CN116445370B - 一种缓解干眼症的短双歧杆菌jybf-117及其菌剂和应用 - Google Patents

一种缓解干眼症的短双歧杆菌jybf-117及其菌剂和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物应用技术领域，具体涉及一种缓解干眼症的短双歧杆菌JYBF‑117及其菌剂和应用。短双歧杆菌（Bifidobacterium breve）JYBF‑117于2022年3月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.24536。该菌株制成的短双歧杆菌JYBF‑117菌剂可以有效缓解环境诱导或维生素A缺乏形成的干眼症，增加泪液分泌量，提高泪膜稳定性，抑制干眼症相关炎症因子IL‑1β、IL‑6、TNF‑α的表达，减轻炎症发生程度。而且该菌剂使用方法简便，治疗效果显著，患者接受度高。

Description

一种缓解干眼症的短双歧杆菌JYBF-117及其菌剂和应用
技术领域
本发明涉及微生物应用技术领域，具体涉及一种缓解干眼症的短双歧杆菌JYBF-117及其菌剂和应用。
背景技术
干眼症又称角结膜干燥症，是指由多种因素所导致的、以眼睛干涩为主要症状的泪液分泌障碍性眼病。干眼症常见症状包括眼睛干涩、容易疲倦、眼痒、有异物感、痛灼热感、分泌物黏稠、怕风、畏光、对外界刺激很敏感；有时眼睛太干，基本泪液不足，反而刺激反射性泪液分泌，而造成常常流泪；较严重者眼睛会红肿、充血、角质化、角膜上皮破皮而有丝状物黏附，这种损伤日久则可造成角结膜病变，并会影响视力。最近研究认为，眼表面的改变、基于免疫的炎症反应、细胞凋亡、性激素水平的改变等是干眼症发生发展的相关因素，干眼症的病因可分为以下四类：先天性无泪腺、老年性泪腺功能降低或是一些自身免疫性疾病造成泪腺发炎、外伤、感染、自律神经失调或长期佩戴隐形眼镜，导致水液层泪腺泪液分泌不足；眼睑疾病造成睑板腺功能不良，导致油脂层分泌不足；缺乏维生素A1者、慢性结膜炎、化学性灼伤等，导致粘蛋白层分泌不足；眼睑疾病造成眼睑闭合不良、眨眼次数减少、长时间停留在冷气房或户外强风燥热的环境中，导致泪液过度蒸发、泪膜分布不均匀。
目前，西医治疗干眼症主要通过各类人工泪液、抗生素等缓解干眼症状，短期内见效较快，但是治标不治本。中医治疗干眼症一般为中药治疗或者针灸治疗，常用的中药有桑白皮汤、三仁汤等，针灸能够达到刺激穴位、疏通经络的作用，可以有效改善干眼症所引起的多种症状，但是部分患者较难接受中药味道或针灸治疗。
发明内容
针对现有干眼症治疗方法的效果较差或患者接受度低的问题，本发明提供一种缓解干眼症的短双歧杆菌JYBF-117及其菌剂和应用。
第一方面，本发明提供一种缓解干眼症的短双歧杆菌JYBF-117，短双歧杆菌（Bifidobacterium breve）JYBF-117于2022年3月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.24536。
第二方面，本发明提供一种短双歧杆菌JYBF-117菌剂，包括上述短双歧杆菌JYBF-117的菌粉。
进一步的，制备方法包括：
（1）制备MRS平板培养基和MRS液体培养基；
（2）取保藏的短双歧杆菌JYBF-117在MRS平板培养基上活化，将活化后菌接种于MRS液体培养基中，培养获得菌液；
（3）将菌液离心后，收集菌体，使用无菌生理盐水洗涤后，重悬于质量浓度为15%的复原脱脂乳中，调整悬浊液的浓度获得菌悬液，冷冻干燥获得菌粉；将菌粉与葡萄糖混合，制成短双歧杆菌JYBF-117菌剂。
进一步的，步骤（2）中，接种量为1%~2%，培养条件为35~37℃，培养时间为48~60h。
进一步的，步骤（3）中，调整悬浊液的浓度为1.0×1010~2.0×1010cfu/mL。
第三方面，本发明提供上述短双歧杆菌JYBF-117在制备缓解干眼症的产品方面的应用。
进一步的，缓解干眼症的产品为缓解环境诱导形成的干眼症的产品。
进一步的，缓解干眼症的产品为缓解维生素A缺乏引起的干眼症的产品。
进一步的，缓解干眼症的产品可以抑制炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α表达。
本发明的有益效果在于：
本发明提供的短双歧杆菌JYBF-117可制成菌剂，经实验证明，短双歧杆菌JYBF-117菌剂可以有效缓解环境诱导或维生素A缺乏形成的干眼症，增加泪液分泌量，提高泪膜稳定性，抑制干眼症相关炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达，减轻炎症发生程度。而且该菌剂使用方法简便，治疗效果显著，患者易接受。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例1
菌种的分离鉴定
1、菌株筛选及纯化
（1）菌株来源：婴幼儿粪便，于2021年9月采集于山东省潍坊市青州市；
（2）制备样品：
①取灭菌后的0.85%生理盐水至于无菌三角瓶中，然后将1g婴幼儿粪便加入其中，振荡，待用；
②对步骤①的溶液稀释制成不同浓度梯度的样品，分别为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，标号分别为1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#，待用；
（3）制备MRS平板培养基：将原料蛋白胨10g、牛肉粉5g、三水醋酸钠5g、七水磷酸氢二钾2g、吐温80 1mL、四水硫酸锰0.05g、柠檬酸三铵2g、葡萄糖20g、七水硫酸镁0.2g、琼脂15g、蒸馏水1000mL混合后，自然pH，搅拌菌液后，在121℃、0.1MPa下灭菌20min，将灭菌后的培养基倒入平皿中，放凉后待用；
（4）培养：将步骤②的1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#号溶液分别使用涂布器涂布MRS平板培养基上，于37℃、厌氧条件下培养48h；
（5）按照以下菌落特征挑选菌落：
菌落直径1~2mm，菌落圆润、边缘整齐、微白色中间有凸起；
（6）分离纯化：根据步骤（5）的菌落特征挑取5个单菌落，采用划线法接种至MRS平板培养基上，于37℃、厌氧条件下培养48h，挑取单菌落，置于甘油管中-70℃保藏。
2、鉴定
将分离纯化后得到的单菌落送去鉴定，鉴定单位：生工生物工程（上海）股份有限公司。
（1）鉴定过程中，使用的引物如下：
27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'
1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'
（2）鉴定过程中，得到菌株的基因序列如下：
TCACCTTAGACGGCTCCCTCCCGCAAGGGGTTAGGCCACCGGCTTCGGGTGCTGCCCACTTTCATGACTTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGCATTCACCGCGACGTTGCTGATTCGCGATTACTAGCGACTCCGCCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGACCGGTTTTCAGGGATCCGCTCCAGCTCGCACTGTCGCATCCCGTTGTACCGGCCATTGTAGCATGCGTGAAGCCCTGGACGTAAGGGGCATGATGATCTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGAGTTAACCCCGGCGGTCCCCCGTGAGTTCCCGGCACAATCCGCTGGCAACACGGGGCGAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACGACCATGCACCACCTGTGAACCCGCCCCGAAGGGAAACCCCATCTCTGGGATCGTCGGGAACATGTCAAGCCCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAATCCGCATGCTCCGCCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTTCTTTGAGTTTTAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGATGCTTAACGCGTTAGCTCCGACACGGAACCCGTGGAACGGGCCCCACATCCAGCATCCACCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTAACGGCCCAGAGACCTGCCTTCGCCATTGGTGTTCTTCCCGATATCTACACATTCCACCGTTACACCGGGAATTCCAGTCTCCCCTACCGCACTCAAGCCCGCCCGTACCCGGCGCGGATCCACCGTTAAGCGATGGACTTTCACACCGGACGCGACGAACCGCCTACGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGATAACGCTTGCACCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGTGCTTATTCGAAAGGTACACTCAACACAAAGTGCCTTGCTCCCTAACAAAAGAGGTTTACAACCCGAAGGCCTCCATCCCTCACGCGGCGTCGCTGCATCAGGCTTGCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTATCTCAGTCCCAATGTGGCCGGTCGCCCTCTCAGGCCGGCTACCCGTCGAAGCCATGGTGGGCCGTTACCCCGCCATCAAGCTGATAGGACGCGACCCCATCCCATGCCGCAAAGGCTTTCCCAACACACCATGCGGTGTGATGGAGCATCCGGCATTACCACCCGTTTCCAGGAGCTATTCCGGTGCATGGGGCAGGTCGGTCACGCATTACTCACCCGTCGCCACTCTCACCACCAG
（3）鉴定结果：该菌株被鉴定为短双歧杆菌Bifidobacterium breve。
将鉴定后的菌株命名为短双歧杆菌JYBF-117，将该菌株送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏信息如下；
分类命名：短双歧杆菌Bifidobacterium breve；保藏日期：2022年3月17日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101；保藏编号：CGMCC No.24536。
实施例2 制备短双歧杆菌JYBF-117菌剂
（1）制备MRS平板培养基和MRS液体培养基，MRS平板培养基制备方法同实施例1，MRS液体培养基的制备方法如下：
将原料蛋白胨10g、牛肉粉5g、三水醋酸钠5g、七水磷酸氢二钾2g、吐温80 1mL、四水硫酸锰0.05g、柠檬酸三铵2g、葡萄糖20g、七水硫酸镁0.2g、蒸馏水1000mL混合后，调pH为6.8，搅拌菌液后，在121℃、0.1MPa下灭菌20min，即可。
（2）取保藏的短双歧杆菌JYBF-117在MRS平板培养基上活化，将活化后菌按照1%的接种量接种于MRS液体培养基中，然后在37℃条件下培养48h，获得菌液；
（3）将菌液离心后，收集菌体，使用无菌生理盐水洗涤后，重悬于15%（w/w）的复原脱脂乳中，获得悬浊液；调整悬浊液的浓度为1.0×1010cfu/mL，获得菌悬液，将菌悬液冷冻干燥后，获得菌粉；将菌粉与葡萄糖混合，制成短双歧杆菌JYBF-117菌剂；葡萄糖购自山东西王糖业有限公司。
在本实施例中，制备的菌剂中菌体数量为1.0×109cfu/g。
实施例3 制备短双歧杆菌JYBF-117菌剂
（1）制备MRS平板培养基和MRS液体培养基，MRS平板培养基制备方法同实施例1，MRS液体培养基的制备方法如下：
将原料蛋白胨10g、牛肉粉5g、三水醋酸钠5g、七水磷酸氢二钾2g、吐温80 1mL、四水硫酸锰0.05g、柠檬酸三铵2g、葡萄糖20g、七水硫酸镁0.2g、蒸馏水1000mL混合后，调pH为6.8，搅拌菌液后，在121℃、0.1MPa下灭菌20min，即可。
（2）取保藏的短双歧杆菌JYBF-117在MRS平板培养基上活化，将活化后菌按照2%的接种量接种于MRS液体培养基中，然后在35℃条件下培养60h，获得菌液；
（3）将菌液离心后，收集菌体，使用无菌生理盐水洗涤后，重悬于15%（w/w）的复原脱脂乳中，获得悬浊液；调整悬浊液的浓度为2.0×1010cfu/mL，获得菌悬液，将菌悬液冷冻干燥后，获得菌粉；将菌粉与葡萄糖混合，制成短双歧杆菌JYBF-117菌剂；葡萄糖购自山东西王糖业有限公司。
在本实施例中，制备的菌剂中菌体数量为2.0×109cfu/g。
实施例4 短双歧杆菌JYBF-117对环境诱导形成的干眼症的影响
1、实验准备
选取30只健康的日本白兔，其中10只正常饲养，作为空白对照组；将其他20只日本白兔放置在相对湿度低于20%，温度为21~23℃的受控环境中，连续14天可诱导该20只日本白兔形成急性干眼症。在无抗胆碱能药物作用的情况下，将急性干眼症日本白兔转移到温度为21~23℃、相对湿度为40%~60%的标准环境中继续维持4个月，可诱导形成慢性干眼症。然后将20只慢性干眼症日本白兔随机平均分为2组，一组为模型对照组，一组为JYBF-117组。
2、实验处理：
①空白对照组：正常饲养。
②模型对照组：每天每只日本白兔灌胃0.5g的葡萄糖，持续28天。
③JYBF-117组：每天灌胃实施例2制备的短双歧杆菌JYBF-117菌剂，用量为每只5.0×108cfu/天，持续28天。
3、结果检测
分别在实验处理前、实验处理第14天和实验处理第28天进行泪液分泌检测，具体为：将泪液检测滤纸条一端折叠放入下睑内1/3结膜囊内第三眼睑外侧，5min后取出滤纸，从折叠处测量其湿润长度。数据如下表所示：
表1 不同处理下的日本白兔的泪液分泌量（x±s，单位mm）
注：*表示与空白对照组相比，差异显著（P＜0.05）
如表1所示，实验处理第28天时，与空白对照组相比，模型对照组泪液分泌量显著减少，JYBF-117组泪液分泌量未有显著差异，并且JYBF-117组泪液分泌量随短双歧杆菌JYBF-117菌剂使用时间增加而增加，表明短双歧杆菌JYBF-117可以显著改善环境诱导形成的干眼症，促进干眼症患者泪液分泌量增加。
实施例5 短双歧杆菌JYBF-117对维生素A缺乏形成的干眼症的影响
1、实验准备
选取健康的日本白兔30只，随机分为3组，分别为空白对照组、模型对照组和JYBF-117组。其中模型对照组和JYBF-117组以干酪素为主的维生素A完全缺乏饲料（购自上海博奥生物科技有限公司）喂养6个月，空白对照组正常饲养。经症状评估，模型对照组和JYBF-117组的日本白兔获得干眼症，造模后的日本白兔泪液分泌减少，泪膜稳定性下降。
2、实验处理
①空白对照组：正常饲养。
②模型对照组：每天每只日本白兔灌胃0.5g的葡萄糖，持续28天。
③JYBF-117组：每天灌胃实施例2制备的短双歧杆菌JYBF-117菌剂，用量为每只5.0×108cfu/天，持续28天。
3、结果检测
在实验处理第28天进行泪膜稳定性检测，通过检测泪膜破裂时间对泪膜稳定性进行检测。用玻璃棒蘸荧光素滴于兔下睑结膜囊内，于裂隙灯下用钴蓝光扫描照射，检查从最后一次瞬目开始，记录泪膜上出现第一个破裂点的时间，即为泪膜破裂时间。
表2 不同处理下的日本白兔的泪膜稳定性（x±s，单位s）
注：*表示与空白对照组相比，差异显著（P＜0.05）
如表2所示，实验处理第28天时，模型对照组泪膜稳定性明显低于空白对照组，JYBF-117组泪膜稳定性与空白对照组未有显著差异。通过该实验可知，短双歧杆菌JYBF-117有助于提高泪膜稳定性，对维生素A缺乏导致的干眼症具有一定治疗作用。
实施例6 短双歧杆菌JYBF-117对干眼症相关炎症因子的影响
1、实验准备
选取健康的雄性日本白兔30只，随机分为3组，分别为空白对照组、模型对照组和JYBF-117组。其中模型对照组和JYBF-117组采用东莨菪碱（购自LGC有限公司，配置浓度为5mg/mL）进行皮下注射，每天4mg/只，持续14天，空白对照组正常饲养。经症状评估，模型对照组和JYBF-117组的日本白兔获得干眼症，造模后的日本白兔眼部出现局部红肿、畏光等。
2、实验处理
①空白对照组：正常饲养。
②模型对照组：每天每只日本白兔灌胃0.5g的葡萄糖，持续28天。
③JYBF-117组：每天灌胃实施例2制备的短双歧杆菌JYBF-117菌剂，用量为每只5.0×108cfu/天，持续28天。
实验处理第29天，将3组日本白兔均以过量麻醉法处死，手术显微镜下取出角膜、结膜组织完整的眼部组织，并用生理盐水浸洗。采集每组大部分眼部组织。切割角、结膜标本，称量标本后，将其放入冻存管中，并加入一定量的PBS后，迅速置于-70℃液氮中冷冻保存，以待ELISA检测。
3、结果检测
严格按照兔IL-1β、IL-6、TNF-α试剂盒（购自优尔生公司）的使用说明，收集各组兔角膜和结膜组织上清液，检测兔角膜和结膜中IL-1β、IL-6、TNF-α的相对表达量。结果如下：
表3 不同处理下日本白兔角膜和结膜中炎症因子的相对表达量（x±s，单位pg/mL）
注：*表示与空白对照组相比，差异显著（P＜0.05）
由表3可知，与空白对照组相比，模型对照组的IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白的表达水平均显著升高，JYBF-117组IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白未见显著差异，说明短双歧杆菌JYBF-117可有效抑制干眼症相关的炎症因子的表达，减轻炎症反应。
尽管通过优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1. 一种缓解干眼症的短双歧杆菌JYBF-117，其特征在于，短双歧杆菌（Bifidobacterium breve）JYBF-117于2022年3月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.24536。
2.一种短双歧杆菌JYBF-117菌剂，其特征在于，包括如权利要求1所述短双歧杆菌JYBF-117的菌粉。
3.如权利要求2所述的短双歧杆菌JYBF-117菌剂，其特征在于，制备方法包括：
（1）制备MRS平板培养基和MRS液体培养基；
（2）取保藏的短双歧杆菌JYBF-117在MRS平板培养基上活化，将活化后菌接种于MRS液体培养基中，培养获得菌液；
（3）将菌液离心后，收集菌体，使用无菌生理盐水洗涤后，重悬于质量浓度为15%的复原脱脂乳中，调整悬浊液的浓度获得菌悬液，冷冻干燥获得菌粉；将菌粉与葡萄糖混合，制成短双歧杆菌JYBF-117菌剂。
4.如权利要求3所述的短双歧杆菌JYBF-117菌剂，其特征在于，步骤（2）中，接种量为1%~2%，培养条件为35~37℃，培养时间为48~60h。
5.如权利要求3所述的短双歧杆菌JYBF-117菌剂，其特征在于，步骤（3）中，调整悬浊液的浓度为1.0×1010~2.0×1010cfu/mL。
6.如权利要求1所述短双歧杆菌JYBF-117在制备缓解干眼症的产品方面的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，缓解干眼症的产品为缓解环境诱导形成的干眼症的产品。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，缓解干眼症的产品为缓解维生素A缺乏引起的干眼症的产品。
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