CN110859785A - 一种抗敏复合物的制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种抗敏复合物的制备方法与应用，属于化妆品技术领域，将酵母菌进行发酵后得到发酵液、加入马齿苋花/叶/茎提取物、金黄洋甘菊提取物、积雪草花/叶/茎提取物、枸桔果提取物以及葡萄皮提取物，加热到40～50℃搅拌溶解；抗敏复合液中的按以下组份进行复配：包括8～15％马齿苋花/叶/茎提取物、3～8％的金黄洋甘菊提取物、3～8％的积雪草花/叶/茎提取物、0.5～1％的枸桔果提取物、1～5％的葡萄皮提取物以及剩余的所述发酵液的上清液。本发明能够有效解决复合液的结合效果差，效果不能完全发挥的问题，具有更好的抗敏感、抗氧化和镇静效果。

Description

一种抗敏复合物的制备方法与应用
技术领域
本发明涉及化妆品技术领域，尤其涉及一种抗敏复合物及制备方法与应用。
背景技术
近年来，随着饮食结构的变化、大气污染、生活和工作压力的增大，过敏患者急剧增加。我国卫生部确定的五家皮肤病诊断机构2017和2018年统计数据显示，接触性皮炎在六大类化妆品皮肤病中最为常见，两年的发病率分别占化妆品皮肤病总发病率的82.6％和93.3％。市场上大多数化妆品中有大量的化学添加剂，容易造成肌肤敏感甚至引发炎症，敏感肌肤使用普通化妆品非常容易出现过敏现象。具有抗敏抗刺激的功效的化妆品日益受到人们的重视，具有抗敏抗刺激活性的物质，尤其是植物源物质受到学者和市场的青睐。
中国专利CN110179709A一种保湿舒敏复合液及其制备方法与应用，方法包括如下步骤：S1、制取银耳提取物；S2、制取枸桔果提取物；S3、选取金黄洋甘菊原料，加入5-10倍50％的乙醇，加入适量柠檬酸钠调节提取液的PH到8左右，常温提取48小时，1um滤纸过滤，即获得金黄洋甘菊提取物；S4、选取马齿苋原料，加入5-10倍的水，微波提取30-60分钟，1um滤纸过滤，即获得马齿苋提取液；S5、由S1-S4获得的4种植物提取物，根据权利要求1中的原料配方，按比例进行复配，获得保湿舒敏复合液。在化妆品技术领域，人们对合成的化学试剂越来越厌恶，天然的原料越来越感兴趣，本方案提供了一种由4种植物提取物混合而成保湿舒敏复合液。
现有技术中将多种植物提取液进行复配形成的舒敏复合液，在若干种提取液的复配过程中可能出现各项液体之间混合不充分的问题，且复配中间并没有使用相关的混合介质，导致其复合液不能将各组分的效果较好的结合，不能充分发挥各组分的效果。
发明内容
为克服现有技术中的存在的复合液的结合效果差，效果不能完全发挥的问题，提出了一种抗敏复合物的制备方法，其特征在于：将酵母菌进行发酵后得到发酵液、加入马齿苋花/叶/茎提取物、金黄洋甘菊提取物、积雪草花/叶/茎提取物、枸桔果提取物以及葡萄皮提取物，加热到40～50℃搅拌溶解；抗敏复合液中的按以下组份进行复配：包括8～15％马齿苋花/叶/茎提取物、3～8％的金黄洋甘菊提取物、3～8％的积雪草花/叶/茎提取物、0.5～1％的枸桔果提取物、1～5％的葡萄皮提取物以及剩余的所述发酵液的上清液。
一种抗敏复合物的应用，应用于发酵抗敏保湿精华水、抗敏清爽乳液以及祛斑霜。
通过采用上述技术方案，在酵母菌的发酵液中加入多种植物提取物，增强了发酵液原有的抗敏方面的功效，并且增加了清热解毒、镇痛、抗炎、抑菌等作用，并且通过将其进行加热搅拌溶解，将各组分进行有效的结合。
作为优选的，所述发酵液中的酵母菌为酿酒酵母菌，且将所述酿酒酵母菌放入培养基中培养，其中发酵条件为pH值范围3.0～7.0，发酵温度25～35℃，摇床速度50～250rpm，发酵时间2～5d。
通过采用上述技术方案，酿酒酵母菌是人类应用最广泛的一种酵母，能够在常温下，酸性条件下快速的发酵，经过摇床发酵能够充分酿酒酵母菌充分发酵，能够有效的减少发酵时间，提高生产效率。
作为优选的，所述的马齿苋花/叶/茎提取物，是将马齿苋粉碎，加入60％～ 75％乙醇作为溶剂，且料液比为1:15～25，超声辅助提取30～60min，再加热提取2～4h，提取温度为70～85℃，然后在60～75℃浓缩掉乙醇，大孔树脂分离纯化得到提取物，其中进样速度、洗脱剂浓度和洗脱速度分别是0.5～2ml/min， 60～80％乙醇，1～4ml/min。
通过采用上述技术方案，将马齿苋中加入大比例的乙醇，能够具有效的杀菌同时与马齿苋充分接触，利用超声辅助提取能够减少提取时对马齿苋的损伤，防止成份的流失，在进行加热提取，可以将马齿苋内的成份充分的提取出来，然后浓缩掉乙醇，最后采用大孔树脂吸附走杂质，大孔树脂分离纯化掉杂质，获得纯化过的提取物。
作为优选的，所述的金黄洋甘菊提取物，是将金黄洋甘菊与水在50～65℃混合，料液比为1:15～25，超声辅助提取70～90min，然后加热煮沸，浓缩至密度为1.01～1.20g/mL，得到金黄洋甘菊提取物。
通过采用上述技术方案，金黄洋与温水混合，金黄洋甘菊通过加热煮沸的方式，充分将其成份溶解于水中，并且浓缩到一定密度，获得精炼的提取物。
作为优选的，所述的积雪草花/叶/茎提取物，是将积雪草粉碎，加入60％～ 75％乙醇作为溶剂，且料液比为1:15～25，45～55℃超声辅助提取1～2h，60～ 75℃浓缩掉乙醇，壳聚糖絮凝法进行除杂，其中絮凝液的添加量为0.3～0.8％、絮凝温度为35～45℃、絮凝时间为2～3h，D-4020树脂分离纯化，进样速度、洗脱剂浓度和洗脱速度分别是0.4～1ml/min，60～75％乙醇，4～8ml/min，之后采用大孔树脂进行纯化得到提取物。
通过采用上述技术方案，通过粉碎并加入乙醇溶剂进行溶解，再经过超声提取、浓缩，最后将积雪草花/叶/茎采用壳聚糖絮凝剂可以减少替代对其的反复放入萃取和层析，简化其纯化的步骤，最后再通过大孔树脂提取得到最终纯化的提取物。
作为优选的，所述的枸桔果提取物，是将枸橘果粉碎后以75％～85％乙醇为溶剂，其中料液比为1:10～15，提取温度为75～85℃，提取时间为4～6h，加热浸泡，过滤，在75～85℃浓缩至密度为1.01～1.20g/mL，得到枸橘果提取物。
通过采用上述技术方案，通过粉碎与乙醇溶剂充分接触，并在高温中提取若干时间，并且经过浸泡使枸桔果中的成份充分的析出，再经过高温浓缩，获得高纯度的提取物。
作为优选的，所述的葡萄皮提取物，是将葡萄皮粉碎后，以乙酸乙酯作为溶剂，料液比1:10～25，浸泡提取，且温度为20～35℃，提取时间为2～3d，离心转速为10000～12000r/min，离心时间为10～12min，得到葡萄皮提取物。
通过采用上述技术方案，葡萄皮的中的主要成分为葡萄皮花色苷以及一些酚类，花色苷的生理活性由于葡萄皮花色苷对羟自由基、超氧自由基都有很好的清除作用，通过提取加入该复合物中，可以提高其抗氧化、抗诱变的作用。
综上所述，本发明相对于现有技术具有以下优点和效果：酵母是一种真菌，含有氨基酸、核苷酸，维生素及一些微量元素等众多营养成分，对于皮肤能起到很好的美白、抗氧化的作用。马齿苋具有清热解毒、凉血止血、止痢之功效。现代医学研究也表明，马齿苋主要含有生物碱类、萜类、香豆素类、黄酮类、有机酸类、挥发油及多糖等化学成分，对皮肤抗炎，镇痛效果明显。金黄洋甘菊的化学成分包括香豆素类、黄酮类、挥发油、多糖类、烯萜类、愈创内酯类、留醇类、有机酸及其他成分，对皮肤具有抗炎、抑菌、解痉与镇静、抗氧化、抗癌等生物活性。积雪草中的活性成分主要是皂苷及皂苷元类，包括积雪草苷、羟基积雪草苷、积雪草酸和羟基积雪草酸等，现代医学研究表明积雪草有抗抑郁、促进伤口愈合、治疗瘢痕、抗肿瘤、抗胃溃疡、抗菌、抗氧化等生理功效。枸桔果的主要成分有黄酮、挥发油和少量的生物碱类化合物，对于皮肤有抗氧化、抗炎、镇静作用。本发明主要从葡萄皮中提取出白藜芦醇，对皮肤起到抗氧化、抗菌消炎、镇静的作用。本发明利用微生物发酵技术与植物提取技术相结合，在酵母发酵产物滤液原有的基础上，通过添加植物提取物，增强产品在抗敏方面的功效。与化工合成得到的产品相比较，植物提取物更安全，无刺激。
附图说明
图1是各提取物及实施例对透明质酸酶活性的抑制率；
图2是实施例1对皮肤的修复作用；
图3是实施例2对皮肤的修复作用；
图4是实施例3对皮肤的修复作用；
图5是实施例4对皮肤的修复作用；
图6是实施例1对常见致敏源的斑贴试验结果；
图7是实施例2对常见致敏源的斑贴试验结果；
图8是实施例3对常见致敏源的斑贴试验结果；
图9是实施例4对常见致敏源的斑贴试验结果；
图10是一种抗敏复合物的制备方法的流程图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
1、将预先摇床培养好的酿酒酵母接种到酵母培养基(YPD培养基)中发酵，发酵条件是：pH值范围3.0～7.0，发酵温度25℃，摇床速度80rpm，发酵时间 2d。
2、将发酵后的发酵液用TDL-80-2B低速离心机，转速7000rpm/min进行菌液离心，收集分离上清液，经0.22μm微孔滤膜过滤。
3、马齿苋提取所用的溶剂为60％乙醇，料液比为1:15，室温超声辅助提取时间为30min，之后加热提取2h，提取温度为70℃，65℃浓缩掉乙醇，1um 滤纸板过滤，大孔树脂进行分离纯化，进样速度、洗脱剂浓度和洗脱速度分别是 0.5ml/min，60％乙醇，1ml/min。添加丁二醇配置成液体与丁二醇比例为1:1 的溶液。
4、金黄洋甘菊提取所用的温度为50℃，料液比为1:15，超声辅助提取时间为70min，之后加热煮沸，浓缩至密度为1.08g/mL(60℃)，双层纱布过滤得滤液，添加丁二醇配置成液体与丁二醇比例为1:1的溶液。
5、积雪草提取所用的溶剂为65％乙醇，料液比为1:15，超声辅助提取温度为45℃，超声时间为1h，60℃浓缩掉乙醇，1um滤纸板过滤，壳聚糖絮凝法除杂条件如下：絮凝液的添加量为0.3％、絮凝温度为35℃、絮凝时间为2h。D-4020 树脂分离纯化，进样速度、洗脱剂浓度和洗脱速度分别是0.4ml/min，60％乙醇， 4ml/min，添加丁二醇配置成液体与丁二醇比例为1:1的溶液。
6、枸桔果提取所用的乙醇浓度为75％，料液比为1:10，提取温度为75℃，提取时间为4h，75℃浓缩至密度为1.10g/mL，1um滤纸板过滤，添加丁二醇配置成液体与丁二醇比例为1:1的溶液。
7、葡萄皮提取以乙酸乙酯为溶剂，料液比为1:10，提取温度为20℃，提取时间为2d，离心转速为10000r/min，离心时间为10min，取上清液，经0.22 μm微孔滤膜过滤，添加丁二醇配置成液体与丁二醇比例为1:1的溶液。
8、取步骤2中的上清液，添加10％的步骤3中的马齿苋提取物，添加5％的步骤4中的金黄洋甘菊提取物，添加5％的步骤5中的积雪草提取物，添加0.5％的步骤6中的枸桔果提取物，添加2％的步骤7中的葡萄皮提取物，45℃加热搅拌溶解，最后即为我们需要的复合物。
实施例2
1、将预先摇床培养好的酿酒酵母接种到酵母培养基(YPD培养基)中发酵，发酵条件是：pH值范围3.0～7.0，发酵温度30℃，摇床速度150rpm，发酵时间4d。
2、将发酵后的发酵液用TDL-80-2B低速离心机，转速7000rpm/min进行菌液离心，收集分离上清液，经0.22μm微孔滤膜过滤。
3、马齿苋提取所用的溶剂为65％乙醇，料液比为1:20，超声辅助提取时间为40min，之后加热提取2h，提取温度为75℃，70℃浓缩掉乙醇，1um滤纸板过滤，大孔树脂进行分离纯化，进样速度、洗脱剂浓度和洗脱速度分别是1ml/min， 60％乙醇，1.8ml/min。添加丁二醇配置成液体与丁二醇比例为1:1的溶液。
4、金黄洋甘菊提取所用的温度为60℃，料液比为1:18，超声辅助提取时间为80min，之后加热煮沸，浓缩至密度为1.10g/mL(60℃)，双层纱布过滤得滤液，添加丁二醇配置成液体与丁二醇比例为1:1的溶液。
5、积雪草提取所用的溶剂为70％乙醇，料液比为1:20，超声辅助提取温度为50℃，超声时间为1h，75℃浓缩掉乙醇，1um滤纸板过滤，壳聚糖絮凝法除杂条件如下：絮凝液的添加量为0.4％、絮凝温度为38℃、絮凝时间为2h。D-4020 树脂分离纯化，进样速度、洗脱剂浓度和洗脱速度分别是0.8ml/min，60％乙醇， 6ml/min，添加丁二醇配置成液体与丁二醇比例为1:1的溶液。
6、枸桔果提取所用的乙醇浓度为80％，料液比为1:15，提取温度为75℃，提取时间为4h，75℃浓缩至密度为1.10g/mL，1um滤纸板过滤，添加丁二醇配置成液体与丁二醇比例为1:1的溶液。
7、葡萄皮提取以乙酸乙酯为溶剂，料液比为1:15，提取温度为30℃，提取时间为2d，离心转速为10000r/min，离心时间为10min，取上清液，经0.22 μm微孔滤膜过滤，添加丁二醇配置成液体与丁二醇比例为1:1的溶液。
8、取步骤2中的上清液，添加10％的步骤3中的马齿苋提取物，添加5％的步骤4中的金黄洋甘菊提取物，添加5％的步骤5中的积雪草提取物，添加0.5％的步骤6中的枸桔果提取物，添加2％的步骤7中的葡萄皮提取物，45℃加热搅拌溶解，最后即为我们需要的复合物。
实施例3
1、将预先摇床培养好的酿酒酵母接种到酵母培养基(YPD培养基)中发酵，发酵条件是：pH值范围3.0～7.0，发酵温度32℃，摇床速度180rpm，发酵时间3d。
2、将发酵后的发酵液用TDL-80-2B低速离心机，转速7000rpm/min进行菌液离心，收集分离上清液，经0.22μm微孔滤膜过滤。
3、马齿苋提取所用的溶剂为70％乙醇，料液比为1:25，超声辅助提取时间为60min，之后加热提取4h，提取温度为85℃，75℃浓缩掉乙醇，1um滤纸板过滤，大孔树脂进行分离纯化，进样速度、洗脱剂浓度和洗脱速度分别是1.8 ml/min，70％乙醇，3.5ml/min。添加丁二醇配置成液体与丁二醇比例为1:1的溶液。
4、金黄洋甘菊提取所用的温度为65℃，料液比为1:25，超声辅助提取时间为90min，之后加热煮沸，浓缩至密度为1.10g/mL(60℃)，双层纱布过滤得滤液，添加丁二醇配置成液体与丁二醇比例为1:1的溶液。
5、积雪草提取所用的溶剂为75％乙醇，料液比为1:25，超声辅助提取温度为55℃，超声时间为2h，75℃浓缩掉乙醇，1um滤纸板过滤，壳聚糖絮凝法除杂条件如下：絮凝液的添加量为0.6％、絮凝温度为45℃、絮凝时间为3h。D-4020 树脂分离纯化，进样速度、洗脱剂浓度和洗脱速度分别是1ml/min，65％乙醇， 7ml/min，添加丁二醇配置成液体与丁二醇比例为1:1的溶液。
6、枸桔果提取所用的乙醇浓度为80％，料液比为1:10，提取温度为80℃，提取时间为6h，75℃浓缩至密度为1.10g/mL，1um滤纸板过滤，添加丁二醇配置成液体与丁二醇比例为1:1的溶液。
7、葡萄皮提取以乙酸乙酯为溶剂，料液比为1:18，提取温度为35℃，提取时间为3d，离心转速为10000r/min，离心时间为10min，取上清液，经0.22 μm微孔滤膜过滤，添加丁二醇配置成液体与丁二醇比例为1:1的溶液。
8、取步骤2中的上清液，添加10％的步骤3中的马齿苋提取物，添加5％的步骤4中的金黄洋甘菊提取物，添加5％的步骤5中的积雪草提取物，添加0.5％的步骤6中的枸桔果提取物，添加2％的步骤7中的葡萄皮提取物，45℃加热搅拌溶解，最后即为我们需要的复合物。
实施例4
1、将预先摇床培养好的酿酒酵母接种到酵母培养基(YPD培养基)中发酵，发酵条件是：pH值范围3.0～7.0，发酵温度35℃，摇床速度220rpm，发酵时间5d。
2、将发酵后的发酵液用TDL-80-2B低速离心机，转速7000rpm/min进行菌液离心，收集分离上清液，经0.22μm微孔滤膜过滤。
3、马齿苋提取所用的溶剂为75％乙醇，料液比为1:20，超声辅助提取时间为50min，之后加热提取2.5h，提取温度为80℃，70℃浓缩掉乙醇，1um滤纸板过滤，大孔树脂进行分离纯化，进样速度、洗脱剂浓度和洗脱速度分别是2 ml/min，65％乙醇，2ml/min。添加丁二醇配置成液体与丁二醇比例为1:1的溶液。
4、金黄洋甘菊提取所用的温度为65℃，料液比为1:22，超声辅助提取时间为75min，之后加热煮沸，浓缩至密度为1.10g/mL(60℃)，双层纱布过滤得滤液，添加丁二醇配置成液体与丁二醇比例为1:1的溶液。
5、积雪草提取所用的溶剂为70％乙醇，料液比为1:20，超声辅助提取温度为50℃，超声时间为1h，70℃浓缩掉乙醇，1um滤纸板过滤，壳聚糖絮凝法除杂条件如下：絮凝液的添加量为0.8％、絮凝温度为40℃、絮凝时间为2h。D-4020 树脂分离纯化，进样速度、洗脱剂浓度和洗脱速度分别是0.8ml/min，70％乙醇， 6ml/min，添加丁二醇配置成液体与丁二醇比例为1:1的溶液。
6、枸桔果提取所用的乙醇浓度为80％，料液比为1:15，提取温度为85℃，提取时间为4h，75℃浓缩至密度为1.10g/mL，1um滤纸板过滤，添加丁二醇配置成液体与丁二醇比例为1:1的溶液。
7、葡萄皮提取以乙酸乙酯为溶剂，料液比为1:20，提取温度为30℃，提取时间为2d，离心转速为10000r/min，离心时间为10min，取上清液，经0.22 μm微孔滤膜过滤，添加丁二醇配置成液体与丁二醇比例为1:1的溶液。
8、取步骤2中的上清液，添加10％的步骤3中的马齿苋提取物，添加5％的步骤4中的金黄洋甘菊提取物，添加5％的步骤5中的积雪草提取物，添加0.5％的步骤6中的枸桔果提取物，添加2％的步骤7中的葡萄皮提取物，45℃加热搅拌溶解，最后即为我们需要的复合物。
上述说明示出并描述了本发明的优选实施例，如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。
效果实施例：
一、抗敏效果的检测：
透明质酸酶活性抑制试验
试验原理：当过敏原初次侵入机体时，机体产生抗体IgE，过敏原再次入侵机体时，与致敏细胞表面的IgE抗体相结合，发生FceRI交联.从而启动活化信号，引发信号传导，使胞内透明质酸酶在内的多种酶活化，此过程被称为过敏反应。透明质酸是组织基质中限制水分和其它胞外物质扩散的成分，被透明质酸酶水解后，细胞间则变为非粘性，引起细胞脱颗粒和合成的新介质渗出，发挥生物效应，导致速发型过敏反应的发生。透明质酸酶是过敏反应的参与者，已有研究表明透明质酸酶与炎症和过敏密切相关，抑制透明质酸酶的活性可使透明质酸不被分解，维持正常的生理功能，从而达到抗敏的功效。
1)溶液配制
透明质酸酶溶液：准确称取0.01g透明质酸酶，加入4mL醋酸缓冲溶液，最终浓度为1250μg/mL。
0.5mg/mL透明质酸钠溶液：准确称取0.005g透明质酸钠，加入到10mL 醋酸缓冲溶液中，充分溶解后备用。
醋酸缓冲溶液(pH＝5.6)：取1155μL冰乙酸于容量瓶中稀释至100mL，混匀后取4.8mL为A溶液；取2.72g乙酸钠结晶，溶解并定容至100mL，混匀后量取45.2mL为B溶液；混合A、B溶液，去离子水定容至100mL混匀。精密测定其pH值，用溶液A或B调pH值至5.6。
埃尔利希试剂：准确称取0.8g对-二甲氨基苯甲醛溶于15mL浓盐酸和15 mL无水乙醇中，备用。
乙酰丙酮溶液：准确取3.5mL乙酰丙酮溶于50mL的1.0mol/L的碳酸钠溶液中。乙酰丙酮溶液需现用现配。
受试样品溶液：分别取产品中各植物提取复合物10mL待用，取最终产品 10mL待用。
2)实验过程
在试管中加入0.1mL的0.25mmol/L的CaCl2溶液和0.5mL透明质酸酶液， 37℃保温培养20min；加入0.5mL样品液，37℃保温培养20min；加入0.5mL 透明质酸钠液，37℃保温30min；然后常温静置5min，加入0.4mol/L的NaOH 溶液0.1mL和乙酰丙酮溶液0.5mL，沸水浴中加热反应15min后立刻冰浴5min；再加入1.0mL埃尔利希试剂并用3.0mL无水乙醇进行稀释，放置20min后进行显色，测定其吸光度值，代入下式计算抑制率。
Figure BDA0002299432190000091
式中：A为对照溶液吸光度值(用醋酸缓冲溶液代替样品溶液)；
B为空白对照溶液吸光度值(用醋酸缓冲溶液代替样品溶液及酶液)；
C为受试样溶液吸光度值；
D为试样空白溶液吸光度值(用醋酸缓冲溶液代替酶液)。
实验时先对A组试样进行波长扫描，波长范围450-700nm，确定最大吸收波长，去离子水作参比，最大吸收波长下对其他试样分别进行ABS值测定。
图1中以1％甘草酸二钾为对照，甘草酸二钾对透明质酸酶的抑制率达到 94.6％，
实施例1、2、3、4对透明质酸酶抑制率分别达到92.3％，94.9％，93.5％， 97.6％。与甘草酸二钾相比，本产品也有着很好的抗敏功效，安全性有更高。
皮肤刺激修复试验
试验原理：皮肤受刺激时，由于局部血流增加，局部温度升高，汗腺分泌增加，代谢加快，可引起TEWL增加，皮肤含水量减少，因此，敏感性皮肤的TEWL、表皮水分、皮肤表面红斑量等生理功能参数会发生特征性变化。本试验旨在皮肤自我修复的速率与添加本产品作后皮肤的修复速率进行比较。
一般选择受试者左、右手臂内测作为受试部位，以规格为2cm×2cm的方形区域进行循环标记；用清水清洗受试区(同一区域)，受试者静坐10min，进行皮肤红值空白值的测量，随后进入涂抹实验阶段；用质量分数为50％的辣椒素水溶液(约0.01mL)对受试区域进行刺激；持续刺激15min及30min后，进行数值采集；在受试区域涂抹测试样品，约0.1mL，15min、30min、45min 后进行数据采集；空白对照涂抹0.05mL纯水；统计受试者实验部位每次测得的数值，分析红值的变化。皮肤红值变化反映在测试周期内，实验区域皮肤泛红随时间变化规律。其值越大，皮肤泛红的程度越大。皮肤红值变化率(％)＝(T-T空白值)/T空白值×100％。
图2到图5，由空白对照涂抹纯水后红值变化率呈现下降趋势，说明皮肤有自我修复能力。
实施例1-4与空白进行比较，反应本产品对于皮肤受到刺激后有着明显的修复效果。
皮肤刺激试验
试验原理：皮肤受到某些特定抗原刺激时，出现以生理功能紊乱或组织细胞损伤为主的异常的特异性的免疫应答，也被称为变态反应。皮肤过敏反应的主要病理变化为通透性增加、皮肤毛细血管扩张、组织变性坏死等，会使皮肤出现瘙痒、发红、肿胀、脱屑等症状。
被测者用Finn Chamber在小臂进行皮肤斑贴试验(斑贴试验)。但是银屑病(牛皮癣)，湿疹(皮疹)患者或其他皮肤损伤，正处在怀孕、哺乳期或服用避孕药、抗组织胺等人群不能参与这项研究。在测试部位用70％的乙醇擦拭，干燥后，在芬兰小室中加入25-30μL的样品，在小臂区域固定芬兰小室，不要沾水。24h后除去贴片；用标记笔在试验部位做好标记，并在30min后，24h 后的再次观察测试部位并详细记录测试人员信息。刺激程度根据((International Contact Dermatitis Research Group:ICDRG)的标准进行了分类，拆除贴片后30min后确定，24h后再次确定，根据皮肤反应国际接触性皮炎研究会判定标准(表1)判定后。再根据皮肤反应平均得分公式[表2]，估算平均得分，皮肤斑贴试验(斑贴试验)根据得分结果确定是否刺激。
[表1]国际接触性皮炎研究会((International Contact Dermatitis ResearchGroup:ICDRG)
判定标准：
Figure BDA0002299432190000131
- ± + ++ +++
Score 0 0.5 1 2 3
※皮肤反应判定标准
1)Negative(-)：无刺激
2)Double or slight reaction and erythema(±)；微刺激
微弱的勉强可见的轻微红斑
3)Erythema+Induration(+)；轻刺激
有明显的红斑，皮肤硬化
4)Erythema+Induration+Vesicle(++)；中刺激
红斑，硬化，有小泡
5)Erythema+Induration+Bullae(+++)；强刺激
红斑，硬化，有大泡
※皮肤反应平均得分Mean score计算公式
Figure BDA0002299432190000141
i＝除去贴片，在30min后，24h后的测试部位根据ICDRG判定标准所得各自分数的结果。标记erythema和edema两种反应,全部适用。
j＝除去贴片，30min后,24h后各自的皮肤有反应测试者人数，标记 erythema和edema两种反应,全部适用。
[表2]皮肤斑贴试验(Patch test))结果
判定(Grade) Mean Score
无刺激(1) 0.00～0.75
微刺激(2) 0.76～1.50
轻刺激(3) 1.51～2.50
中刺激(4) 2.51～4.00
强刺激(5) 4.01
表3去除贴片30min后，皮肤状态
Figure BDA0002299432190000142
Figure BDA0002299432190000151
表4去除贴片24h后，皮肤状态
Figure BDA0002299432190000152
表3和表4的斑贴试验反应了本产品对于皮肤没有刺激，体现植物提取物的安全性。
刺激物的斑贴试验
涂抹本产品后，再按照(3)试验进行刺激物的斑贴试验。
根据图6到图9所示：涂抹本产品后，再进行刺激物的斑贴试验，涂抹区域能大大减缓刺激源对皮肤所造成的损伤，远小于空白对照的致敏率，这表明本产品能在一定程度上保护表皮细胞膜结构完整性及屏障功能，提高皮肤的耐受性，并有修复受损肌肤减轻过敏症状的功效。
清除DPPH自由基试验
实验原理：自由基是含有一个不成对电子的原子团，过敏体质的形成，以及过敏的发作，都与机体内的自由基过多地堆积有关。体内活性氧自由基具有一定的功能，如免疫和信号传导过程。但过多的活性氧自由基就会有破坏行为，导致人体正常细胞和组织的损坏从而导致人体出现敏感症状。优秀的防敏化妆品不仅能高效清除自由基，而且可保护细胞膜不受自由基侵害，还可以抑制致敏因子——组胺的释放，能深入细胞从根本上阻断过敏反应的发生。
试剂准备：
①3.943mg DPPH用95％乙醇定容至50mL
②10mg左右Trolox用95％乙醇定容至100mL
③实施例1，实施例2，实施例3，实施例4
试验步骤：
①UV校零，95％乙醇作为空白样
②预实验(DPPH浓度选择)
500μL DPPH+1000μL 95％乙醇震荡10s，静置10min，测吸光度值(520 nm处吸光度值0.45-0.55，则可作为以下实验DPPH溶液)
③Trolox的测定
Sample Trolox(μL) 95％乙醇(μL) DPPH(μL)
S 100 900 500
SB 100 900+500 0
C 0 100+900 500
CB 0 100+900+500 0
加入DPPH或95％乙醇后，震荡10s，静置10min，测吸光度值
④实验
S:(sample+95％乙醇)共1000μL)+DPPH 500μL
SB:(sample+95％乙醇)共1000μL)+95％乙醇500μL
C:(样品溶剂+95％乙醇)共1000μL)+DPPH 500μL
CB:(样品溶剂+95％乙醇)共1000μL)+95％乙醇500μL
加入DPPH或95％乙醇后，震荡10s，静置10min，测吸光度值
计算公式：抑制率(％)＝[1-(S-SB)/(C-CB)]*100
Trolox S SB C CB
0.150 0.011 0.449 0.003
0.149 0.010 0.448 0.002
Figure BDA0002299432190000191
Figure BDA0002299432190000201
本产品能够通过清除一定的过剩自由基，从而减弱自由基对肥大细胞和嗜碱细胞细胞膜的破坏作用，降低组胺的释放量，起到抗敏止痒的功效。
美白效果的检测：
酪氨酸酶活性抑制试验
实验原理：酪氨酸经过酪氨酸酶催化生成多巴，多巴脱氢后形成多巴醌，多巴醌最大吸收波长在475nm，通过测量475nm波长的吸光率，可以反应出生成多巴醌的浓度的大小。酪氨酸酶与美白活性成分同时存在时，酪氨酸酶的催化活性会受到一定程度的抑制，从而减少多巴醌的生成。根据前后吸光度对比，可以判断美白活性成分对酪氨酸酶活性的抑制程度，进而评估美白成分在体外的美白功效。
材料：缓冲液：K2HPO4(8.71g/500mL)+KH2PO4(6.805g/mL)(pH＝6.80
±0.02)；底物：0.3mg/mL左右的L-酪氨酸；分光光度计：uv(475nm)
实验方法：取少量的酶，用缓冲液溶解；取1.5ml离心管加入(L-酪氨酸(0.3mg/ml)500μL+缓冲液500μL+水450μL+酶50μL)；加酶前，37℃，20min；加酶后，37℃，(加酶-测试)10min后，分光光度计波长475nm处，测吸光度。调整酶浓度，使吸光度(ABS)在0.45-0.55之间。此浓度的酶作为实验用酶液。
Figure BDA0002299432190000211
酪氨酸酶抑制率(％)＝[1-(A-B)/(C-D)]*100
酪氨酸酶抑制率测试结果如下
实施例 抑制率
实施例1 51.76％
实施例2 52.22％
实施例3 53.45％
实施例4 66.91％
本产品除了抗敏功效外，还具有一定的美白功效。
保湿效果的检测：
皮肤角质层水合率试验
采用世界公认的Cornemeter法—电容法：基于水(81)和其他物质的介电常数(＜7)变化相当大，按照含水量的不同，适当形状的测量用电容器会随着皮肤的电容量的变化而变化，而皮肤的电容量又是在测量的范围内，这样就可以
实验方法：测试区域：手前臂内侧
试验前，受试者需要统一清洁前臂内侧，用干的面巾纸搽拭干净，清洁后在受试者前臂内侧做好测量区域标记，正式测试前应该在符合标准的房间内静坐至少30min，前臂暴露，呈测试状态放置，保持轻松。
实验中前臂内侧标记2×4cm2实验区域，同一手臂可同时标记多个区域，区域间隔2cm。测试产品和空白对照均随机分布在手前臂上，先测量各测试区域清洁后30min的空白值，然后按2.0±0.1mg样品/cm2的用量，使用乳胶指套将受试样均匀涂布于实验区内，涂抹后分别测量0.5h、1h、2h、4h受试区域和对照区域的皮肤水分含量。同一个志愿者的测量由同一个测量人员完成。
水合率＝(测试值-空白对照值)/空白对照值*100％
保湿效果的测试结果如下：
实施例1 实施例2 实施例3 实施例4 空白
0.5h 48.05％ 54.95％ 51.45％ 68.51％ 34.23％
1h 46.50％ 49.57％ 44.00％ 59.84％ 35.63％
2h 37.23％ 42.90％ 40.23％ 46.77％ 38.46％
4h 36.04％ 35.78％ 33.66％ 34.23％ 34.37％
本产品同时还具有一定的保湿效果，但保湿效果持续时间仅为2h。
应用实施例：
(1)发酵抗敏保湿精华水
Figure BDA0002299432190000221
Figure BDA0002299432190000231
发酵抗敏保湿精华水工艺：
1.A相80℃加热溶解，搅拌40分钟后开始降温
2.将B相加入A相中，搅拌混合均匀
3.待降温至60℃，依次将C、D相加入其中，搅拌均匀
4.搅拌冷却至40℃加入D相，搅拌均匀即可
(2)抗敏清爽乳液
Figure BDA0002299432190000232
Figure BDA0002299432190000241
抗敏清爽乳液工艺：
1.A相80℃加热溶解
2.B相80℃相加热搅拌溶解后，C相加入B相中搅拌溶解
3.A相加入B相中5500转乳化3min
4.搅拌冷却至40℃加入D相，搅拌均匀即可
(3)祛斑霜
Figure BDA0002299432190000242
Figure BDA0002299432190000251
祛斑霜工艺：
1.A相80℃加热溶解
2.B相80℃加热搅拌溶解
3.B相加入A相中，乳化3min，5000r/min
4.降温到50℃左右后，依次加入C、D相，搅拌溶解混匀即可。

Claims (8)

1.一种抗敏复合物的制备方法，其特征在于：将酵母菌进行发酵后得到发酵液、加入马齿苋花/叶/茎提取物、金黄洋甘菊提取物、积雪草花/叶/茎提取物、枸桔果提取物以及葡萄皮提取物，加热到40～50℃搅拌溶解；抗敏复合液中的按以下组份进行复配：包括8～15％马齿苋花/叶/茎提取物、3～8％的金黄洋甘菊提取物、3～8％的积雪草花/叶/茎提取物、0.5～1％的枸桔果提取物、1～5％的葡萄皮提取物以及剩余的所述发酵液的上清液。
2.根据权利要求1所述的一种抗敏复合物的制备方法，其特征在于：所述发酵液中的酵母菌为酿酒酵母菌，且将所述酿酒酵母菌放入培养基中培养，其中发酵条件为pH值范围3.0～7.0，发酵温度25～35℃，摇床速度50～250rpm，发酵时间2～5d。
3.根据权利要求1所述的一种抗敏复合物的制备方法，其特征在于：所述的马齿苋花/叶/茎提取物，是将马齿苋粉碎，加入60％～75％乙醇作为溶剂，且料液比为1:15～25，超声辅助提取30～60min，再加热提取2～4h，提取温度为70～85℃，然后在60～75℃浓缩掉乙醇，大孔树脂分离纯化得到提取物，其中进样速度、洗脱剂浓度和洗脱速度分别是0.5～2ml/min，60～80％乙醇，1～4ml/min。
4.根据权利要求1所述的一种抗敏复合物的制备方法，其特征在于：所述的金黄洋甘菊提取物，是将金黄洋甘菊与水在50～65℃混合，料液比为1:15～25，超声辅助提取70～90min，然后加热煮沸，浓缩至密度为1.01～1.20g/mL，得到金黄洋甘菊提取物。
5.根据权利要求1所述的抗敏复合物的制备方法，其特征在于：所述的积雪草花/叶/茎提取物，是将积雪草粉碎，加入60％～75％乙醇作为溶剂，且料液比为1:15～25，45～55℃超声辅助提取1～2h，60～75℃浓缩掉乙醇，壳聚糖絮凝法进行除杂，其中絮凝液的添加量为0.3～0.8％、絮凝温度为35～45℃、絮凝时间为2～3h，D-4020树脂分离纯化，进样速度、洗脱剂浓度和洗脱速度分别是0.4～1ml/min，60～75％乙醇，4～8ml/min，之后采用大孔树脂进行纯化得到提取物。
6.根据权利要求1所述的一种抗敏复合物的制备方法，其特征在于：所述的枸桔果提取物，是将枸橘果粉碎后以75％～85％乙醇为溶剂，其中料液比为1:10～15，提取温度为75～85℃，提取时间为4～6h，加热浸泡，过滤，在75～85℃浓缩至密度为1.01～1.20g/mL，得到枸橘果提取物。
7.根据权利要求1所述的一种抗敏复合物的制备方法，其特征在于：所述的葡萄皮提取物，是将葡萄皮粉碎后，以乙酸乙酯作为溶剂，料液比1:10～25，浸泡提取，且温度为20～35℃，提取时间为2～3d，离心转速为10000～12000r/min，离心时间为10～12min，得到葡萄皮提取物。
8.一种抗敏复合物的应用，其特征在于应用于发酵抗敏保湿精华水、抗敏清爽乳液以及祛斑霜。
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