段真空微波处理产物的酶解；
(III)步骤(II)获得的酶解产物的发酵。
根据本发明，步骤(I)中所述的黑老虎和粉萆薢，以干燥后质量计，黑老虎和粉萆薢的质量比为1:(1-3)，优选为1:(1-2)。
根据本发明，所述干燥是指采用本领域已知或常用的干燥方法，使黑老虎和粉萆薢的含水量分别均为2-10％，优选4-8％，例如5％，6％，7％等。
根据本发明，步骤(I)黑老虎和粉萆薢转移至真空微波炉内，进行分段真空微波处理；分段真空微波处理包括第一段真空微波处理和第二段真空微波处理，且第一段真空微波处理和第二段真空微波处理是在同一个微波设备中，保持真空度为0.06-0.09MPa连续完成；其中，先进行第一段真空微波处理，即采用间歇微波处理，微波剂量0.2kw/kg，处理时间90min，维持微波炉腔体温度为30-40℃；然后进行第二段真空微波处理，即采用间歇微波处理，微波剂量2kw/kg，处理时间6-10min，维持微波炉腔体温度为160-200℃。
根据本发明，在分段真空微波处理前，可采用本领域中常用的粉碎方法，将黑老虎和粉萆薢粉碎，以提高分段真空微波处理效率。所述粉碎方法包括但不限于，研磨、剪切、超声等。在本发明的一个实施方式中，黑老虎和粉萆薢被粉碎为60-80目。
根据本发明，在分段真空微波处理后，所得分段真空微波处理产物可直接用于后续步骤。
发明人意外发现，分段真空微波处理对后续酶解和发酵的效率有较大影响，尤其对获得的发酵组合物中的多糖体和维生素类化合物的得率有较大影响。不受特殊理论的限制，由于植物纤维结构复杂,降低了酶与纤维素的有效接触，不利于酶解和发酵的进行，推测其可能的原因是经过分段真空微波处理，由于微波频率与化学基团的旋转振动频率接近,可用以改变分子的构象,有选择的活化某些反应基团,促进化学反应,抑制副反应，又或者是细胞中的水分快速汽化,形成向外扩散的蒸汽压作用于细胞壁,并在纹孔膜等薄弱环节形成突破,造成纹孔膜破裂；另据本发明人实验验证得知，黑老虎和粉萆薢的含水量分别均为2-10％时，得到的发酵组合物的功效最佳，推测可能是一定量的含水量有利于分段真空微波处理效果，从而有利于后续酶解与发酵。
根据本发明，步骤(II)分段真空微波处理产物的酶解，采用果胶酶、淀粉酶、纤维素酶和蛋白酶。
根据本发明，采用果胶酶和淀粉酶混合而成的复合酶A进行第一步酶解，之后采用纤维素酶和蛋白酶混合而成的复合酶B进行第二步酶解。
根据本发明，复合酶A中，果胶酶和淀粉酶的质量比为1:(1-2)；复合酶B中，纤维素酶和蛋白酶的质量比为1:(1-3)。
以步骤(I)分段真空微波处理产物的干重计，复合酶A的质量为分段真空微波处理产物的0.02-0.5％，复合酶B的质量为分段真空微波处理产物的0.01-0.25％。
优选，以步骤(I)分段真空微波处理产物的干重计，复合酶A的质量为分段真空微波处理产物的0.1-0.5％。
优选，以步骤(I)分段真空微波处理产物的干重计，复合酶B的质量为分段真空微波处理产物的0.1-0.25％。
根据本发明，所述果胶酶、淀粉酶、纤维素酶和蛋白酶可以选用本领域中已商品化的各种果胶酶、淀粉酶、纤维素酶和蛋白酶。在本发明的一个实施方式中，所用果胶酶是诺维信公司的Pectinex BE XXL、Pectinex AFP XXL、Pectinex5XL、Pectinex SMASH XXL、Pectinex Ultra SP-L中的至少一种；所用淀粉酶是诺维信公司的Amylase AG XXL、Amylase AG 300L中的至少一种；所用纤维素酶是诺维信公司的Celluclast 1.5L；所用蛋白酶是诺维信公司的Protamex中性蛋白酶。
根据本发明，以步骤(I)分段真空微波处理产物的干重计，酶解反应混合物中，分段真空微波处理产物与水的质量比为：1:(5-20)，优选为1:(10-15)。
本领域技术人员可以根据所用酶的具体种类、用量等实际情况，调整每一步酶解反应的pH值、温度、时间等条件。
可以根据所用酶的酶活性最适宜的pH和温度，来调整酶解体系的pH和酶解温度。
根据本发明，采用复合酶A进行的第一步酶解，酶解温度为35-60℃，优选为40-55℃。
根据本发明，采用复合酶B进行的第二步酶解，酶解温度为55-75℃，优选为60-70℃。
可采用本领域常用的pH调节剂，调整酶解反应混合物的pH值，所述pH调节剂包括但不限于常用的各种有机酸、无机酸、有机碱、无机碱，例如：一乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、异丙醇胺、氨甲基丙醇、氢氧化钠、氢氧化钾、氨水中的一种或数种。在本发明的一个实施方式中，所述酶解反应混合物的pH值为6.5-8.0，优选为
7.0-7.5。
可以通过监测酶解物中总多糖体的含量来控制酶解时间。
步骤(II)的酶解处理有利于黑老虎和粉萆薢细胞壁的瓦解，释放出原生质，并产生多糖、氨基酸或寡肽，利于后续发酵。
在本发明的一个实施方式中，将步骤(I)获得的分段真空微波处理产物与水，按照料液质量比1:(10-15)加入酶解釜中，以pH调节剂调节pH至7.0-7.5；加入复合酶A，在40-55℃下反应4-8h；再加入复合酶B，在60-70℃下反应6-12h。酶解反应全程保持搅拌状态，酶解反应结束后，降温至室温，离心获得酶解液，酶解液灭酶灭菌后，获得酶解产物，也称为待发酵液。
在本发明的一个实施方式中，所述搅拌的速度为50-150rpm/min。
根据本发明，步骤(III)酶解产物的发酵，采用芽孢杆菌和乳酸杆菌。
所述的芽孢杆菌，优选为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus Bacillus)、纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megateriun)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)中的至少一种。
所述的乳酸杆菌，优选为嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、瑞士乳杆菌(lactobacillus helveticus)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)中的至少一种。
所述的芽孢杆菌的接种量为(2×106-5×108)CFU/ml。
所述的乳酸杆菌的接种量为(5×106-10×108)CFU/ml。
本领域技术人员可以根据需要，向酶解产物中添加碳源、氮源等发酵菌所需的培养基物质。在本发明的一个实施方式中，向酶解产物中添加葡萄糖作为碳源，葡萄糖的添加量为酶解产物质量的0.005-0.015％。在本发明的一个实施方式中，向酶解产物中添加尿素作为氮源，尿素的添加量为酶解产物质量的0.1-0.2％。
本领域技术人员可以根据所用发酵菌的种类和接种量，调整发酵的温度、时间等具体条件。
发酵温度没有特别限制，只要能进行发酵即可，通常为15-50℃，优选为20-45℃，更优选为30-40℃。发酵通常通过通气搅拌进行。在本发明的一个实施方式中，发酵温度为31-35℃，搅拌速度为30-50rpm/min。
步骤(III)的发酵有利于大分子物质的水解，生成易于透皮吸收的小分子营养物质，同时，可以把有害成分去除，极大提高发酵组合物中多糖体和维生素类化合物的得率。
在本发明的一个实施方式中，将步骤(II)获得的待发酵液加入发酵罐中，加入葡萄糖和尿素，灭菌，冷却至室温，在无菌条件下接种芽孢杆菌和乳酸杆菌复合菌，升温搅拌，发酵48-72h。
根据本发明，所述制备方法任选进一步包括步骤(IV)，对步骤(III)获得的发酵物的后处理。
本领域技术人员可采用本领域常用的固液分离方法，从步骤(III)发酵物中得到发酵原液。所述固液分离方法包括但不限于，离心、过滤等。
根据本发明，在得到发酵原液后，可采用本领域常用的精制方法，对所述发酵原液做进一步精制，例如采用离子交换树脂、活性炭柱或膜过滤等方法。精制后的产物可以直接作为原料用于后续的化妆品生产。
在本发明的一个实施方式中，采用膜过滤的方法，使用微滤膜分离获得分子量小于等于10000道尔顿，优选小于等于8000道尔顿，更优选小于等于5000道尔顿的物质。在本发明的一个实施方式中，所述的微滤膜分子量为8000道尔顿，截留分子量超过8000道尔顿的物质，获得所述的植物发酵组合物。在本发明的另一个实施方式中，所述的微滤膜分子量为5000道尔顿，截留分子量超过5000道尔顿的物质，获得所述的植物发酵组合物。
在本发明的一个实施方式中，将步骤(III)获得的发酵物固液分离，得到发酵原液，以分子量为5000～8000道尔顿的微滤膜过滤，紫外灭菌。
由上述制备方法获得的植物发酵组合物。
根据本发明，该植物发酵组合物具有抗氧化、抗衰老的作用，能够增加纤维母细胞对维生素C的吸收，从而刺激胶原蛋白的合成；抑制金属蛋白酶(MMP-2和MMP-9)活性，防止细胞外基质成分的降解；中和自由基，具有良好的抗氧化性能；减缓皱纹深度，增加皮肤弹性，起到抗皱防皱的作用。
根据本发明，所述植物发酵组合物中，还可以根据需要进一步含有防腐剂。所述防腐剂可以是本领域常用的防腐剂，例如包括但不限于羟苯甲酯、羟苯丙酯、苯氧乙醇、苯甲醇、苯乙醇、双(羟甲基)咪唑烷基脲、山梨酸钾、苯甲酸钠、氯苯甘醚、脱氢乙酸钠等中的一种或多种。在本发明的一个实施方式中，所用防腐剂为山梨酸钾。
根据本发明，优选所述植物发酵组合物的pH值为弱酸性，适于化妆品护发领域的应用。
在本发明的一个实施方式中，所述植物发酵组合物被配置成10％的水溶液时，pH值为4.5-6.5。
根据本发明，由所述制备方法获得的植物发酵组合物，复合了黑老虎和粉萆薢两种富含活性物质的植物，经本发明的制备方法加工后，发酵组合物含有丰富的维生素类化合物、多糖体、低分子多酚类及多种氨基酸等营养成分，活性成分的透皮吸收性好，从而刺激胶原蛋白生成，具有抗氧化，清除自由基，使皮肤光滑、美白、有弹性、防止皮肤出现皱纹的功效，适用于化妆品，尤其是祛皱类化妆品的制造，可提供相应化妆品祛皱、保湿、抗氧化作用，有嫩肤防衰老的功效。
上述植物发酵组合物在制备化妆品中的应用。
在化妆品配制中，所述植物发酵组合物的用量没有特别的限定，可以根据化妆品的种类进行适当调整。所述植物发酵组合物的用量，在化妆品为100％质量时，可以为0.1-10wt％，尤其是2-8wt％。
可使用所述植物发酵组合物的化妆品种类为护肤类，例如，面膜、祛皱精华乳、美白霜、保湿霜、化妆水等。
一种化妆品组合物，其含有所述植物发酵组合物。这些化妆品组合物中，根据其种类，根据需要，还可以添加其他成分，例如，其他植物提取物、维生素、矿物质、防腐剂、乳化剂、增稠剂、色素、香料等。
在本发明的一个实施方式中，所述化妆品组合物是祛皱精华乳。以祛皱精华乳的质量为100％计，所述植物发酵组合物在其中的添加量为0.1-10wt％，优选为2-8wt％。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)黑老虎和粉萆薢复配，黑老虎含有丰富的维生素C、木脂素类和三萜类，其次还有单萜类、倍半萜类、甾体类、氨基酸等成分；粉萆薢含有甾体类化合物，也有二芳基庚烷类，木脂素类，有机酸及脂类等化学成分；采用黑老虎和粉萆薢两种原料植物复配，结合两种植物化学成分的长处，使获得的功效物质更均衡，活性成分的透皮吸收性好，从而能够增加纤维母细胞对维生素C的吸收，刺激胶原蛋白的合成；抑制金属蛋白酶(MMP-2和MMP-9)活性，防止细胞外基质成分的降解；中和自由基，具有良好的抗氧化性能；减缓皱纹深度，增加皮肤弹性，起到抗皱防皱的作用；
(2)以分段真空微波处理、酶法和发酵多步骤联合处理，可极大提高最终发酵组合物中多糖体和维生素类化合物的得率，相较单一的方法或者溶剂提取法，在功效物质的组成和得率上更具有优势；
(3)制备工艺不采用有毒有害溶剂，酶解和发酵后获得的植物发酵组合物中不含有机溶剂，无需后续有机溶剂的脱除处理，可直接以水溶液的形式应用于产品配方中，不仅利于提高产品的安全性，也利于降低生产工艺的污染和能耗；
(4)本发明获得的植物发酵组合物，经过测试安全，在祛皱、促进皮肤新陈代谢,嫩肤防衰老等方面均有明显的效果，适合在化妆品中应用，尤其适合于祛皱防衰类产品中应用。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明实施方式作进一步地详细描述,但本发明的实施方式不限于此,对于未特别注明的工艺参数或条件,可参照常规技术进行。
以下实施例中所用试剂，如无特殊说明，均为可商购获得的常规常用试剂。
干燥植物的水含量测定方法参照《GB5009.3-2010食品中水分的测定第一法直接干燥法》。
固形物的测定方法采用热重法，以鼓风干燥箱在(110±5)℃干燥3h后测定。
本发明所述的SEPIPLUS265是赛比克公司的一款乳化增稠剂。
实施例1
(I)黑老虎和粉萆薢的分段真空微波处理
将5质量份黑老虎(水分含量为10％)和5质量份粉萆薢(水分含量为10％)粉碎至60目，然后转移至真空微波炉内，进行分段真空微波处理；分段真空微波处理包括第一段真空微波处理和第二段真空微波处理，且第一段真空微波处理和第二段真空微波处理是在同一个微波设备中，保持真空度为0.06MPa连续完成；其中，先进行第一段真空微波处理，即采用间歇微波处理，微波剂量0.2kw/kg，处理时间90min，维持微波炉腔体温度为30℃；然后进行第二段真空微波处理，即采用间歇微波处理，微波剂量2kw/kg，处理时间10min，维持微波炉腔体温度为160℃；得到约8质量份干粉，备用；
(II)酶解
将步骤(I)获得的8质量份分段真空微波处理干粉与80质量份水，加入酶解釜中，以三乙醇胺调节pH至7.0；加入0.0016质量份复合酶A(0.0008质量份果胶酶PectinexBEXXL和0.0008质量份淀粉酶Amylase AG XXL)，在40℃下反应4h；再加入0.0008质量份复合酶B(0.0004质量份纤维素酶Celluclast1.5L与0.0004质量份Protamex中性蛋白酶)，在60℃下反应6h。酶解反应全程保持50rpm/min搅拌状态，酶解反应结束后，降温至室温，离心获得酶解液，酶解液以90℃灭酶灭菌30min，得到66质量份酶解产物；
(III)发酵
将步骤(II)获得的66质量份酶解产物加入发酵罐中，加入0.0033质量份葡萄糖和0.066质量份尿素，121℃下进行蒸汽灭菌30min，冷却至室温，在无菌条件下接种纳豆芽孢杆菌，接种量为(2×106)CFU/ml，和嗜酸乳杆菌，接种量为(5×106)CFU/ml。升温至31℃，以30rpm/min搅拌，发酵48h；
(IV)后处理
将步骤(III)获得的发酵产物离心，得到60质量份发酵原液，以5000道尔顿微滤膜装置过滤，以90μw/cm2紫外灯辐照15min灭菌，加入0.36质量份山梨酸钾，获得60.36质量份植物发酵组合物1#。
经检测，植物发酵组合物1#的固形物含量3.2％，10％水溶液的pH为4.5。
实施例2
(I)黑老虎和粉萆薢的分段真空微波处理
将2.5质量份黑老虎(水分含量为2％)和7.5质量份粉萆薢(水分含量为2％)粉碎至80目，然后转移至真空微波炉内，进行分段真空微波处理；分段真空微波处理包括第一段真空微波处理和第二段真空微波处理，且第一段真空微波处理和第二段真空微波处理是在同一个微波设备中，保持真空度为0.09MPa连续完成；其中，先进行第一段真空微波处理，即采用间歇微波处理，微波剂量0.2kw/kg，处理时间90min，维持微波炉腔体温度为40℃；然后进行第二段真空微波处理，即采用间歇微波处理，微波剂量2kw/kg，处理时间6min，维持微波炉腔体温度为200℃；得到约9质量份干粉，备用；
(II)酶解
将步骤(I)获得的9质量份分段真空微波处理干粉与135质量份水，加入酶解釜中，以三乙醇胺调节pH至7.5；加入0.045质量份复合酶A(0.015质量份果胶酶Pectinex BE XXL和0.03质量份淀粉酶Amylase AG XXL)，在55℃下反应8h；再加入0.0225质量份复合酶B(0.005625质量份纤维素酶Celluclast1.5L与0.016875质量份Protamex中性蛋白酶)，在70℃下反应12h。酶解反应全程保持150rpm/min搅拌状态，酶解反应结束后，降温至室温，离心获得酶解液，酶解液以95℃灭酶灭菌15min，得到124质量份酶解产物；
(III)发酵
将步骤(II)获得的124质量份酶解产物加入发酵罐中，加入0.0186质量份葡萄糖和0.248质量份尿素，121℃下进行蒸汽灭菌30min，冷却至室温，在无菌条件下接种纳豆芽孢杆菌，接种量为(5×108)CFU/ml，和嗜酸乳杆菌，接种量为(10×108)CFU/ml。升温至35℃，以50rpm/min搅拌，发酵72h；
(IV)后处理
将步骤(III)获得的发酵产物离心，得到118质量份发酵原液，以5000道尔顿微滤膜装置过滤，以180μw/cm2紫外灯辐照5min灭菌，加入1.18质量份苯甲酸钠，获得119.18质量份植物发酵组合物2#。
经检测，植物发酵组合物2#的固形物含量5.3％，10％水溶液的pH为6.5。
实施例3
(I)黑老虎和粉萆薢的分段真空微波处理
将4质量份黑老虎(水分含量为6％)和6质量份粉萆薢(水分含量为5％)粉碎至70目，然后转移至真空微波炉内，进行分段真空微波处理；分段真空微波处理包括第一段真空微波处理和第二段真空微波处理，且第一段真空微波处理和第二段真空微波处理是在同一个微波设备中，保持真空度为0.07MPa连续完成；其中，先进行第一段真空微波处理，即采用间歇微波处理，微波剂量0.2kw/kg，处理时间90min，维持微波炉腔体温度为35℃；然后进行第二段真空微波处理，即采用间歇微波处理，微波剂量2kw/kg，处理时间8min，维持微波炉腔体温度为180℃；得到约9.4质量份干粉，备用；
(II)酶解
将步骤(I)获得的9.4质量份分段真空微波处理干粉与112.8质量份水，加入酶解釜中，以氨甲基丙醇调节pH至7.2；加入0.0094质量份复合酶A(0.00376质量份果胶酶PectinexBEXXL和0.00564质量份淀粉酶Amylase AG XXL)，在45℃下反应6h；再加入0.0094质量份复合酶B(0.00376质量份纤维素酶Celluclast1.5L与0.00564质量份Protamex中性蛋白酶)，在65℃下反应8h。酶解反应全程100rpm/min搅拌状态，酶解反应结束后，降温至室温，离心获得酶解液，酶解液以92℃灭酶灭菌20min，得到98.54质量份酶解产物；
(III)发酵
将步骤(II)获得的98.54质量份酶解产物加入发酵罐中，加入0.009854质量份葡萄糖和0.14781质量份尿素，121℃下进行蒸汽灭菌30min，冷却至室温，在无菌条件下接种纳豆芽孢杆菌，接种量为(3×107)CFU/ml，和嗜酸乳杆菌，接种量为(5×107)CFU/ml。升温至32℃，以40rpm/min搅拌，发酵56h；
(IV)后处理
将步骤(III)获得的发酵产物离心，得到91.5质量份发酵原液，以5000道尔顿微滤膜装置过滤，以120μw/cm2紫外灯辐照10min灭菌，加入0.732质量份山梨酸钾，获得92.232质量份植物发酵组合物3#。
经检测，植物发酵组合物3#的固形物含量4.3％，10％水溶液的pH为5.0。
实施例4
(I)黑老虎和粉萆薢的分段真空微波处理
将3质量份黑老虎(水分含量为7％)和7质量份粉萆薢(水分含量为8％)粉碎至65目，然后转移至真空微波炉内，进行分段真空微波处理；分段真空微波处理包括第一段真空微波处理和第二段真空微波处理，且第一段真空微波处理和第二段真空微波处理是在同一个微波设备中，保持真空度为0.08MPa连续完成；其中，先进行第一段真空微波处理，即采用间歇微波处理，微波剂量0.2kw/kg，处理时间90min，维持微波炉腔体温度为32℃；然后进行第二段真空微波处理，即采用间歇微波处理，微波剂量2kw/kg，处理时间7min，维持微波炉腔体温度为190℃；得到约9.1质量份干粉，备用；
(II)酶解
将步骤(I)获得的9.1质量份分段真空微波处理干粉与91质量份水，加入酶解釜中，以氢氧化钠调节pH至7.3；加入0.0182质量份复合酶A(0.0091质量份果胶酶PectinexBEXXL和0.0091质量份淀粉酶Amylase AG XXL)，在45℃下反应7h；再加入0.01365质量份复合酶B(0.00455质量份纤维素酶Celluclast 1.5L与0.0091质量份Protamex中性蛋白酶)，在68℃下反应8h。酶解反应全程保持120rpm/min搅拌状态，酶解反应结束后，降温至室温，离心获得酶解液，酶解液以92℃灭酶灭菌25min，得到78.5质量份酶解产物；
(III)发酵
将步骤(II)获得的78.5质量份酶解产物加入发酵罐中，加入0.00628质量份葡萄糖和0.0942质量份尿素，121℃下进行蒸汽灭菌30min，冷却至室温，在无菌条件下接种纳豆芽孢杆菌，接种量为(9×106)CFU/ml，和嗜酸乳杆菌，接种量为(9×106)CFU/ml。升温至32℃，以45rpm/min搅拌，发酵60h；
(IV)后处理
将步骤(III)获得的发酵产物离心，得到70质量份发酵原液，以5000道尔顿微滤膜装置过滤，以150μw/cm2紫外灯辐照8min灭菌，加入0.56质量份山梨酸钾，获得70.56质量份植物发酵组合物4#。
经检测，植物发酵组合物4#的固形物含量4.6％，10％水溶液的pH为5.1。
对比实施例5
无分段真空微波处理步骤，其余步骤和条件同实施例1。
得到植物发酵组合物5#，经检测，植物发酵组合物5#的固形物含量1.1％，10％水溶液的pH为4.8。
对比实施例6
无酶解步骤，其余步骤和条件同实施例1。
得到植物发酵组合物6#，经检测，植物发酵组合物6#的固形物含量2.4％，10％水溶液的pH为5.8。
对比实施例7
无发酵步骤，其余步骤和条件同实施例1。
得到组合物7#，经检测，组合物7#的固形物含量1.7％，10％水溶液的pH为5.0。
对比实施例8
无分段真空微波处理、酶解、发酵步骤，分别以水、水-乙醇(体积比1:1)、水-丙二醇(体积比1:1)为溶剂，采用5质量份黑老虎和5质量份粉萆薢(水分含量皆为0.7％)，以料液比为1:10，按照常规工艺进行提取，同样以5000道尔顿微滤膜装置过滤，得到组合物8#、9#、10#。
经检测，8#的固形物含量1.4％。
9#的固形物含量1.7％。
10#的固形物含量2.1％。
以上各实施例中所制备的组合物及其编号沿用于以下各实施例和实验中。
应用实施例9
在祛皱精华乳中的应用,如表1-2所示：
表1
表2
其中，本发明祛皱精华乳A-D所述的植物发酵组合物分别为实施例1-4所得的植物发酵组合物1#、2#、3#、4#，祛皱精华乳E所述的植物发酵组合物为实施例4所得的植物发酵组合物4#；祛皱精华乳a-f所述的组合物分别为对比实施例5-8所得的组合物5#、6#、7#、8#、9#、10#。
本发明的功效评估
1、植物发酵组合物的透明质酸酶抑制率
透明质酸酶抑制率大小在一定程度上反应了样品的抗炎活力，抑制率越高，抗炎活性越强。通过构建体外抑制透明质酸酶实验体系，评估本发明植物发酵组合物对透明质酸酶的抑制率。不同受试浓度下植物发酵组合物抑制透明质酸酶实验结果如表3所示。
表3
本实验选甘草酸二钾为参照物。
结果表明，各受试组合物均有不同程度的透明质酸酶抑制活性，其中组合物1#、2#、3#和4#在浓度为1％时对透明质酸酶抑制率达到50％，说明有较好的透明质酸酶抑制活性。
组合物5#、6#和7#是缺少分段真空微波处理、酶解、发酵三个步骤中的一个步骤所制得的组合物，在浓度为1％时对透明质酸酶的抑制率≤13％，抑制活性较弱。可见，分段真空微波处理、酶解、发酵是三个关键步骤，经过三个步骤得到的发酵组合物对透明质酸酶活性的抑制作用影响显著。
组合物8#、9#和10#是用常规水提醇提得到的组合物，在浓度为1％时对透明质酸酶活性的抑制率均小于10％，抑制活性较弱。可见本发明制备方法与常规提取方法相比，得到的组合物在功效方面有明显的提升。
2、本发明制备的祛皱精华乳抗皱功效，以下为测试结果。
测试方法：招募志愿者440人(年龄30至65岁)，每组40人，分别使用应用实施例9制备的祛皱精华乳，每天使用两次，每次半脸使用，连续使用28后采用德国CKMPA580弹性测试仪和美国CANFIELD公司VISIA皮肤分析测试仪测试使用精华乳前后皮肤弹性和皱纹深度的变化。每天早晚清洁面部后取适量以上精华乳均匀涂抹在左脸部，右边脸部不涂抹。使用样品28后使用MPA580弹性测试仪和VISIA皮肤分析测试仪测试左右两侧脸部皮肤弹性和皱纹深度的变化，进行对比分析，实验数据如表4：
从上表可以看出，使用祛皱精华乳A-E，28天后左侧脸部的皮肤弹性和皱纹深度情况相对与右侧未涂抹脸部有明显改善(≥23％)，且改善情况比使用祛皱精华乳a-f的效果要好(≤6.1％)。
祛皱精华乳a-c是添加缺少分段真空微波处理、酶解、发酵三个步骤中的一个步骤所制得的组合物的化妆品，使用28天后左侧脸部的皮肤弹性和皱纹深度改善情况均≤6.1％，效果不好。可见，分段真空微波处理、酶解、发酵是三个关键步骤，经过三个步骤得到的发酵组合物对皮肤弹性和皱纹深度改善作用影响显著。
祛皱精华乳d-f是添加用常规水提醇提得到的组合物的化妆品，使用28天后左侧脸部的皮肤弹性和皱纹深度改善情况均≤4.8％，效果较不好。可见本发明制备方法与常规提取方法相比，得到的组合物在功效方面有明显的提升。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (9)

1.一种具有祛皱功效的植物发酵组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(I)、黑老虎和粉萆薢的分段真空微波处理；
(II)、步骤(I)获得的分段真空微波处理产物的酶解；
(III)、步骤(II)获得的酶解产物的发酵。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(I)中的黑老虎和粉萆薢，以干燥后质量计，黑老虎和粉萆薢的质量比为：1:（1-3），优选为1:（1-2）；优选所述黑老虎和粉萆薢的含水量分别均为2-10％。
3.如权利要求1-2任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(II)的酶解，采用果胶酶、淀粉酶、纤维素酶和蛋白酶；
优选采用果胶酶和淀粉酶混合而成的复合酶A进行第一步酶解，之后采用纤维素酶和蛋白酶混合而成的复合酶B进行第二步酶解；
优选复合酶A中，果胶酶和淀粉酶的质量比为1:(1-2)，复合酶B中，纤维素酶和蛋白酶的质量比为1:(1-3)；
优选，以步骤(I)分段真空微波处理产物的干重计，复合酶A的用量为分段真空微波处理产物的0.02-0.5％，复合酶B的用量为分段真空微波处理产物的0.01-0.25％；
优选，以步骤(I)分段真空微波处理产物的干重计，优选复合酶A的质量为分段真空微波处理产物的0.1-0.5％；
优选，以步骤(I)分段真空微波处理产物的干重计，优选复合酶B的质量为分段真空微波处理产物的0.1-0.25％；
优选，以步骤(I)分段真空微波处理产物的干重计，酶解反应混合物中，分段真空微波处理产物与水的质量比为：1:（5-20），优选为1:（10-15）。
4.如权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(III)的发酵，采用芽孢杆菌和乳酸杆菌；
优选所述的芽孢杆菌为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus Bacillus)、纳豆芽孢杆菌(Bacillusnatto)、巨大芽孢杆(Bacillus megateriun)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)中的至少一种；
优选所述乳酸杆菌为嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、瑞士乳杆菌(lactobacillus helveticus)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)中的至少一种；
优选所述芽孢杆菌的接种量为(2×106-5×108)CFU/ml；
优选所述乳酸杆菌的接种量为(5×106-10×108)CFU/ml。
5.由权利要求1-4任一项所述的制备方法制备的植物发酵组合物。
6.权利要求5所述的植物发酵组合物在制备化妆品中的应用，其特征在于，所述的化妆品为祛皱精华乳；所述植物发酵组合物的添加量为0.1-10wt％，优选为2-8wt％，以祛皱精华乳的质量为100％计。
7.一种化妆品组合物，其特征在于，含有权利要求5所述的植物发酵组合物；优选在化妆品组合物为100％质量时，所述植物发酵组合物的含量为0.1-10wt％，尤其是2-8wt％。
8.如权利要求7所述的化妆品组合物，其特征在于，所述化妆品组合物为祛皱精华乳；优选在化妆品组合物为100％质量时，所述植物发酵组合物的含量为0.1-10wt％，尤其是2-8wt％。
9.一种祛皱精华乳，其特征在于，所述祛皱精华乳中含有权利要求5所述的植物发酵组合物，以祛皱精华乳的质量为100％计，所述植物发酵组合物的添加量为0.1-10wt％，优选为2-8wt％。
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