CN116270386B - 一种藏红花发酵滤液的制备方法及其应用 - Google Patents

一种藏红花发酵滤液的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种藏红花发酵滤液的制备方法，所述制备方法包括：S01藏红花提取物：称取藏红花柱头、藏红花花瓣，经研磨、过筛后，置于萃取釜内，采用超临界CO2萃取方法，得到藏红花提取物；S02藏红花酶解：称取藏红花花瓣，放置于恒温干燥箱内干燥后磨碎成粉，加水并调至合适的pH值后，加入复合酶，置于水浴中恒温酶促反应，得到藏红花酶解提取物；S03藏红花发酵：本发明采用制备工艺组合的方式，得到的滤液更具有良好的吸收性；同时具有舒缓、紧致、淡纹、抗皱、润泽的效果。

Description

一种藏红花发酵滤液的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及A61K技术领域，尤其是涉及一种藏红花发酵滤液的制备方法及其应用。
背景技术
藏红花又名西红花、番红花，是鸢尾科番红花属多年生草本植物，在世界上其种植主要分布在中亚和欧洲等地，藏红花主要被用作香水、染料、香料以及药用。
藏红花的活性部位通常特指其柱头藏红花柱头含有水、含氮物质、糖、可溶性提取物、精油、纤维和灰分，还包括磷、镁、钙、铁、钾和钠在内的不少矿物质。
藏红花柱头的化学成分主要包括类胡萝卜素类、单萜、黄酮类和酚酸类。另外，藏红花花瓣挥发性成分包含了烷烃、酮、酸、醇、醛、酯类和芳香化合物，主要是酯类和酸类。藏红花中酸类物质具有抑制诱癌剂诱导的肿瘤发生和抑制肿瘤细胞生长的作用。
专利CN114146042A主要提供了一种藏红花发酵物及其制备方法和应用，利用微生物发酵技术，采用酿酒酵母菌种及红曲霉菌种与藏红花进行共生发酵，制备了一种富含藏红花苷、藏红花素、藏红花多糖的发酵物，微生物发酵技术制备藏红花发酵物的工艺简单，有利于降低藏红花活性成分的提取难度，有利于节约工艺成本。
专利CN114515001A提供了一种通过酶解、混料、灭酶提取、发酵培养、离心等工艺制备得到新型的食品原料发酵藏红花外泌体。与传统藏红花外泌体的制备方法不同，发酵藏红花外泌体主要通过酶解和发酵两个重要环节实现，通过酶制剂在特定温度和时间下的酶解作用，发挥最佳酶解效果，通过发酵菌粉在特定温度和时间下的发酵作用达到一定的酸度，得到发酵藏红花外泌体。
发明内容
本发明的目的在于提供一种藏红花发酵滤液的制备方法，所述制备方法包括：
S01藏红花提取物：称取藏红花柱头、藏红花花瓣，经研磨、过筛后，置于萃取釜内，采用超临界CO2萃取方法，得到藏红花提取物；
S02藏红花酶解：称取藏红花花瓣，放置于恒温干燥箱内干燥后磨碎成粉，加水并调至合适的pH值后，加入复合酶，置于水浴中恒温酶促反应，得到藏红花酶解提取物；
S03藏红花发酵：
(1)获得种子液：将瑞士乳杆菌和青春双歧杆菌接入液体种子培养基中进行培养，获得种子液；
(2)发酵培养：取步骤(1)所得的种子液，接种至发酵罐的发酵培养基中发酵获得发酵滤液；其中所述发酵培养基包括藏红花花瓣、藏红花提取物、藏红花酶解提取物和液体培养基；
(3)藏红花发酵滤液：将步骤(2)制备所得的发酵滤液进行灭活、过滤、纯化后得藏红花发酵滤液。
作为本发明的一种实施方式，所述超临界CO2萃取方法的条件为：CO2流量20-50Kg/h、萃取压力20-28MPa、萃取温度45-52℃；分离釜的压力为13-16MPa，分离釜温度为50-55℃；且步骤S01中，研磨过50目筛。
作为本发明的一种实施方式，所述S02中，复合酶为纤维素酶和果胶酶；且两者比例为1：2。
作为本发明的一种实施方式，S02中所述pH值为5.0～7.0。
作为本发明的一种实施方式，所述S03中，所述液体种子培养基的成分包括：
葡萄糖120g/L，硫酸铵1g/L，KCl 0.6g/L，KH2PO4 0.1g/L，MgCl2·6H2O 0.2g/L，精氨酸20g/L，柠檬酸2-4g/L，自然pH，蒸馏水配制。
作为本发明的一种实施方式，所述S03中，所述液体培养基的成分包括：
葡萄糖125g/L，蛋白胨250g/L，NH4Cl 2g/L，KCl 0.8g/L，KH2PO4 0.1g/L，七水合硫酸镁0.2g/L，ZnSO4·7H2O 30g/L，柠檬酸3g/L，自然pH，蒸馏水配制。
作为本发明的一种实施方式，所述发酵条件为所述发酵的温度为35℃，时间为36h；所述发酵的通气量0.3vvm；发酵摇床速度为180r/min；所述瑞士乳杆菌和青春双歧杆菌的种子液的共同接种量为12-20％。
作为本发明的一种实施方式，所述步骤(3)中使用12μm滤板对发酵培养基进行过滤，所得滤液90℃灭菌20min，得到所述藏红花发酵滤液。
本发明第二方面提供所述藏红花发酵滤液在化妆品中的应用。
采用上述技术方案，本发明具有如下有益效果：
1.藏红花的成分中起主要作用的是大部分具有非水溶性，常规的发酵工艺无法实现最大化的功效成分的获取；本发明选用不同制备工艺的组合，实现了水溶性有效成分和非水溶性有效成分的最大获取；
2.本发明选用制备工艺组合的方式，得到的滤液更具有良好的吸收性；同时具有舒缓、紧致、淡纹、抗皱、润泽效果；
3.采用本发明提供的制备工艺组合方式，使得滤液中内生真菌多糖含量增加，且分子量较小，护肤效果非常明显。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1和对照组的弹性蛋白酶抑制率；
图2为实施例1和对照组的透明质酸酶抑制率；
图3为各组弹性蛋白酶抑制率；
图4为各组透明质酸酶抑制率；
图5为抗皱功效人体测试图；
图6为抗皱功效人体测试图；
图7为抗皱功效人体测试图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明第一方面提供一种藏红花发酵滤液的制备方法，所述制备方法包括：
S01藏红花提取物：称取藏红花柱头、藏红花花瓣，经研磨、过筛后，置于萃取釜内，采用超临界CO2萃取方法，得到藏红花提取物；
其中，藏红花柱头、藏红花花瓣的质量比为10：1；研磨并过筛50目筛；所述超临界CO2萃取方法的条件为：CO2流量20-50Kg/h、萃取压力20-28MPa、萃取温度45-52℃；分离釜的压力为13-16MPa，分离釜温度为50-55℃；更加优选为所述超临界CO2萃取方法的条件为：CO2流量35Kg/h、萃取压力22MPa、萃取温度45℃；分离釜的压力为13MPa，分离釜温度为50℃。
S02藏红花酶解：称取藏红花花瓣，放置于恒温干燥箱内干燥后磨碎成粉，加水并调至合适的pH值后，加入复合酶，置于水浴中恒温酶促反应，得到藏红花酶解提取物；
其中，所述恒温干燥箱内的温度为35℃，研磨成粉过50目筛得藏红花花瓣粉末，所述藏红花花瓣粉末和水的比例为1：40(M/V)；所述合适的pH值为5.0～7.0，更加优选为6.9，调节pH值的方式为添加磷酸盐缓冲液。所述复合酶为纤维素酶和果胶酶；且两者比例为1：2；恒温酶促反应条件为52℃，1h，复合酶和藏红花花瓣粉末的质量比为1：10。
S03藏红花发酵：
(1)获得种子液：将瑞士乳杆菌和青春双歧杆菌接入液体种子培养基中进行培养，获得种子液；
其中，所述液体种子培养基的成分包括：
葡萄糖120g/L，硫酸铵1g/L，KCl 0.6g/L，KH2PO4 0.1g/L，MgCl2·6H2O 0.2g/L，精氨酸20g/L，柠檬酸2-4g/L，自然pH，蒸馏水配制。
(2)发酵培养：取步骤(1)所得的种子液，接种至发酵罐的发酵培养基中发酵获得发酵滤液；其中所述发酵培养基包括藏红花花瓣、藏红花提取物、藏红花酶解提取物和液体培养基；
所述液体培养基的成分包括：
葡萄糖125g/L，蛋白胨250g/L，NH4Cl 2g/L，KCl 0.8g/L，KH2PO4 0.1g/L，七水合硫酸镁0.2g/L，ZnSO4·7H2O 30g/L，柠檬酸3g/L，自然pH，蒸馏水配制。
所述瑞士乳杆菌和青春双歧杆菌的种子液的共同接种量为12-20％；更加优选为16％；且瑞士乳杆菌和青春双歧杆菌的比例为2：1。
所述藏红花花瓣、藏红花提取物、藏红花酶解提取物和液体培养基的质量比例为1：2：3：10。
所述发酵条件为所述发酵的温度为35℃，时间为36h；所述发酵的通气量0.3vvm；发酵摇床速度为180r/min。
(3)藏红花发酵滤液：将步骤(2)制备所得的发酵滤液进行灭活、过滤、纯化后得藏红花发酵滤液。
所述步骤(3)中使用12μm滤板对发酵培养基进行过滤，所得滤液90℃灭菌20min，得到所述藏红花发酵滤液。
本发明第二方面提供一种藏红花发酵滤液，其由上述发酵制备方法制备得到。
本发明第三方面提供所述藏红花发酵滤液在化妆品中的应用。
下面结合具体的实施方式对本发明做进一步的解释说明。
实施例1
本实施例提供一种藏红花发酵滤液的制备方法，所述制备方法包括：
S01藏红花提取物：称取藏红花柱头、藏红花花瓣，经研磨、过筛后，置于萃取釜内，采用超临界CO2萃取方法，得到藏红花提取物；
其中，藏红花柱头、藏红花花瓣的质量比为10：1；研磨并过筛50目筛；所述超临界CO2萃取方法的条件为：CO2流量35Kg/h、萃取压力22MPa、萃取温度45℃；分离釜的压力为13MPa，分离釜温度为50℃。
S02藏红花酶解：称取藏红花花瓣，放置于恒温干燥箱内干燥后磨碎成粉，加水并调至合适的pH值后，加入复合酶，置于水浴中恒温酶促反应，得到藏红花酶解提取物；
其中，所述恒温干燥箱内的温度为35℃，研磨成粉过50目筛得藏红花花瓣粉末，所述藏红花花瓣粉末和水的比例为1：40(M/V)；所述合适的pH值为6.9，调节pH值的方式为添加pH为5.0的磷酸盐缓冲液。所述复合酶为纤维素酶和果胶酶；且两者比例为1：2；恒温酶促反应条件为52℃，1h，复合酶和藏红花花瓣粉末的质量比为1：10。
S03藏红花发酵：
(1)获得种子液：将瑞士乳杆菌和青春双歧杆菌接入液体种子培养基中进行培养，获得种子液；
其中，所述液体种子培养基的成分包括：
葡萄糖120g/L，硫酸铵1g/L，KCl 0.6g/L，KH2PO4 0.1g/L，MgCl2·6H2O 0.2g/L，精氨酸20g/L，柠檬酸2g/L，自然pH，蒸馏水配制。
瑞士乳杆菌和青春双歧杆菌的比例为2：1。
(2)发酵培养：取步骤(1)所得的种子液，接种至发酵罐的发酵培养基中发酵获得发酵滤液；其中所述发酵培养基包括藏红花花瓣、藏红花提取物、藏红花酶解提取物和液体培养基；
所述液体培养基的成分包括：
葡萄糖125g/L，蛋白胨250g/L，NH4Cl 2g/L，KCl 0.8g/L，KH2PO4 0.1g/L，七水合硫酸镁0.2g/L，ZnSO4·7H2O 30g/L，柠檬酸3g/L，自然pH，蒸馏水配制。
所述瑞士乳杆菌和青春双歧杆菌的种子液的共同接种量为16％；且瑞士乳杆菌和青春双歧杆菌的比例为2：1。
所述藏红花花瓣、藏红花提取物、藏红花酶解提取物和液体培养基的质量比例为1：2：3：10。
所述发酵条件为所述发酵的温度为35℃，时间为36h；所述发酵的通气量0.3vvm；发酵摇床速度为180r/min。
(3)藏红花发酵滤液：将步骤(2)制备所得的发酵滤液进行灭活、过滤、纯化后得藏红花发酵滤液。
所述步骤(3)中使用12μm滤板对发酵培养基进行过滤，所得滤液90℃灭菌20min，得到所述藏红花发酵滤液。
实施例2
本实施例提供一种藏红花发酵滤液的制备方法，所述制备方法包括：
S01藏红花酶解：称取藏红花花瓣，放置于恒温干燥箱内干燥后磨碎成粉，加水并调至合适的pH值后，加入复合酶，置于水浴中恒温酶促反应，得到藏红花酶解提取物；
其中，所述恒温干燥箱内的温度为35℃，研磨成粉过50目筛得藏红花花瓣粉末，所述藏红花花瓣粉末和水的比例为1：40(M/V)；所述合适的pH值为6.9，调节pH值的方式为添加pH为5.0的磷酸盐缓冲液。所述复合酶为纤维素酶和果胶酶；且两者比例为1：2；恒温酶促反应条件为52℃，1h，复合酶和藏红花花瓣粉末的质量比为1：10。
S02藏红花发酵：
(1)获得种子液：将瑞士乳杆菌和青春双歧杆菌接入液体种子培养基中进行培养，获得种子液；
其中，所述液体种子培养基的成分包括：
葡萄糖120g/L，硫酸铵1g/L，KCl 0.6g/L，KH2PO4 0.1g/L，MgCl2·6H2O 0.2g/L，精氨酸20g/L，柠檬酸2g/L，自然pH，蒸馏水配制。
瑞士乳杆菌和青春双歧杆菌的比例为2：1。
(2)发酵培养：取步骤(1)所得的种子液，接种至发酵罐的发酵培养基中发酵获得发酵滤液；其中所述发酵培养基包括藏红花花瓣、藏红花酶解提取物和液体培养基；
所述液体培养基的成分包括：
葡萄糖125g/L，蛋白胨250g/L，NH4Cl 2g/L，KCl 0.8g/L，KH2PO4 0.1g/L，七水合硫酸镁0.2g/L，ZnSO4·7H2O 30g/L，柠檬酸3g/L，自然pH，蒸馏水配制。
所述瑞士乳杆菌和青春双歧杆菌的种子液的共同接种量为16％；且瑞士乳杆菌和青春双歧杆菌的比例为2：1。
所述藏红花花瓣、藏红花酶解提取物和液体培养基的质量比例为1：3：10。
所述发酵条件为所述发酵的温度为35℃，时间为36h；所述发酵的通气量0.3vvm；发酵摇床速度为180r/min。
(3)藏红花发酵滤液：将步骤(2)制备所得的发酵滤液进行灭活、过滤、纯化后得藏红花发酵滤液。
所述步骤(3)中使用12μm滤板对发酵培养基进行过滤，所得滤液90℃灭菌20min，得到所述藏红花发酵滤液。
实施例3
本实施例提供一种藏红花发酵滤液的制备方法，所述制备方法包括：
S01藏红花提取物：称取藏红花柱头、藏红花花瓣，经研磨、过筛后，加入60倍量的水，水提三次，将水提三次后的液体混合并加入浓缩至体积为30倍的量，得到藏红花提取物；
其中，藏红花柱头、藏红花花瓣的质量比为10：1。
S02藏红花酶解：称取藏红花花瓣，放置于恒温干燥箱内干燥后磨碎成粉，加水并调至合适的pH值后，加入复合酶，置于水浴中恒温酶促反应，得到藏红花酶解提取物；
其中，所述恒温干燥箱内的温度为35℃，研磨成粉过50目筛得藏红花花瓣粉末，所述藏红花花瓣粉末和水的比例为1：40(M/V)；所述合适的pH值为6.9，调节pH值的方式为添加pH为5.0的磷酸盐缓冲液。所述复合酶为纤维素酶和果胶酶；且两者比例为1：2；恒温酶促反应条件为52℃，1h，复合酶和藏红花花瓣粉末的质量比为1：10。
S03藏红花发酵：
(1)获得种子液：将瑞士乳杆菌和青春双歧杆菌接入液体种子培养基中进行培养，获得种子液；
其中，所述液体种子培养基的成分包括：
葡萄糖120g/L，硫酸铵1g/L，KCl 0.6g/L，KH2PO4 0.1g/L，MgCl2·6H2O 0.2g/L，精氨酸20g/L，柠檬酸2g/L，自然pH，蒸馏水配制。
瑞士乳杆菌和青春双歧杆菌的比例为2：1。
(2)发酵培养：取步骤(1)所得的种子液，接种至发酵罐的发酵培养基中发酵获得发酵滤液；其中所述发酵培养基包括藏红花花瓣、藏红花提取物、藏红花酶解提取物和液体培养基；
所述液体培养基的成分包括：
葡萄糖125g/L，蛋白胨250g/L，NH4Cl 2g/L，KCl 0.8g/L，KH2PO4 0.1g/L，七水合硫酸镁0.2g/L，ZnSO4·7H2O 30g/L，柠檬酸3g/L，自然pH，蒸馏水配制。
所述瑞士乳杆菌和青春双歧杆菌的种子液的共同接种量为16％；且瑞士乳杆菌和青春双歧杆菌的比例为2：1。
所述藏红花花瓣、藏红花提取物、藏红花酶解提取物和液体培养基的质量比例为1：2：3：10。
所述发酵条件为所述发酵的温度为35℃，时间为36h；所述发酵的通气量0.3vvm；发酵摇床速度为180r/min。
(3)藏红花发酵滤液：将步骤(2)制备所得的发酵滤液进行灭活、过滤、纯化后得藏红花发酵滤液。
所述步骤(3)中使用12μm滤板对发酵培养基进行过滤，所得滤液90℃灭菌20min，得到所述藏红花发酵滤液。
实施例4
本实施例提供一种藏红花发酵滤液的制备方法，所述制备方法包括：
S01藏红花提取物：称取藏红花柱头、藏红花花瓣，经研磨、过筛后，置于萃取釜内，采用超临界CO2萃取方法，得到藏红花提取物；
其中，藏红花柱头、藏红花花瓣的质量比为10：1；研磨并过筛50目筛；所述超临界CO2萃取方法的条件为：CO2流量35Kg/h、萃取压力22MPa、萃取温度45℃；分离釜的压力为13MPa，分离釜温度为50℃。
S02藏红花发酵：
(1)获得种子液：将瑞士乳杆菌和青春双歧杆菌接入液体种子培养基中进行培养，获得种子液；
其中，所述液体种子培养基的成分包括：
葡萄糖120g/L，硫酸铵1g/L，KCl 0.6g/L，KH2PO4 0.1g/L，MgCl2·6H2O 0.2g/L，精氨酸20g/L，柠檬酸2g/L，自然pH，蒸馏水配制。
瑞士乳杆菌和青春双歧杆菌的比例为2：1。
(2)发酵培养：取步骤(1)所得的种子液，接种至发酵罐的发酵培养基中发酵获得发酵滤液；其中所述发酵培养基包括藏红花花瓣、藏红花提取物、藏红花酶解提取物和液体培养基；
所述液体培养基的成分包括：
葡萄糖125g/L，蛋白胨250g/L，NH4Cl 2g/L，KCl 0.8g/L，KH2PO4 0.1g/L，七水合硫酸镁0.2g/L，ZnSO4·7H2O 30g/L，柠檬酸3g/L，自然pH，蒸馏水配制。
所述瑞士乳杆菌和青春双歧杆菌的种子液的共同接种量为16％；且瑞士乳杆菌和青春双歧杆菌的比例为2：1。
所述藏红花花瓣、藏红花提取物和液体培养基的质量比例为1：2：10。
所述发酵条件为所述发酵的温度为35℃，时间为36h；所述发酵的通气量0.3vvm；发酵摇床速度为180r/min。
(3)藏红花发酵滤液：将步骤(2)制备所得的发酵滤液进行灭活、过滤、纯化后得藏红花发酵滤液。
所述步骤(3)中使用12μm滤板对发酵培养基进行过滤，所得滤液90℃灭菌20min，得到所述藏红花发酵滤液。
实施例5
本实施例提供一种藏红花发酵滤液的制备方法，所述制备方法包括：
S01藏红花提取物：称取藏红花柱头、藏红花花瓣，经研磨、过筛后，置于萃取釜内，采用超临界CO2萃取方法，得到藏红花提取物；
其中，藏红花柱头、藏红花花瓣的质量比为10：1；研磨并过筛50目筛；所述超临界CO2萃取方法的条件为：CO2流量35Kg/h、萃取压力22MPa、萃取温度45℃；分离釜的压力为13MPa，分离釜温度为50℃。
S02藏红花酶解：称取藏红花花瓣，放置于恒温干燥箱内干燥后磨碎成粉，加水并调至合适的pH值后，加入复合酶，置于水浴中恒温酶促反应，得到藏红花酶解提取物；
其中，所述恒温干燥箱内的温度为35℃，研磨成粉过50目筛得藏红花花瓣粉末，所述藏红花花瓣粉末和水的比例为1：40(M/V)；所述合适的pH值为6.9，调节pH值的方式为添加pH为5.0的磷酸盐缓冲液。所述复合酶为纤维素酶和果胶酶；且两者比例为1：2；恒温酶促反应条件为52℃，1h，复合酶和藏红花花瓣粉末的质量比为1：10。
S03藏红花发酵：
(1)获得种子液：将酿酒酵母菌和红曲霉菌接入液体种子培养基中进行培养，获得种子液；
其中，所述液体种子培养基的成分包括：
葡萄糖120g/L，硫酸铵1g/L，KCl 0.6g/L，KH2PO4 0.1g/L，MgCl2·6H2O 0.2g/L，精氨酸20g/L，柠檬酸2g/L，自然pH，蒸馏水配制。
酿酒酵母菌和红曲霉菌的比例为2：1。
(2)发酵培养：取步骤(1)所得的种子液，接种至发酵罐的发酵培养基中发酵获得发酵滤液；其中所述发酵培养基包括藏红花花瓣、藏红花提取物、藏红花酶解提取物和液体培养基；
所述液体培养基的成分包括：
葡萄糖125g/L，蛋白胨250g/L，NH4Cl 2g/L，KCl 0.8g/L，KH2PO4 0.1g/L，七水合硫酸镁0.2g/L，ZnSO4·7H2O 30g/L，柠檬酸3g/L，自然pH，蒸馏水配制。
所述酿酒酵母菌和红曲霉菌的种子液的共同接种量为16％；且酿酒酵母菌和红曲霉菌的比例为2：1。
所述藏红花花瓣、藏红花提取物、藏红花酶解提取物和液体培养基的质量比例为1：2：3：10。
所述发酵条件为所述发酵的温度为35℃，时间为36h；所述发酵的通气量0.3vvm；发酵摇床速度为180r/min。
(3)藏红花发酵滤液：将步骤(2)制备所得的发酵滤液进行灭活、过滤、纯化后得藏红花发酵滤液。
所述步骤(3)中使用12μm滤板对发酵培养基进行过滤，所得滤液90℃灭菌20min，得到所述藏红花发酵滤液。
实施例6
本实施例提供一种藏红花发酵滤液的制备方法，所述制备方法包括：
(1)获得种子液：将瑞士乳杆菌和青春双歧杆菌接入液体种子培养基中进行培养，获得种子液；
其中，所述液体种子培养基的成分包括：
葡萄糖120g/L，硫酸铵1g/L，KCl 0.6g/L，KH2PO4 0.1g/L，MgCl2·6H2O 0.2g/L，精氨酸20g/L，柠檬酸2g/L，自然pH，蒸馏水配制。
瑞士乳杆菌和青春双歧杆菌的比例为2：1。
(2)发酵培养：取步骤(1)所得的种子液，接种至发酵罐的发酵培养基中发酵获得发酵滤液；其中所述发酵培养基包括藏红花花瓣和液体培养基；
所述液体培养基的成分包括：
葡萄糖125g/L，蛋白胨250g/L，NH4Cl 2g/L，KCl 0.8g/L，KH2PO4 0.1g/L，七水合硫酸镁0.2g/L，ZnSO4·7H2O 30g/L，柠檬酸3g/L，自然pH，蒸馏水配制。
所述瑞士乳杆菌和青春双歧杆菌的种子液的共同接种量为16％；且瑞士乳杆菌和青春双歧杆菌的比例为2：1。
所述藏红花花瓣和液体培养基的质量比例为1：10。
所述发酵条件为所述发酵的温度为35℃，时间为36h；所述发酵的通气量0.3vvm；发酵摇床速度为180r/min。
(3)藏红花发酵滤液：将步骤(2)制备所得的发酵滤液进行灭活、过滤、纯化后得藏红花发酵滤液。
所述步骤(3)中使用12μm滤板对发酵培养基进行过滤，所得滤液90℃灭菌20min，得到所述藏红花发酵滤液。
实施例7
本实施例提供一种藏红花提取物的制备方法，所述制备方法包括：
S01藏红花提取物：称取藏红花柱头、藏红花花瓣，经研磨、过筛后，置于萃取釜内，采用超临界CO2萃取方法，得到藏红花提取物；
其中，藏红花柱头、藏红花花瓣的质量比为10：1；研磨并过筛50目筛；所述超临界CO2萃取方法的条件为：CO2流量35Kg/h、萃取压力22MPa、萃取温度45℃；分离釜的压力为13MPa，分离釜温度为50℃。
S02藏红花酶解：称取藏红花花瓣，放置于恒温干燥箱内干燥后磨碎成粉，加水并调至合适的pH值后，加入复合酶，置于水浴中恒温酶促反应，得到藏红花酶解提取物；
其中，所述恒温干燥箱内的温度为35℃，研磨成粉过50目筛得藏红花花瓣粉末，所述藏红花花瓣粉末和水的比例为1：40(M/V)；所述合适的pH值为6.9，调节pH值的方式为添加pH为5.0的磷酸盐缓冲液。所述复合酶为纤维素酶和果胶酶；且两者比例为1：2；恒温酶促反应条件为52℃，1h，复合酶和藏红花花瓣粉末的质量比为1：10。
S03混合S01和S02的藏红花提取物和酶解提取物，即得。
性能测试
1.抗皱功效评价，检测依据，按照HMC-W1-028弹性蛋白酶抑制率进行测试。
藏红花发酵滤液：用纯水稀释至样品浓度为5％；
阳性对照物(表没食子儿茶素没食子酸酯)：用水稀释至阳性对照物浓度为0.1％；
阴性对照物：纯水。
试验操作步骤：
设计样品组、样品本底组、溶剂组和溶剂本底组，每个组别设立需设立3个平行，在96孔板中分别加入不同试剂溶液，轻轻摇匀，25℃孵育15min后，将其放在酶标仪中，在410nm处测定吸光值。
计算公式
弹性蛋白酶抑制率(％)＝(1-(C-D)/(A-B))×100
其中，A为不含样品的反应溶液的吸光度；B为不含样品和酶的反应溶液的吸光度；C为含有样品和酶的反应溶液的吸光度；D为含有样品和不含酶的反应溶液的吸光度。
统计分析软件为SPSS，试验样品、阳性对照物和阴性对照物弹性蛋白酶抑制率之间的比较采用独立样板t检验。上述统计分析均为双尾检验，显著性水平为α＝0.05，P＞0.05，表示两组之间无显著性差异；P＜0.05，表示两组之间具有显著性差异。
表1抗皱功效结果表
名称 试验结果(％) P值
实施例1的发酵滤液 69.752±1.131 ＜0.05
阴性对照 -9.382±1.352 /
阳性对照 70.935±2.535 ＜0.05
弹性蛋白酶抑制率保留三位小数，P＜0.05，表示样品和阳性对照与阴性对照相比有显著性差异。
因此，针对上述操作对实施例1-7均进行弹性蛋白酶抑制率测试。
表2实施例1-7的弹性蛋白酶抑制率试验结果表(弹性蛋白酶抑制率保留1位小数)
名称 试验结果(％)
实施例1 69.8
实施例2 65.3
实施例3 67.2
实施例4 63.6
实施例5 58.1
实施例6 57.1
实施例7 54.9
2.舒缓功效数据：检测依据，按照HMC-W1-029透明质酸酶抑制率进行测试。
红茶/茉莉花发酵滤液：用纯水稀释至样品浓度为5％；
阳性对照物(甘草酸二钾，纯度≥98％)：用水稀释至阳性对照物浓度为3％；
阴性对照物：纯水。
试验操作步骤：
设计样品组、样品本底组、溶剂组和溶剂本底组，每个组别设立需设立3个平行，分别在四组中加入不同试剂溶液，摇匀，室温放置30min显色，用紫外分光光度计测定波长为528nm处吸光度值。
计算公式
透明质酸酶抑制率(％)＝(1-(C-D)/(A-B))×100
其中，A为不含样品的反应溶液的吸光度；B为不含样品和酶的反应溶液的吸光度；C为含有样品和酶的反应溶液的吸光度；D为含有样品和不含酶的反应溶液的吸光度。
统计分析软件为SPSS，试验样品、阳性对照物和阴性对照物透明质酸酶抑制率之间的比较采用独立样板t检验。上述统计分析均为双尾检验，显著性水平为α＝0.05，P＞0.05，表示两组之间无显著性差异；P＜0.05，表示两组之间具有显著性差异。
表3舒缓功效试验结果表
名称 实验结果 P值
实施例1的发酵液 49.323±0.316 ＜0.05
阴性对照 -4.784±0.355 /
阳性对照 52.984±3.135 ＜0.05
透明质酸酶抑制率保留三位小数，P＜0.05，表示样品和阳性对照与阴性对照相比有显著性差异。
因此，针对上述操作对实施例1-7均进行弹性蛋白酶抑制率测试。
表4实施例1-7的透明质酸酶抑制率试验结果表(弹性蛋白酶抑制率保留1位小数)
名称 试验结果(％)
实施例1 49.3
实施例2 45.2
实施例3 47.2
实施例4 43.9
实施例5 42.1
实施例6 40.2
实施例7 38.9
3.保湿性能测试：将实施例1-7制备得到的滤液，加蒸馏水稀释至浓度为1％，随后直接用无纺布面膜纸浸于稀释液中，封装入袋，巴氏灭菌30min即可得到面膜。
选取年龄在35～40岁的健康皮肤志愿者42名(健康皮肤是指无过敏特质)，随机分成7组，实验前48h内不使用任何护肤品，在温度为25℃，相对湿度为35％下用水清洁皮肤后，分别使用实施例1-实施例7制备得到的面膜，15min后取下，用德国Corneometer CM825皮肤水分测试仪测量额头的皮肤情况，记录皮肤水分含量MVV值。
MVV值的普通评判标准：
MVV值<35记为皮肤干燥；
MVV值处于35～50记为皮肤水分中等；
MVV值>50皮肤水分充分。
表5保湿性能测试结果
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (4)

1.一种藏红花发酵滤液的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
S01 藏红花提取物：称取藏红花柱头、藏红花花瓣，经研磨、过筛后，置于萃取釜内，采用超临界CO2萃取方法，得到藏红花提取物；
其中，藏红花柱头、藏红花花瓣的质量比为10：1；研磨并过筛50目筛；所述超临界CO2萃取方法的条件为：CO2流量35 Kg/h、萃取压力22MPa、萃取温度45℃；分离釜的压力为13MPa，分离釜温度为50℃；
S02 藏红花酶解：称取藏红花花瓣，放置于恒温干燥箱内干燥后磨碎成粉，加水并调至合适的pH值后，加入复合酶，置于水浴中恒温酶促反应，得到藏红花酶解提取物；
其中，所述恒温干燥箱内的温度为35℃，研磨成粉过50目筛得藏红花花瓣粉末，所述藏红花花瓣粉末和水的比例为1：40；所述合适的pH值为6.9，调节pH值的方式为添加pH为5.0的磷酸盐缓冲液；所述复合酶为纤维素酶和果胶酶；且两者比例为1：2；恒温酶促反应条件为52℃，1h，复合酶和藏红花花瓣粉末的质量比为1：10；
S03 藏红花发酵：
(1) 获得种子液：将瑞士乳杆菌和青春双歧杆菌接入液体种子培养基中进行培养，获得种子液；所述瑞士乳杆菌和青春双歧杆菌的种子液的共同接种量为16%；且瑞士乳杆菌和青春双歧杆菌的比例为2：1；所述液体种子培养基的成分包括：
葡萄糖120g/L，硫酸铵1g/L，KCl 0.6g/L，KH2PO4 0.1g/L，MgCl2·6H2O 0.2g/L，精氨酸20g/L，柠檬酸2g/L，自然pH，蒸馏水配制；
所述发酵条件为所述发酵的温度为35℃，时间为36 h；所述发酵的通气量0.3 vvm；发酵摇床速度为180 r/min；
(2)发酵培养：取步骤(1)所得的种子液，接种至发酵罐的发酵培养基中发酵获得发酵滤液；其中所述发酵培养基包括藏红花花瓣、藏红花提取物、藏红花酶解提取物和液体培养基；
(3) 藏红花发酵滤液：将步骤(2)制备所得的发酵滤液进行灭活、过滤、纯化后得藏红花发酵滤液。
2.根据权利要求1所述的藏红花发酵滤液的制备方法，其特征在于，所述S03中，所述液体培养基的成分包括：
葡萄糖125g/L，蛋白胨250g/L，NH4Cl 2g/L，KCl 0.8g/L，KH2PO4 0.1g/L，七水合硫酸镁0.2g/L，ZnSO4·7H2O 30g/L，柠檬酸 3g/L，自然pH，蒸馏水配制。
3.根据权利要求1所述的藏红花发酵滤液的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中使用12μm滤板对发酵培养基进行过滤，所得滤液90℃灭菌20min，得到所述藏红花发酵滤液。
4.一种根据权利要求1-3任一项所述藏红花发酵滤液在化妆品中的应用。
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