CN114948831A - 一种具有舒缓保湿功效的组合物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种具有舒缓保湿功效的组合物及其制备方法和应用。本申请提供的组合物由铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花共生发酵获得。本申请提供的组合物具有抗氧化和舒缓保湿的作用，组合物温和不刺激，适合应用于儿童护理产品中。

Description

一种具有舒缓保湿功效的组合物及其制备方法与应用

技术领域

本申请属于护肤品领域，特别涉及一种具有舒缓保湿功效的组合物及其制备方法和应用。

背景技术

儿童的皮肤比较娇嫩，需特别护理，尤其是在冬夏季，护理不当容易出现皮肤问题。在干燥的冬天，大部分儿童皮肤水分蒸发严重，容易导致皮肤的天然保护屏障——水脂膜出现“漏洞”，儿童皮肤抵御外界刺激的能力减退，从而引起各种皮肤问题。目前，市场保湿产品品类众多，保湿效果各异，常用的保湿成分大多是多元醇类、油脂类等，这些成分皮肤难以吸收、封闭皮肤、肤感厚重黏腻，效果也有限，且部分多元醇类、油脂类保湿成分对儿童皮肤刺激性较大，无法满足儿童皮肤保湿的需求。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点与不足，本申请的首要目的在于提供一种具有舒缓保湿功效的组合物的制备方法。

本申请另一目的在于提供上述方法制备的具有舒缓保湿功效的组合物，其可以解决现有技术中的保湿成分不适用于儿童皮肤的问题。

本申请再一目的在于提供上述具有舒缓保湿功效的组合物的应用，尤其是儿童护理产品的应用。

本申请的目的通过下述方案实现：

一种具有舒缓保湿功效的组合物的制备方法，包括以下步骤：

将铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花加入至液体培养基中，得到液态发酵培养基；

将菌剂种子液接入至所述液态发酵培养基中发酵，得到发酵液；

对所述发酵液进行灭活处理和纯化处理，得到具有舒缓保湿功效的组合物。

可选的，在一些实施方式中，所述菌剂种子液包括乳酸菌种子液和/或酵母菌种子液。

可选的，在一些实施方式中，在所述将铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花加入至液体培养基中，得到液态发酵培养基的步骤之前，还包括制备所述乳酸菌种子液和/或所述酵母菌种子液，具体步骤如下：

将乳酸菌种和酵母菌种分别配制成乳酸菌悬液和酵母菌悬液；

将所述乳酸菌悬液和所述酵母菌悬液分别接种于固体培养基中活化培养，得到活化的乳酸菌和酵母菌；

将所述活化的乳酸菌和酵母菌分别接种至种子培养基中进行扩培，得到所述乳酸菌种子液和所述酵母菌种子液。

可选的，在一些实施方式中，不管是单独加入还是一起加入，所述的乳酸菌种子液和所述酵母菌种子液的浓度均为1x10⁷cfu/ml至1x10⁹CFU/mL，所述的乳酸菌种子液或所述酵母菌种子液的加入量占所述液态发酵培养基的总质量百分比均为1％至5％。

可选的，在一些实施方式中，所述乳酸菌包括植物乳杆菌和/或鼠李糖乳杆菌。

可选的，在一些实施方式中，所述酵母菌包括酿酒酵母菌和/或裂殖酵母菌。

可选的，在一些实施方式中，铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花在所述液态发酵培养基中的总质量百分比为0.1％至30％；优选为0.2％至20％。

可选的，在一些实施方式中，铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花的质量比为5～30:1～8:5～30:5～30；优选为10～20:3～6:10～20:10～20；更优选为2:1:2:2。

可选的，在一些实施方式中，所述液体培养基选自沙氏液体培养基、高盐察氏培养基、氯硝胺18％甘油琼脂培养基、孟加拉红培养基或YES培养基中的一种或多种的组合。

可选的，在一些实施方式中，所述发酵培养的温度为25℃至45℃，pH为4.0-7.0，发酵罐的搅拌桨的转速为100至300r/min，发酵时间为24h至72h。

可选的，在一些实施方式中，当发酵菌种为乳酸菌时，发酵培养的温度为25℃-45℃。发酵的pH为5.0-7.0。

可选的，在一些实施方式中，当发酵菌种为酵母菌时，发酵培养的温度为25℃-30℃。发酵的pH为4.0-6.0。

可选的，在一些实施方式中，当发酵菌种为乳酸菌和酵母菌时，发酵培养的温度为25℃-30℃。发酵的pH为5.0-6.0。

可选的，在一些实施方式中，在将所述乳酸菌种子液和/或所述酵母菌种子液接入至液态发酵培养基的步骤之后，还包括调节液态发酵培养基的pH。

可选的，在一些实施方式中，所述发酵液的灭活处理的温度为90℃至110℃，所述灭活处理的时间为30s至120s；所述纯化处理包括对所述发酵液进行脱色处理、过滤去渣或过微滤膜。

可选的，在一些实施方式中，所述脱色处理的脱色剂选自硅藻土助滤剂、羧甲基可聚糖或脱色活性炭中的一种多种，所述脱色处理的时间为10min至30min。脱色剂用量为发酵液质量的0.5至2％。

可选的，在一些实施方式中，所述过微滤膜的步骤包括将所述发酵液依次经过10μm、5.0μm及2.5μm的聚丙烯微滤膜滤柱以除去所述发酵液的杂质。

可选的，在一些实施方式中，在所述将铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花加入至液体培养基中，得到发酵培养基的步骤之前，还包括对铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花进行酶解处理。

可选的，在一些实施方式中，所述酶解处理选用的酶包括纤维素酶和/或果胶酶。

可选的，在一些实施方式中，所述纤维素酶和/或果胶酶的添加量为铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花与水形成的混合液的质量百分比的0.02至1％。

可选的，在一些实施方式中，所述纤维素酶和所述果胶酶的添加量比例为1:9至9:1，优选为1:1。

可选的，在一些实施方式中，所述纤维素酶和所述果胶酶的酶解温度为40℃至55℃，所述纤维素酶和所述果胶酶的酶解时间为3h至5h。

可选的，在一些实施方式中，所述纤维素酶和所述果胶酶的灭酶温度为85℃至95℃，所述纤维素酶和所述果胶酶的灭酶时间为20min至40min。

可选的，在一些实施方式中，所述酶解处理选用的酶还包括蛋白酶；所述蛋白酶优选为木瓜蛋白酶和/或菠萝蛋白酶。

可选的，在一些实施方式中，所述蛋白酶的添加量为铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花与水形成的混合液的质量百分比的0.05％至1％。

可选的，在一些实施方式中，所述蛋白酶的酶解温度为50℃至60℃，所述蛋白酶的酶解时间为2h至4h。

在所述将铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花加入至液体培养基中，得到液态发酵培养基的步骤之前，还包括对铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花进行固态发酵处理：

制备固态发酵菌悬液；

制备铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花的发酵床；

对所述发酵床进行发酵处理；

对所述发酵床进行灭活处理。

可选的，在一些实施方式中，所述固态发酵菌悬液占铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花的发酵床的总质量百分比的35％至55％。

可选的，在一些实施方式中，所述固态发酵选用的菌种为酵母菌；优选为产朊假丝酵母菌、面包酵母菌、酿酒酵母菌中一种或多种的组合。

可选的，在一些实施方式中，所述固态发酵的温度为25℃至40℃，所述发酵的湿度为85％至90％，所述固态发酵的时间为48h至120h。

可选的，在一些实施方式中，所述发酵床灭活处理的温度为90℃至110℃，所述发酵床灭活处理的时间为30s至120s。

铁皮石斛为兰科石斛属多年生附生型草本植物，富含石斛多糖、石斛碱、多酚、菲类、联节类、荀酮化合物、氨基酸以及微量元素等多种生物活性物，是我国传统的名贵中草药。根据植物化学及植物药理学研究发明，铁皮石斛主要的活性成分为石斛多糖，具有免疫调节、抗肿瘤、抗疲劳、抗敏消炎、抗氧化、抗衰老以及补水保湿等功效。

砂仁是传统的“四大南药”之一，具有广泛的药用基础与经济价值。目前主要栽培于云南、广西、广东等地。砂仁干燥成熟的果实是一味重要的中药材，始载于唐代的《药性本草》，原名为缩沙蔤，为历代常用中药。历年《中华人民共和国药典》均有收载，砂仁具有化湿开胃，温脾止泻，理气安胎之功效，用于治疗湿浊中阻，脘痞不饥，脾胃虚寒，呕吐泄泻，妊娠恶阻，胎动不安等症。挥发性物质(乙酸龙脑酯、樟脑、柠檬烯、龙脑等)是砂仁的主要功效成分。现代研究表明砂仁精油具有良好的调节胃肠道功能、抗溃疡、镇痛、抗炎、抑菌、抗过敏，抗氧化和降血糖的作用。

柚子是芸香科植物柚的成熟果实，产于我国南方地区,其果实酸甜凉润，营养丰富；其果皮、柚花皆可入药。柚子富含营养物质和较高的药用价值，特别是柚子皮中富含多种活性多糖、黄酮、果胶、天然色素、香精油等多种有益健康的活性成分，且高于柚果中的含量。然而，柚子经人们食用和生产加工后，仍有鲜重20～30％的柚皮无法加以利用。这些柚皮大多被晒干、焚烧或直接当做废弃物扔掉，不仅对生态环境造成了严重污染，而且还大大浪费了柚皮中丰富的资源。柚子果皮经过加工后的提取物具有美白祛斑、消炎抗菌、抗过敏、抗氧化等多种美容功效，是非常好的天然植物化妆品原料。

茉莉花为木樨科茉莉属，原产印度，现广泛种植于我国江苏、广西、福建和广东等地区。茉莉花含有大量营养成分及活性物质。研究表明，目前茉莉花检测出的功效有抗感染、抗肿瘤、抗癌、降血糖等。当今化妆品行业飞速发展，茉莉花作为中国的天然植物资源之一，富含多种活性成分和活性功能，主要包括多糖、黄酮、挥发油等，在化妆品中具有巨大的应用前景。

本申请将铁皮石斛、砂仁、柚皮、茉莉花共同发酵，得到的组合物富含活性物质，具有舒缓保湿的功效。

本申请还提供一种具有舒缓保湿功效的组合物，所述具有舒缓保湿功效的组合物采用如前所述的制备方法制备得到。

本申请还提供一种具有舒缓保湿功效的组合物的应用，尤其是在儿童护理产品中的应用。

可选的，在一些实施方式中，所述儿童护理产品包括柔肤水类、乳液类、膏霜类、啫喱类、粉类、喷雾类、精华类、洗护类的儿童护理产品。

可选的，在一些实施方式中，所述具有舒缓保湿功效的组合物在儿童护理产品的添加量为1-20％。

本申请相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：

(1)本申请提供的制备方法得到的组合物中富含铁皮石斛、砂仁、柚皮、茉莉花中的活性物质。植物提取物中活性物质的提取效率明显高于水提法和超声辅助提取法的提取效率，有利于植物提取物中活性物质的充分提取与应用。

(2)本申请选用的发酵菌种均为益生菌或常见的可食用菌种，对人体安全无害，适合推广和大规模生产。

(3)将多种植物与乳酸菌和/或酵母菌共生发酵，避免了单独将每一种植物进行发酵，大大简化了制备工艺，缩短制程时间，降低生产成本，适合规模化生产。

(4)铁皮石斛、砂仁、柚皮、茉莉花共生发酵过程中，各植物之间存在协同作用，四者共同发酵的发酵液的效果优于单独使用铁皮石斛、砂仁、柚皮、茉莉花，或使用四者中的三个进行发酵得到的发酵液的效果。

(5)本申请提供的具有舒缓保湿功效的组合物的制备过程不使用任何有机溶剂，卫生安全，环保无污染，适合应该用于工业生产。

(6)本申请提供的由多种植物共同发酵得到的组合物具有舒缓保湿功效，适合应用于儿童护理产品。

(7)本申请选用的柚皮为人们食用和生产加工柚子后剩余的边角料，选用柚皮制备组合物有利于充分利用植物资源，降低生态环境污染。

附图说明

为了更清楚地说明本申请中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本申请提供的实施例1-4和对比例1-10对自由基的抑制效果图。

图2为本申请提供的使用实施例1-4和对比例1-10的组合物1、2、4、6小时后的皮肤角质层水分含量的变化率的示意图。

图3为本申请提供的皮肤弹性测试中使用实施例1-4和对比例1-10的组合物后R2值在第5天、第7天、第10天、第15天与第0天的差值示意图。

图4为本申请提供的皮肤弹性测试中使用实施例1-4和对比例1-10的组合物后R5值在第5天、第7天、第10天、第15天与第0天的差值示意图。

图5为本申请提供的皮肤弹性测试中使用实施例1-4和对比例1-10的组合物后R7值在第5天、第7天、第10天、第15天与第0天的差值示意图。

图6为本申请实施例1-4和对比例1-10制备得到的组合物的使用者调查问卷结果柱状图。

具体实施方式

下面将结合本申请中的附图，对本申请中的具有舒缓保湿功效的组合物及其制备方法与其在护理产品中的应用进行清楚、完整地描述，目的是为了让公众更好的理解本申请所述的技术方案，而不是对所述技术方案进行限制，事实上，在以相同或近似的原理对所述配方及其制备方法进行的改进，都在本申请所要求保护的权利要求范围之内。

实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本申请提供一种具有舒缓修复功效的组合物的制备方法，具体包括以下步骤：

步骤B10：将铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花加入至液体培养基中，得到液态发酵培养基。

具体的，使用粉碎机分别将晒干后的铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花打碎。将铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花粉末加入至液体培养基中，混合均匀。将混合铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花粉末的液体培养基通过高压蒸汽灭菌，降温至室温，得到液态发酵培养基。其中，

铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花在液态发酵培养基中的总质量百分比为0.1％至30％；优选为0.2％至20％。

铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花的质量比为5～30:1～8:5～30:5～30；优选为10～20:3～6:10～20:10～20；更优选为2:1:2:2。

液体培养基可以选自沙氏液体培养基、高盐察氏培养基、氯硝胺18％甘油培养基、孟加拉红培养基或YES培养基中的一种或多种的组合。

液体培养基可以通过以下步骤制备得到：

沙氏液体培养基的配置方法为(以制备1L的沙氏液体培养基为例)：将40g至50g葡萄糖，10g至30g蛋白胨溶解于人工海水中，并定容至1L，120℃至130℃灭菌20min至30min后贮存备用。其中，人工海水的配方为：NaCl 20g至30g、MgSO₄·7H₂O 1g至8g、CaCl₂·2H₂O 1g至3g、KCl 0.5g至1g、NaHCO₃ 0.2g至1.0g、KBr 0.1g至0.5g、H₃BO₃ 0.01g至0.05g，蒸馏水加至1L。

高盐察氏培养基的配置方法为(以制备1L的高盐察氏培养基为例)：NaCl 50g至80g、AgNO₃ 1g至5g、KH₂PO₄ 1g至3g、MgSO₄·7H₂O 0.5g至3g、KCl 0.5g至1g、FeSO₄0.01g至0.5g、蔗糖30g至50g，蒸馏水加至1L，120℃至130℃灭菌20min至30min后贮存备用。

氯硝胺18％甘油培养基的配置方法为(以制备1L的氯硝胺18％甘油培养基为例)：蛋白胨5g至10g、无水葡萄糖10g至30g、KH₂PO₄ 1g至3g、MgSO₄·7H₂O 0.5g至3.0g、氯硝胺0.002g至0.01g、氯霉素0.1g至0.5g、甘油200g至250g、蒸馏水加至1L，120℃至130℃灭菌20min至30min后贮存备用。

孟加拉红培养基的配置方法为(以制备1L的孟加拉红培养基为例)：蛋白胨5g至10g、葡萄糖10g至20g、KH₂PO₄ 1g至3g、MgSO₄·7H₂O 0.5g至3g、氯霉素0.1g至0.5g、1/3000孟加拉红溶液100ml至200ml，蒸馏水加至1L，120℃至130℃灭菌20min至30min后贮存备用。

YES培养基的配置方法为(以制备1L的YES培养基为例)：酵母提取物1g至5g、葡萄糖10至30g、NaCl 50g至80g、CuSO₄·5H₂O 0.001g至0.01g、ZnSO₄ 0.01g至0.05g、氯硝胺0.002g至0.02g、氯霉素0.1g至0.5g，蒸馏水加至1L，120℃至130℃灭菌20min至30min后贮存备用。

在将混合铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花粉末的液体培养基通过高压蒸汽灭菌的步骤中，高压蒸汽灭菌的温度为120℃至130℃，高压蒸汽灭菌的时间为20min至60min。

步骤B20：将菌剂种子液接入至液态发酵培养基中发酵，得到发酵液。

具体的，移取菌剂种子液至发酵罐的液态发酵培养基中，通过搅拌桨搅动发酵罐内的液态发酵培养基进行发酵培养，得到发酵液。其中，

菌剂种子液包括乳酸菌种子液和/或酵母菌种子液。其中，

乳酸菌选自植物乳杆菌和/或鼠李糖乳杆菌。植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌均为兼性厌氧菌，在有氧和无氧条件下均可繁殖，因此，发酵时不需要对氧气进行严格的控制即可进行发酵。植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌可以发酵多种单糖(葡萄糖、阿拉伯糖、麦芽糖等)，发酵过程不产生吲哚和硫化氢，具有耐酸、耐胆汁盐、耐多种抗生素的生物学特点。选用乳酸菌进行发酵，有助于提高铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花中多糖物质的溶出。

酵母菌选自酿酒酵母菌和/或裂殖酵母菌。酵母菌具有耐酸、耐热和耐盐和容易培养的特点。选用酒酵母菌和/或裂殖酵母菌进行发酵，有助于提高铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花中酮类物质的溶出。

本申请利用乳酸菌和/或酵母菌共同发酵铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花。铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花的植物组合刺激了乳酸菌和酵母菌次级代谢生物合成途径改变，继而使得最终得到的组合物中活性物质含量较高，组合物的抗氧化性能和保湿功效最好。

在本申请中，植物乳杆菌选自植物乳杆菌(BNCC 194165)菌种，鼠李糖乳杆菌选自鼠李糖乳乳杆菌(BNCC 134266)菌种。酿酒酵母菌选自酿酒酵母菌(BNCC 336054)菌种。裂殖酵母菌选自裂殖酵母菌(BNCC 115640)。

乳酸菌种子液的接种量为液态发酵培养基的质量百分比的1％至5％，酵母菌种子液的接种量为液态发酵培养基的质量百分比的1％至5％。在乳酸菌种子液中，乳酸菌的浓度为1x10⁷cfu/ml至1x10⁹cfu/ml。在酵母菌种子液中，酵母菌的浓度为1x10⁷cfu/ml至1x10⁹cfu/ml。

发酵培养的温度为25至45℃，发酵罐内的发酵培养的pH为4.0-7.0，搅拌桨的转速为100至300r/min，发酵时间为24h至72h。

当发酵菌种为乳酸菌时，发酵培养的温度为25℃-45℃。发酵的pH为5.0-7.0。当发酵菌种为酵母菌时，发酵培养的温度为25℃-30℃。发酵的pH为4.0-6.0。当发酵菌种为乳酸菌和酵母菌时，发酵培养的温度为25℃-30℃。发酵的pH为5.0-6.0。

在上述温度和pH范围内，乳酸菌和酵母菌繁殖速度较快，得到的组合物活性物质较多。

在一些实施方式中，将乳酸菌种子液和/或酵母菌种子液接入至液态发酵培养基后，还包括：

调节发酵罐内的液态发酵培养基的pH。

具体的，可以通过柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液和/或磷酸缓冲溶液调节液态发酵培养基的pH。其中，pH的调节范围为6.0-7.0。

步骤B30：对发酵液进行灭活处理和纯化处理，得到具有舒缓保湿功效的组合物。

将发酵得到的发酵液进行灭活处理，以对液态发酵培养基中的乳酸菌和酵母菌灭活。将灭活处理后的发酵液进行脱色处理、过滤去渣或过微滤膜，得到具有舒缓保湿功效的组合物。具有舒缓保湿功效的组合物包括铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花中的多种活性物质。其中，

灭活处理的条件为灭活温度为90℃至110℃，灭活处理的时间为30s至120s。

脱色处理是指采用脱色剂对发酵液进行脱色。脱色剂选自硅藻土助滤剂、羧甲基可聚糖或脱色活性炭中的一种多种。脱色处理的时间为10min至30min。脱色剂用量为发酵液质量的0.5至2％。

过滤去渣是指利用板框压滤机过滤去渣。

过微滤膜是指将滤液依次经过10μm、5.0μm及2.5μm的聚丙烯微滤膜滤柱除去杂质。

将发酵液进行脱色处理、过滤去渣或过微滤膜可以去除发酵液中的杂质，提高组合物在发酵液中的浓度，降低组合物在应用时对皮肤的刺激性。

在一些实施方式中，对发酵液进行纯化处理可以包括依次对发酵液进行脱色处理、过滤去渣和过微滤膜。对发酵液进行多步骤的纯化处理可以进一步减少发酵液中的杂质，降低组合物在应用时对皮肤的刺激性。

在一些实施方式中，在将乳酸菌种子液和/或酵母菌种子液接入至液态发酵培养基中发酵之前，还可以包括：

步骤B40：制备乳酸菌种子液和/或酵母菌种子液。

具体可以包括以下步骤：

步骤B41：将乳酸菌种或酵母菌种分别配制成乳酸菌悬液和酵母菌悬液。

其中，溶剂为无菌水。乳酸菌的质量百分比为0.01％至1％。酵母菌的质量百分比为0.01％至1％。

步骤B42：将乳酸菌悬液和酵母菌悬液分别接种于固体培养基活化培养，得到活化的乳酸菌和酵母菌。

其中，培养的温度为25℃-40℃，培养的时间为24h至72h。乳酸菌悬液的移取量为1μL至5μL。酵母菌悬液的移取量为1μL至5μL。

固体培养基选自马铃薯葡萄糖琼脂培养基和/或DRBC琼脂固体培养基。马铃薯葡萄糖琼脂培养基和DRBC琼脂固体培养基可以采用以下步骤制备得到：

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(以制备1L的马铃薯葡萄糖琼脂培养基为例)的制备步骤为：将新鲜马铃薯洗净去皮，称取200g至300g马铃薯切块，加水煮烂(煮沸20min至40min)，利用100目至500目滤布过滤残渣。在滤液中添加琼脂20g至40g，葡萄糖20g至40g，再补足水分至1L，120℃至130℃灭菌20min至30min后贮存备用。

DRBC琼脂固体培养基(以制备1L的DRBC琼脂固体培养基为例)的制备步骤为：取3号月示胨5g至10g、葡萄糖10g至30g、KH₂PO₄ 1g至3g、氯硝胺0.002g至0.01g、MgSO₄·7H₂O0.5g至3.0g、虎红0.0g至0.1g、琼脂15g至30g混合均匀，再补足水分至1L，120℃至130℃灭菌20min至30min后贮存备用。

需要说明的是，本申请中以制备1L的马铃薯葡萄糖琼脂培养基和1L的DRBC琼脂固体培养基为例，在实际制备固体培养基时，可以依据实际的需求调整上述原料的添加量，本申请中原料的添加量并不以此为限。

步骤B43：将活化的乳酸菌和酵母菌接种分别至不同的种子培养基中进行扩培，得到乳酸菌种子液和酵母菌种子液。

具体的，通过接种环将活化的乳酸菌和酵母菌分别接种至种子培养基中进行培养，在25℃至40℃的条件下培养24h至72h，得到乳酸菌种子液和酵母菌种子液。

在乳酸菌种子液中，乳酸菌的浓度为1x10⁷cfu/ml至1x10⁹cfu/ml。在酵母菌种子液中，酵母菌的浓度为1x10⁷cfu/ml至1x10⁹cfu/ml。

种子培养基可以选自沙氏液体培养基、高盐察氏培养基、氯硝胺18％甘油培养基、孟加拉红培养基或YES培养基中的一种或多种的组合。沙氏液体培养基、高盐察氏培养基、氯硝胺18％甘油培养基、孟加拉红培养基和YES培养基的制备如前所述，此处不再累述。

本申请采用微生物发酵的工艺，以乳酸菌和酵母菌共生发酵铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花，获得具有舒缓保湿功效的组合物。本申请制备具有舒缓保湿功效的组合物的过程是一个环境友善的绿色化学过程。组合物的制备过程中不使用有机溶剂，卫生安全，环保无污染反应条件温和、操作简单、成本较低，适合应该用于工业生产。

在一些实施方式中，在将铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花加入至液体培养基的步骤之前，还可以包括：

步骤B50：对铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花进行酶解处理。

具体的，使用粉碎机分别将铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花打碎，在铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花粉末中加入水，混合均匀，得到混合液。在混合液中加入纤维素和果胶酶进行酶解，酶解结束后进行灭酶处理。

纤维素酶和果胶酶的总用量为混合液的质量百分比的0.02％至1％。纤维素酶和果胶酶的添加量比例为1:9至9:1，优选为1:1。酶解的温度为40℃至55℃。纤维素酶和果胶酶的酶解的时间为3h至5h。纤维素酶和果胶酶的灭酶的温度为85℃至95℃。纤维素酶和果胶酶的灭酶时间为20min至40min。

在本申请中，可以将铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花这四个植物样品分别采用纤维素酶和果胶酶进行酶解处理，也可以将铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花的粉末进行混合，同时将四个样品通过纤维素酶和果胶酶进行酶解，本申请中对此不作限定。

通过对铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花进行酶解处理，可以将植物样品中的纤维素进行裂解，减弱植物样品细胞间的连接，破坏植物细胞的细胞壁，有利于后续发酵步骤中活性物质的溶出，提高活性物质的提取效率。

在一些实施方式中，可以仅使用纤维素酶或果胶酶对铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花进行酶解处理。

在一些实施方式中，可以在铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花这四个样品通过纤维素酶和/或果胶酶进行酶解处理后，再加入蛋白酶进一步酶解，酶解结束后对蛋白酶进行灭酶处理。

蛋白酶可以选自木瓜蛋白酶和/或菠萝蛋白酶。蛋白酶的用量为混合液的质量百分比的0.05％至1％。蛋白酶的酶解的温度为50℃至60℃，酶解的时间为2h至4h。蛋白酶的灭酶的温度为85℃至95℃，灭酶时间为20min至40min。

同样地，在本申请中，可以将铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花这四个样品分别采用蛋白酶进行酶解处理，也可以将铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花的粉末进行混合，同时将四个样品通过蛋白酶进行酶解，本申请中对此不作限定。

在铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花通过纤维素酶和/或果胶酶酶解处理后，进一步采用蛋白酶对植物样品中的蛋白质进行分解，可以进一步减弱植物细胞的细胞间的作用，破坏植物细胞膜，有利于活性物质的流出。同时，蛋白酶可以将植物细胞中的酶进行分解，降低了植物细胞中的酶对乳酸菌和/或酵母菌的干扰，提高发酵过程的稳定性，进一步提高活性物质的提取效率。

在一些实施方式中，在将铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花加入至液体培养基的步骤之前，还可以包括：

步骤B60：对铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花进行固体发酵处理。

具体的可以包括以下步骤：

步骤B61：制备固态发酵菌悬液。

配置营养液，在营养液中加入固态发酵菌，得到固态发酵菌悬液。

其中，固态发酵菌选自酵母菌。优选为产朊假丝酵母菌、面包酵母菌和酿酒酵母菌中的一种或多种组合。酵母菌是一类非丝状真核微生物。酵母菌可以利用铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花中的五碳糖和六碳糖，还可以充分利用植物样品中的各类蛋白质。酵母菌的菌体含有丰富的蛋白质、B族维生素、糖和酶的活性成分，为后续乳酸菌和酵母菌提供丰富的营养物质。在本申请的固态发酵菌悬液中，产朊假丝酵母菌的数量达到1x10⁷cfu/ml至1x10¹⁰cfu/ml。

营养液的配置方法为(以制备1L的营养液为例)：将5g至10g的(NH₄)₂HPO₃、1g至3g的MgCl₂和1g至3g的Na₂SO₄溶解于蒸馏水中，并定容至1L，120℃至130℃灭菌20min至30min后贮存备用。

步骤B62：制备铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花的发酵床。

向铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花的粉末均匀喷洒步骤B61制备的固态发酵菌悬液。将混合有固态发酵菌悬液的铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花的粉末装入至方形塑料槽内，制成包含铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花粉末的发酵床。

其中，固态发酵菌悬液占铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花的发酵床的总质量百分比的35％至55％。

步骤B63：对发酵床进行发酵处理。

将铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花粉末的发酵床置于发酵室中进行固态发酵。其中，发酵温度为25℃至40℃，发酵室的湿度保持在85％至90％之间，发酵时间为48h至120h。

步骤B64：对发酵床进行灭活处理。

发酵结束后，将铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花的发酵床进行灭活处理。其中，灭活处理的条件为灭活温度为90℃至110℃，灭活处理的时间为30s至120s。

固体发酵具有培养基简单、产率高、能耗低、环境污染较少的优点。在铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花进行液体发酵前对铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花进行固体发酵处理，固态发酵中酵母菌的发酵产物可以为液态发酵的菌种提供能量和营养物质，在一定程度上提高铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花发酵产物的质量，制备得到的组合物活性物质含量更高，舒缓保湿功效更好。

在一些实施方式中，还可以将铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花四个植物样品依次进行固态发酵处理、酶解处理后再进行液态发酵处理。即，铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花四个植物样品进行步骤B60和步骤B50之后，再进行步骤B10制备组合物。

将铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花四个植物样品经过固态发酵处理和酶解处理后再进行液态发酵处理，固态发酵处理可以为液态发酵的乳酸菌和酵母菌提供多种营养物质，有利于液态发酵的进行。同时，酶解处理可以减弱植物细胞的细胞间的作用，破坏植物细胞膜，有利于活性物质的流出，降低了植物细胞中的酶对乳酸菌和酵母菌的干扰，提高发酵过程的稳定性，进一步提高活性物质的提取效率。

实施例1

一种具有舒缓保湿功效的组合物，采用如下方法制备得到：

1)配置固体培养基、种子培养基和液体培养基。

本实施例中选用马铃薯葡萄糖琼脂培养基作为固体培养基，选用高盐察氏培养基作为种子培养基和液体培养基。马铃薯葡萄糖琼脂培养基和高盐察氏培养基的制备步骤如前所述，此处不再累述。

2)菌株活化与扩培。

将植物乳杆菌溶于无菌水制成菌悬液，移取3μL植物乳杆菌悬液在马铃薯葡萄糖琼脂培养基表面划线，活化培养。培养温度为35℃，培养时间36h。培养结束后获得活化后的植物乳杆菌。将活化后的植物乳杆菌通过接种环接种至含有高盐察氏培养基的发酵摇瓶中进行扩培。植物乳杆菌的培养温度为35℃。发酵摇瓶的转速为200r/min。将植物乳杆菌培养36h后，得植物乳杆菌种子液，在种子液中，植物乳杆菌的浓度为1×10⁸CFU/mL。

3)制备液态发酵培养基

称取1kg铁皮石斛、0.5kg砂仁、1kg柚皮和1kg茉莉花，将四种植物样品分别用粉碎机打碎。将四种植物样粉末注入至96.5kg高盐察氏培养基，使铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花在液态发酵培养基中的总质量百分比为3.5％。将发酵罐密闭，升温至120℃，保持30min进行灭菌处理，然后降温至室温，获得液态发酵培养基。

4)液态发酵培养。

将1％(质量分数)植物乳杆菌种子液加入至液态发酵培养基中，利用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液调节发酵罐内料液pH为6.5，在35℃，搅拌桨的转速为200r/min下发酵48h，得到发酵液。

5)对发酵液进行灭活处理。

利用巴氏灭菌法对发酵液中的微生物进行灭活处理，灭活处理温度为90℃，灭活处理的时间为60s。

6)对发酵液进行纯化处理。

待发酵液完成降温后，向发酵罐中加入发酵液质量分数为0.5％脱色活性炭，静置吸附20min后，利用板框压滤机过滤，将滤液再依次经过10μm、5.0μm及2.5μm的聚丙烯微滤膜滤柱除去杂质，得到滤液。滤液包括具有舒缓保湿功效的组合物。

实施例2

一种具有舒缓保湿功效的组合物，采用如下方法制备得到：

1)配置固体培养基、种子培养基和液体培养基。

本实施例中选用的固体培养基、种子培养基和液体培养基与实施例1相同，此处不再累述。

2)菌株活化与扩培。

本实施例中菌株活化与扩培的步骤与实施例1相同，此处不再累述。

3)对铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花进行酶解处理。

称取1kg铁皮石斛、0.5kg砂仁、1kg柚皮和1kg茉莉花，将四种植物样品分别用粉碎机打碎。将四种植物样粉末注入至6.47kg蒸馏水中，混合均匀，得到混合液。在混合液中加入15g纤维素酶和15g果胶酶，在45℃下酶解4小时，酶解结束后，在90℃下保持30min进行灭酶处理，得到酶处理后的植物样品。

4)制备液态发酵培养基

将酶处理后的植物样品注入至90kg高盐察氏培养基，使铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花在液态发酵培养基中的总质量百分比为3.5％。将发酵罐密闭，升温至120℃，保持30min进行灭菌处理，然后降温至室温，获得液态发酵培养基。

5)液态发酵培养。

本实施例中液态发酵培养的步骤与实施例1相同，此处不再累述。

6)对发酵液进行灭活处理。

本实施例中对发酵液进行灭活处理的步骤与实施例1相同，此处不再累述。

7)对发酵液进行纯化处理。

本实施例中纯化处理的步骤与实施例1相同，此处不再累述。纯化处理后，得到具有舒缓保湿功效的组合物。

本实施例与实施例1的区别在于，本申请实施例中的铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花四个植物样品在进行液态发酵处理之前，先进行了酶解处理的步骤。

实施例3

一种具有舒缓保湿功效的组合物，采用如下方法制备得到：

1)配置固体培养基、种子培养基和液体培养基。

本实施例中选用的固体培养基、种子培养基和液体培养基与实施例1相同，此处不再累述。

2)菌株活化与扩培。

本实施例中菌株活化与扩培的步骤与实施例1相同，此处不再累述。

3)植物样品固态发酵处理。

在营养液中加入产朊假丝酵母菌悬液，制得固态发酵菌悬液(产朊假丝酵母菌的数量达到1x10⁸cfu/ml)。称取1kg铁皮石斛、0.5kg砂仁、1kg柚皮和1kg茉莉花，将四种植物样品分别用粉碎机打碎。向铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花的粉末均匀喷洒3.5kg固态发酵菌悬液。将混合有固态发酵菌悬液的铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花的粉末装入至方形塑料槽内，制成包含铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花粉末的发酵床。将铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花粉末的发酵床置于30℃，湿度为90％的发酵室中发酵96h。固态发酵处理结束后，在120℃下保持30min对微生物进行灭活处理，得到固态发酵处理后的植物样品。

营养液的制备步骤如前所述，此处不再累述。

4)制备液态发酵培养基

将固态发酵处理后的植物样品注入至93kg高盐察氏培养基，使铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花在液态发酵培养基中的总质量百分比为3.5％。将发酵罐密闭，升温至120℃，保持30min进行灭菌处理，然后降温至室温，获得液态发酵培养基。

5)液态发酵培养。

本实施例中液态发酵培养的步骤与实施例1相同，此处不再累述。

6)对发酵液进行灭活处理。

本实施例中对发酵液进行灭活处理的步骤与实施例1相同，此处不再累述。

7)对发酵液进行纯化处理。

本实施例中纯化处理的步骤与实施例1相同，此处不再累述。纯化处理后，得到具有舒缓保湿功效的组合物。

本实施例与实施例1的区别在于，本申请实施例中的铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花四个植物样品在进行液态发酵处理之前，先进行了固态发酵处理的步骤。

实施例4

一种具有舒缓保湿功效的组合物，采用如下方法制备得到：

1)配置固体培养基、种子培养基和液体培养基。

本实施例中选用的固体培养基、种子培养基和液体培养基与实施例1相同，此处不再累述。

2)菌株活化与扩培。

本实施例中菌株活化与扩培的步骤与实施例1相同，此处不再累述。

3)植物样品固态发酵处理。

在营养液中加入产朊假丝酵母菌悬液，制得固态发酵菌悬液(产朊假丝酵母菌的数量达到1x10⁸cfu/ml)。称取1kg铁皮石斛、0.5kg砂仁、1kg柚皮和1kg茉莉花，将四种植物样品分别用粉碎机打碎。向铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花的粉末均匀喷洒4.5kg固态发酵菌悬液。将混合有固态发酵菌悬液的铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花的粉末装入至方形塑料槽内，制成包含铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花粉末的发酵床。将铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花粉末的发酵床置于30℃，湿度为90％的发酵室中发酵96h。固态发酵处理结束后，在120℃下保持30min对微生物进行灭活处理，得到固态发酵处理后的植物样品。

营养液的制备步骤如前所述，此处不再累述。

4)植物样品酶解处理。

将固态发酵处理后的植物样品注入至1.97kg蒸馏水中，混合均匀，得到混合液。在混合液中加入15g纤维素和15g果胶酶，在45℃下酶解4小时，酶解结束后，在90℃下保持30min进行灭酶处理，得到酶处理后的植物样品。

5)制备液态发酵培养基

将酶解处理后的植物样品注入至90kg高盐察氏培养基，使铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花在液态发酵培养基中的总质量百分比为3.5％。将发酵罐密闭，升温至120℃，保持30min进行灭菌处理，然后降温至室温，获得液态发酵培养基。

6)液态发酵培养。

本实施例中液态发酵培养的步骤与实施例1相同，此处不再累述。

7)对发酵液进行灭活处理。

本实施例中对发酵液进行灭活处理的步骤与实施例1相同，此处不再累述。

8)对发酵液进行纯化处理。

待发酵液完成降温后，向发酵罐中加入发酵液质量分数为0.5％脱色活性炭，静置吸附20min后，利用板框压滤机过滤，将滤液再依次经过10μm、5.0μm及2.5μm的聚丙烯微滤膜滤柱除去杂质，得到滤液。滤液包括具有舒缓保湿功效的组合物。

本实施例与实施例1的区别在于，本申请实施例中的铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花四个植物样品在进行液态发酵处理之前，先进行了固态发酵处理和酶解处理的步骤。

实施例5

1)配置固体培养基、种子培养基和液体培养基。

本实施例中选用DRBC琼脂固体培养基作为固体培养基，选用沙氏液体培养基作为种子培养基和液体培养基。DRBC琼脂固体培养基和沙氏液体培养基的制备步骤如前所述，此处不再累述。

2)菌株活化与扩培。

将酿酒酵母菌溶于无菌水制成菌悬液，移取3μL酿酒酵母菌悬液在马铃薯葡萄糖琼脂培养基表面划线，活化培养，培养温度30℃，培养时间72h，获得活化后的酿酒酵母菌。将活化后的酿酒酵母菌通过接种环接种至含有沙氏液体培养基的发酵摇瓶中进行扩培，培养温度为30℃，发酵摇瓶的转速为200r/min。培养48h后，得到酿酒酵母菌种子液。在种子液中，酿酒酵母菌的浓度为1×10⁸CFU/mL。

3)制备液态发酵培养基

称取4kg铁皮石斛、2kg砂仁、4kg柚皮和4kg茉莉花，将四种植物样品分别用粉碎机打碎。将四种植物样粉末注入至86kg沙氏液体培养基，使铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花在液态发酵培养基中的总质量百分比为14％。将发酵罐密闭，升温至130℃，保持20min进行灭菌处理，然后降温至室温，获得液态发酵培养基。

4)液态发酵培养。

将1％(质量分数)酿酒酵母菌种子液加入至液态发酵培养基中，利用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液调节发酵罐内料液pH为5.0，在30℃，搅拌桨的转速为200r/min下发酵72h，得到发酵液。

5)对发酵液进行灭活处理。

利用巴氏灭菌法对发酵液中的微生物进行灭活处理，灭活处理温度为110℃，灭活处理的时间为30s。

6)对发酵液进行纯化处理。

待发酵液完成降温后，向发酵罐中加入发酵液质量分数为1％脱色活性炭，静置吸附30min后，利用板框压滤机过滤，将滤液再依次经过10μm、5.0μm及2.5μm的聚丙烯微滤膜滤柱除去杂质，得到滤液。滤液包括具有舒缓保湿功效的组合物。

实施例6

一种具有舒缓保湿功效的组合物，采用如下方法制备得到：

1)配置固体培养基、种子培养基和液体培养基。

本实施例中选用马铃薯葡萄糖琼脂培养基作为固体培养基，选用氯硝胺18％甘油培养基作为种子培养基和液体培养基。马铃薯葡萄糖琼脂培养基和氯硝胺18％甘油培养基的制备步骤如前所述，此处不再累述。

2)菌株活化与扩培。

将鼠李糖乳杆菌溶于无菌水制成菌悬液，移取1μL鼠李糖乳杆菌悬液在马铃薯葡萄糖琼脂培养基表面划线，活化培养，培养温度35℃，培养时间24h，获得活化后的鼠李糖乳杆菌。分别将活化后的鼠李糖乳杆菌通过接种环接种至含有氯硝胺18％甘油培养基的发酵摇瓶中进行扩培，培养温度为35℃，发酵摇瓶的转速为300r/min。培养72h后，得到鼠李糖乳杆菌种子液，在种子液中，鼠李糖乳杆菌的浓度均为1×10⁹CFU/mL。

3)制备液态发酵培养基

称取4.5kg铁皮石斛、3kg砂仁、3.6kg柚皮和3.9kg茉莉花，将四种植物样品分别用粉碎机打碎。将四种植物样粉末注入至85kg氯硝胺18％甘油培养基，使铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花在液态发酵培养基中的总质量百分比为15％。将发酵罐密闭，升温至120℃，保持60min进行灭菌处理，然后降温至室温，获得液态发酵培养基。

4)液态发酵培养。

将5％(质量分数)鼠李糖乳杆菌种子液加入至液态发酵培养基中，利用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液调节发酵罐内料液pH为6.0，在35℃，搅拌桨的转速为100r/min下发酵24h，得到发酵液。

5)对发酵液进行灭活处理。

利用巴氏灭菌法对发酵液中的微生物进行灭活处理，灭活处理温度为110℃，灭活处理的时间为100s。

6)对发酵液进行纯化处理。

待发酵液完成降温后，向发酵罐中加入发酵液质量分数为2％脱色活性炭，静置吸附10min后，利用板框压滤机过滤，将滤液再依次经过10μm、5.0μm及2.5μm的聚丙烯微滤膜滤柱除去杂质，得到滤液。滤液包括具有舒缓保湿功效的组合物。

实施例7

1)配置固体培养基、种子培养基和液体培养基。

本实施例中选用DRBC琼脂固体培养基作为固体培养基，选用孟加拉红培养基作为种子培养基和液体培养基。DRBC琼脂固体培养基和孟加拉红培养基的制备步骤如前所述，此处不再累述。

2)菌株活化与扩培。

将裂殖酵母菌溶于无菌水制成菌悬液，移取4μL裂殖酵母菌悬液在DRBC琼脂固体培养基表面划线，活化培养，培养温度30℃，培养时间36h，获得活化后的裂殖酵母菌。分别将活化后的裂殖酵母菌通过接种环接种至含有孟加拉红培养基的发酵摇瓶中进行扩培，培养温度为30℃，发酵摇瓶的转速为100r/min。培养56h后，得到裂殖酵母菌种子液，在种子液中，裂殖酵母菌的浓度为1×10⁷CFU/mL。

3)制备液态发酵培养基

称取6kg铁皮石斛、4.8kg砂仁、6kg柚皮和6kg茉莉花，将四种植物样品分别用粉碎机打碎。将四种植物样粉末注入至77.2kg孟加拉红培养基，使铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花在液态发酵培养基中的总质量百分比为22.8％。将发酵罐密闭，升温至120℃，保持30min进行灭菌处理，然后降温至室温，获得液态发酵培养基。

4)液态发酵培养。

将2％(质量分数)裂殖酵母菌种子液加入至液态发酵培养基中，利用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液调节发酵罐内料液pH为5.0，在30℃，搅拌桨的转速为300r/min下发酵24h，得到发酵液。

5)对发酵液进行灭活处理。

利用巴氏灭菌法对发酵液中的微生物进行灭活处理，灭活处理温度为120℃，灭活处理的时间为100s。

6)对发酵液进行纯化处理。

待发酵液完成降温后，向发酵罐中加入发酵液质量分数为1.5％脱色活性炭，静置吸附25min后，利用板框压滤机过滤，将滤液再依次经过10μm、5.0μm及2.5μm的聚丙烯微滤膜滤柱除去杂质，得到滤液。滤液包括具有舒缓保湿功效的组合物。

实施例8

1)配置固体培养基、种子培养基和液体培养基。

本实施例中选用DRBC琼脂固体培养基作为固体培养基，选用YES培养基作为种子培养基和液体培养基。DRBC琼脂固体培养基和YES培养基的制备步骤如前所述，此处不再累述。

2)菌株活化与扩培。

将植物乳杆菌种和酿酒酵母菌种分别溶于无菌水制成菌悬液，分别移取4μL植物乳杆菌悬液和酿酒酵母菌悬液在DRBC琼脂固体培养基表面划线，活化培养，培养温度30℃，培养时间36h，获得活化后的植物乳杆菌和酿酒酵母菌。分别将活化后的植物乳杆菌和酿酒酵母菌通过接种环接种至含有YES培养基的发酵摇瓶中进行扩培，培养温度为30℃，发酵摇瓶的转速为200r/min。培养56h后，得到植物乳杆菌种子液和酿酒酵母菌种子液，在种子液中，植物乳杆菌和酿酒酵母菌的浓度均为1×10⁸CFU/mL。

3)制备液态发酵培养基

称取7kg铁皮石斛、2.1kg砂仁、7kg柚皮和7kg茉莉花，将四种植物样品分别用粉碎机打碎。将四种植物样粉末注入至76.9kg YES培养基，使铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花在液态发酵培养基中的总质量百分比为23.1％。将发酵罐密闭，升温至120℃，保持30min进行灭菌处理，然后降温至室温，获得液态发酵培养基。

4)液态发酵培养。

将3％(质量分数)植物乳杆菌种子液、3％(质量分数)酿酒酵母菌种子液加入至液态发酵培养基中，利用磷酸缓冲溶液调节发酵罐内料液pH为6.0，在30℃，搅拌桨的转速为300r/min下发酵36h，得到发酵液。

5)对发酵液进行灭活处理。

利用巴氏灭菌法对发酵液中的微生物进行灭活处理，灭活处理温度为120℃，灭活处理的时间为30s。

6)对发酵液进行纯化处理。

待发酵液完成降温后，向发酵罐中加入发酵液质量分数为1.5％脱色活性炭，静置吸附30min后，利用板框压滤机过滤，将滤液再依次经过10μm、5.0μm及2.5μm的聚丙烯微滤膜滤柱除去杂质，得到滤液。滤液包括具有舒缓保湿功效的组合物。

对比例1

采用水提法制备铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花的组合物，具体制备步骤如下：

利用粉碎机分别将1kg铁皮石斛、0.5kg砂仁、1kg柚皮和1kg茉莉花粉碎处理，加入96.5kg的水，在80℃温度、匀速200r/min搅拌条件下提取48h；加入0.5％的活性炭静置吸附20min后，利用板框压滤机过滤，将滤液再依次经过10μm、5.0μm及2.5μm的聚丙烯微滤膜滤柱除去杂质，得到复合植物提取物。

对比例2

采用超声辅助提取法制备铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花的组合物，具体制备步骤如下：

利用粉碎机分别将1kg铁皮石斛、0.5kg砂仁、1kg柚皮和1kg茉莉花粉碎处理，加入96.5kg质量分数为70％的乙醇溶液超声提取2h(超声波温度为60℃，超声波频率为59kHz、超声波功率为600W)。超声提取结束后，在混合液中加入0.5％的活性炭静置吸附20min后，利用板框压滤机过滤，将滤液再依次经过10μm、5.0μm及2.5μm的聚丙烯微滤膜滤柱除去杂质，得到复合植物提取物。

对比例3

一种组合物，采用如下方法制备得到：

重复实施例1，不同的是植物样品中的1kg铁皮石斛、0.5kg砂仁、1kg柚皮和1kg茉莉花更改为1.16kg砂仁、1.16kg柚皮和1.17kg茉莉花,其他制备过程与实施例1相同。

即，对比例3的制备的组合物中不加入铁皮石斛。

对比例4

重复实施例1，不同的是植物样品中的1kg铁皮石斛、1kg砂仁、0.5kg柚皮和1kg茉莉花更改为1.16kg铁皮石斛、1.16kg柚皮和1.17kg茉莉花,其他制备过程与实施例1相同。

即，对比例4的制备的组合物中不加入砂仁。

对比例5

重复实施例1，不同的是植物样品中的1kg铁皮石斛、0.51kg砂仁、1kg柚皮和1kg茉莉花更改为1.16kg铁皮石斛、1.16kg砂仁和1.17kg茉莉花,其他制备过程与实施例1相同。

即，对比例5的制备的组合物中不加入柚皮。

对比例6

重复实施例1，不同的是植物样品中的1kg铁皮石斛、0.5kg砂仁、1kg柚皮和1kg茉莉花更改为1.16kg铁皮石斛、1.16kg砂仁和1.17kg柚皮,其他制备过程与实施例1相同。

即，对比例6的制备的组合物中不加入茉莉花。

对比例7

重复实施例1，不同的是植物样品中的1kg铁皮石斛、0.5kg砂仁、1kg柚皮和1kg茉莉花更改为3.5kg铁皮石斛，其他制备过程与实施例1相同。

对比例8

重复实施例1，不同的是植物样品中的1kg铁皮石斛、0.5kg砂仁、1kg柚皮和1kg茉莉花更改为3.5kg砂仁，其他制备过程与实施例1相同。

对比例9

重复实施例1，不同的是植物样品中的1kg铁皮石斛、0.5kg砂仁、1kg柚皮和1kg茉莉花更改为3.5kg柚皮,其他制备过程与实施例1相同。

对比例10

重复实施例1，不同的是植物样品中的1kg铁皮石斛、0.5kg砂仁、1kg柚皮和1kg茉莉花更改为3.5kg茉莉花,其他制备过程与实施例1相同。

性能测试

本申请中的实施例1-4和对比例1-10制备得到的组合物的性能测试结果如下：

1、抗氧化性能测试

利用DPPH法测试本申请中的实施例1-4和对比例1-10制备得到的组合物对自由基的清除效果。DPPH又称1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，具有单电子，在517nm处有一强吸收，其无水乙醇溶液呈紫色的特性。当有自由基清除剂存在时，由于与其单电子配对而使其吸收逐渐消失，其褪色程度与其接受的电子数量成定量关系，因而可用分光光度计进行快速的定量分析。

测试方法：

按以下表1依次加样，其中，DPPH-乙醇溶液由以下步骤制备得到：称取1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(Macklin，纯度>96％)12mg溶解于无水乙醇中，加入乙醇定容至250mL棕色容量瓶。DPPH-乙醇溶液临用时现配。样品溶液由以下步骤制备得到：分别移取实施例1-4和对比例1-6的组合物0.001mL、0.1mL、1mL、10mL、30mL，加入去离子水定容至1000mL棕色容量瓶，得到0.0001％、0.01％、0.1％、1％、3％浓度样品溶液。

表1样品加液要求

试剂	T-样品管	T<sub>0</sub>-样品本底	C-DPPH管	C<sub>0</sub>-溶剂本底
					样品溶液(mL)	1	1	—	—
水(mL)	2	2	3	3
					DPPH-乙醇溶液(mL)	1	—	1	—
无水乙醇(mL)	—	1	—	1

扫描C-DPPH组的最大吸收波长，在最大吸收波长处检测吸光度值。测量结果显示，溶液在517nm处有最大吸收峰。将各支试管反应溶液混匀后，移入3cm比色皿中，测量每组溶液在517nm的吸光度。

清除率计算公式为：

式中：

T—样品管吸光值，即样品与DPPH反应后溶液吸光值；

T₀—样品本底吸光值；

C—DPPH管吸光值，即未加样品时DPPH溶液吸光值；

C₀—溶剂本底吸光值。

取三次测量平均值，测试结果如图1所示。

如图1所示，在系列浓度梯度下，实施例1-4的组合物对自由基的清除率均大于对比例1-10的组合物对自由基的清除率。

实施例1-4和对比例3-10的组合物对自由基的清除率均大于对比例1-2的组合物对自由基的清除率，说明采用液态发酵法制备的组合物中含有抗氧化活性物质多于水提法和超声波辅助提取法制备的组合物含有抗氧化活性物质。

实施例1的组合物对自由基的清除率大于对比例3-10的组合物对自由基的清除率。实施例1的组合物与对比例3-10的组合物在进行液态发酵时，所加入的植物样品的重量相同。对比例3的液态发酵培养基中不加入铁皮石斛、对比例4的液态发酵培养基中不加入砂仁、对比例5的液态发酵培养基中不加入柚皮、对比例6的液态发酵培养基中不加入茉莉花。对比例7的液态发酵培养基中仅加入铁皮石斛、对比例8的液态发酵培养基中仅加入砂仁、对比例9的液态发酵培养基中仅加入柚皮、对比例10的液态发酵培养基中仅加入茉莉花。测试结果说明在本申请制备的组合物中，铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花之间存在协同作用。将铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花共生发酵，得到的组合物中抗氧化活性物质较多，对自由基的抑制作用更强。

实施例2-4的组合物对自由基的清除率大于实施例1的组合物对自由基的清除率，且实施例4的组合物对自由基的清除率大于实施例2和实施例3的组合物对自由基的清除率。其中，实施例2和实施例3的植物样品在进行液态发酵之前，进行了酶解处理或固态发酵处理；实施例4植物样品在进行液态发酵之前依次进行酶解处理和固态发酵处理。测试结果说明在植物样品在进行液态发酵之前，对植物样品进行酶解处理和固态发酵处理可以提高组合物中活性物质的含量，提高组合物对自由基的抑制作用。在植物样品进行液态发酵之前依次酶解处理和固态发酵处理，可以进一步提高组合物中活性物质的含量，更大程度上提高组合物对自由基的抑制作用。

2、保湿功效测试

依据《QB/T 4256-2011化妆品保湿功效评价指南》测试本申请中的实施例1-4和对比例1-10制备得到的组合物的保湿效果。

测试所用仪器为皮肤弹性测试仪MPA580。测试所用样品为实施例1-4和对比例1-10制备得到的组合物(把各样品制备成含量10wt％的水溶液)。

实验步骤：筛选适合的受试者，清洁前臂内侧并标记测试区域。受试者在恒温恒湿条件下静坐20分钟，测量皮肤角质层水分含量、皮肤经皮水分流失量的初始值；按样品随机分布表分别在测试区域内涂抹(2.0±0.1)mg/cm²的待测样品。测量使用样品1、2、4、6小时后的皮肤角质层水分含量、皮肤经皮水分流失量；利用软件SPSS 19.0对数据进行统计分析。

测试结果如图2所示。

如图2所示，在使用实施例1-4和对比例1-10的组合物第1h、2h、4h和6h后，实施例1-4的组合物提升皮肤角质层水分含量的效果大于对比例1-10的组合物提升皮肤角质层水分含量的效果，说明实施例1-4的组合物的保湿功效强于对比例1-10的组合物的保湿功效。

使用实施例1-4和对比例3-10的组合物后皮肤角质层水分含量高于使用对比例1-2的组合物后皮肤角质层水分含量，说明采用液态发酵法制备的组合物中的保湿活性物质多于水提法和超声辅助提取法制备的组合物中的保湿活性物质。

实施例1的组合物的保湿功效大于对比例3-10的组合物保湿功效，说明在本申请制备的组合物中，铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花之间存在协同作用。将铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花共生发酵，得到的组合物中保湿活性物质较多，使用后，皮肤的角质层水分含量更高。

实施例2-4的组合物的保湿功效大于实施例1的组合物的保湿功效，且实施例4的组合物的保湿功效大于实施例2和实施例3的组合物的保湿功效，说明在植物样品在进行液态发酵之前，对植物样品进行酶解处理或固态发酵处理可以提高组合物中活性物质的含量，提高组合物的保湿效果。在植物样品进行液态发酵之前依次酶解处理和固态发酵处理，可以进一步提高组合物中活性物质的含量，更大程度上提高组合物的保湿效果。

3、皮肤弹性测试

为了确认本申请实施例1-4和对比例1-10中的组合物的改善皮肤弹性的效果，以20-40岁健康女性140名作为对象进行试验(每10名志愿者使用一个样品)，受试者将使用本申请所述样品(把各样品制备成含量10wt％的水溶液)喷于左面面部，每天至少3次，共使用15天。右边脸部作为空白对照。

采用皮肤弹性测试仪MPA580采集数据。测3次取平均值。测试区域为眉心正中间往上2cm额头区域、下嘴唇正中间往下2cm下巴区域、鼻尖与瞳孔交线处左、右脸颊区域。

在进行测试时，先测量被测试区域清洁后30min的空白值(R2、R5、R7)，随后规定受试者每天早晚坚持使用上述试验品，分别测试5天、7天、10天、15天后测试区域皮肤弹性指数R1、R2、R3值(测试过程中负压恒定为450mbar)，R2、R5、R7值的计算遵循下述公式：

R2＝Ua/Uf

R5＝Ur/Ue

R7＝Ur/Uf

其中，Ua为从取消负压到下一次连续测试皮肤表面再加负压时皮肤的恢复值；Ue为恒定负压加到皮肤上后，0.1秒钟时皮肤的拉伸量，定位弹性部分拉伸量；Ur为取消负压后，皮肤就会迅速恢复原状态，同样分为弹性部分值Ur，即取消负压0.1秒后，皮肤的恢复值和粘弹性部分值，或称塑性部分值；Uf为皮肤最大拉伸量。

测试标准为：皮肤弹性指数R2、R5、R7越接近1，皮肤的弹性越好。

R2、R5、R7分别在第5天、第7天、第10天、第15天与第0天的差值如图3至图5所示。

如图3-5所示，在使用实施例和对比例的方法制备得到的组合物后，皮肤的弹性均变好。

实施例1-4的组合物R2、R5和R7的差值均大于对比例1-10的组合物R2、R5和R7的差值，说明实施例1-4的组合物改善皮肤弹性的效果强于对比例1-10的组合物改善皮肤弹性的效果。

实施例1的组合物的改善皮肤弹性的效果强于对比例3-10的组合物改善皮肤弹性的效果，说明在本申请制备的组合物中，铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花之间存在协同作用。将铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花共生发酵，得到的组合物中保湿活性物质较多，从而使得实施例1的组合物改善皮肤的效果强于对比例3-10的组合物改善皮肤弹性的效果。

实施例2-4的组合物的改善皮肤弹性的效果强于实施例1的组合物改善皮肤弹性的效果，且实施例4的组合物的改善皮肤弹性的效果强于实施例2和实施例3的组合物改善皮肤弹性的效果，说明在植物样品在进行液态发酵之前，对植物样品进行酶解处理或固态发酵处理可以提高组合物中活性物质的含量，提高组合物改善皮肤弹性的效果。在植物样品进行液态发酵之前依次酶解处理和固态发酵处理，可以进一步提高组合物中活性物质的含量，更大程度上提高组合物改善皮肤弹性的效果。

4、志愿者感官评价

选择干性皮肤、皮肤轻度红痒的受试者(30人次)，年龄分布为20-40岁之间，分别使用本申请实施例1-4和对比例1-10制备得到的组合物(制备方法中得到的滤液，把各样品制备成含量10wt％的水溶液)。使用样品之前，用清水清洗皮肤并擦干，将样品涂于全脸。30分钟后，让受试者填写调查问卷，调查项目包括使用后的滋润感、保湿感、改善皮肤红痒程度和刺激性，其中使用后的滋润感、保湿感、改善皮肤红痒程度和刺激性分值分布为0-10分，最终结果为30人每项得分的平均值。评价结果如图6所示。

评价结果表明，本申请提供的组合物刺激性均较少。其中，使用实施例1-4的组合物的保湿效果和舒缓作用(改善皮肤红痒程度)均强于使用对比例1-10的组合物的保湿效果和舒缓作用。对比例1和对比例2的保湿感和改善皮肤红痒程度的评分最低，说明使用水提法和超声辅助提取法得到的组合物保湿效果和舒缓作用最差。实施例1的组合物的保湿感和改善皮肤红痒程度评分高于对比例3-10的组合物的保湿感和改善皮肤红痒程度评分，说明铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花之间存在协同作用，可以提升组合物的保湿效果和舒缓作用。实施例4的保湿感和改善皮肤红痒程度评分最高，实施例2和实施例3的保湿感和改善皮肤红痒程度评分高于实施例1的保湿感和改善皮肤红痒程度评分，说明对植物样品进行酶解处理或固态发酵处理可以提高组合物的保湿效果和舒缓作用。在植物样品进行液态发酵之前依次酶解处理和固态发酵处理，可以进一步提高组合物中活性物质的含量，更大程度上提高组合物的保湿效果和舒缓作用。

上述的性能测试结果表明，本申请使用液态发酵法对铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花实现共生发酵，所得到的组合物中富含活性物质，组合物具有显著的抗氧化、舒缓保湿和改善皮肤弹性的功效。铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花起到协同作用，提高了组合物抗氧化、舒缓保湿和改善皮肤弹性的效果。进一步地，在铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花进行液态发酵之前，对铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花进行酶解处理和/或固态发酵处理，可以增加铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花中活性物质的提取效率，进一步提高组合物抗氧化、舒缓保湿和改善皮肤弹性。

本申请提供一种具有舒缓保湿功效的组合物的制备方法。本申请提供的制备方法，将多种植物与乳酸菌和/或酵母菌共生发酵，得到组合物中富含铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花的活性物质。本申请的具有舒缓保湿功效的组合物采用可食用菌种进行发酵，安全无害，适合作为儿童护理产品的舒缓保湿成分。植物提取物中活性物质的提取效率明显高于水提法和超声波辅助提取法的提取效率，有利于植物提取物中活性物质的充分提取与应用。本申请提供的制备方法将多种植物共生发酵，避免了单独将每一种植物进行发酵，大大简化了制备工艺，缩短制程时间，降低生产成本，制备过程不使用任何有机溶剂，卫生安全，环保无污染，适合应该用于工业生产。

本申请还提供一种具有舒缓保湿功效的组合物，本申请提供的组合物采用如前所述的制备方法制备得到。本申请提供的组合物富含铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花的活性物质，具有抗氧化、舒缓保湿和改善皮肤弹性的功效。

本申请还提供一种具有舒缓保湿功效的组合物在儿童护理产品中的应用。其中，儿童护理产品包括柔肤水类、乳液类、膏霜类、啫喱类、粉类、喷雾类、精华类、洗护类的儿童护理产品。

其中，具有舒缓保湿功效的组合物在儿童护理产品的添加量为1-20％。上述添加量为安全添加量。当具有舒缓保湿功效的组合物在儿童护理产品中的添加量大于20％时，组合物容易对儿童皮肤造成刺激，引起儿童的皮肤问题。

以上对本申请所提供的一种具有舒缓保湿功效的组合物及其制备方法与其在儿童护理产品中的应用进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本申请的原理及实施例进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本申请的方法及其核心思想；同时，对于本领域的技术人员，依据本申请的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本申请的限制。

Claims (10)

1.一种具有舒缓保湿功效的组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花加入至液体培养基中，得到液态发酵培养基；

将菌剂种子液接入至所述液态发酵培养基中发酵，得到发酵液；

对所述发酵液进行灭活处理和纯化处理，得到具有舒缓保湿功效的组合物。

2.根据权利要求1所述的具有舒缓保湿功效的组合物的制备方法，其特征在于：

所述菌剂种子液包括乳酸菌种子液和/或酵母菌种子液。

3.根据权利要求2所述的具有舒缓保湿功效的组合物的制备方法，其特征在于：

在所述将铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花加入至液体培养基中，得到液态发酵培养基的步骤之前，还包括制备所述乳酸菌种子液和/或所述酵母菌种子液，具体步骤如下：

将乳酸菌种和酵母菌种分别配制成乳酸菌悬液和酵母菌悬液；

将所述乳酸菌悬液和所述酵母菌悬液分别接种于固体培养基中活化培养，得到活化的乳酸菌和酵母菌；

将所述活化的乳酸菌和酵母菌分别接种至种子培养基中进行扩培，得到所述乳酸菌种子液和所述酵母菌种子液。

4.根据权利要求2所述的具有舒缓保湿功效的组合物的制备方法，其特征在于：

所述乳酸菌包括植物乳杆菌和/或鼠李糖乳杆菌；所述乳酸菌种子液的浓度为1x10⁷cfu/ml至1x10⁹cfu/ml；

所述酵母菌包括酿酒酵母菌和/或裂殖酵母菌；所述酵母菌种子液的浓度为1x10⁷cfu/ml至1x10⁹cfu/ml。

5.根据权利要求1所述的具有舒缓保湿功效的组合物的制备方法，其特征在于：

铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花在所述液态发酵培养基中的总质量百分比为0.1％至30％。

6.根据权利要求1所述的具有舒缓保湿功效的组合物的制备方法，其特征在于：

铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花的质量比为5～30:1～8:5～30:5～30。

7.根据权利要求1所述的具有舒缓保湿功效的组合物的制备方法，其特征在于：

在所述将铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花加入至液体培养基中，得到发酵培养基的步骤之前，还包括对铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花进行酶解处理；其中，

所述酶解处理选用的酶包括纤维素酶和/或果胶酶；

所述纤维素酶和/或果胶酶的添加量为铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花与水形成的混合液的质量百分比的0.02至1％；

所述纤维素酶和所述果胶酶的酶解温度为40℃至55℃，所述纤维素酶和所述果胶酶的酶解时间为3h至5h。

8.根据权利要求1所述的具有舒缓保湿功效的组合物的制备方法，其特征在于：

在所述将铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花加入至液体培养基中，得到液态发酵培养基的步骤之前，还包括对铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花进行固态发酵处理，具体步骤如下：

制备固态发酵菌悬液；

制备铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花的发酵床；

对所述发酵床进行发酵处理；

对所述发酵床进行灭活处理；

其中，所述固态发酵选用的菌种为产朊假丝酵母菌、面包酵母菌、酿酒酵母菌中的至少一种；

所述固态发酵菌悬液占铁皮石斛、砂仁、柚皮和茉莉花的发酵床的总质量百分比的35％至55％；

所述固态发酵的温度为25℃至40℃，所述发酵的湿度为85％至90％，所述固态发酵的时间为48h至120h；

所述发酵床灭活处理的温度为90℃至110℃，所述发酵床灭活处理的时间为30s至120s。

9.一种具有舒缓保湿功效的组合物，其特征在于，采用如权利要求1至8任一项所述的具有舒缓保湿功效的组合物的制备方法制备得到。

10.权利要求9所述的具有舒缓保湿功效的组合物在护理产品，尤其是在儿童护理产品中的应用。

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