CN114558040B

CN114558040B - 一种用于缓解视疲劳的灵芝糖类提取物及其制备方法

Info

Publication number: CN114558040B
Application number: CN202210174982.0A
Authority: CN
Inventors: 李晓; 王学方; 范毅; 陈玲; 宁二娟; 于立芹; 王伟; 魏悦; 朱杰; 张丽先; 魏磊
Original assignee: Henan Napu Biotechnology Co ltd; Henan Academy of Sciences
Current assignee: Henan Napu Biotechnology Co ltd; Henan Academy of Sciences
Priority date: 2022-02-25
Filing date: 2022-02-25
Publication date: 2023-02-28
Anticipated expiration: 2042-02-25
Also published as: CN114558040A

Abstract

本发明涉及一种用于缓解视疲劳的灵芝糖类提取物的制备方法，其将粉碎过的灵芝干燥子实体与含发酵菌和生物酶的水溶液混合，经发酵、酶解；加水提取，过滤，脱色，浓缩，醇沉，再次过滤，获得沉淀和滤液；滤液回收乙醇，浓缩液注入大孔吸附树脂中，收集水洗脱部分，浓缩，冷冻干燥，得灵芝糖类提取物Ⅰ；沉淀加水溶解后，超滤，收集截留液，减压浓缩，冷冻干燥，得灵芝糖类提取物Ⅱ；所述灵芝糖类提取物Ⅱ和/或灵芝糖类提取物Ⅰ即为灵芝糖类提取物；其能显著清除自由基、保护视网膜上皮细胞、降低氧化应激压力等，制成滴眼液、眼用凝胶或洗眼液等，具有温和无刺激、无毒副作用、有效缓解视疲劳等优点。

Description

一种用于缓解视疲劳的灵芝糖类提取物及其制备方法

技术领域

本发明属于天然药物领域，具体涉及一种用于缓解视疲劳的灵芝糖类提取物及其制备方法。

背景技术

随着视频终端（如电脑、手机等）的广泛应用，特别是目前VR、3D游戏、手机网游等的推行，视疲劳患者日益增多，64％～90％电脑使用者及70％干眼患者均有视疲劳症状，患者通常表现为眼痛、眼干、眼胀、眼痒、眼部充血、眼部有异物感、视物模糊、重影、畏光流泪等症状，进一步会导致视力下降、青光眼、白内障、致盲等，严重影响了患者的视觉和生活质量。

常见缓解视疲劳的方法有药物治疗、屈光不正矫正、中医治疗、视力训练等，其中，药物治疗是较为方便有效的治疗手段。现有缓解视疲劳的药物中，化学成分如萘扑维、萘敏维等会产生一定的副作用，长期使用会使泪液分泌减少，导致泪液分泌功能退化，且该类成分滴眼液对有心血管疾病、糖尿病、甲状腺功能亢进等患者慎用；含中药成分滴眼液，如熊胆粉滴眼液、四味珍层冰硼滴眼液、七叶洋地黄双苷滴眼液等，使用时有一定的刺激性，且对一些过敏体质人群，用药后会有眼痒、眼睑皮肤肿胀等情况出现；人工泪液以聚乙烯醇、羧甲基纤维素钠、玻璃酸钠等为主要成分，渗透压和pH值与泪液相近，无刺激性，可不同程度地缓解眼睛干涩症状，但其只是对症治疗，治标不治本。

本发明灵芝多糖和低聚糖组合物能保护视网膜上皮细胞、显著清除自由基、降低氧化应激压力等，将其制成眼部药物，具有温和无刺激、无毒副作用、有效缓解视疲劳等优点。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种用于缓解视疲劳的灵芝糖类提取物及其制备方法，该组合物能保护视网膜上皮细胞、显著清除自由基、降低氧化应激压力等，可以有效缓解视疲劳，且温和无刺激、无毒副作用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于缓解视疲劳的灵芝糖类提取物的制备方法，其包括如下步骤：

1）将粉碎过的灵芝干燥子实体按质量比1:3-6与含发酵菌和生物酶的水溶液进行混合，然后于25-45℃发酵12-24h，再升温至40-60℃酶解2-5h；

2）加入灵芝干燥子实体6-12重量倍的水于85-100℃提取0.5-2 h，过滤，提取液脱色后浓缩至相对密度为1.04-1.14，加乙醇至终浓度为60%-80%（体积浓度），放置12-36h进行醇沉，再次过滤，获得沉淀和滤液；，

3）滤液回收乙醇，得浓缩液，浓缩液注入大孔吸附树脂（大孔吸附树脂为非极性大孔树脂，如D101、HP20、LSA-30、HPD200A等）中，收集水洗脱部分，浓缩至相对密度为1.06-1.12，冷冻干燥，得灵芝糖类提取物Ⅰ；沉淀加水溶解后，通过分子量2000Da的超滤膜，收集截留液，减压浓缩至相对密度为1.06-1.12，冷冻干燥，得灵芝糖类提取物Ⅱ；

4）所述灵芝糖类提取物Ⅰ和/或灵芝糖类提取物Ⅱ，即为灵芝糖类提取物，总糖含量在95%以上。

具体的，步骤1）中，所述含发酵菌和生物酶的水溶液中，发酵菌含量为灵芝干燥子实体重量的0.5%-1.5%，生物酶含量为灵芝干燥子实体重量的1%-3%；所述发酵菌由体积比1-3：1-2：1-4的植物乳杆菌菌液、嗜酸乳杆菌菌液和酵母菌菌液混合组成，植物乳杆菌菌液、嗜酸乳杆菌菌液和酵母菌菌液的浓度均为10⁹cfu/ml；所述生物酶由质量比1-5：0.5-2的纤维素酶和蛋白酶混合组成。

具体的，步骤2）中，加入灵芝干燥子实体6-10重量倍的水于85-100℃提取0.5-2h，过滤，滤渣中再加入灵芝干燥子实体8-12重量倍的水于85-100℃提取0.5-2 h，过滤，弃去滤渣，合并两次提取液进行脱色。

进一步的，步骤2）中，提取液中加入脱色剂于60-80℃脱色0.5-1h；所述脱色剂由质量比1-3：0-2：0-1的活性炭、活性白土和硅藻土混合组成，脱色剂添加量为灵芝干燥子实体重量的5%-15%。

具体的，步骤3）中，冷冻干燥条件为：真空度10-100Pa条件下于-10℃~ -20℃冷冻干燥3-6h。

本发明提供了采用上述制备方法制备得到的用于缓解视疲劳的灵芝糖类提取物。

本发明还提供了一种包含上述用于缓解视疲劳的灵芝糖类提取物的复方制剂。进一步的，所述复方制剂可以为滴眼液、眼用凝胶、洗眼液等，在缓解眼干、眼涩、眼疲劳方面有较好效果。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

1）本发明灵芝糖类提取物从灵芝子实体中提取精制制成，能显著清除自由基、保护视网膜上皮细胞、降低氧化应激压力等，将其制成滴眼液、眼用凝胶、洗眼液，具有温和无刺激、无毒副作用、有效缓解视疲劳等优点；

2）本发明灵芝糖类提取物总糖含量可达95%以上，具有保水性、成膜性，可显著缓解泪膜破裂等，在保护视网膜的同时，兼具缓解眼干、眼涩功效，针对眼疲劳可达到标本兼治的效果。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。

本发明中，菌种为普通市售产品，其它原料均为本领域可以直接买到的普通市售产品。

实施例中，所用菌种均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心CICC；其中，植物乳杆菌Lactobacillus plantarum subsp. plantarum （菌株编号CICC 20272）；嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus（CICC 20985）；酵母菌Saccharomyces cerevisiae（菌株编号CICC 1001）。

菌液配制方法如下：

乳杆菌：在无菌操作条件下，取购买到的植物乳杆菌或嗜酸乳杆菌冻干粉菌种，接种于装有10mL MRS培养基的试管中，充分振荡后，37℃静置培养48h，然后以 5 %的接种量继续培养传代，传代三次后，取第三代菌液 4℃保存，备用。临用前加入适量无菌生理盐水，调节菌液浓度为10⁹cfu/ml；

酵母菌：在无菌操作条件下，取购买到的酵母菌接种于10mL 麦芽汁琼脂培养基的试管中，充分振荡后，38-40℃ 静置培养24h，然后以5 %的接种量继续培养传代，传代三次后，取第三代菌液 4℃保存，备用。临用前加入适量无菌生理盐水，调节菌液浓度为10⁹cfu/ml。

所用纤维素酶、蛋白酶，均购自夏盛（北京）生物科技发展有限公司，酶活力为100u/mg。

所用大孔吸附树脂D101、LSA-30购自西安蓝晓科技有限公司。

所用 MRS培养基、麦芽汁琼脂培养基、胰蛋白酶-EDTA消化液(0.25%)均购买自北京索莱宝科技有限公司。

总糖含量测定参照《GB/T 15672 食用菌中总糖含量的测定》进行。

实施例1

1）将粉碎过的灵芝干燥子实体按质量比1:4与含发酵菌和生物酶的水溶液进行混合，然后于28℃发酵24h，再升温至45℃酶解5h；

所述含发酵菌和生物酶的水溶液中，发酵菌含量为灵芝干燥子实体重量的1.0%，生物酶含量为灵芝干燥子实体重量的2%；所述发酵菌由体积比1：1：1的植物乳杆菌菌液、嗜酸乳杆菌菌液和酵母菌菌液混合组成，植物乳杆菌菌液、嗜酸乳杆菌菌液和酵母菌菌液的浓度均为10⁹个/ml；所述生物酶由质量比3：1的纤维素酶和蛋白酶混合组成；

2）加入灵芝干燥子实体10重量倍的水于90℃提取1 h，过滤，滤渣中再加入灵芝干燥子实体8重量倍的水于90℃提取1 h，过滤，弃去滤渣，合并两次提取液进行脱色。提取液脱色后浓缩至相对密度为1.04，加乙醇至终浓度为65%（体积浓度），放置24h进行醇沉，再次过滤，获得沉淀和滤液；脱色具体为：提取液中加入脱色剂于70℃脱色1h；所述脱色剂由质量比1：1：1的活性炭、活性白土和硅藻土混合组成，脱色剂添加量为灵芝干燥子实体重量的10%。

3）滤液回收乙醇至无醇，得浓缩液，浓缩液注入大孔吸附树脂D101中，收集水洗脱部分，浓缩至相对密度为1.06，冷冻干燥（真空度20Pa条件下于-20℃冷冻干燥3h，下同），得灵芝糖类提取物Ⅰ（总糖含量96.2%）；沉淀加水溶解后，通过分子量2000Da的超滤膜，收集截留液，减压浓缩至相对密度为1.06，冷冻干燥，得灵芝糖类提取物Ⅱ（总糖含量98.3%）。

实施例2

1）将粉碎过的灵芝干燥子实体按质量比1:5与含发酵菌和生物酶的水溶液进行混合，然后于40℃发酵12h，再升温至60℃酶解2h；

所述含发酵菌和生物酶的水溶液中，发酵菌含量为灵芝干燥子实体重量的1.5%，生物酶含量为灵芝干燥子实体重量的3%；所述发酵菌由体积比2：1：3的植物乳杆菌菌液、嗜酸乳杆菌菌液和酵母菌菌液混合组成，植物乳杆菌菌液、嗜酸乳杆菌菌液和酵母菌菌液的浓度均为10⁹cfu/ml；所述生物酶由质量比2：1的纤维素酶和蛋白酶混合组成；

2）加入灵芝干燥子实体10重量倍的水于95℃提取1 h，过滤，滤渣中再加入灵芝干燥子实体8重量倍的水于90℃提取1 h，过滤，弃去滤渣，合并两次提取液进行脱色。提取液脱色后浓缩至相对密度为1.14，加乙醇至终浓度为75%（体积浓度），放置24h进行醇沉，再次过滤，获得沉淀和滤液；脱色具体为：提取液中加入脱色剂于70℃脱色1h；所述脱色剂由质量比2：1：1的活性炭、活性白土和硅藻土混合组成，脱色剂添加量为灵芝干燥子实体重量的15%。

3）滤液回收乙醇至无醇，得浓缩液，浓缩液注入大孔吸附树脂LSA-30中，收集水洗脱部分，浓缩至相对密度为1.12，冷冻干燥（真空度50Pa条件下于-15℃冷冻干燥4h，下同），得灵芝糖类提取物Ⅰ（总糖含量95.7%）；沉淀加水溶解后，通过分子量2000Da的超滤膜，收集截留液，减压浓缩至相对密度为1.12，冷冻干燥，得灵芝糖类提取物Ⅱ（总糖含量96.5%）。

应用试验

将实施例1制备所得灵芝糖类提取物Ⅰ、灵芝糖类提取物Ⅱ及其两者复配的组合物进行对光诱导的人视网膜色素上皮细胞(hRPE)的保护作用试验。

光损伤参与的氧化应激反应是视网膜损伤的主要机制，光损害会导致视网膜功能异常、引发视疲劳、甚至视力丧失。本试验采用持续光照诱导hRPE细胞损伤，考察灵芝糖类提取物Ⅰ、灵芝糖类提取物Ⅱ及其两者复配的组合物对损伤细胞模型的保护作用。

1.样品制备

灵芝糖类提取物Ⅰ溶液的制备：称取5mg 灵芝糖类提取物Ⅰ粉末，用5mL 1640完全培养基溶解，涡旋振荡混匀制成终浓度为1mg/mL的灵芝糖类提取物Ⅰ母液，滤器过滤，取上述母液，用1640完全培养基稀释至相应浓度，进行试验。

灵芝糖类提取物Ⅱ溶液的制备：同上法配制灵芝糖类提取物Ⅱ溶液。

按不同浓度比例配制灵芝糖类提取物Ⅰ和灵芝糖类提取物Ⅱ的复配组合物。

2.hRPE细胞培养与光损伤模型

细胞培养：配制含有10%胎牛血清、1%青链霉素的1640完全培养基，将细胞置于37℃、5%CO₂密闭的培养箱中培养，每天换液1次，细胞生长融合至80%，用胰蛋白酶-EDTA消化液(0.25%)消化细胞，镜下观察呈花斑状时随即用1640完全培养基终止，以1：3比例传代，取对数生长期的4代细胞用于实验。

光损伤模型：将LED冷光灯置于培养箱内，采用直落式照射，检测光照强度，给予模型组及各试验组持续光照时间为24h且光照强度为（16500±200）Lux照射。光照在无自然光干扰的37℃、5%CO₂密闭的培养箱内进行，排除温度上升引起细胞光热损伤的可能。细胞在接受光照时，正常组细胞培养板以不透光黑布遮盖，其它各组细胞均在相同孵箱内培养。

3.试验分组及方法

1.正常组：正常hRPE细胞组；

2.模型组：正常hRPE细胞+光照射组；

3.灵芝糖类提取物Ⅰ组：正常 hRPE 细胞+光照射前2h+0.1mg/mL灵芝糖类提取物Ⅰ；

4.灵芝糖类提取物Ⅱ组：正常hRPE细胞+光照射前2h+0.1mg/mL灵芝糖类提取物Ⅱ；

5.灵芝糖类提取物Ⅰ:灵芝糖类提取物Ⅱ=1:1组：正常hRPE细胞+光照射前2h+0.05mg/mL灵芝糖类提取物Ⅰ+0.05mg/mL灵芝糖类提取物Ⅱ；

6.灵芝糖类提取物Ⅰ:灵芝糖类提取物Ⅱ=1:4组：正常hRPE细胞+光照射前2h+0.02mg/mL灵芝糖类提取物Ⅰ+0.08mg/mL灵芝糖类提取物Ⅱ；

7.灵芝糖类提取物Ⅰ:灵芝糖类提取物Ⅱ=1:9组:正常hRPE细胞+光照射前2h+0.01mg/mL灵芝糖类提取物Ⅰ+0.09mg/mL灵芝糖类提取物Ⅱ；

8.灵芝糖类提取物Ⅰ:灵芝糖类提取物Ⅱ=4:1组：正常hRPE细胞+光照射前2h+0.08mg/mL灵芝糖类提取物Ⅰ+0.02mg/mL灵芝糖类提取物Ⅱ；

9.灵芝糖类提取物Ⅰ:灵芝糖类提取物Ⅱ=9:1组：正常hRPE细胞+光照射前2h+0.09mg/mL灵芝糖类提取物Ⅰ+0.01mg/mL灵芝糖类提取物Ⅱ。

实验于光照前2h在各组别加入20ul不同浓度的受试品溶液，于光照结束后6h检测，其中采用MTT法检测细胞存活率，采用流式细胞仪检测细胞中活性氧ROS含量，采用ELISA法测定细胞中超氧化物歧化酶SOD、丙二醛MDA的含量。

4.结果见下表。

注：同一列，不同的字母表示组间差异显著（P<0.01）.

上表的结果显示：与正常组比较，模型组细胞存活率显著降低（P<0.01），细胞中SOD含量显著降低（P<0.01），ROS水平和MDA含量显著升高（P<0.01），说明强光照射导致hRPE细胞的损伤。与模型组相比，灵芝糖类提取物Ⅰ、灵芝糖类提取物Ⅱ组及其不同浓度配比组合物组均能显著提高细胞存活率（P<0.01），细胞中SOD含量显著升高（P<0.01），ROS水平和MDA含量显著降低（P<0.01），其中以灵芝糖类提取物Ⅰ:灵芝糖类提取物Ⅱ=1:4组效果最佳，灵芝糖类提取物Ⅱ组、灵芝糖类提取物Ⅰ:灵芝糖类提取物Ⅱ=1:1组、1:9组、4:1组、9:1组与其比较无显著性差异。

结论：hRPE 细胞位于脉络膜和感光细胞层之间，为感光细胞层提供营养。如果hRPE 细胞发生氧化损伤，感光细胞就会很快发生分解，视力会明显受损。本发明的试验结果表明：灵芝糖类提取物Ⅰ、灵芝糖类提取物Ⅱ及其不同浓度配比的组合物均能显著提高光损伤hRPE 细胞的存活率，有效降低光诱导损伤后hRPE 细胞的 ROS 水平和 MDA 含量，并且能对细胞抗氧化酶SOD 的活性有促进和提高，说明灵芝糖类提取物Ⅱ和灵芝糖类提取物Ⅰ及其组合物可通过清除自由基、缓解氧化应激，起到保护视网膜上皮细胞的作用。

Claims

1.一种用于缓解视疲劳的灵芝糖类提取物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

2）加入灵芝干燥子实体6-12重量倍的水于85-100℃提取0.5-2 h，过滤，提取液脱色后浓缩至相对密度为1.04-1.14，加乙醇至终浓度为60%-80%，放置12-36h进行醇沉，再次过滤，获得沉淀和滤液；

3）滤液回收乙醇，得浓缩液，浓缩液注入大孔吸附树脂中，收集水洗脱部分，浓缩至相对密度为1.06-1.12，冷冻干燥，得灵芝糖类提取物Ⅰ；沉淀加水溶解后，通过分子量2000Da的超滤膜，收集截留液，减压浓缩至相对密度为1.06-1.12，冷冻干燥，得灵芝糖类提取物Ⅱ；

4）所述灵芝糖类提取物Ⅰ和/或灵芝糖类提取物Ⅱ，即为灵芝糖类提取物；

步骤1）中，所述含发酵菌和生物酶的水溶液中，发酵菌含量为灵芝干燥子实体重量的0.5%-1.5%，生物酶含量为灵芝干燥子实体重量的1%-3%；所述发酵菌由体积比1-3：1-2：1-4的植物乳杆菌菌液、嗜酸乳杆菌菌液和酵母菌菌液混合组成，植物乳杆菌菌液、嗜酸乳杆菌菌液和酵母菌菌液的浓度均为10⁹cfu/ml；所述生物酶由质量比1-5：0.5-2的纤维素酶和蛋白酶混合组成。

2.如权利要求1所述用于缓解视疲劳的灵芝糖类提取物的制备方法，其特征在于，步骤2）中，加入灵芝干燥子实体6-10重量倍的水于85-100℃提取0.5-2 h，过滤，滤渣中再加入灵芝干燥子实体8-12重量倍的水于85-100℃提取0.5-2 h，过滤，弃去滤渣，合并两次提取液进行脱色。

3.如权利要求2所述用于缓解视疲劳的灵芝糖类提取物的制备方法，其特征在于，步骤2）中，提取液中加入脱色剂于60-80℃脱色0.5-1h；所述脱色剂由质量比1-3：0-2：0-1的活性炭、活性白土和硅藻土混合组成，脱色剂添加量为灵芝干燥子实体重量的5%-15%。

4.如权利要求1所述用于缓解视疲劳的灵芝糖类提取物的制备方法，其特征在于，步骤3）中，冷冻干燥条件为：真空度10-100Pa条件下于-10℃~ -20℃冷冻干燥3-6h。

5.采用权利要求1至4任一所述制备方法制备得到的用于缓解视疲劳的灵芝糖类提取物。

6.一种由权利要求5所述用于缓解视疲劳的灵芝糖类提取物制成的复方制剂。

7.如权利要求6所述的复方制剂，其特征在于，所述复方制剂为滴眼液、眼用凝胶、洗眼液。