CN114146042A - 一种藏红花发酵物及其制备方法和应用 - Google Patents
一种藏红花发酵物及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种藏红花发酵物的制备方法，包括如下步骤：1)菌柱活化与扩培：将酿酒酵母菌和红曲霉菌接入液体种子培养基中进行培养，获得种子液；2)发酵培养：取步骤1)所得的种子液，接种至发酵罐的发酵培养基中发酵获得发酵液；其中所述发酵培养基包括藏红花和液体培养基；所述藏红花为发酵培养基质量分数的1％～5％；3)发酵物灭活：将步骤2)制备所得的发酵液进行灭活处理；4)纯化：将灭活处理后的发酵液进行多次纯化处理后，即得藏红花发酵物。本发明还公开了该藏红花发酵物的应用。本发明所提供的藏红花发酵物具有活性成分含量高，以及具有强抗氧化和抗糖化活性，适于推广应用。
Description
技术领域
本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一种藏红花发酵物及其制备方法和应用。
背景技术
藏红花(Saffron，Crocus sativus L.)，又名番红花、西红花、洎夫蓝、撒法郎，为鸢尾科番红花属多年生草本植物，据《中华人名共和国药典》记载，其药用部位为干燥的花柱，藏红花作为传统中药其功效为:活血化瘀，凉血解毒，解郁安神。用于经闭癥瘕，产后瘀阻，温毒发斑，忧郁痞闷，惊悸发狂等；除药用外，它可用作食品添加剂、食用色素和高端化妆品原料、高级香料；藏红花的主要有效成分集中在花柱头中，主要成分有：藏红花花酸、藏红花素、藏红花苷以及多糖等。
藏红花传统的提取方法主要是水热提取法和碱液提取法，但是这两种提取方法都存在一定的问题：水热提取法虽操作简单但提取效率低；而碱液提取法会破坏藏红花中的有效成分。因此，现对藏红花活性成分的提取一般采用乙醇-水体系超声辅助法，例如发明专利CN201910491529.0中利用40～70％乙醇水溶液作为提取溶剂，采用超声加热方法提取藏红花提取液，其中藏红花苷的提取率约为30％。但是藏红花素、藏红花粗多糖为水溶性活性成分，利用乙醇水体系将会极大影响其提取效率；CN201310652092.7公开了一种天然藏红花素提取分离方法，其通过采用加入助溶剂的去离子水浸提、膜过滤分离除杂结合大孔吸附树脂层析法纯化藏红花素，藏红花素提取率为89.2％～93.5％；201811188946.X公开了藏红花花瓣总多糖及其提取方法和应用，通过水提-醇提后，用阴离子交换柱层析纯化、凝胶柱层析纯化获得藏红花花瓣总多糖，多糖的提取率为32.10％；但是上述方法提取藏红花活性成分单一，提取工艺复杂，且藏红花活性成分的提取效率较低，因此开发一种具有高效提取藏红花活性分成的工艺具有重要意义。
众所周知，由于藏红花中含有多种珍贵的药食用成分，药用功效突出，但因藏红花原料太贵、使用成本较高导致应用范围受到限制；因此活性成分的保护性提取利用就具有重要的研究意义。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的主要目的在于提供一种具有强抗氧化和抗糖化活性的藏红花发酵物，臧红花发酵物富含臧红花活性成分；同时还提供了该藏红花发酵物的制备方法和应用。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种藏红花发酵物的制备方法，包括如下步骤：
1)菌株活化与扩培：将酿酒酵母菌和红曲霉菌接入液体种子培养基中进行培养，获得种子液；
2)发酵培养：取步骤1)所得的种子液，接种至发酵罐的发酵培养基中发酵获得发酵液；其中所述发酵培养基包括藏红花和液体培养基；所述藏红花为发酵培养基质量的1％～5％；
3)发酵物灭活：将步骤2)制备所得的发酵液进行灭活处理；
4)纯化：将灭活处理后的发酵液进行多次纯化处理后，即得藏红花发酵物。
优选地，其中步骤1)中，所述培养的条件为培养温度为25～37℃，转速为100～300r/min，培养时间为24～72h；在所述种子液中，所述酿酒酵母菌和红曲霉菌的浓度均为1×107～1×1010CFU/mL。
优选地，在进行步骤1)之前还包括：活化所述酿酒酵母菌和所述红曲霉菌。所述活化步骤为：将酿酒酵母菌种、红曲霉菌种分别配成酿酒酵母菌悬液和红曲霉菌悬液，然后将所述酿酒酵母菌悬液和红曲霉菌悬液接种于固体培养基，于25-35℃的温度下活化培养36-72小时，得到活化的酿酒酵母菌以及红曲霉菌，所述固体培养基为PDA固体培养基或DRBC琼脂固体培养基中的一种或两种的组合物。
其中步骤1)中的所述活化为将酿酒酵母菌、红曲霉菌分别配成菌悬液，然后接种于固体培养基，于25-35℃的温度下活化培养36-72小时，得到活化的酿酒酵母菌种以及红曲霉菌种，所述固体培养基为PDA固体培养基或DRBC琼脂固体培养基中的一种。
优选地，其中步骤2)中所述发酵条件为于发酵温度25～37℃、pH为6.0～7.0和转速为100～300r/min的条件下发酵24～72h。
优选地，其中步骤2)中所述藏红花经过粉碎机打碎，过40-80目筛网过滤，所述pH值通过柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液进行调节，所述种子液的接种量为所述发酵培养基的体积百分比的1％～5％。
优选地，其中所述液体种子培养基和液体培养基均为沙氏液体培养基、高盐察氏培养基、氯硝胺18％甘油培养基、孟加拉红培养基或YES培养基中的一种或任意两种以上的组合物。
优选地，其中步骤3)中所述灭活处理的条件为灭活温度为90～110℃，灭活处理的时间为30～120s。
优选地，其中步骤4)中所述纯化处理包括发酵液脱色处理、过滤去渣和过微滤膜。
本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种藏红花发酵物，由上述的制备方法制得，具体表现为该藏红花发酵物富含藏红花苷、藏红花素和藏红花多糖等活性组分。
本发明要解决的第三个问题是提供采用上述藏红花发酵物用于化妆品，具有具有强抗氧化和抗糖化活性；本发明中的化妆品可为爽肤水、乳液、精华液、面霜、面膜、眼膜等常见的化妆品。
与现有技术相比，本发明至少具有以下优点：
1)本发明通过利用微生物发酵技术，采用酿酒酵母菌种及红曲霉菌种与藏红花进行共生发酵，制备了一种富含藏红花苷、藏红花素、藏红花多糖的发酵物，微生物发酵技术制备藏红花发酵物的工艺简单，有利于降低藏红花活性成分的提取难度，有利于节约工艺成本。
2)本发明的藏红花发酵物在化妆品中具有较好的应用效果，采用该藏红花发酵物的化妆品具有优异的抗氧化、抗糖化性能.
3)本发明的藏红花发酵物在制备过程不使用任何有机溶剂，卫生安全，环保无污染，且藏红花苷、藏红花素、藏红花多糖的得率明显高于醇水浸提法、超声提取等提取方法，便于推广使用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1为本发明所提供的藏红花发酵物中藏红花苷-Ⅰ、臧红花苷-Ⅱ的高效液相色谱图；
图2本发明所提供的藏红花发酵物中藏红花素的高效液相色谱图；
图3为对比例1中藏红花苷-Ⅰ、臧红花苷-Ⅱ的高效液相色谱图；
图4为对比例1中藏红花素的高效液相色谱图；
图5为对比例2中藏红花苷-Ⅰ、臧红花苷-Ⅱ的高效液相色谱图；
图6为对比例2中藏红花素的高效液相色谱图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
当以范围、优选范围、或者优选的数值上限以及下限的形式表述某个量、浓度或其它值或参数的时候，应当理解相当于具体揭示了通过将任意一对范围上限或优选数值与任意范围下限或优选数值结合起来的任何范围，而不考虑该范围是否具体揭示。除非另外指出，本文所列出的数值范围值在包括范围的端点，和该范围之内的所有整数和分数。
除非另外说明，本文中所有的百分比、份数、比值等均是按重量计。
本文的材料、方法和实施例均是示例性的，并且除非特别说明，不应理解为限制性的。
本发明中的所述酿酒酵母菌种为酿酒酵母EBY100菌种，进一步的其菌种编号为BIO-82069；所述红曲霉菌种的编号为BNCC 336206，本发明中的酿酒酵母菌种和红曲霉菌种均为已公开的菌株，可以通过商业途径获得；其中臧红花包括臧红花干和/或臧红花柱，均可通过商业途径获得。
进一步的，将酿酒酵母菌种、红曲霉菌种分别配成菌悬液，然后接种于固体培养基，于25-35℃的温度下活化培养36-72小时，得到活化的酿酒酵母菌以及红曲霉菌，所述固体培养基为PDA固体培养基或DRBC琼脂固体培养基中的一种或两种的组合物：
其中所述PDA固体培养基的制备步骤为：将新鲜马铃薯洗净去皮，称取200～300g马铃薯切块，加水煮烂(煮沸30min)，利用100～500目滤布过滤残渣。在滤液中添加琼脂20～40g，葡萄糖20～40g，再补足水分至1L，120～130℃灭菌20～30min后贮存备用。
所述DRBC琼脂固体培养基的制备步骤为：3号月示胨5.0～10.0g、葡萄糖10.0～30.0g、KH2PO41.0～3.0g、氯硝胺0.002～0.01g、MgSO4·7H2O 0.5～3.0g、虎红0.01～0.1g、琼脂15～30g，再补足水分至1L，120～130℃灭菌20～30min后贮存备用。
其中所述液体种子培养基和液体培养基均为沙氏液体培养基、高盐察氏培养基、氯硝胺18％甘油培养基、孟加拉红培养基或YES培养基中的一种；
其中所述沙氏液体培养基的配置方法是：将40.0～50.0g葡萄糖，10.0～30.0g蛋白胨溶解在人工海水中，并定容至1L，然后灭菌，备用；人工海水的配方为：NaCl 20～30g、MgSO4·7H2O 1.0～8.0g、CaCl2·2H2O 1.0～3.0g、KCl 0.5～1.0g、NaHCO3 0.2～1.0g、KBr0.1～0.5g、H3BO3 0.01～0.05mg，蒸馏水加至1L；所述灭菌是在120～130℃灭菌20～30min。
所述高盐察氏培养基的配置方法是：NaCl 50～80g、AgNO3 1.0～5.0g、KH2PO41.0～3.0g、MgSO4·7H2O 0.5～3.0g、KCl 0.5～1.0g、FeSO4 0.01～0.5g、蔗糖30～50g，蒸馏水加至1L，灭菌，备用。所述灭菌是在120～130℃灭菌20～30min。
所述氯硝胺18％甘油培养基的配置方法是：蛋白胨5.0～10.0g、无水葡萄糖10.0～30.0g、KH2PO41.0～3.0g、MgSO4·7H2O 0.5～3.0g、氯硝胺0.002～0.01g、氯霉素0.1～0.5g、甘油200～250g、蒸馏水加至1L，灭菌，备用。所述灭菌是在120～130℃灭菌20～30min。
所述孟加拉红培养基的配置方法是：蛋白胨5.0～10.0g、葡萄糖10.0～20.0g、KH2PO41.0～3.0g、MgSO4·7H2O 0.5～3.0g、氯霉素0.1～0.5g、1/3000孟加拉红溶液100～200ml，蒸馏水加至1L，灭菌，备用；所述灭菌是在120～130℃灭菌20～30min。
所述YES培养基的配置方法是：酵母提取物1.0～5.0g、葡萄糖10～30g、NaCl 50～80g、CuSO4·5H2O 0.001～0.01g、ZnSO4 0.01～0.05g、氯硝胺0.002～0.02g、氯霉素0.1～0.5g，蒸馏水加至1L，灭菌，备用；所述灭菌是在120～130℃灭菌20～30min。
其中步骤4)中所述纯化处理包括发酵液脱色处理、过滤去渣和过微滤膜，具体为：其中所述脱色处理是指采用硅藻土助滤剂、羧甲基可聚糖和/或脱色活性炭对发酵液进行脱色；硅藻土助滤剂的用量为发酵液质量分数的0.5～2％，羧甲基可聚糖的用量为发酵液质量分数的0.5～2％，脱色活性炭为发酵液质量分数的0.5～2％；所述脱色处理的时间为10～30min；
所述过滤去渣是指利用板框压滤机过滤去渣；
所述过微滤膜是指将滤液依次经过10μm、5.0μm及2.5μm的聚丙烯微滤膜滤柱除去杂质。
实施例1
1)配置固体培养基、液体种子培养基和液体培养基；
本实施例中选用PDA固体培养基作为固体培养基，其中固体培养基的制备步骤为：将新鲜马铃薯洗净去皮，称取200g马铃薯切块，加水煮烂(煮沸30min)，利用300目滤布过滤残渣，在滤液中添加琼脂20g，葡萄糖20g，再补足水分至1L，120℃灭菌20min冷却后贮存备用。
本实施例中选用沙氏液体培养基作为种子液体培养基，其中沙氏液体培养基的配置方法是：将40.0g葡萄糖，10.0g蛋白胨溶解在人工海水(人工海水配方：NaCl 20g、MgSO4·7H2O 1g、CaCl2·2H2O 1g、KCl 0.5g、NaHCO3 0.2g、KBr 0.1g、H3BO3 0.01mg，蒸馏水加至1L)中，并定容至1L，然后在120℃灭菌20min后贮存备用。
2)菌株活化与扩培：将酿酒酵母菌种、红曲霉菌种分别溶于无菌水制成菌悬液，分别移取酿酒酵母菌种和红曲霉菌种3μL菌悬液在PDA固体培养基表面划线，活化培养，培养温度30℃，培养时间36h，获得活化后的酿酒酵母菌和红曲霉菌；然后分别将活化后的酿酒酵母菌、红曲霉菌通过接种环接种至含有沙氏液体培养基的发酵摇瓶中进行扩培，培养温度为30℃，转速200r/min，培养48h后，得到酿酒酵母菌和红曲霉菌的种子液；在种子液中，酿酒酵母菌和红曲霉菌的浓度均为1×107CFU/mL；
3)藏红花原料处理：称取1kg藏红花(花干或花柱)，用粉碎机打碎，过60目筛网，注入99kg沙氏液体培养基，使藏红花的质量分数为1.0％，将发酵罐密闭，升温至120℃，保持30min进行灭菌处理，然后降温至室温，获得发酵培养基；
4)发酵培养：将1％(体积分数)酿酒酵母菌种子液、2％(体积分数)红曲霉菌种子液加入含有1％(质量分数)藏红花的发酵培养基中，利用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液调节发酵罐内料液pH为6.2，在30℃，转速200r/min下发酵48h，得到发酵液；
5)发酵物灭菌：将上述发酵物利用巴氏灭菌法，在灭活处理温度为90℃，灭活处理的时间为60s；完成对微生物的灭活处理；
6)纯化：待发酵液完成降温后，向发酵罐中加入发酵液质量分数0.5％脱色活性炭，静置吸附20min后，利用板框压滤机过滤，将滤液再依次经过10μm、5.0μm及2.5μm的聚丙烯微滤膜滤柱除去杂质，得到滤液87.9kg。
实施例2
1)配置固体培养基、液体种子培养基和液体培养基；
本实施例中选用DRBC琼脂固体培养基作为固体培养基，其中DRBC琼脂固体培养基的制备步骤为：3号月示胨6.0g、葡萄糖20.0g、KH2PO42.0 g、氯硝胺0.006g、MgSO4·7H2O1.5g、虎红0.05g、琼脂20g，再补足水分至1L，125℃灭菌25min后贮存备用。
本实施例中选用氯硝胺18％甘油培养基作为液体培养基，其中氯硝胺18％甘油培养基的配置方法是所述氯硝胺18％甘油培养基的配置方法是：蛋白胨5.0g、无水葡萄糖10.0g、KH2PO41.0g、MgSO4·7H2O 0.5g、氯硝胺0.002g、氯霉素0.1g、甘油200g、蒸馏水加至1L，在120℃灭菌20min后贮存备用。
2)菌株活化与扩培：将酿酒酵母菌种、红曲霉菌菌种分别溶于无菌水制成菌悬液，分别移取3μL菌悬液在DRBC琼脂固体培养基表面划线，活化培养，培养温度28℃，培养时间48h，获得活化后酿酒酵母菌和红曲霉菌；然后分别将活化后的酿酒酵母菌和红曲霉菌通过接种环接种至含有氯硝胺18％甘油培养基的发酵摇瓶中进行扩培，培养温度为28℃，转速150r/min，培养24h后，得到酿酒酵母菌和红曲霉菌的种子液，在种子液中，酿酒酵母菌和红曲霉菌的浓度均为1×108CFU/mL；
3)藏红花原料处理：称取3kg藏红花(花干或花柱)，用粉碎机打碎，过40目筛网，注入97kg氯硝胺18％甘油培养基，使藏红花的质量分数为3.0％，将发酵罐密闭，升温至120℃，保持30min进行灭菌处理，然后降温至室温，获得发酵培养基；
4)发酵培养：将2％(体积分数)酿酒酵母菌种子液、2％(体积分数)红曲霉菌种子液加入含有3％(质量分数)藏红花的发酵培养基中，利用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液调节发酵罐内料液pH为6.0，在32℃，转速150r/min下发酵48h，得到发酵液；
5)发酵物灭菌：将上述发酵物利用巴氏灭菌法，在灭活处理温度为110℃的条件下灭活处理60s；完成对微生物的灭活处理；
6)纯化：待发酵液完成降温后，向发酵罐中加入发酵液质量分数1.0％脱色活性炭，静置吸附15min后，利用板框压滤机过滤，将滤液再依次经过10μm、5.0μm及2.5μm的聚丙烯微滤膜滤柱除去杂质，得到滤液88.0kg。
实施例3
1)配置固体培养基、液体种子培养基和液体培养基；
本实施例中选用PDA固体培养基作为固体培养基，其中固体培养基的制备步骤为：将新鲜马铃薯洗净去皮，称取200g马铃薯切块，加水煮烂(煮沸30min)，利用300目滤布过滤残渣，在滤液中添加琼脂20g，葡萄糖20g，再补足水分至1L，120℃灭菌20min冷却后贮存备用。
本实施例中选用YES培养基作为种子液体培养基，其中YES培养基的配置方法是：酵母提取物3.0g、葡萄糖20g、NaCl 60g、CuSO4·5H2O 0.008g、ZnSO40.03g、氯硝胺0.01g、氯霉素0.3g，蒸馏水加至1L，灭菌，备用；所述灭菌是在130℃灭菌20min。
2)菌株活化与扩培：将酿酒酵母种、红曲霉菌菌种分别溶于无菌水制成菌悬液，分别移取3μL菌悬液在PDA固体培养基表面划线，活化培养，培养温度30℃，培养时间36h，获得活化后的酿酒酵母菌和红曲霉菌；然后分别将活化后的酿酒酵母菌、红曲霉菌通过接种环接种至含有沙氏液体培养基的发酵摇瓶中进行扩培，培养温度为30℃，转速200r/min，培养58h后，得到酿酒酵母菌和红曲霉菌的种子液，在种子液中，酿酒酵母菌和红曲霉菌的浓度均为1×1010CFU/mL；
3)藏红花原料处理：称取5kg藏红花(花柱或花干)，粉碎机打碎，过60目筛网，注入95kg沙氏液体培养基，使藏红花的质量分数为5.0％，将发酵罐密闭，升温至120℃，保持30min进行灭菌处理，然后降温至室温，获得发酵培养液；
4)发酵培养：将2％(体积分数)酿酒酵母EBY100种子液、3％(体积分数)红曲霉菌加入含有5％(质量分数)藏红花的沙氏液体培养基中，利用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液调节发酵罐内料液pH为6.8，在35℃，转速200r/min下发酵48h，得到发酵液；
5)发酵物灭菌：将上述发酵物利用巴氏灭菌法，在灭活处理温度为110℃的条件下灭活处理30s，完成对微生物的灭活处理；
6)纯化：待发酵液完成降温后，向发酵罐中加入发酵液质量分数2％脱色活性炭，静置吸附20min后，利用板框压滤机过滤，将滤液再依次经过10μm、5.0μm及2.5μm的聚丙烯微滤膜滤柱除去杂质，得到滤液90.0kg。
对比例1
利用粉碎机将5kg藏红花粉碎处理，过60目筛网，按照料液质量比为5：95，加入95kg的纯水，80℃温度、匀速200r/min搅拌条件下提取6h；加入0.5％质量分数的活性炭，搅拌20min后利用板框压滤机过滤，将滤液再依次经过10μm、5.0μm及2.5μm的聚丙烯微滤膜滤柱除去杂质，得到滤液88.3kg。
对比例2
利用粉碎机将5kg藏红花干粉碎处理，过60目筛网，按照料液质量比为5：95，加入95kg质量分数为70％的乙醇溶液超声提取1h，得到藏红花提取物，其中超声波温度为60℃，超声波频率为59kHz、超声波功率为600W；加入0.5％质量分数的活性炭，搅拌20min后利用板框压滤机过滤，将滤液再依次经过10μm、5.0μm及2.5μm的聚丙烯微滤膜滤柱除去杂质，得到滤液87.8kg。
性能测试
本发明制备的藏红花发酵物中藏红花苷I、藏红花苷II的成分含量采用高效液相色谱发进行测定，具体方法参照西红花中西红花苷-1和西红花苷-2含量测定方法的建立[J],药物分析杂志,2006,26(9):1270-1273；藏红花素的含量测试方法参照GB 5009.149-2016《食品安全国家标准食品中栀子黄的测定》中的标准，利用高效液相色谱法检测藏红花素；藏红花多糖的含量测试方法参照《中国药典》苯酚-硫酸法，l利用紫外分光光度计法进行多糖含量的测试。
如图1-图6所示，表1为实施例1～3和对比例1～2制备的藏红花提取物的活性成分含量表，具体如从表1(a)和表1(b)所示；其中图1和图2为本发明中实施例1所提供的臧红花发酵物测试所得的活性成分含量表：
表1(a)实施例1～3和对比例1～2中活性成分的含量情况表
表1(b)实施例1～3和对比例1～2中活性成分的提取率情况表
| 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 对比例1 | 对比例2 | |
| 藏红花苷1(％) | 98.61 | 92.94 | 95.46 | 34.95 | 52.21 |
| 藏红花苷II(％) | 98.57 | 90.43 | 91.64 | 35.71 | 51.50 |
| 藏红花素(％) | 98.35 | 96.69 | 95.45 | 41.32 | 74.38 |
| 藏红花多糖(％) | 91.11 | 88.88 | 90.37 | 51.11 | 31.85 |
从表1(a)和表1(b)可知，实施例1、实施例2和实施例3使用本制备方法得到的藏红花发酵物中藏红花苷I、藏红花苷II、藏红花素、藏红花多糖的含量明显高于对比例1水提法和对比例2醇水提取法制备的藏红花提取物中活性物含量：本发明制备的藏红花发酵物中藏红花苷I含量为0.1800％-0.1920％，提取率高于92％；藏红花苷II含量为0.1200％-0.1400％，提取率高于90％；藏红花素含量为2.3000％-2.4000％，提取率高于95％；藏红花多糖含量为1.2000％-1.3000％，提取率高于88％。对比例1中藏红花苷I含量为0.0678％，藏红花苷II含量为0.0500％，藏红花素含量为1.000％，藏红花多糖含量为0.6900％；对比例2中藏红花苷I含量为0.1013％，藏红花苷II含量为0.0721％，藏红花素含量为1.8000％，藏红花多糖含量为0.4300％。因此，利用本发明所提供的制备方法可以制备具有高含量的藏红花苷I、藏红花苷II、藏红花素和藏红花多糖的藏红花发酵物。
效果实施例
本发明所提供的臧红花发酵物主要用于化妆品中，作为辅助材料加入；本发明通过对实施例1-3与对比例1-2的藏红花发酵物(提取物)进行抗氧化、抗糖化效果检验对比，结果如下所述：
1)抗氧化性能测试
利用DPPH法测试本发明所提供的藏红花发酵物对自由基的清除效果。DPPH又称1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，具有单电子，在517nm处有一强吸收，其无水乙醇溶液呈紫色的特性；当有自由基清除剂存在时，由于与其单电子配对而使其吸收逐渐消失，其褪色程度与其接受的电子数量成定量关系，因而可用分光光度计进行快速的定量分析。
测试方法：
按以下表2依次加样，其中，DPPH-乙醇溶液由以下步骤制备得到：称取1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(Macklin，纯度>96％)12mg溶解于无水乙醇中，加入乙醇定容至250mL棕色容量瓶。DPPH-乙醇溶液临用时现配。样品溶液由以下步骤制备得到：分别移取实施例1-3及对比例1-2的组合物1mL，加入去离子水定容至10mL棕色容量瓶，得到稀释10倍后的样品溶液。
表2样品加液要求
| 试剂 | T-样品管 | T0-样品本底 | C-DPPH管 | C0-溶剂本底 |
| 样品溶液(mL) | 1 | 1 | — | — |
| 水(mL) | 2 | 2 | 3 | 3 |
| DPPH-乙醇溶液(mL) | 1 | — | 1 | — |
| 无水乙醇(mL) | — | 1 | — | 1 |
扫描C-DPPH组的最大吸收波长，在最大吸收波长处检测吸光度值。测量结果显示，溶液在517nm处有最大吸收峰。将各支试管反应溶液混匀后，移入3cm比色皿中，测量每组溶液在517nm的吸光度。
清除率计算公式为：
式中：
T—样品管吸光值，即样品与DPPH反应后溶液吸光值；
T0—样品本底吸光值；
C—DPPH管吸光值，即未加样品时DPPH溶液吸光值；
C0—溶剂本底吸光值。
取三次测量平均值，测试结果如下表3所示：
表3不同样品的清除自由基效果
从表3可以看出，本发明实施例1-3对自由基的清除率均≥95％；而对比例1以及对比例2可知，对自由基清除率均低于75％。实验证明，使用本发明所提供的制备方法制备所得的藏红花发酵液的抗氧化效果明显高于对比例1水提法和对比例2醇水提取法制备的藏红花提取物的抗氧化效果。
2)抗糖化性能测试
糖基化反应是皮肤衰老的重要机制，发生在皮肤内部的还原糖与基质蛋白之间。非酶糖基化是一系列复杂的非酶促反应，蛋白质和葡萄糖在体内发生非酶促反应形成Schiff碱和Amadori产物等早期糖基化产物，进而经过氧化、重排、交联等过程，形成不可逆的非酶糖基化终产物(AGEs)，其储存在组织中与其受体(RAGE)连接，损伤皮肤的形态和生理活动。因此，能够有效清除AGEs的物质提示具有抗衰老的功效。AGEs可自发荧光，在特定波长下检测荧光强度，可以得到化妆品原料的抗糖基化效果。
测试方法:
(1)BSA-葡萄糖建模：将0.05mol/L的PBS缓冲液(pH＝7.4)，8mg/mL的牛血清白蛋白溶液(BSA)及0.2mol/L的葡萄糖溶液在60℃下避光反应40h，得到BSA-葡萄糖糖化模型溶液(注意，PBS、牛血清白蛋白和葡萄糖浓度为混合溶液中的终浓度)；
(2)取样：准确移取200μL不同样品溶液(样品溶液为抗氧化性能测试里面稀释10倍后得到的样品溶液)与300μLBSA-葡萄糖糖化模型溶液混合均匀，避光反应0.5-1h；
(3)FAGEs的检测：AGEs衍生的荧光可以通过酶标仪在370nm激发波长和440nm发射波长条件下检测；
(4)数据分析:
FAGEs抑制率(％)＝[1-(A-B)/(C-D)]×100％
其中：A——添加受试物的葡萄糖溶液的荧光强度；
B——添加受试物的超纯水溶液的荧光强度，即将步骤(2)中的300μLBSA-葡萄糖糖化模型溶液替换为300μL的超纯水；
C——没有受试物，但有葡萄糖溶液的荧光强度；即将步骤(2)中的200μL不同样品溶液替换为200μL的超纯水；
D——没有受试物，没有葡萄糖溶液的荧光强度，即为超纯水的荧光强度。
取三次测量平均值，测试结果如下表4所示：
表4不同样品的抗糖基化效果
从表4可以看出，本发明实施例1-3对糖基化方应的抑制率均≥95％；而对比例1以及对比例2可知，对糖基化方应的抑制率均低于65％。实验证明，使用本发明所提供的制备方法获得的藏红花发酵物的抗糖化效果明显高于对比例1水提法和对比例2醇水提取法制备的藏红花提取物的抗糖化效果。
实施例4
重复实施例2，不同的是将液体种子培养基和液体培养基选用高盐察氏培养基、孟加拉红培养基，所得结果与实施例2基本相同。
实施例5
重复实施例2，不同的是将液体种子培养基和液体培养基选用沙氏液体培养基、高盐察氏培养基、氯硝胺18％甘油培养基、孟加拉红培养基或YES培养基中任意两种以上的组合物，所得结果与实施例2基本相同。
以上，仅为本发明较佳的具体实施方式，但发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。
Claims (10)
1.一种藏红花发酵物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)菌柱活化与扩培：将酿酒酵母菌和红曲霉菌接入液体种子培养基中进行培养，获得种子液；
2)发酵培养：取步骤1)所得的种子液，接种至发酵罐的发酵培养基中发酵获得发酵液；其中所述发酵培养基包括藏红花和液体培养基；所述藏红花为发酵培养基质量分数的1％～5％；
3)发酵物灭活：将步骤2)制备所得的发酵液进行灭活处理；
4)纯化：将灭活处理后的发酵液进行多次纯化处理后，即得藏红花发酵物。
2.根据权利要求1所述的藏红花发酵物的制备方法，其特征在于，步骤1)中，所述培养的条件为培养温度为25～37℃，转速为100～300r/min，培养时间为24～72h；在所述种子液中，所述酿酒酵母菌和红曲霉菌的浓度均为1×107～1×1010CFU/mL。
3.根据权利要求2所述的藏红花发酵物的制备方法，其特征在于，在进行步骤1)之前还包括：活化所述酿酒酵母菌和红曲霉菌，所述活化步骤为：将酿酒酵母菌种、红曲霉菌种分别配成酿酒酵母菌悬液和红曲霉菌悬液，然后将所述酿酒酵母菌悬液和红曲霉菌悬液接种于固体培养基，于25-35℃的温度下活化培养36-72小时，得到活化的酿酒酵母菌以及红曲霉菌，所述固体培养基为PDA固体培养基或DRBC琼脂固体培养基中的一种或两种的组合物。
4.根据权利要求3所述的藏红花发酵物的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述发酵条件为于发酵温度25～37℃、pH为6.0～7.0和转速为100～300r/min的条件下发酵24～72h。
5.根据权利要求4所述的藏红花发酵物的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述藏红花经过粉碎机打碎，过40-80目筛网过滤，所述pH值通过柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液进行调节，所述种子液的接种量为所述发酵培养基中液体培养基体积百分比的1％～5％。
6.根据权利要求1所述的藏红花发酵物的制备方法，其特征在于，所述液体种子培养基和液体培养基均为沙氏液体培养基、高盐察氏培养基、氯硝胺18％甘油培养基、孟加拉红培养基或YES培养基中的一种或任意两种以上的组合物。
7.根据权利要求1所述的藏红花发酵物的制备方法，其特征在于，步骤3)中所述灭活处理的条件为灭活温度为90～110℃，灭活处理的时间为30～120s。
8.根据权利要求7所述的藏红花发酵物的制备方法，其特征在于，其中步骤4)中所述纯化处理包括发酵液脱色处理、过滤去渣和过微滤膜。
9.一种藏红花发酵物，由权利要求1-8中任一项所述的制备方法制得。
10.权利要求9所述的藏红花发酵物在化妆品中的应用。
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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