CN113813209B - 一种玫瑰花瓣发酵液及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种玫瑰花瓣发酵液及其制备方法和用途。所述方法包括步骤：(1)使发酵原浆进行第一次发酵得到初发酵液；(2)使初发酵液进行第二次发酵，得到玫瑰花瓣发酵液；所述发酵原浆通过玫瑰花瓣干粉与水混合而得到。
Description
技术领域
本发明涉及化妆品领域，尤其涉及一种玫瑰花瓣复合发酵工艺及其在化妆品中的应用。
背景技术
植物花瓣一般含有丰富多糖、蛋白质及多酚等功效成分而在化妆品中具有较大应用潜质。植物多糖具有保湿、抗氧化等功效，植物源多肽具有刺激胶原蛋白增生、抗衰老、抗氧化、增强皮肤的活力与弹性等作用。目前，生物发酵技术被广泛应用在化妆品原料生产过程中。但从现有技术看，存在微生物发酵活性低，发酵产物中活性成分浓度低、种类少，对植物花瓣利用不完全等缺陷。另外，在发酵过程中外加碳源和氮源，增加了带入风险物质的可能性，对发酵产物的使用安全性造成影响。发酵产物中葡萄糖的存在可能会与配方中的氨基酸发生美拉德反应，造成产品变色。葡萄糖在发酵中作为碳源使用,残留在发酵产物中会增加使用风险，如产品变色，糖基化反应等。
因此，本领域迫切需要提供一种有效提取植物花瓣中的多糖、多肽等有效成分的方法及其相关应用。
发明内容
本发明旨在提供一种玫瑰花瓣发酵液的制备方法及其相关应用。
在本发明的第一方面，提供一种玫瑰花瓣发酵液的制备方法，所述方法包括步骤：
(1)使发酵原浆进行第一次发酵得到初发酵液；和
(2)使初发酵液进行第二次发酵，得到玫瑰花瓣发酵液；
所述发酵原浆通过玫瑰花瓣干粉与水混合而得到。
在另一实施方式中，所述第一次发酵是将发酵原浆与酿酒酵母菌或乳酸杆菌接触。
在另一实施方式中，所述第二次发酵是将初发酵液与酿酒酵母菌、枯草芽孢杆菌或毕赤酵母菌接触。
在另一实施方式中，以所述发酵原浆的总重量计，第一次发酵中酿酒酵母菌或乳酸杆菌的使用量为0.5-5wt％。
在另一实施方式中，以所述初发酵液的总重量计，第二次发酵中酿酒酵母菌、枯草芽孢杆菌或毕赤酵母菌的使用量为0.5-5wt％。
在另一实施方式中，所述第一次发酵温度为25-45℃，发酵时间为24-200小时；优选温度为31℃-39℃，更优选温度为32℃-37℃；优选时间为24-140小时，更优选时间为24-100h小时。
在另一实施方式中，所述第二次发酵温度为25-45℃，发酵时间为12-120小时；优选温度为31℃-39℃，更优选温度为34℃-37℃；优选时间为12-70小时，更优选时间为24-50h小时。
在另一实施方式中，所述发酵原浆是经灭菌处理的。
在本发明的第二方面，提供一种如上所述的本发明提供的制备方法得到的玫瑰花瓣发酵液；以发酵原浆中的糖含量计，制得的玫瑰花瓣发酵液中的糖含量增加了60-400％；和/或
以所述玫瑰花瓣发酵液的总重量计，其中的糖含量超过1mg/mL；和/或
其中的多肽种类在100种以上。
在本发明的第三方面，提供一种如上所述的本发明提供的玫瑰花瓣发酵液的应用。
在另一实施方式中，所述应用为用于制备化妆品和/或护肤品。
据此，本发明提供了一种有效提取植物花瓣中的多糖、多肽等有效成分的方法及其相关应用。
附图说明
图1是本发明提供的玫瑰花瓣发酵液制备示意图。
图2是通过制备实施例2提供的玫瑰花瓣发酵液2的多肽分析谱图。
图3是通过本发明提供的方法制备得到的玫瑰花瓣发酵液的细胞毒性测试结果；其中，
A是空白对照，B是发酵前的，C是发酵后的。
具体实施方式
发明人经过广泛而深入的研究，提供一种不外部添加碳源、氮源，而能显著提高发酵产物中活性成分含量和多肽种类的复合发酵工艺，并将发酵产物应用在化妆或护肤产品中。在此基础上，完成了本发明。
如本文所用，“玫瑰(Rosa rugosa Thunb.)”是指一种蔷薇目，蔷薇科、蔷薇属的落叶灌木。枝杆多针刺，奇数羽状复叶，小叶5-9片，椭圆形，有边刺。花瓣倒卵形，重瓣至半重瓣，花有紫红色、白色，果期8-9月，扁球形。
如本文所用，“含糖量”是通过硫酸蒽酮法测定的多糖含量，硫酸蒽酮法包括步骤：使糖类遇浓硫酸脱水生成糠醛及其衍生物，该衍生物与蒽酮发生反应，反应后溶液呈蓝绿色，于620nm处有最大吸收。
玫瑰花瓣发酵液制备方法
本发明提供一种玫瑰花瓣发酵液，通过包括下述步骤的制备方法而获得：
第一步，使发酵原浆与酿酒酵母菌或乳酸杆菌接触，进行第一次发酵，得到初发酵液；
第二步，使初发酵液与酿酒酵母菌、枯草芽孢杆菌或毕赤酵母菌接触，进行第二次发酵，得到玫瑰花瓣发酵液。
上述本发明提供的方法中涉及的各种发酵菌种可以是本领域常规使用的，酿酒酵母菌包括下述的一种或两种以上：CICC1001、CICC1002，乳酸杆菌包括下述的一种或两种以上：CICC6159、CICC23941；枯草芽孢杆菌包括下述的一种或两种以上：CICC20643、ATCC6633、CMCC(B)63501。
在本发明的一种实施方式中，上述第一步和第二步中使用的菌种不同。
在本发明的一种实施方式中，上述方法中所述的与菌种接触包括但不限于，在发酵原浆或初发酵液中接种菌种、将发酵原浆或初发酵液与含有菌种的菌液混合等；在本发明的一个实施例中，所述发酵菌种的菌液浓度为106-109CFU/mL。
在本发明的一种实施方式中，上述第一步中的发酵原浆是将玫瑰花瓣干粉与水混合而得到；优选地，其中不包含其他物质。所述玫瑰花瓣干粉可以通过将冷冻干燥的玫瑰花瓣粉碎而得，干粉目数在10-50目范围内。在本发明的一个实施例中，以发酵原浆的总重量计，其中玫瑰花瓣干粉的含量在0.1-10wt％之间。
在本发明的一种较佳实施方式中，上述第一步中使用的发酵原浆已经灭菌处理，灭菌条件为在105℃-121℃下放置3-15分钟，冷却后在第一步中使用。
在本发明的一种实施方式中，上述第一步中以所述发酵原浆的总重量计，第一次发酵中酿酒酵母菌或乳酸杆菌的使用量为0.5-5wt％。
在本发明的一种实施方式中，上述第一步中的第一次发酵的温度在25-45℃之间，发酵时间在24-200小时之间；较佳地，温度在31℃-39℃之间；更佳地，温度在32℃-37℃之间；较佳地，发酵时间在24-140小时之间；更佳地，发酵时间在24-100h小时之间。
在本发明的一种实施方式中，上述第二步中使用的初发酵液中不加入其他物质，例如本领域常规使用的碳源和/或氮源，例如但不限于，葡萄糖、果糖等。
在本发明的一种实施方式中，上述第二步中以所述初发酵液的总重量计，第二次发酵中酿酒酵母菌、枯草芽孢杆菌或毕赤酵母菌的使用量为0.5-5wt％。
在本发明的一种实施方式中，上述第二步中的第一次发酵的温度在25-45℃之间，发酵时间在12-120小时之间；较佳地，温度在31℃-39℃之间；更佳地，温度在34℃-37℃之间；较佳地，发酵时间在12-70小时之间；更佳地，发酵时间在24-50h小时之间。
在本发明的一种实施方式中，将第二步得到的玫瑰花瓣发酵液进行后续处理，包括灭菌、过滤或离心。在本发明的一个实施例中，所述灭菌采用高温灭菌的方式；所述过滤包括通过孔径0.22μm的滤膜；所述离心转速为3000-11000rp/min(优选5000-11000rpm/min)。
本发明提供的上述方法利用酿酒酵母菌或乳酸杆菌有效利用发酵原浆中的营养物质，在不外加碳源和氮源的情况下，也能将玫瑰花瓣纤维素转化为小分子多糖，破坏植物细胞壁，将胞内蛋白质等物质释放出来，为第二步菌种发酵提供碳源和氮源，同时多糖和蛋白质作为发酵底物，在此基础上接种枯酿酒酵母菌、枯草芽孢杆菌或毕赤酵母菌进行第二次发酵，利用枯草芽孢杆菌发酵过程产生蛋白酶、端肽酶等，对玫瑰花瓣中蛋白质进行分解和修饰，产生不同序列的多肽。
玫瑰花瓣发酵液
通过本发明提供的方法获得的玫瑰花瓣发酵液与发酵原浆中的糖含量相较，其中的糖含量可增加60-400％。发酵原浆中多糖含量较低，发酵后花瓣纤维素转化为多糖，通过发酵前后多糖含量测定得到。
通过本发明提供的方法获得的玫瑰花瓣发酵液，以其总重量计，其中的糖含量超过1mg/mL。
通过本发明提供的方法获得的玫瑰花瓣发酵液可以多种形态存在，例如液体，也可以固体形态存在，如但不限于将获得的玫瑰花瓣发酵液进行冷冻干燥形成粉末、其他载体包裹的固体形态。
通过本发明提供的方法获得的玫瑰花瓣发酵液中有丰富的多肽种类(100种以上)，从而有利于刺激胶原蛋白增生，抚平皱纹，也具有加快表皮修复和再生及皮肤屏障结构与功能的重建。
玫瑰花瓣发酵液用途
通过本发明提供的方法获得的玫瑰花瓣发酵液可用于形成对皮肤有良好保养、修复、再生等功能的化妆品和/或护肤品。所述化妆品或护肤品可以是但不限于，柔肤水、营养感的化妆水、按摩膏、营养霜、面膜、精华、软膏、彩妆BASE、粉底霜、乳液、啫喱、面霜、喷雾等。
除非本说明书另有定义，此处所用的科学与技术词汇的含义与本领域技术人员所理解与惯用的意义相同。此外，在不和上下文冲突的情形下，本说明书所用的单数名词涵盖该名词的复数型；而所用的复数名词时亦涵盖该名词的单数型。
为使本领域技术人员可了解本发明的特点及效果，以下谨就说明书及权利要求书中提及的术语及用语进行一般性的说明及定义。除非另有指明，否则文中使用的所有技术及科学上的字词，均为本领域技术人员对于本发明所了解的通常意义，当有冲突情形时，应以本说明书的定义为准。
本文描述和公开的理论或机制，无论是对或错，均不应以任何方式限制本发明的范围，即本发明内容可以在不为任何特定的理论或机制所限制的情况下实施。
在本文中，所有以数值范围或百分比范围形式界定的特征，如数值、数量、含量与浓度仅是为了简洁及方便。据此，数值范围或百分比范围的描述应视为已涵盖且具体公开所有可能的次级范围及范围内的个别数值(包括整数与分数)。
本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，只要这些特征的组合不存在矛盾，所有可能的组合都应当认为是本说明书记载的范围。说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
本发明的主要优点在于：
1、本发明提供的制备方法中接种的两种菌种存在协同发酵功效，可显著增加发酵产物多肽的种类，提高多糖含量。
2、本发明提供的制备方法中发酵过程仅以玫瑰花瓣为原料，不另外添加碳源或氮源，保证发酵产物天然植物来源；经过复合发酵将玫瑰花瓣中的纤维素和蛋白质分别转化为多糖和小分子肽和寡肽，更有利于皮肤的吸收，提高了其利用度。以玫瑰花瓣为原料，通过两次发酵，发酵产物中多糖含量达到1.024mg/mL,多肽的种类由13种增加到135种；多糖测定按照硫酸蒽酮法进行，多肽含量测定使用茚三酮显色法。
3、本发明提供的制备方法获得的玫瑰花瓣发酵液具有促进Ⅰ型胶原蛋白表达的功效，应用在面膜配方中，使用含有2％玫瑰花瓣发酵液的面膜具有显著提亮和抚平皱纹的效果。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的，例如是指在100毫升的溶液中溶质的重量(克)。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
制备实施例中的菌种均购自中国工业微生物菌种保藏中心，酿酒酵母菌：CICC1002，乳酸杆菌：CICC6159，枯草芽孢杆菌：CICC20643，毕赤酵母菌：CICC 1688。
制备实施例
实施例1
将新鲜玫瑰花瓣冷冻干燥，粉碎成30-50目干粉。取玫瑰花瓣干粉2份，加水97份，获得发酵原浆液。将发酵原浆液于121℃下灭菌15分钟，冷却。接种酿酒酵母菌1份，32℃下厌氧发酵72小时；再接种枯草芽孢杆菌1份，37℃混合发酵48小时。灭菌，10000rpm/min离心，取上清液，得到玫瑰花瓣发酵液1。
实施例2
将新鲜玫瑰花瓣冷冻干燥，粉碎成30-50目干粉。取玫瑰花瓣干粉2份，加水97份，获得发酵原浆液。将发酵原浆液于121℃下灭菌15分钟，冷却。接种乳酸杆菌1份，32℃下发酵48小时；再接种酿酒酵母菌1份，37℃混合发酵48小时。灭菌，10000rpm/min离心，取上清液，得到玫瑰花瓣发酵液2。
对比例1
将新鲜玫瑰花瓣冷冻干燥，粉碎成30-50目的干粉。取玫瑰花干粉2份，加水97份，于121℃下灭菌15分钟。灭菌后的原液，冷却。同时接种酿酒酵母菌1份和枯草芽孢杆菌1份，于35℃下混合发酵120小时。灭菌，10000rpm/min离心，取上清液，得到对比液1。
对比例2
将新鲜花玫瑰花瓣冷冻干燥，粉碎成30-50目干粉。取玫瑰花干粉2份，加水97份，于121℃下灭菌15分钟，冷却。同时接种酿酒酵母菌1份和乳酸杆菌1份，于35℃混合发酵120h。灭菌，10000rpm/min离心，取上清液，得到对比液2。
对比例3
将新鲜玫瑰花瓣冷冻干燥，粉碎成30-50目干粉。取玫瑰花瓣干粉2份，加水97份，获得发酵原浆液。将发酵原浆液于121℃下灭菌15分钟，冷却。接种毕赤酵母菌1份，32℃下厌氧发酵72小时；再接种枯草芽孢杆菌1份，37℃混合发酵48小时。灭菌，10000rpm/min离心，取上清液，得到对比液3。
试验实施例
实施例1
多糖测定
主要材料：
蒽酮试剂
葡萄糖标准液
分光光度计
分析天平制备实施例中获得的玫瑰花瓣发酵液1、玫瑰花瓣发酵液2、对比液1、对比液2和对比液3
方法：硫酸蒽酮法测定的多糖含量，步骤包括：使糖类遇浓硫酸脱水生成糠醛及其衍生物，该衍生物与蒽酮发生反应，反应后溶液呈蓝绿色，于620nm处有最大吸收。
结果：见表1。
实施例2
多肽片段分析
取发酵液12000g离心10分钟，取上清用10KD超滤管过滤，取滤过液用C18柱进行除盐处理，除盐后的肽段溶液经离心浓缩仪抽干后，冻存于-20℃待测。
质谱分析使用SCIEX公司的TripleTOF 5600+液质联用系统进行。样品通过微升流速的液相Eksigent microLC 415系统进行分离。肽段样品经过上样缓冲液溶解，由自动进样器吸入后结合至C18捕获柱(5μm,300μm×5mm)，接着被洗脱至分析柱(3μm,300μm×15mm)进行分离。
流动相A:3％DMSO,0.1％甲酸,96.9％H2O，流动相B:3％DMSO,0.1％甲酸,96.9％ACN，液相的流速设置为5μL/min。流动相A和B按体积比1:1，质谱DDA模式分析时，每个扫描循环中包含一个MS全扫描(scan range 350–1500m/z,ion accumulation time 250ms)，以及随后的40个MS/MS扫描(scan range 100–1500m/z,ion accumulation time 50ms)。信号超过120cps的肽段离子(+2～+5)触发MS/MS扫描。MS/MS重复采集的排除时间设置为18s。
TripleTOF 5600+产生的质谱数据通过ProteinPilot(V4.5)进行检索，采用的数据库检索算法是Paragon。检索使用的数据库是UniProt中Rosaceae的蛋白质组参考数据库。
结果见表1和图2所示。
结果表明，本发明提供的发酵产物中肽的种类较多，其分子量主要集中在852Da-2032Da之间。肽种类多达135种，相较于发酵前(多肽十余种)，肽种类增加了约十倍。这主要是由于混合接力发酵过程中，两种菌协同作用，充分将花瓣中的蛋白质分解为小分子和寡肽片段。
表1
| 待测物 | 多糖含量mg/mL | 多肽种类 |
| 玫瑰花瓣发酵液1 | 0.997 | 130 |
| 玫瑰花瓣发酵液2 | 1.024 | 135 |
| 对比液1 | 0.644 | 69 |
| 对比液2 | 0.579 | 62 |
| 对比液3 | 0.4 | 68 |
实施例3
安全性测试
3.1刺激性测试
采用EpiSkinTM皮肤模型进行体外皮肤刺激性测试
预培养：将3D皮肤模型转移至装有2ml测试用培养基的12孔板中，二氧化碳培养箱培养24h。
加样：
取20％玫瑰花瓣发酵液(由制备实施例2的玫瑰花瓣发酵液2加水稀释得到)10mg于组织表面并涂匀。
样品处理与冲洗：加样后将组织在室温下放置15min，之后用DPBS(磷酸盐缓冲液)彻底冲洗以去除样品；用5％SDS(十二烷基环酸钠溶液)作阳性对照，磷酸缓冲液作阴性对照，每个处理重复3次。
受测试样品处理3D皮肤模型组织时间为15min(又称为暴露时间)，暴露时间结束后要将样品冲洗掉。接下来进行下一步孵育培养，阳性对照和阴性对照操作步骤与玫瑰花瓣发酵液的处理过程相同。
后孵育：将处理好的样品转入新的维持培养基中，在二氧化碳培养箱中培养42h。
细胞活性测试：用MTT法测试组织的细胞活性。
结果：见表2。
表2
| 产品名称/编号 | 处理方式 | 细胞活性 | 结果判定 |
| DPBS(NgC) | 10ul/15min | 100％ | 非刺激性物质 |
| 5％SDS(PC) | 10ul/15min | 8.4％ | 刺激性物质 |
| 20％玫瑰花瓣发酵液 | 10ul/15min | 90.7％ | 非刺激性物质 |
注：PC为阳性对照。
结果表明，20％的玫瑰花瓣发酵液细胞活性90.7％，为非刺激性物质。
3.2细胞毒性测试
基于真皮成纤维细胞的毒性测试
1.细胞接种：按0.8E4个/孔的接种密度接种细胞至96孔板，培养箱(37℃、5％CO2)中孵育过夜。
2.给药：待96孔板中细胞铺板率达到40％～60％时进行给药。空白对照组每孔加入200μL培养液；样品组每孔加入200μL含有相应浓度样品(由制备实施例2的玫瑰花瓣发酵液2)的培养液，给药完成后将96孔板放置在培养箱(37℃、5％CO2)中培养。
3.检测：细胞孵育培养24小时后，弃掉上清，加入MTT工作液(0.5mg/mL)，37℃避光孵育4h，孵育结束后，弃掉上清，每孔加150μLDMSO，在490nm处读取OD值。
4.细胞相对活力计算：根据公式计算，
细胞相对活力(％)＝样品孔OD/空白对照孔OD*100％。结果见图3。其中的空白对照为MEM基础培养基，发酵前和发酵后的样品由制备实施例2的玫瑰花瓣发酵前和发酵后得到。结果表明，从形态学上可看出，5％未发酵的玫瑰提取液有轻微细胞毒性，细胞形态出现一些变化；与之相比5％的发酵液，形态上无变化而数量上有所增加，因此本发明提供的玫瑰花瓣发酵液对真皮成纤维细胞无毒性且对该细胞生长有一定促进作用。
实施例4
功效测试
4.1DPPH自由基清除活性测试
试验方法:DPPH甲醇溶液为紫罗兰色，在517nm下有强的吸光值，若与样品结合会降低在517nm下的吸光值，由此借以判断样品清除自由基能力。
试剂：DPPH甲醇溶液：取7.88mg DPPH用甲醇定容到100mL，暗处存放。
Vc溶液(0.1mg/mL)：精确称取10mg抗坏血酸，定容到100mL。
配置不同浓度的玫瑰花瓣发酵液(由制备实施例2的玫瑰花瓣发酵液2加水稀释得到)，并与Vc作对比，考察玫瑰花瓣发酵液对DPPH自由基的清除率。
结果：见表3。
表3
| 试样 | DPPH自由基清除率 |
| 0.25％玫瑰花瓣发酵液 | 71.52％ |
| 0.5％玫瑰花瓣发酵液 | 95.66％ |
| 1.25％玫瑰花瓣发酵液 | 96.78％ |
| 0.002％VC溶液 | 93.60％ |
结果表明，0.25％的玫瑰花瓣发酵液具有较好的DPPH自由基清除率，0.5％的玫瑰花瓣发酵液对DPPH自由基的清除率已经超过0.002％Vc的效果。说明该工艺获得的玫瑰花瓣发酵液具有较好的DPPH自由基清除率。
4.2Ⅰ型胶原蛋白测试
以成纤维细胞为检测模型，通过免疫荧光(IF)法跟踪Ⅰ型胶原蛋白的表达量。
细胞接种：按2.5E4个/孔的接种密度接种细胞至24孔板，培养箱(37℃、5％CO2)中孵育过夜。
给药：根据实验方案，待24孔板中细胞铺板率达到20％～30％时，进行分组给药，每孔加样1mL，每组设3个复孔。给药完成后将24孔板放置在培养箱(37℃、5％CO2)中培养24h。
收样：孵育培养结束后，吸弃旧液，1mL/孔PBS清洗三次，每孔加1mL 4％的多聚甲醛室温固定爬片15min。固定结束后将24孔板放置于4℃下保存备用。
封闭：滴加山羊血清200μL/孔，室温封闭60min。
孵育一抗：弃掉山羊血清封闭液，滴加适当比例稀释后的一抗(200μL/孔)(山羊血清稀释)，4℃孵育过夜。
孵育二抗：用PBS清洗3次/5min，滴加适当比例稀释后的荧光二抗(200μL/孔)，室温避光孵育1h。
核染：用PBS清洗3次/5min，滴加Hochest33342(200μL/孔)，室温孵育5min。
封片：用针头挑出爬片，在载玻片上滴加一滴抗淬灭剂并将爬片反放与载玻片上。
观察拍照：24h内荧光显微镜拍照。
结果：见表4。
表4
| 待测物 | Mean(平均值) | Sd(偏差) | P-value |
| BC | 1 | 0.298 | / |
| PC | 6.639 | 0.618 | 0 |
| 0.25％玫瑰花瓣发酵液 | 1.197 | 0.338 | 0.492 |
| 0.50％玫瑰花瓣发酵液 | 2.579 | 0.272 | 0.002 |
注：BC为空白对照(PBS)，PC为阳性对照(TGF-β1)，所用的玫瑰花发酵液由制备实施例2得到；其中，
0.25％玫瑰花瓣发酵液：0.25份玫瑰花瓣发酵液与99.75份去离子水稀释得到。
其他类推。
结果表明，0.5％的玫瑰花瓣发酵液能显著提高Ⅰ性胶原蛋白的表达量，在护肤产品中具有很大应用潜质。
应用实施例
将玫瑰花瓣发酵液(由制备实施例2的玫瑰花瓣发酵液2)应用在面膜产品中，考察玫瑰花瓣发酵液的应用效果。
A相：去离子水49.78份，二丙二醇3份，甘油聚醚-26 0.8份，PEG/PPG-17/6共聚物0.5份，海藻糖0.3份，对羟基苯乙酮0.2份，EDTA-2Na 0.01份，D-泛醇0.5份
DC 2501 0.3份，甘油5份，聚丙烯酸钠0.02份
B相：去离子水20份，丙烯酰二甲基牛磺酸铵/VP共聚物0.05份，透明质酸钠0.01份，汉生胶T 0.08份
C相：去离子水10份，卡波姆-941 0.1份
D相：去离子水5份，羟乙基纤维素0.05份
E相：去离子水2份，氨丁三醇0.1份
F相：1,3丁二醇2份，辛甘醇0.05份，辛基十二醇聚醚-16 0.1份，乙基己基甘油0.04份
香精0.01份
将B相混合后加热到50℃，搅拌均匀加入A相，搅拌均匀。加入C相、D相，搅拌均匀，冷却至30℃，加入E相和F相，搅拌均匀。最后1#配方添加2份的去离子水，搅拌均匀。2#配方添加1份玫瑰花瓣发酵液(由制备实施例2的玫瑰花瓣发酵液2)和1份去离子水，搅拌均匀。3#配方添加2份的玫瑰花瓣发酵液(由制备实施例2的玫瑰花瓣发酵液2)，搅拌均匀。
以30名志愿者为使用对象，每2天使用一次，使用7次后进行统计，计分规则：细纹改善值1-5分，得分越大代表抚平皱纹效果越明显。提亮分值1-5分，得分越大代表提亮效果越明显。紧致感分值1-5分，得分越高分代表紧致感越明显。计算平均值和方差，用t检验对测试结果进行统计分析，p值<0.05。
结果：见表5。
表5
| 测试项目 | 1# | 2# | 3# |
| 水润感 | 4.26 | 4.48 | 4.38 |
| 提亮 | 3.85 | 4.05 | 4.45* |
| 紧致感 | 3.78 | 3.98 | 4.05 |
| 细纹改善 | 3.91 | 4.22* | 4.45* |
注：*p<0.05，与1#样品比，有显著差异。
结果表明，长期使用添加2％玫瑰发酵液的面膜，具有明显的提亮和抚平皱纹的功效。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。
Claims (10)
1.一种玫瑰花瓣发酵液的制备方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(1)在发酵原浆中接种酿酒酵母菌进行第一次发酵得到初发酵液；所述发酵为厌氧发酵，以所述发酵原浆的总重量计，第一次发酵中酿酒酵母菌的使用量为0.5-5 wt%，发酵温度32℃-37℃，发酵时间24-100小时；
(2)在初发酵液中接种枯草芽孢杆菌进行第二次发酵，得到玫瑰花瓣发酵液；以所述初发酵液的总重量计，第二次发酵中枯草芽孢杆菌的使用量为0.5-5wt%，发酵温度34℃-39℃，发酵时间12-70小时；
所述发酵原浆通过玫瑰花瓣干粉与水混合而得到；
并且，步骤(1)和步骤(2)均不外加碳源和氮源。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述第一次发酵中，发酵温度为32℃。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述第二次发酵中，发酵温度为34℃-37℃。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述第一次发酵中，发酵时间为72-100小时。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述第一次发酵中，发酵时间为72小时。
6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述第二次发酵中，发酵时间为24-50小时。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述第二次发酵中，发酵时间为48小时。
8.如权利要求1-7任一项所述的制备方法，其特征在于，所述发酵原浆是经灭菌处理的。
9.一种如权利要求1-8任一项所述的制备方法得到的玫瑰花瓣发酵液；以发酵原浆中的糖含量计，制得的玫瑰花瓣发酵液中的糖含量增加了60-400%；和/或
以所述玫瑰花瓣发酵液的总重量计，其中的糖含量超过1mg/mL；和/或
其中的多肽种类在100种以上。
10.一种如权利要求9所述的玫瑰花瓣发酵液在制备化妆品和/或护肤品中的应用。
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