CN110710675A - 治疗胃肠紊乱及腹胀腹泻的益生元多肽复合益生菌及制备方法 - Google Patents

治疗胃肠紊乱及腹胀腹泻的益生元多肽复合益生菌及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种治疗胃肠紊乱及腹胀腹泻的益生元多肽复合益生菌及制备方法，其包括：麦芽糊精5‑8份、玉米淀粉3‑5份、低聚果糖2‑3份、果蔬酵素粉20‑25份、荞麦粉10‑12份、大豆多肽粉5‑8份、苦瓜肽粉10‑12份、鼠李糖乳杆菌0.1‑0.2份、唾液乳杆菌0.2‑0.4份、乳链球菌0.2‑0.3份、嗜酸乳杆菌0.1‑0.2份、动物双歧杆菌0.2‑0.3份、无水柠檬酸1‑2份、车前子2‑3份、甘草8‑10份、鸡内金0.8‑1份、大黄1‑2份、六神曲1‑2份、葡萄糖5‑6份。其通过反复酶解、分阶段发酵结合光照、磁场等处理制备苦瓜肽粉、大豆肽粉，使其中小分子苦瓜肽和大豆肽的含量得以提高，且同时通过与其他天然植物组分、中草药的配合使用来达到更好的降血糖、增加肠动力、促进肠胃消化吸收以及调节肠胃功能等效果。

Description

治疗胃肠紊乱及腹胀腹泻的益生元多肽复合益生菌及制备 方法
技术领域
本发明涉及营养功能性食品与生物发酵领域。更具体地说，本发明涉及一种治疗胃肠紊乱及腹胀腹泻的益生元多肽复合益生菌及制备方法。
背景技术
肠道是人体最大的消化器官，人体营养的99％需要靠肠道吸收，同时也是最易受到外界压力影响的器官。在抗生素治疗、饮食不佳以及快节奏的生活方式压力下，肠道中的益生菌群比例也逐渐减少，肠道内微生态环境不良造成的腹痛、腹胀、腹泻、便秘随之出现。
腹泻是消化系统疾病中的一种常见症状，系指排便次数多于平时，粪便稀薄，含水量增加，有时脂肪增多，带有不消化物，或含有脓血。
目前腹泻诊治原则主要是“预防脱水，纠正水及电解质紊乱，继续饮食，合理用药”，。由细菌感染引起的腹泻虽可选用抗生素，但单种西药难以兼顾多种症状，而多种西药的联合应用又由于药物间的相互作用而受到诸多限制，就如同时患有胃窦炎和营养不良的患者，只有控制了胃窦炎，患者才可能进行较充分的食物摄入，从而改善营养状况。此外，西药治标不治本，长期服用某药，容易蓄积，引起严重的副作用或并发症。合理的液体疗法因能预防和及时纠正水、电解质紊乱和酸中毒，因而是目前治疗腹泻的首要原则。腹泻合并轻、中度脱水目前主要采用世界卫生组织推荐的ORS液(葡萄糖电解质口服液)。ORS液治疗各种腹泻是有效和安全的，但ORS液对腹泻状态下的肠道多营养问题、肠道感染及肠道毒素影响、口感涩味等问题均未解决，且标准ORS液既不能降低腹泻的次数，也不能缩短腹泻病程。
因此，如何提供一种能有效缓解肠胃消化不良、功能紊乱，改善胃肠胀气、腹泻状况的食品或保健品显得尤为重要。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种缓解胃肠不适及腹胀腹泻的益生元多肽复合益生菌及其制备方法，其通过反复酶解、分阶段发酵结合光照、磁场等处理制备苦瓜肽粉、大豆肽粉，使其中小分子苦瓜肽和大豆肽的含量得以提高，且同时通过与其他天然植物组分、中草药(如鸡内金和六神曲等)以及益生菌(如鼠李糖乳杆菌等)的配合使用来达到更好的降血糖、增加肠动力、促进肠胃消化吸收以及调节肠胃功能等效果。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种治疗胃肠紊乱及腹胀腹泻的益生元多肽复合益生菌，其特征在于，按重量份计，其包括：麦芽糊精5-8份、玉米淀粉3-5份、低聚果糖2-3份、果蔬酵素粉20-25份、荞麦粉10-12份、大豆多肽粉5-8份、苦瓜肽粉10-12份、鼠李糖乳杆菌0.1-0.2份、唾液乳杆菌0.2-0.4份、乳链球菌0.2-0.3份、嗜酸乳杆菌0.1-0.2份、动物双歧杆菌0.2-0.3份、无水柠檬酸1-2份、车前子2-3份、甘草8-10份、鸡内金0.8-1份、大黄1-2份、六神曲1-2份、葡萄糖5-6份。
优选的，所述苦瓜肽粉的制备方法包括如下步骤：
S11、取新鲜苦瓜、干燥苦瓜、苦瓜籽中的一项或几项作为苦瓜原料，加入苦瓜原料重量5倍的去离子水，并在25℃水温下浸泡8-12h，取出再用去离子水冲洗2-3遍；
S12、将清洗后的苦瓜原料进行干燥，打碎磨浆，得到苦瓜浆液；
S13、取苦瓜浆液以及缓冲液进行混合，以获得混合体系，按重量比计，按照苦瓜浆液：缓冲液＝1:(4.5-5.5)；记录混合体系总体积数值，将pH值调节为7后对混合体系进行温度处理，以获得浸提物；
所述温度处理过程包括：
升温至45-55℃，保温45-60min，再降温至20-25℃，保温25-30min，并记录此时混合体系整体的第一体积数值；按照(总体积-第一体积)*60％补入含有去离子水和缓冲液的第一混合液，且按照重量比计，去离子水：缓冲液＝4：1；补入第一混合液后，升温至60-75℃，保温60-75min，再降温至45-55℃，保温30-35min，并记录此时混合体系整体的第二体积数值；按照(总体积-第二体积)*75％补入含有去离子水和缓冲液的第二混合液，且按照重量比计，去离子水：缓冲液＝3：1；补入第二混合液后，升温至80-90℃，保温75-85min，再降温至60-75℃，保温35-45min；
S14、将浸提物温度降至20-25℃后对所述浸提物进行酶解，以获得苦瓜肽酶解体系；其中，所述酶解过程包括：
第一次酶解：将浸提物的pH值调节至8.0，按浸提物重量的4.5％加入胰蛋白酶，80-100转/min条件下搅拌，且搅拌的同时升温至35-40℃，保温45-60min后得到第一酶解体系；
第二次酶解：待第一酶解体系温度降至20-25℃后，再调整其pH值至3.5，按第一酶解体系重量的3％加入果胶酶，80-100转/min条件下搅拌，且搅拌的同时升温至45-55℃，保温40-60min后得到第二酶解体系；
第三次酶解：待第二酶解体系温度降至20-25℃后，再调整其pH值至4.8，按第二酶解体系重量的2％加入纤维素酶，80-100转/min条件下搅拌，且搅拌的同时升温至55-60℃，保温30-45min后得到第三酶解体系；
S15、待步骤S14中的酶解过程完成后，对获得的第三酶解体系升温至90℃，维持10min，以完成灭酶活过程，获得苦瓜肽粗提体系；再在所述苦瓜肽粗提体系中按其重量的4-5％加入活性炭，搅拌均匀，在65℃下保温60-90min后离心，去沉渣后获得苦瓜肽粗提液；
将所述苦瓜肽粗提液经硅藻土过滤，以得到苦瓜肽清液，且过滤压力为0.2-0.3MPa；再在所述苦瓜肽清液中按其重量加入4.5％的活性炭，静置45-50min后离心，去沉渣；
S16、将去沉渣后的苦瓜肽清液经过滤孔径为0.5-0.8μm的微滤陶瓷膜进行过滤，过滤温度为60℃，以获得微滤膜透过液；
再将所述微滤膜透过液经截留分子量为100-200kDa卷式超滤膜进行过滤，过滤温度为45-50℃，以获得超滤膜透过液；
再将所述超滤膜截留液经截留分子量为150-1000Da的卷式高压反渗透膜进行浓缩，以除去水分及部分残留无机盐和小分子杂质，浓缩温度在40℃以下，以得到苦瓜肽浓缩液；
S17、通过真空冷冻干燥方法对所述苦瓜肽浓缩液进行干燥，以获得苦瓜多肽蛋白含量不低于30％的苦瓜肽粉。
优选的，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液。
优选的，所述大豆多肽粉的制备方法包括如下步骤：
S21、将黑曲霉菌种以及米曲霉菌种分别接种于独立的马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，再分别放入培养箱中，均于28-35℃条件下活化48-72h，以获得活化的黑曲霉菌种以及米曲霉菌种；
采用配制好的第一液体培养基培养活化的黑曲霉菌种，以获得液态黑曲霉种子液，以及采用配制好的第二液体培养基培养活化的米曲霉菌种，以获得液态米曲霉种子液；
再将所述液态黑曲霉种子液接种到发酵罐中的第一发酵培养基内进行扩大培养，扩大培养温度30-35℃，扩大培养pH6.5-7.0，转速500-800rpm搅拌，培养时间为1-2d，以获得黑曲霉孢子悬浮液；以及将所述液态米曲霉种子液接种到发酵罐中的第二发酵培养基内进行扩大培养，扩大培养温度30-40℃，扩大培养pH6.5-7.0，转速400-600rpm搅拌，培养时间为1-2d，以获得液态米曲霉孢子悬浮液；
S22、按重量份计，在反应釜中加入大豆蛋白粉30-45份、去离子水250-350份、黑曲霉孢子悬浮液20-25份、米曲霉孢子悬浮液15-20份、La(NO3)3.6H2O 0.5-0.6份、NH4Cl 1.5-2.5份、KNO3 1-2份，以获得发酵体系，并调节所述发酵体系的pH至6.8-7.0；
对所述发酵体系依次进行三阶段的发酵处理：
第一发酵阶段处理中，发酵温度为30-35℃，并在转速300-400rpm条件下对发酵体系进行搅拌，同时对发酵体系进行第一光照处理和第一磁场处理，处理时间为1-2d；所述第一光照处理为：采用光强为25-30μmol.m-2.s-1的红光以及光强为30-35μmol.m-2.s-1的蓝光照射发酵体系，照射处理时间为45-60min；所述第一磁场处理为：采用50Hz、磁场强度为0.45-0.55mT的交变磁场对发酵体系进行磁场处理，磁场处理时间为45-60min；
第二发酵阶段处理中，发酵温度为25-35℃，并在转速500-600rpm条件下对发酵体系进行搅拌，同时对发酵体系进行第二光照处理和第二磁场处理，处理时间为1-2d；所述第二光照处理为：采用光强为20-24μmol.m-2.s-1的红光以及光强为24-28μmol.m-2.s-1的蓝光照射发酵体系，照射处理时间为35-45min；所述第二磁场处理为；采用50Hz、磁场强度为0.35-0.45mT的交变磁场对发酵体系进行处理磁场处理，磁场处理时间为35-45min；
第三发酵阶段处理中，发酵温度为25-35℃，并在转速300-400rpm条件下对发酵体系进行搅拌，同时对发酵体系进行第三光照处理和第三磁场处理，处理时间为1-2d；所述第三光照处理为：采用光强为16-20μmol.m-2.s-1的红光以及光强为20-22μmol.m-2.s-1的蓝光照射发酵体系，照射处理时间为25-35min；所述第三磁场处理为：采用50Hz、磁场强度为0.2-0.3mT的交变磁场对发酵体系进行处理磁场处理，磁场处理时间为25-35min；
S23、将经步骤S22中发酵处理的发酵体系升温至85℃，维持10min，以完成灭酶活过程，获得大豆肽酶解液；
S24、将所述大豆肽酶解液分散于其质量5-6倍的95％乙醇溶液中，且同时进行超声处理及搅拌，超声功率为600-800W，超声处理时间为10-15min，搅拌转速为100-120转/min；
S25、对经步骤S24处理后的反应体系进行过滤，过滤压力控制在0.3-0.4MPa，过滤温度为50-60℃，弃滤渣，以获得大豆肽清液；
S26、对大豆肽清液进行冷冻干燥，以获得所述大豆肽粉。
优选的，按重量比计，第一液体培养基包括：茶多酚1％、蔗糖1.5％、葡萄糖2.5％、麦芽提取物5％、CoCl.6H2O 0.1％、CuSO4.5H2O 0.05％、FeNaEDTA 2％、H3BO30.25％、Na2MoO4.2H2O 0.15％、ZnSO4.7H2O 0.1％、MgSO4 0.1％、KNO3 0.1％、KNO3 0.1％、MnSO4.H2O0.2％、去离子水86.85％。
优选的，所述步骤S21中，按重量比计，所述第一发酵培养基包括：番茄汁10％、可溶性淀粉2％、蔗糖2％、葡萄糖2％、玉米粉2.5％、酵母粉0.5％、FeSO4.7H2O 0.1％、MgSO40.05％、KNO3 0.05％、CuCl2.2H2O 0.1％、(NH4)6Mo7O24.7H2O 0.15％、MnSO4.H2O 0.1％、去离子水80.45％。
优选的，按重量比计，所述第二液体培养基包括：豆芽汁8％、蔗糖1.5％、葡萄糖2.5％、蛋白胨2％、FeNaEDTA 2％、H3BO30.25％、Na2MoO4.2H2O 0.15％、MgSO4 0.1％、KNO30.1％、MnSO4.H2O 0.2％去离子水83.2％。
优选的，按重量比计，所述第二发酵培养基包括：麦芽糊精5％、玉米粉8％、木糖2％、酵母膏1.5％、MgSO4 0.05％、KNO3 0.1％、NH4NO3 0.15％、MnSO4.H2O 0.1％、去离子水83.1％。
优选的，扩大培养过程中，每天对接种到对应发酵培养基中的液态黑曲霉种子液和/或液态米曲霉种子液进行超声处理，且超声处理频率为20-40Khz，处理时间为30min。
还提供一种治疗胃肠紊乱及腹胀腹泻的益生元多肽复合益生菌的制备方法，其包括：
S100、制备苦瓜肽粉以及大豆肽粉；
S200、将上述重量份的车前子、甘草、鸡内金、大黄、六神曲充分混合，以获得原料混合物，再将所述原料混合物置于一级发酵罐中，加入所述原料混合物重量5-6倍的去离子水以及所述原料混合物重量0.2-0.25倍的纤维素酶，调节pH为6.8-7，且调节至25-35℃进行一级发酵，发酵36-48h后分离出液态的第一发酵液；
分离出所述第一发酵液后，向一级发酵罐内的残留物中加入所述一级发酵罐内的残留物重量1-2倍的去离子水、所述一级发酵罐内的残留物重量0.2-0.3倍的果胶酶、权利要求1所述的重量份的无水柠檬酸，调节pH为3.5-4.5，且调节至40-50℃再次进行一级发酵，发酵24-36h后分离出液态的第二发酵液；
S300、将所述第一发酵液、第二发酵液合并转移至二级发酵罐中，加入所述第一发酵液与第二发酵液重量总和0.8-1倍的去离子水以及所述第一发酵液与第二发酵液重量总和0.2-0.3倍的纤维素酶，调节pH为6.8-7，且调节至30-40℃进行二级发酵，发酵24-36h后获得分离出液态的第三发酵液；
S400、分离出所述第三发酵液后，将所述二级发酵罐中的残留物与一级发酵罐中再次进行一级发酵、且分离出液态的第二发酵液后的残留物合并，加入合并后残留物重量总和1-2倍的去离子水、合并后残留物重量总和0.05-0.15倍的果胶酶，调节pH为3.0-4.0，且调节至35-55℃进行再次发酵，发酵24-36h后分离出液态的第四发酵液；
S500、将第三发酵液以及第四发酵液合并，以获得合并发酵液，并对所述合并发酵液进行离心，去除沉淀后获得发酵清液；
S600、在发酵清液中加入体积分数85％的乙醇，于8-10℃温度条件下按照120-180转/min搅拌20-30min，且按体积比计，所述发酵清液：乙醇＝(2-4)：1；然后升温至60-75℃以使得乙醇挥发；
S700、步骤S600中乙醇挥发后的发酵清液经截留分子量≥10000Da的超滤膜过滤，以获得超滤液；
S800、将所述超滤液依次过阳离子柱和阴离子柱，收集经阴离子柱排除的流出液，并在流出液中加入权利要求1所述重量份的麦芽糊精、玉米淀粉、低聚果糖、果蔬酵素粉、荞麦粉、大豆多肽粉、苦瓜肽粉、鼠李糖乳杆菌、唾液乳杆菌、乳链球菌、嗜酸乳杆菌、动物双歧杆菌及葡萄糖，调节pH至4.0-5.5以及调节温度至30-37℃，48-72h后超滤液转移至升膜蒸发器中，调节温度至30-35℃、真空度至-0.05－-0.08Mpa，所述超滤液体积缩小至原来的30-40％时停止蒸发，以获得一次浓缩液，再将一次浓缩液转移至刮板式浓缩器继续浓缩，调节温度至30-35℃、真空度至-0.05－-0.08Mpa，所述一次浓缩液体积缩小至原来的20-30％时停止蒸发，以获得二次浓缩液；
S800、将二次浓缩液转移至粗结晶罐内，于温度4℃下静置18-24h，中途每间隔2h以150-180转/min搅拌10min，以获得粗结晶原料；按质量百分比计，将粗结晶原料脱水至含水量≤20％，得粗结晶；再将所述粗结晶重新溶解，调节温度至30-35℃，并加入粗结晶重量1-2％的活性碳搅拌脱色，待脱色液透光度为100％时过滤去除活性碳；
S900、将脱色液转移至结晶锅，调节温度至30-35℃、真空度至-0.05－-0.08Mpa，所述脱色液体积缩小至原来的15-20％时停止蒸发，以获得脱色浓缩液；再将脱色浓缩液转移至育晶锅内，于温度4℃、150-200转/min条件下搅拌30分钟后静置24-36h，静置过程中每间隔2h以150-200转/min搅拌10min；按质量百分比计，再将育晶锅内结晶充分的原料脱水至含水量≤8％，于真空干燥机中烘干30-60min后即得到所述治疗胃肠紊乱及腹胀腹泻的益生元多肽复合益生菌。
本发明至少包括以下有益效果：
本发明通过阶段性升温、反复酶解以及多重过滤的提取工艺，使得苦瓜肽中苦瓜多肽蛋白含量不低于20％，由此可大幅提高苦瓜多肽蛋白的生产效率和纯度；通过光照、磁场处理结合多阶段的酶解步骤来提高大豆肽中有效成分的产率。进一步的，苦瓜肽、大豆肽与其他组分复配(包括膳食纤维、益生菌以及中草药等)使用后，其具有明显的增加肠动力、促进肠胃消化吸收以及调节肠胃功能等效果。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
具体实施方式
下面结合实例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
需要说明的是，下述实施方案中所述试验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
<实施例1>
按重量份计，本实施例中治疗胃肠紊乱及腹胀腹泻的益生元多肽复合益生菌包括：麦芽糊精5份、玉米淀粉3份、低聚果糖2份、果蔬酵素粉20份、荞麦粉10份、大豆多肽粉5份、苦瓜肽粉10份、鼠李糖乳杆菌0.1份、唾液乳杆菌0.2份、乳链球菌0.2份、嗜酸乳杆菌0.1份、动物双歧杆菌0.2份、无水柠檬酸1份、车前子2份、甘草8份、鸡内金0.8份、大黄1份、六神曲1份、葡萄糖5份。
进一步的，所述苦瓜肽粉的制备方法包括如下步骤：
S11、取新鲜苦瓜、干燥苦瓜、苦瓜籽中的一项或几项作为苦瓜原料，加入苦瓜原料重量5倍的去离子水，并在25℃水温下浸泡8-10h(优选8.5h)，取出再用去离子水冲洗2-3遍，以去除农残药残以及杂质；
S12、将冲洗后的苦瓜原料风干干燥，取出打碎磨浆，得到苦瓜浆液；
S13、取苦瓜浆液以及缓冲液(所述缓冲液为包含有酸、碱、盐等试剂的缓冲体系，如磷酸盐缓冲液)进行混合，以获得混合体系，按重量比计，按照苦瓜浆液：缓冲液＝1:(4.5-5.5)(优选为1:5)；记录混合体系总体积数值，将pH值调节为7后对混合体系进行温度处理，以获得浸提物；
其中，所述温度处理过程包括：
升温至45-55℃(优选为50℃)，保温45-60min(优选为55min)，降温至20-25℃(优选为22℃)，保温25-30min(优选为28min)，并记录此时混合体系整体的第一体积数值；因在前述升温、保温过程中，其反应体系内的水、酸等会被蒸发，有可能会导致其中酸、碱以及无机离子的溶解度产生变化，从而影响浸提效果，因此，在前述升温、保温过程后，需按照(总体积-第一体积)*60％补入含有去离子水和所述缓冲液的第一混合液，且按照重量比计，去离子水：缓冲液＝4：1，由此对水、酸等蒸发后的反应体系进行补偿，使反应体系始终处于较优的浸提环境中；补入第一混合液后，升温至60-75℃(优选为65℃)，保温60-75min(优选为65min)，降温至45-55℃(优选为50℃)，保温30-35min(优选为32℃)，并记录此时混合体系整体的第二体积数值；按照(总体积-第二体积)*75％补入含有去离子水和缓冲液的第二混合液，且按照重量比计，去离子水：缓冲液＝3：1，该次升温、保温的温度相较第一次而言有所提高，因此，反应体系内的水、酸等的蒸发效果更为明显，因此此次补入的第二混合液的比例要有所上升(增加到75％)，且第二混合液中缓冲液的比例有所增加；补入第二混合液后，升温至80-90℃(优选为85℃)，保温75-85min(优选为80min)，降温至60-75℃(优选为70℃)，保温35-45min(优选为40min)；
本步骤中，通过阶段性的升温、保温，可使得组分的细胞结构(如细胞壁等)组成在不同的温度变化环境下被反复冲击、破坏，同时，每一升温、保温阶段结束后补充相应比例的水以及缓冲液，由此对水、酸等蒸发后的反应体系进行补偿，使反应体系始终处于较优的浸提环境中，以达到最佳的浸提效果；
S14、将浸提物温度降至20-25℃后对所述浸提物进行酶解，以获得苦瓜肽酶解体系；其中，所述酶解过程包括：
第一次酶解：将浸提物的pH值调节至8.0，按浸提物重量的4.5％加入胰蛋白酶，80-100转/min条件下搅拌，且搅拌的同时升温至35-40℃(优选为37℃)，保温45-60min(优选55min)后得到第一酶解体系；
第二次酶解：待第一酶解体系温度降至20-25℃后，再调整其pH值至3.5，按第一酶解体系重量的3％加入果胶酶，80-100转/min条件下搅拌，且搅拌的同时升温至45-55℃(优选为50℃)，保温40-60min(优选50min)后得到第二酶解体系；
第三次酶解：待第二酶解体系温度降至20-25℃后，再调整其pH值至4.8，按第二酶解体系重量的2％加入纤维素酶，80-100转/min条件下搅拌，且搅拌的同时升温至55-60℃(优选为58℃)，保温30-45min(优选35min)后得到第三酶解体系；
由于本发明中的组分多为植物组分，其细胞结构中包含有细胞壁，因此，本步骤中，通过在不同阶段采用不用的酶及酶解条件对细胞壁进行充分酶解，使细胞壁中的纤维素、果胶等成分破坏殆尽，可使得细胞壁内的有效成分(如苦瓜多肽蛋白)得以充分释放，以提高其提取效率；
S15、待步骤S14中的酶解过程完成后，对获得的第三酶解体系升温至90℃，维持10min，以完成灭酶活过程，获得苦瓜肽粗提体系；再在所述苦瓜肽粗提体系中按其重量的4-5％加入活性炭，搅拌均匀，在65℃下保温60-90min(优选75min)后离心，去沉渣后获得苦瓜肽粗提液；
将所述苦瓜肽粗提液经硅藻土过滤，以得到苦瓜肽清液，且过滤压力为0.2-0.3MPa(优选0.25MPa)；再在所述苦瓜肽清液中按其重量加入4-5％的活性炭，静置45-50min后离心，去沉渣；
通过上述活性炭、硅藻土的吸附处理，苦瓜肽酶解液中的色素、悬浮颗粒以及胶体等杂质，使最后获得的成品纯度更高；
S16、将去沉渣后的苦瓜肽清液经过滤孔径为0.5-0.8μm的微滤陶瓷膜进行过滤，过滤温度为55-65℃(优选为60℃)，以获得微滤膜透过液；进一步的，所述微滤陶瓷膜采用三支膜并联使用；
再将所述微滤膜透过液经截留分子量为100-200kDa卷式超滤膜进行过滤，除去大分子杂质，操作温度控制在55-65℃，以获得超滤膜透过液；其中，卷式超滤膜为能截留分子量为100-200kDa的卷式超滤膜，且所述卷式超滤膜采用两支膜并联使用；
再将所述超滤膜截留液经截留分子量为150-1000Da的卷式高压反渗透膜进行浓缩，以除去水分及部分残留无机盐和小分子杂质，浓缩温度在40℃以下，以得到苦瓜肽浓缩液，且苦瓜肽浓缩液的固形物含量≥40％；其中，卷式高压反渗透膜系统为高压浓缩膜，具体由(PS)聚砜或(PFS)聚醚砜材料等复合材料膜制成，且采用四支膜串联使用；
该步骤中采用多层次的膜分离纯化技术分离纯化苦瓜多肽蛋白，其浓缩温度低，有效保证苦瓜蛋白多肽的天然活性及其高含量；
S17、通过真空冷冻干燥方法对所述苦瓜肽浓缩液进行干燥，以获得苦瓜多肽蛋白含量不低于30％的苦瓜肽粉。
同时，大豆多肽为小分子蛋白质，易被人体吸收，适合蛋白质消化吸收不佳的人群食用，此外，大豆多肽还具有提高免疫力、增强体力、缓解疲劳、降三高等功效。因此，本实施例还提供了一种大豆多肽粉的制备方法，其包括如下步骤：
S21、将黑曲霉菌种以及米曲霉菌种分别接种于独立的马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，再分别放入培养箱中，均于28-35℃(优选为32℃)条件下活化48-72h(优选60h)，以获得活化的黑曲霉菌种以及米曲霉菌种；
采用配制好的第一液体培养基培养活化的黑曲霉菌种，以获得液态黑曲霉种子液，以及采用配制好的第二液体培养基培养活化的米曲霉菌种，以获得液态米曲霉种子液；其中，按重量比计，所述第一液体培养基包括：茶多酚1％、蔗糖1.5％、葡萄糖2.5％、麦芽提取物5％、CoCl.6H2O 0.1％、CuSO4.5H2O 0.05％、FeNaEDTA 2％、H3BO0.25％、Na2MoO4.2H2O0.15％、ZnSO4.7H2O 0.1％、MgSO4 0.1％、KNO3 0.1％、KNO3 0.1％、MnSO4.H2O 0.2％、去离子水86.85％，所述第二液体培养基包括：豆芽汁8％、蔗糖1.5％、葡萄糖2.5％、蛋白胨2％、FeNaEDTA 2％、H3BO30.25％、Na2MoO4.2H2O 0.15％、MgSO4 0.1％、KNO3 0.1％、MnSO4.H2O0.2％、去离子水83.2％；
再将所述液态黑曲霉种子液接种到发酵罐中的第一发酵培养基内进行扩大培养，扩大培养温度30-35℃(优选32℃)，扩大培养pH6.5-7.0，转速500-800rpm(优选650rpm)搅拌，培养时间为1-2d，以获得黑曲霉孢子悬浮液；以及将所述液态米曲霉种子液接种到发酵罐中的第二发酵培养基内进行扩大培养，扩大培养温度30-40℃(优选35℃)，扩大培养pH6.5-7.0，转速400-600rpm(优选500rpm)搅拌，培养时间为1-2d，以获得液态米曲霉孢子悬浮液；其中，按重量比计，所述第一发酵培养基包括：番茄汁10％、可溶性淀粉2％、蔗糖2％、葡萄糖2％、玉米粉2.5％、酵母粉0.5％、FeSO4.7H2O 0.1％、MgSO4 0.05％、KNO30.05％、CuCl2.2H2O 0.1％、(NH4)6Mo7O24.7H2O 0.15％、MnSO4.H2O 0.1％、去离子水80.45％，所述第二发酵培养基包括：麦芽糊精5％、玉米粉8％、木糖2％、酵母膏1.5％、MgSO4 0.05％、KNO3 0.1％、NH4NO3 0.15％、MnSO4.H2O 0.1％、去离子水83.1％；
优选的，为促进黑曲霉和/或米曲霉的生长和提高产酶效率，对液态黑曲霉种子液和/或液态米曲霉种子液进行扩大培养时，每天对接种有黑曲霉种子液或液态米曲霉种子液的对应发酵培养基进行超声处理，且超声处理频率为20-40Khz(优选30Khz)，处理时间为30min；
S22、按重量份计，在反应釜中加入大豆蛋白粉30-45份(优选35份)、去离子水250-350份(优选280份)、黑曲霉孢子悬浮液20-25份(优选22.5份)、米曲霉孢子悬浮液15-20份(优选10份)、La(NO3)3.6H2O 0.5-0.6份(优选0.55份)、NH4Cl 1.5-2.5份(优选2.0份)、KNO31-2份(优选1.5份)，以获得发酵体系，并调节所述发酵体系的pH至6.8-7.0；本步骤中，所述大豆蛋白粉由非转基因大豆制成，且其中分子量≥8000Da的多肽含量≥45％；
对所述发酵体系依次进行三阶段的发酵处理：
第一发酵阶段处理中，发酵温度为30-35℃(优选32℃)，并在转速300-400rpm(优选350rpm)条件下对发酵体系进行搅拌，同时对发酵体系进行第一光照处理和第一磁场处理，处理时间为1-2d；所述第一光照处理为：采用光强为25-30μmol.m-2.s-1(优选28μmol.m-2.s-1)的红光以及光强为30-35μmol.m-2.s-1(优选32μmol.m-2.s-1)的蓝光照射发酵体系，照射处理时间为45-60min(优选50min)；所述第一磁场处理为：采用50Hz、磁场强度为0.45-0.55mT(优选0.5mT)的交变磁场对发酵体系进行处理磁场处理，磁场处理时间为45-60min(优选50min)；
第二发酵阶段处理中，发酵温度为25-35℃(优选30℃)，并在转速500-600rpm(优选550rpm)条件下对发酵体系进行搅拌，同时对发酵体系进行第二光照处理和第二磁场处理，处理时间为1-2d；所述第二光照处理为：采用光强为20-24μmol.m-2.s-1(优选22μmol.m-2.s-1)的红光以及光强为24-28μmol.m-2.s-1(优选25μmol.m-2.s-1)的蓝光照射发酵体系，照射处理时间为35-45min(优选40min)；所述第二磁场处理为；采用50Hz、磁场强度为0.35-0.45mT(优选0.4mT)的交变磁场对发酵体系进行磁场处理，磁场处理时间为35-45min(优选40min)；
第三发酵阶段处理中，发酵温度为25-35℃(优选30℃)，并在转速300-400rpm优选350rpm)条件下对发酵体系进行搅拌，同时对发酵体系进行第三光照处理和第三磁场处理，处理时间为1-2d；所述第三光照处理为：采用光强为16-20μmol.m-2.s-1(优选18μmol.m-2.s-1)的红光以及光强为20-22μmol.m-2.s-1(优选21μmol.m-2.s-1)的蓝光照射发酵体系，照射处理时间为25-35min(优选30min)；所述第三磁场处理为：采用50Hz、磁场强度为0.2-0.3mT(优选0.25mT)的交变磁场对发酵体系进行处理磁场处理，磁场处理时间为25-35min(优选30min)；
S23、将经步骤S22中发酵处理的发酵体系升温至85℃，维持10min，以完成灭酶活过程，获得大豆肽酶解液；
S24、将所述大豆肽酶解液分散于其质量5-6倍的体积分数为95％的乙醇溶液中，且同时进行超声处理及搅拌，超声功率为600-800W(优选为750W)，超声处理时间为10-15min，搅拌转速为100-120转/min；
S25、对经步骤S24处理后的反应体系进行过滤，过滤压力控制在0.3-0.4MPa(优选为0.35Mpa)，过滤温度为50-60℃(优选55℃)，弃滤渣，以获得大豆肽清液；
S26、对大豆肽清液进行冷冻干燥，以获得所述大豆肽粉。
黑曲霉菌种和米曲霉菌种可产生β-葡萄糖苷酶、淀粉酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、糖化酶、纤维素酶等多种酶类，进一步可用于分解大豆蛋白粉中的纤维素、乳糖、大分子蛋白质、淀粉等原料，将其分解成更容易被胃肠吸收的小分子营养成分，改善胃肠免疫功能。因此本步骤中采用黑曲霉菌种以及米曲霉菌种作为发酵菌种，分别用特定的培养基活化、扩大培养后，再在含有La(NO3)3.6H2O的培养基中对含有大分子蛋白质的大豆蛋白粉进行酶解发酵，其中La3+对黑曲霉和米曲霉的生长代谢起到促进作用，提高两者的生长效率，并提高两者各种酶的产量和酶活力，由此可有效分解大豆蛋白粉中的纤维素、淀粉、蛋白等大分子物质。进一步的，三阶段发酵处理中，红光以及蓝光也能通过调节细胞质膜的通透性来促进其同化作用，并提高酶活，交变磁场则通过细胞膜上钙离子的释放来促进黑曲霉和米曲霉生物量的生长，进一步提高酶的产量。同时，为避免红光、蓝光以及交变磁场长期在恒定数值而对黑曲霉和米曲霉的生长产生不良影响，本步骤中采用三阶段发酵处理，且每一阶段红光、蓝光的光强、交变磁场的强度均逐步递减，由此保证黑曲霉和米曲霉始终处于较强的生长活力中，以此持续高效产生多种高活力酶类，进一步分解纤维素、淀粉、蛋白质等大分子，促进大豆蛋白粉中活性成分(如小分子多肽等)的释放。
此外，为充分发挥综合果蔬粉、益生菌协同作用时的功效，以提高其促进肠胃消化，增强免疫力的效果，因此，本实施例中还提供了一种综合果蔬酵素粉的制备方法，其具体包括：
S31、将果蔬原料(包括水果、蔬菜、果皮、果渣中的一项或几项)放入其重量5-8倍(优选6.5倍)的水中浸泡10-12h(优选10.5h)，取出沥干后再进行超声清洗，超声功率为180-200W、超声频率为40-50KHz、超声清洗时间为10-15min；超声清洗后沥干果蔬原料，置100℃烘箱中干燥8-10小时，再于35-40℃(优选37℃)下粉碎，过100目筛，以获得果蔬原料粉；
S32、将康宁木霉菌种接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，再放入培养箱中，于28-35℃(优选32℃)条件下活化48-72h，以获得活化的康宁木霉菌种；其中，
采用配制好的液体培养基培养活化的康宁木霉菌种，以获得液态康宁木霉菌种种子液；其中，按重量比计，所述液体培养基包括：茶多酚1％、蔗糖1.5％、葡萄糖2.5％、麦芽提取物5％、CoCl.6H2O 0.1％、CuSO4.5H2O 0.05％、FeNaEDTA 2％、H3BO30.15％、Na2MoO4.2H2O 0.15％、ZnSO4.7H2O 0.1％、MgSO4 0.1％、KNO3 0.1％、MnSO4.H2O 0.25％、去离子水87％；
再将所述液态康宁木霉菌种种子液接种到发酵罐中的发酵培养基上进行扩大培养，调节pH至6.5-7.5(优选7.0)，扩大培养温度25-35℃(优选30℃)，转速500-800rpm条件下搅拌，培养时间为1-2d，以获得康宁木霉孢子悬浮液；其中，按重量比计，所述发酵培养基包括：麸皮10％、可溶性淀粉2％、蔗糖2％、乳糖2％、玉米粉2.5％、MgSO4 0.05％、KH2PO40.05％、(NH4)2SO4 0.15％、去离子水81.25％；
S33、取所述果蔬原料粉，并在其中加入其重量5-10％(优选8％)的康宁木霉孢子悬浮液以及果蔬原料粉重量4-5倍的水后进行酶解，以获得酶解体系；其中，所述酶解过程包括：
第一次酶解：按果蔬原料粉重量的0.03-0.04％(优选为0.035％)加入脂肪酶，调节pH值至6.5-7.5(优选7.0)，充分搅拌，且搅拌的同时升温至30-45℃(优选37℃)，保温35-40min后得到第一酶解体系；
第二次酶解：待第一次酶解体系温度降温至20-25℃后，再调整其pH值至4.0-4.5(优选4.2)，按第一次酶解体系重量的0.02-0.025％(优选为0.022％)加入β-葡聚糖酶，充分搅拌，且搅拌的同时升温至40-50℃(优选45℃)，保温30-35min后得到第二酶解体系；
第三次酶解：待第二次酶解体系温度降至20-25℃后，再调整其pH值至4.0-5.5(优选5.0)，按第二次酶解液体系重量的0.02-0.03％(优选为0.025％)加入纤维素酶，充分搅拌，且搅拌的同时升温至50-65℃(优选60℃)，保温25-35min后得到第三酶解体系；
S34、待酶解完成后，对获得的第三酶解体系升温至85℃，维持10min，以完成灭酶活过程，获得果蔬酶解液；
S35、在所述果蔬酶解液中按其重量的4％加入活性炭，搅拌均匀，在65℃下保温65-85min(优选75min)后离心，去沉渣后获得果蔬粗提液；
S36、对所述果蔬粗提液进行真空浓缩，当果蔬粗提液体积缩小到原来的12-15％时停止浓缩，以获得果蔬浓缩液，再对所述果蔬浓缩液进行真空干燥，过筛后获得所述综合果蔬酵素粉。
<实施例2>
本实施例与实施例1的不同之处仅在于，本实施例中治疗胃肠紊乱及腹胀腹泻的益生元多肽复合益生菌由以下组分组成：麦芽糊精8份、玉米淀粉5份、低聚果糖3份、果蔬酵素粉25份、荞麦粉12份、大豆多肽粉8份、苦瓜肽粉12份、鼠李糖乳杆菌0.2份、唾液乳杆菌0.4份、乳链球菌0.3份、嗜酸乳杆菌0.2份、动物双歧杆菌0.3份、无水柠檬酸2份、车前子3份、甘草10份、鸡内金1份、大黄2份、六神曲2份、葡萄糖6份、水55份。
<实施例3>
本实施例与实施例1的不同之处仅在于，本实施例中治疗胃肠紊乱及腹胀腹泻的益生元多肽复合益生菌有以下组分组成：麦芽糊精7份、玉米淀粉4份、低聚果糖2.5份、果蔬酵素粉22份、荞麦粉11份、大豆多肽粉7份、苦瓜肽粉11份、鼠李糖乳杆菌0.15份、唾液乳杆菌0.3份、乳链球菌0.25份、嗜酸乳杆菌0.15份、动物双歧杆菌0.25份、无水柠檬酸1.5份、车前子2.5份、甘草9份、鸡内金0.9份、大黄1.5份、六神曲1.5份、葡萄糖5.5份、水54份。
<苦瓜肽分子量检测结果>
采用申请号201710832199.8(“一种全程低温生产苦瓜多肽蛋白提取物的新方法、苦瓜多肽蛋白提取物及其应用”)的专利申请中实施例1所述的方法提取苦瓜肽，以作为对比例1，将其与通过本发明实施例1-3中的苦瓜肽粉制备方法制备获得的苦瓜肽粉进行高效凝胶过滤色谱法检测，以获得苦瓜肽分子量大小及分布范围，其结果如表1所示。
表1苦瓜肽分子量大小及分布范围
Figure BDA0002247071800000151
由此可见，本发明的苦瓜肽粉制备方法中，首先通过阶段性的升温、保温，可使得组分的细胞结构(如细胞壁等)组成在不同的温度变化环境下被反复冲击、破坏，同时，每一升温、保温阶段结束后补充相应比例的水以及缓冲液，由此对水、酸等蒸发后的反应体系进行补偿，使反应体系始终处于较优的浸提环境中，进一步再进行阶段性升温、反复酶解以及多层次的膜分离纯化技术提取工艺来制备苦瓜多肽蛋白，使得到的苦瓜多肽提取物中苦瓜多肽蛋白的含量高于30％，且提取物产品中不含大豆蛋白多肽等其他非苦瓜来源的多肽蛋白。从表1中可以看出，本发明制备获得的1000-5000Da范围内的苦瓜多肽片段占比接近35％，而1000-5000Da范围内的苦瓜多肽片段可以促进肠道蠕动，增加肠胃动力，清理肠道垃圾，进一步起到润肠通便、缓解便秘的功效。
<大豆肽分子量检测结果>
首先以申请号201310478523.2(“一种提高低分子量大豆肽产量的方法”)的发明专利申请中实施例1所述方案制备的大豆肽粉作为对比例2。将其与通过本发明实施例1-3中的制备方法制备获得的大豆肽粉进行高效凝胶过滤色谱法检测，以获得大豆肽分子量大小及分布范围，其结果如表2所示。
表2大豆肽分子量大小及分布范围
Figure BDA0002247071800000161
从表2中可以看出，本发明的大豆多肽粉制备方法中，可通过接种黑曲霉菌种以及米曲霉菌种产生β-葡萄糖苷酶、淀粉酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、糖化酶、纤维素酶等多种酶类，进一步可用于分解大豆蛋白粉中的纤维素、乳糖、大分子蛋白质、淀粉等原料，将其分解成更容易被胃肠吸收的小分子营养成分(如小分子多肽等)，由此改善胃肠免疫功能，缓解各种胃肠不适症状。其中，本发明制备获得的大豆肽粉中，蛋白肽平均分子量约为500Da，其中1000Da以下的多肽占85％，500Da以下的多肽占37％，由此可便于人体胃肠快速、高效吸收，使其充分发挥其功效。
<综合果蔬酵素粉检测>
先将混合好的水果蔬菜原料添加适量水，通过常规粉碎打浆机打浆后泵送进微通道粉碎机中进行超微粉碎，泵送压力80Mpa，流速可达到120m/s；将得到的超微粉碎的果蔬浆液进行干燥、粉碎，即得作为对比例3的综合果蔬粉；再将其与通过本发明实施例1-3中的制备方法获得的综合果蔬酵素粉进行感官评价以及纤维素含量、果胶含量、可溶性β-葡萄糖含量、可溶性木聚糖含量、溶解率检测，其结果如表3所示；其中感官评价分值为外观20分、质地25分、风味30分、口感25分。
表3综合果蔬粉检测
Figure BDA0002247071800000162
Figure BDA0002247071800000171
从上述表3中可以看出，通过本发明的方法制备获得综合果蔬酵素粉中，其不溶性纤维素含量较对比例3降低50％以上，但同时果胶、可溶性β-葡萄糖、可溶性木聚糖这三种可溶性膳食纤维的含量显著增加，以此通过与不溶性纤维素的协同作用延长胃的排空时间、增加胃肠动力、延缓葡萄糖的吸收、降低血胆固醇水平，减少排泄物在肠道的停留时间，增加体积，润肠通便，缓解胃肠胀气等各种不适症状。在此基础上，本发明制备获得的综合果蔬酵素粉溶解率约为97％，带来良好口感和风味的同时利于肠胃吸收。而这种对于果蔬粉成分含量的改变正是通过将康宁木霉菌种作为发酵菌种，结合多阶段的酶解过程所获得的。
<实施例4>
本实施例还提供了一种治疗胃肠紊乱及腹胀腹泻的益生元多肽复合益生菌的制备方法，其包括：
S100、按照实施例1-3任一项所述制备方法制备苦瓜肽粉以及大豆肽粉；
S200、将如实施例1-3任一项所述重量份的车前子、甘草、鸡内金、大黄、六神曲充分混合，以获得原料混合物，再将所述原料混合物置于一级发酵罐中，加入所述原料混合物重量5-6倍的去离子水以及所述原料混合物重量0.2-0.25倍(优选0.22倍)的纤维素酶，调节pH为6.8-7，且调节至25-35℃(优选30℃)进行一级发酵，发酵36-48h(优选42h)后分离出液态的第一发酵液；
分离出所述第一发酵液后，向一级发酵罐内的残留物中加入所述一级发酵罐内的残留物重量1-2倍的去离子水、所述一级发酵罐内的残留物重量0.2-0.3倍(优选0.25倍)的果胶酶、如实施例1-3任一项所述重量份的无水柠檬酸，调节pH为3.5-4.5(优选4.0)，且调节至40-50℃(优选45℃)再次进行一级发酵，发酵24-36h后分离出液态的第二发酵液；
S300、将所述第一发酵液、第二发酵液合并转移至二级发酵罐中，加入所述第一发酵液与第二发酵液重量总和0.8-1倍的去离子水以及所述第一发酵液与第二发酵液重量总和0.2-0.3倍(优选0.25倍)的纤维素酶，调节pH为6.8-7，且调节至30-40℃(优选35℃)进行二级发酵，发酵24-36h后获得分离出液态的第三发酵液；
S400、分离出所述第三发酵液后，将所述二级发酵罐中的残留物与一级发酵罐中再次进行一级发酵、且分离出液态的第二发酵液后的残留物合并，加入合并后残留物重量总和1-2倍的去离子水、合并后残留物重量总和0.05-0.15倍(优选0.1倍)的果胶酶，调节pH为3.0-4.0(优选3.5)，且调节至35-55℃(优选45℃)进行再次发酵，发酵24-36h后分离出液态的第四发酵液；
S500、将第三发酵液以及第四发酵液合并，以获得合并发酵液，并对所述合并发酵液进行离心，去除沉淀后获得发酵清液；
S600、在发酵清液中加入体积分数85％的乙醇，于8-10℃温度条件下按照120-180转/min(优选150转/min)搅拌20-30min(优选25min)，且按体积比计，所述发酵清液：乙醇＝(2-4)：1(优选为3:1)；然后升温至60-75℃(优选65℃)以使得乙醇挥发；
S700、步骤S600中乙醇挥发后的发酵清液经截留分子量≥10000Da的超滤膜过滤，以获得超滤液；
S800、将所述超滤液依次过阳离子柱和阴离子柱(其中，阳离子柱中装填的是S2528型Lewatit阳离子交换树脂；阴离子柱中装填的是315型阴离子交换树脂)，收集经阴离子柱排除的流出液，并在流出液中加入如实施例1-3任一项所述重量份的麦芽糊精、玉米淀粉、低聚果糖、果蔬酵素粉、荞麦粉、大豆多肽粉、苦瓜肽粉、鼠李糖乳杆菌、唾液乳杆菌、乳链球菌、嗜酸乳杆菌、动物双歧杆菌及葡萄糖，调节pH至4.0-5.5(优选4.5)以及调节温度至30-37℃(优选35℃)，48-72h后超滤液转移至升膜蒸发器中，调节温度至30-35℃(优选32℃)、真空度至-0.05－-0.08Mpa(优选-0.06Mpa)，所述超滤液体积缩小至原来的30-40％(优选35％)时停止蒸发，以获得一次浓缩液，再将一次浓缩液转移至刮板式浓缩器继续浓缩，调节温度至30-35℃(优选32℃)、真空度至-0.05－-0.08Mpa(优选-0.06Mpa)，所述一次浓缩液体积缩小至原来的20-30％(优选25％)时停止蒸发，以获得二次浓缩液；
S800、将二次浓缩液转移至粗结晶罐内，于温度4℃下静置18-24h(优选20h)，中途每间隔2h以150-180转/min(优选150转/min)搅拌10min，以获得粗结晶原料；按质量百分比计，将粗结晶原料脱水至含水量≤20％，得粗结晶；再将所述粗结晶重新溶解，调节温度至30-35℃，并加入粗结晶重量1-2％(优选1.5％)的活性碳搅拌脱色，待脱色液透光度为100％时过滤去除活性碳；
S900、将脱色液转移至结晶锅，调节温度至30-35℃、真空度至-0.05－-0.08Mpa(优选-0.06Mpa)，所述脱色液体积缩小至原来的15-20％(优选18％)时停止蒸发，以获得脱色浓缩液；再将脱色浓缩液转移至育晶锅内，于温度4℃、150-200转/min(优选180转/min)条件下搅拌30分钟后静置24-36h，静置过程中每间隔2h以150-200转/min(优选180转/min)搅拌10min；按质量百分比计，再将育晶锅内结晶充分的原料脱水至含水量≤8％，于真空干燥机中烘干30-60min(优选45min)后即得到所述治疗胃肠紊乱及腹胀腹泻的益生元多肽复合益生菌。
<促消化功效评价试验>
选用清洁级雄性SD大鼠200只，体重120g～150g，随机分成10组，分别为空白对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组。其中，空白对照组：饲喂纯净水；低剂量组：按给药剂量为0.5g/kg·d给予本发明的益生元多肽复合益生菌(以下均为“益生元多肽复合益生菌”)，正常进食饮水；中剂量组：按给药剂量为1g/kg·d给予本发明的元益生多肽复合益生菌，正常进食饮水；高剂量组：按给药剂量为2g/kg·d给予本发明的元益生多肽复合益生菌，正常进食饮水。每天1次，连续30d。实验期间，大鼠每周测2次体重和食物摄入量，并根据体重变化调整给样量。实验结束前各组动物禁食不禁水24h，采用大鼠幽门结扎法收集3h内排出的胃液，测定单位时间内胃液量和胃蛋白酶活性，其结果如表4所示。
其中，胃蛋白酶测定包括：用内径2mm长10cm的毛细玻璃管吸满蛋清(纱布过滤)，然后于70℃热水中使蛋白凝固，制成蛋白管。精确取胃液1mL放入15mL0.05mol/L盐酸溶液摇匀，再放入蛋白管两根，在37℃恒温箱中保温48h，测量蛋白管两端透明部分的长度(mm)，计算胃蛋白酶活性。胃蛋白酶活性(U/mL)＝四端蛋白管透明部分长度均值2×16。
表4益生元多肽复合益生菌对大鼠胃液量和胃蛋白酶活性影响
Figure BDA0002247071800000191
Figure BDA0002247071800000201
从表4结果可以看出，相对于空白对照组，通过本发明的益生元多肽复合益生菌饲喂的大鼠中，其单位时间内胃液量和胃蛋白酶活性均显著提高(最多可分别提高47％和25.9％)，而胃液量和胃蛋白酶活性的显著的增加可极大的促进肠胃的消化能力，起到促消化、缓解胃肠不适的功能。
<人体临床试验>
采用自身和组间对照两种试验设计。按受试者的便秘症状(排便次数、粪便性状、症状、持续时间等)随机分为试食组和对照组，尽可能考虑到影响结果的主要因素如年龄、性别、日常饮食、便秘原因等，进行均衡性检验，以保证组间的可比性。每组受试者为50例。
受试组：按服用量2g/kg·d服用本发明的益生元多肽复合益生菌，每日2次，不改变原来的饮食习惯，正常饮食；空白对照组：不服用药剂，不改变原来的饮食习惯，正常饮食；阳性对照组：服用麻仁丸水蜜丸，每日2次，一次9g，不改变原来的饮食习惯，正常饮食。
在给予受试样品之前，无菌采集受试者粪便0.1g，10倍系列稀释，选择合适的稀释度分别接种在各培养基上。培养后，以菌落形态、革兰氏染色镜检、生化反应等鉴定计数菌落，计算出每克湿便中的菌数，取对数后进行统计处理。试验14d，最后一次给予受试样品之后24h，与实验前同样方式取粪便，检测肠道菌群，方法同上。结果如表5所示。进一步的，通过临床观察采集试验结果，显著改善便秘为有效，毫无改善，无正面影响为无效，其结果如表6所示。
表5益生元多肽复合益生菌对肠道菌群的影响
Figure BDA0002247071800000211
表6有效率统计结果
组别 人数 有效 无效 总有效率
实施例1 50 47 3 94％
实施例2 50 45 5 90％
实施例3 50 48 2 96％
阳性对照组 50 44 7 88％
表5-6结果表明：受试组体内的双歧杆菌、乳酸杆菌、肠球菌、肠杆菌益生菌数与空白对照组相比显著上升，且增长数优于对比例。临床观察功效比较中，实施例1-3有效率都比对比例高，且实施例3总有效率最高，为96％。由此可以得知，本发明的受治疗胃肠紊乱及腹胀腹泻的益生元多肽复合益生菌能够缓解胃肠道不适、预防与缓解腹泻，增强胃动力，防止便秘。
需要说明的是，上述实施例1至4中的技术方案可进行任意组合，且组合后获得的技术方案均属于本发明的保护范围。
综上所述，本发明通过阶段性升温、反复酶解以及多重过滤的提取工艺，使得苦瓜肽中苦瓜多肽蛋白含量不低于20％，以及通过阶段性升温和反复超声提取的方式获得平卧菊三七提取物，由此可大幅提高苦瓜多肽蛋白的生产效率和纯度；通过光照、磁场处理结合多阶段的酶解步骤来提高大豆肽中有效成分的产率。进一步的，苦瓜肽、大豆肽与其他组分复配使用后，其具有明显的增加肠动力、促进肠胃消化吸收以及调节肠胃功能等效果。
这里说明的设备数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实例。

Claims (10)

1.治疗胃肠紊乱及腹胀腹泻的益生元多肽复合益生菌，其特征在于，按重量份计，其包括：麦芽糊精5-8份、玉米淀粉3-5份、低聚果糖2-3份、果蔬酵素粉20-25份、荞麦粉10-12份、大豆多肽粉5-8份、苦瓜肽粉10-12份、鼠李糖乳杆菌0.1-0.2份、唾液乳杆菌0.2-0.4份、乳链球菌0.2-0.3份、嗜酸乳杆菌0.1-0.2份、动物双歧杆菌0.2-0.3份、无水柠檬酸1-2份、车前子2-3份、甘草8-10份、鸡内金0.8-1份、大黄1-2份、六神曲1-2份、葡萄糖5-6份。
2.如权利要求1所述的益生元多肽复合益生菌，其特征在于，所述苦瓜肽粉的制备方法包括如下步骤：
S11、取新鲜苦瓜、干燥苦瓜、苦瓜籽中的一项或几项作为苦瓜原料，加入苦瓜原料重量5倍的去离子水，并在25℃水温下浸泡8-12h，取出再用去离子水冲洗2-3遍；
S12、将清洗后的苦瓜原料进行干燥，打碎磨浆，得到苦瓜浆液；
S13、取苦瓜浆液以及缓冲液进行混合，以获得混合体系，按重量比计，按照苦瓜浆液：缓冲液＝1:(4.5-5.5)；记录混合体系总体积数值，将pH值调节为7后对混合体系进行温度处理，以获得浸提物；
所述温度处理过程包括：
升温至45-55℃，保温45-60min，再降温至20-25℃，保温25-30min，并记录此时混合体系整体的第一体积数值；按照(总体积-第一体积)*60％补入含有去离子水和缓冲液的第一混合液，且按照重量比计，去离子水：缓冲液＝4：1；补入第一混合液后，升温至60-75℃，保温60-75min，再降温至45-55℃，保温30-35min，并记录此时混合体系整体的第二体积数值；按照(总体积-第二体积)*75％补入含有去离子水和缓冲液的第二混合液，且按照重量比计，去离子水：缓冲液＝3：1；补入第二混合液后，升温至80-90℃，保温75-85min，再降温至60-75℃，保温35-45min；
S14、将浸提物温度降至20-25℃后对所述浸提物进行酶解，以获得苦瓜肽酶解体系；其中，所述酶解过程包括：
第一次酶解：将浸提物的pH值调节至8.0，按浸提物重量的4.5％加入胰蛋白酶，80-100转/min条件下搅拌，且搅拌的同时升温至35-40℃，保温45-60min后得到第一酶解体系；
第二次酶解：待第一酶解体系温度降至20-25℃后，再调整其pH值至3.5，按第一酶解体系重量的3％加入果胶酶，80-100转/min条件下搅拌，且搅拌的同时升温至45-55℃，保温40-60min后得到第二酶解体系；
第三次酶解：待第二酶解体系温度降至20-25℃后，再调整其pH值至4.8，按第二酶解体系重量的2％加入纤维素酶，80-100转/min条件下搅拌，且搅拌的同时升温至55-60℃，保温30-45min后得到第三酶解体系；
S15、待步骤S14中的酶解过程完成后，对获得的第三酶解体系升温至90℃，维持10min，以完成灭酶活过程，获得苦瓜肽粗提体系；再在所述苦瓜肽粗提体系中按其重量的4-5％加入活性炭，搅拌均匀，在65℃下保温60-90min后离心，去沉渣后获得苦瓜肽粗提液；
将所述苦瓜肽粗提液经硅藻土过滤，以得到苦瓜肽清液，且过滤压力为0.2-0.3MPa；再在所述苦瓜肽清液中按其重量加入4.5％的活性炭，静置45-50min后离心，去沉渣；
S16、将去沉渣后的苦瓜肽清液经过滤孔径为0.5-0.8μm的微滤陶瓷膜进行过滤，过滤温度为60℃，以获得微滤膜透过液；
再将所述微滤膜透过液经截留分子量为100-200kDa卷式超滤膜进行过滤，过滤温度为45-50℃，以获得超滤膜透过液；
再将所述超滤膜截留液经截留分子量为150-1000Da的卷式高压反渗透膜进行浓缩，以除去水分及部分残留无机盐和小分子杂质，浓缩温度在40℃以下，以得到苦瓜肽浓缩液；
S17、通过真空冷冻干燥方法对所述苦瓜肽浓缩液进行干燥，以获得苦瓜多肽蛋白含量不低于30％的苦瓜肽粉。
3.如权利要求2所述的益生元多肽复合益生菌，其特征在于，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液。
4.如权利要求1所述的益生元多肽复合益生菌，其特征在于，所述大豆多肽粉的制备方法包括如下步骤：
S21、将黑曲霉菌种以及米曲霉菌种分别接种于独立的马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，再分别放入培养箱中，均于28-35℃条件下活化48-72h，以获得活化的黑曲霉菌种以及米曲霉菌种；
采用配制好的第一液体培养基培养活化的黑曲霉菌种，以获得液态黑曲霉种子液，以及采用配制好的第二液体培养基培养活化的米曲霉菌种，以获得液态米曲霉种子液；
再将所述液态黑曲霉种子液接种到发酵罐中的第一发酵培养基内进行扩大培养，扩大培养温度30-35℃，扩大培养pH6.5-7.0，转速500-800rpm搅拌，培养时间为1-2d，以获得黑曲霉孢子悬浮液；以及将所述液态米曲霉种子液接种到发酵罐中的第二发酵培养基内进行扩大培养，扩大培养温度30-40℃，扩大培养pH6.5-7.0，转速400-600rpm搅拌，培养时间为1-2d，以获得液态米曲霉孢子悬浮液；
S22、按重量份计，在反应釜中加入大豆蛋白粉30-45份、去离子水250-350份、黑曲霉孢子悬浮液20-25份、米曲霉孢子悬浮液15-20份、La(NO3)3.6H2O 0.5-0.6份、NH4Cl 1.5-2.5份、KNO3 1-2份，以获得发酵体系，并调节所述发酵体系的pH至6.8-7.0；
对所述发酵体系依次进行三阶段的发酵处理：
第一发酵阶段处理中，发酵温度为30-35℃，并在转速300-400rpm条件下对发酵体系进行搅拌，同时对发酵体系进行第一光照处理和第一磁场处理，处理时间为1-2d；所述第一光照处理为：采用光强为25-30μmol.m-2.s-1的红光以及光强为30-35μmol.m-2.s-1的蓝光照射发酵体系，照射处理时间为45-60min；所述第一磁场处理为：采用50Hz、磁场强度为0.45-0.55mT的交变磁场对发酵体系进行磁场处理，磁场处理时间为45-60min；
第二发酵阶段处理中，发酵温度为25-35℃，并在转速500-600rpm条件下对发酵体系进行搅拌，同时对发酵体系进行第二光照处理和第二磁场处理，处理时间为1-2d；所述第二光照处理为：采用光强为20-24μmol.m-2.s-1的红光以及光强为24-28μmol.m-2.s-1的蓝光照射发酵体系，照射处理时间为35-45min；所述第二磁场处理为；采用50Hz、磁场强度为0.35-0.45mT的交变磁场对发酵体系进行处理磁场处理，磁场处理时间为35-45min；
第三发酵阶段处理中，发酵温度为25-35℃，并在转速300-400rpm条件下对发酵体系进行搅拌，同时对发酵体系进行第三光照处理和第三磁场处理，处理时间为1-2d；所述第三光照处理为：采用光强为16-20μmol.m-2.s-1的红光以及光强为20-22μmol.m-2.s-1的蓝光照射发酵体系，照射处理时间为25-35min；所述第三磁场处理为：采用50Hz、磁场强度为0.2-0.3mT的交变磁场对发酵体系进行处理磁场处理，磁场处理时间为25-35min；
S23、将经步骤S22中发酵处理的发酵体系升温至85℃，维持10min，以完成灭酶活过程，获得大豆肽酶解液；
S24、将所述大豆肽酶解液分散于其质量5-6倍的95％乙醇溶液中，且同时进行超声处理及搅拌，超声功率为600-800W，超声处理时间为10-15min，搅拌转速为100-120转/min；
S25、对经步骤S24处理后的反应体系进行过滤，过滤压力控制在0.3-0.4MPa，过滤温度为50-60℃，弃滤渣，以获得大豆肽清液；
S26、对大豆肽清液进行冷冻干燥，以获得所述大豆肽粉。
5.如权利要求4所述的益生元多肽复合益生菌，其特征在于，按重量比计，第一液体培养基包括：茶多酚1％、蔗糖1.5％、葡萄糖2.5％、麦芽提取物5％、CoCl.6H2O 0.1％、CuSO4.5H2O 0.05％、FeNaEDTA 2％、H3BO30.25％、Na2MoO4.2H2O 0.15％、ZnSO4.7H2O 0.1％、MgSO4 0.1％、KNO3 0.1％、KNO3 0.1％、MnSO4.H2O 0.2％、去离子水86.85％。
6.如权利要求4所述的益生元多肽复合益生菌，其特征在于，所述步骤S11中，按重量比计，所述第一发酵培养基包括：番茄汁10％、可溶性淀粉2％、蔗糖2％、葡萄糖2％、玉米粉2.5％、酵母粉0.5％、FeSO4.7H2O 0.1％、MgSO4 0.05％、KNO3 0.05％、CuCl2.2H2O 0.1％、(NH4)6Mo7O24.7H2O 0.15％、MnSO4.H2O 0.1％、去离子水80.45％。
7.如权利要求4所述的益生元多肽复合益生菌，其特征在于，按重量比计，所述第二液体培养基包括：豆芽汁8％、蔗糖1.5％、葡萄糖2.5％、蛋白胨2％、FeNaEDTA 2％、H3BO30.25％、Na2MoO4.2H2O 0.15％、MgSO4 0.1％、KNO3 0.1％、MnSO4.H2O 0.2％去离子水83.2％。
8.如权利要求4所述的益生元多肽复合益生菌，其特征在于，按重量比计，所述第二发酵培养基包括：麦芽糊精5％、玉米粉8％、木糖2％、酵母膏1.5％、MgSO4 0.05％、KNO30.1％、NH4NO3 0.15％、MnSO4.H2O 0.1％、去离子水83.1％。
9.如权利要求4所述的益生元多肽复合益生菌，其特征在于，扩大培养过程中，每天对接种到对应发酵培养基中的液态黑曲霉种子液和/或液态米曲霉种子液进行超声处理，且超声处理频率为20-40Khz，处理时间为30min。
10.一种治疗胃肠紊乱及腹胀腹泻的益生元多肽复合益生菌的制备方法，其特征在于，包括：
S100、制备苦瓜肽粉以及大豆肽粉；
S200、将如权利要求1所述重量份的车前子、甘草、鸡内金、大黄、六神曲充分混合，以获得原料混合物，再将所述原料混合物置于一级发酵罐中，加入所述原料混合物重量5-6倍的去离子水以及所述原料混合物重量0.2-0.25倍的纤维素酶，调节pH为6.8-7，且调节至25-35℃进行一级发酵，发酵36-48h后分离出液态的第一发酵液；
分离出所述第一发酵液后，向一级发酵罐内的残留物中加入所述一级发酵罐内的残留物重量1-2倍的去离子水、所述一级发酵罐内的残留物重量0.2-0.3倍的果胶酶、权利要求1所述的重量份的无水柠檬酸，调节pH为3.5-4.5，且调节至40-50℃再次进行一级发酵，发酵24-36h后分离出液态的第二发酵液；
S300、将所述第一发酵液、第二发酵液合并转移至二级发酵罐中，加入所述第一发酵液与第二发酵液重量总和0.8-1倍的去离子水以及所述第一发酵液与第二发酵液重量总和0.2-0.3倍的纤维素酶，调节pH为6.8-7，且调节至30-40℃进行二级发酵，发酵24-36h后获得分离出液态的第三发酵液；
S400、分离出所述第三发酵液后，将所述二级发酵罐中的残留物与一级发酵罐中再次进行一级发酵、且分离出液态的第二发酵液后的残留物合并，加入合并后残留物重量总和1-2倍的去离子水、合并后残留物重量总和0.05-0.15倍的果胶酶，调节pH为3.0-4.0，且调节至35-55℃进行再次发酵，发酵24-36h后分离出液态的第四发酵液；
S500、将第三发酵液以及第四发酵液合并，以获得合并发酵液，并对所述合并发酵液进行离心，去除沉淀后获得发酵清液；
S600、在发酵清液中加入体积分数85％的乙醇，于8-10℃温度条件下按照120-180转/min搅拌20-30min，且按体积比计，所述发酵清液：乙醇＝(2-4)：1；然后升温至60-75℃以使得乙醇挥发；
S700、步骤S600中乙醇挥发后的发酵清液经截留分子量≥10000Da的超滤膜过滤，以获得超滤液；
S800、将所述超滤液依次过阳离子柱和阴离子柱，收集经阴离子柱排除的流出液，并在流出液中加入权利要求1所述重量份的麦芽糊精、玉米淀粉、低聚果糖、果蔬酵素粉、荞麦粉、大豆多肽粉、苦瓜肽粉、鼠李糖乳杆菌、唾液乳杆菌、乳链球菌、嗜酸乳杆菌、动物双歧杆菌及葡萄糖，调节pH至4.0-5.5以及调节温度至30-37℃，48-72h后超滤液转移至升膜蒸发器中，调节温度至30-35℃、真空度至-0.05－-0.08Mpa，所述超滤液体积缩小至原来的30-40％时停止蒸发，以获得一次浓缩液，再将一次浓缩液转移至刮板式浓缩器继续浓缩，调节温度至30-35℃、真空度至-0.05－-0.08Mpa，所述一次浓缩液体积缩小至原来的20-30％时停止蒸发，以获得二次浓缩液；
S800、将二次浓缩液转移至粗结晶罐内，于温度4℃下静置18-24h，中途每间隔2h以150-180转/min搅拌10min，以获得粗结晶原料；按质量百分比计，将粗结晶原料脱水至含水量≤20％，得粗结晶；再将所述粗结晶重新溶解，调节温度至30-35℃，并加入粗结晶重量1-2％的活性碳搅拌脱色，待脱色液透光度为100％时过滤去除活性碳；
S900、将脱色液转移至结晶锅，调节温度至30-35℃、真空度至-0.05－-0.08Mpa，所述脱色液体积缩小至原来的15-20％时停止蒸发，以获得脱色浓缩液；再将脱色浓缩液转移至育晶锅内，于温度4℃、150-200转/min条件下搅拌30分钟后静置24-36h，静置过程中每间隔2h以150-200转/min搅拌10min；按质量百分比计，再将育晶锅内结晶充分的原料脱水至含水量≤8％，于真空干燥机中烘干30-60min后即得到所述治疗胃肠紊乱及腹胀腹泻的益生元多肽复合益生菌。
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