CN113662894A - 一种积雪草酶解发酵物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物发酵技术领域，公开了一种积雪草酶解发酵物及其制备方法和应用。本发明所述积雪草酶解发酵物由积雪草经香菇发酵后酶液预处理，再经乳酸菌和酵母菌发酵制得。本发明以香菇的发酵酶液对积雪草酶解预处理，然后选择适宜的发酵菌种对其进行发酵获得酶解发酵物，相对于金盏花的酶解发酵物，表现出更优异的抗氧化和抗过敏能力，同时积雪草和金盏花酶解发酵物组成的发酵组合物具有协同增加抗氧化能力和抗过敏能力的效果，为其在化妆品领域中的应用提供了更好的基础。

Description

一种积雪草酶解发酵物及其制备方法和应用

技术领域

本申请涉及微生物发酵技术领域，尤其涉及一种积雪草酶解发酵物及其制备方法和应用。

背景技术

积雪草(Centella asiatica(L.)Urban)为伞形科植物积雪草的干燥全草，应用历史悠久，资源丰富。现代医学研究表明积雪草有抗抑郁、促进伤口愈合、治疗瘢痕、抗肿瘤、抗胃溃疡、抗菌、抗氧化等生理功效。积雪草中的活性成分主要是皂苷及皂苷元类，包括积雪草苷、羟基积雪草苷、积雪草酸和羟基积雪草酸等，可有效促进皮肤损伤后的组织修复,特别对促进胶原合成代谢方面有重要的作用。积雪草的提取物能使胶原蛋白和纤维结合素的合成明显增加，具有促进伤口愈合和明显的消炎作用。世界有名的美国Kiehl's药妆护肤品牌专门生产了以积雪草提取物为主要成分的多种系列护肤美容用品，其使用效果深获全世界用户的好评。

金盏花(Calendula officinalis L)属菊科类植物金盏花是菊科一年草本植物，花朵橘黄色，富含黄酮、多酚、花青素、叶黄素、槲皮素等多种活性成分。金盏花也是一种极好的化妆品功能性基质，可调理敏感性肤质，具有舒缓、抗菌、消炎、抗自由基等功效。

制约植物提取产业发展的主要因素在于植物活性成分的提取与分离。传统提取分离方法的缺点有：提取效率低下、能耗偏高、工序繁琐和生产周期长等。为了克服传统提取方法中的缺点，研究者们提出多种新的提取方法用于植物提取产业，提取方法包括：超声提取法、微波辅助提取法、近临界水提取法和酶提取法等。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种积雪草酶解发酵物及其制备方法，使得所制备积雪草酶解发酵物具有较高的抗氧化能力和抗过敏能力；

本发明的另外一个目的在于提供上述制备的积雪草酶解发酵物在制备化妆品中的应用；

本发明的另外一个目的在于提供一种包含积雪草酶解发酵物的植物酶解发酵组合物，使其能够协同提高抗氧化能力；

本发明的另外一个目的在于提供一种包含积雪草酶解发酵物的植物酶解发酵组合物，使其能够协同提高抗过敏能力；

本发明的另外一个目的在于提供上述植物酶解发酵组合物在制备化妆品中的应用。

为了解决上述技术问题或者至少部分地解决上述技术问题，本发明提供了一种积雪草酶解发酵物，由积雪草经香菇发酵后酶液预处理，再经乳酸菌和酵母菌发酵制得。

在本发明具体实施方式中，所述酵母菌为酿酒酵母，可购自于中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为CGMCC 2.3871。所述乳酸菌为植物乳杆菌，购自于中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为CGMCC 1.1856。本发明酶解预处理阶段的香菇菌种同样可以购自于中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为CGMCC 5.898。

作为优选，所述香菇发酵后酶液由香菇在包含碳源、氮源、无机盐、积雪草和金盏花的培养基中发酵后获得，例如在包含麸皮、葡萄糖、玉米粉、K₂SO₄，积雪草和金盏花的培养基中发酵。

与同类功效植物金盏花相比，在相同的工艺条件下制备积雪草和金盏花酶解发酵物，本发明所述积雪草酶解发酵物表现出更加优异的抗氧化能力和抗过敏能力。基于此，本发明提出了所述积雪草酶解发酵物在制备化妆品中的应用，所述化妆品为对额外增加或提高美白、祛斑、抗衰老、抗过敏、抗氧化等效果有需求的化妆品。

同时，本发明还提供了所述积雪草酶解发酵物的制备方法，包括：

步骤1、香菇接种至产酶培养基中发酵获得酶液；

步骤2、积雪草用香菇发酵后酶液酶解预处理；

步骤3、酶解预处理液用乳酸菌和酵母菌发酵，获得所述积雪草酶解发酵物。

作为优选，步骤1为：

香菇接种至包含碳源、氮源、无机盐、积雪草和金盏花的培养基中发酵，发酵液离心取上清获得香菇发酵后酶液；进一步优选地，该培养基包含麸皮、葡萄糖、玉米粉、K₂SO₄，积雪草和金盏花；在具体的实施方式中，该培养基每1L中组分如下：

积雪草1g,金盏花0.5g,麸皮10g，无水葡萄糖20g，玉米粉10g，K₂SO₄ 0.1742g，pH＝9.0，添加适量纯化水定容至1L，121℃灭菌20min。

作为优选，步骤2中酶解预处理在酶液适宜温度范围内，例如50℃±5℃进行酶解；酶解时间3h。

作为优选，步骤3为：

酶解预处理液先接种乳酸菌进行第一阶段的发酵，发酵完成后接种酵母菌进行第二阶段的发酵，发酵液离心的上清液为酶解发酵物。进一步优选地，两个阶段发酵的时间为3d，乳酸菌接种比例为5％，酵母菌接种比例为1％，发酵环境选择菌种的适宜环境即可，在本发明具体实施中给出了37±5℃的温度范围。

此外，本发明还提供了一种包含积雪草酶解发酵物的植物酶解发酵组合物，使其他植物提取物、植物发酵物等成分与所述积雪草酶解发酵物表现出相加(功效类别增加)或增效(功效程度增加)的作用，应用于美白、抗衰老、抗氧化、抗过敏、保湿、紧致肌肤、祛斑等领域的化妆品制备中。

作为优选，本发明所述植物酶解发酵组合物还包括金盏花酶解发酵物，其由金盏花经香菇的发酵后酶液预处理，再经乳酸菌和酵母菌发酵制得。作为最佳的制备方案，其可以参照积雪草酶解发酵物的制备工艺。在组合物中，优选使积雪草酶解发酵物用量不少于金盏花酶解发酵物用量，参考用量比为(1-5):1。

相对于单一的酶解发酵物组，在总含量相同的前提下，本发明植物酶解发酵组合物中积雪草和金盏花酶解发酵物均减少了使用量，但结果显示DPPH清除率、羟自由基清除率ABTS清除率、透明质酸酶抑制率均明显提高；同时，对组胺抑制率和多种促炎性细胞因子抑制率均明显增加；表明，由积雪草和金盏花酶解发酵物组成的组合物表现出在降低各自使用量的前提下增加功效的协同作用。基于此，本发明提出了所述植物酶解发酵组合物在制备化妆品中的应用，所述化妆品为对额外增加或提高美白、祛斑、抗衰老、抗过敏、抗氧化等效果有需求的化妆品。

由以上技术方案可知，本发明以香菇的发酵后酶液对积雪草酶解预处理，然后选择适宜的发酵菌种对其进行发酵获得酶解发酵物，相对于金盏花的酶解发酵物，表现出更优异的抗氧化和抗过敏能力，同时积雪草和金盏花酶解发酵物组成的发酵组合物具有协同增加抗氧化能力和抗过敏能力的效果，为其在化妆品领域中的应用提供了更好的基础。

具体实施方式

本发明公开了一种积雪草酶解发酵物及其制备方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述工艺、应用和产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述工艺、应用和产品进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。显然，所描述的实施例是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

需要说明的是，在本文中，诸如“第一”和“第二”、“步骤1”和“步骤2”以及“(1)”和“(2)”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

在本发明对比实验中，除去各组应有的差异外，其他未特别说明的实验环境、工艺参数、原料来源批次等保持一致，保证实验结果的可对比性。

1、本发明中积雪草/金盏花酶解预处理的香菇酶液制备

(1)香菇产酶方法：

香菇CGMCC 5.898，中国普通微生物菌种保藏管理中心；

产酶培养基：积雪草1g,金盏花0.5g,麸皮10g，无水葡萄糖20g，玉米粉10g，K₂SO₄0.1742g，pH＝9.0，添加适量纯化水定容1L，121℃灭菌20min。

将活化后的香菇种子液接种到产酶培养基中，30℃下振荡恒温培养72h。取香菇发酵液于离心，取上清液即为香菇粗酶液。

2、发酵菌种及其活化

乳酸菌：植物乳杆菌(CGMCC 1.1856)；

酵母菌：酿酒酵母(CGMCC 2.3871)；

酵母菌：将菌种接种于YPD培养基中，于30℃恒温培养36-48h，连续传代3次，使菌种充分活化至活菌数在1.0×10⁷CFU/mL以上；

乳酸菌：将菌种接种于MRS培养基中，于35℃恒温培养24h，连续传代3次，使菌种充分活化至活菌数在1.0×10⁸CFU/mL以上。

3、酶解发酵方式

香菇发酵酶液：积雪草/金盏花干粉＝20:1的比例，50℃酶解3小时后，加入4倍体积的水，分装在250mL的蓝盖试剂瓶中(200mL/瓶)，灭菌后(115℃，30min)准备发酵。首先按接种量5％的比例接入活化好的乳酸菌菌种，混匀，置于37℃的培养箱中，发酵3d后按照1％比例接种酵母菌，发酵3天后，离心得到积雪草酶解发酵物或者金盏花酶解发酵物用于指标检测。

4、指标检测方法

(1)DPPH自由基清除能力的测定：

实验组加入1ml样液+1ml 0.2mmol/L的DPPH。对照组加入1ml无水乙醇+1ml样液。空白组加入1ml无水乙醇+1ml 0.2mmol/L的DPPH，混匀室温(25℃)下静置30min。517nm下，吸取300ul，测定实验组吸光度，记为Ai。测定对照组吸光度，记为Aj。记空白组为A0。每个样品测3次平行。

DPPH清除率(％)＝[1-(Ai-Aj)/A0]×100％

(2)超氧阴离子自由基清除能力测定：

在10mL试管中加入5.7mL Tris-HCl缓冲液(50mmol/L，pH8.2)，加入0.2mL样品进行混合之后放置在25℃保温箱中，10min后取出，再加0.1mL(10mmol/L)邻苯三酚溶液(已预热)，快速混匀后用多功能酶标仪测定320nm波长1min内吸光值的增加值(Aj)，线性范围内算出每1min吸光度的增加值，另取如上试剂，用等体积水替代样品，测定在320nm波长下，1min内吸光度的增加值(Ai)。

超氧阴根离子自由基清除率(％)＝(Ai-Aj)/Ai×100％

(3)羟基自由基(·OH)清除能力测定：

羟基自由基(·OH)清除测试方法参照Fenton反应方法，在试管中依次加入硫酸亚铁溶液(6mmol/L)、过氧化氢溶液(6mmol/L)、样品各2mL后静放置10min，之后再加入2mL水杨酸溶液(6mmol/L)，静放30min后在510nm处测定吸光度A0，用蒸馏水代替样品溶液同样处理，测定吸光值Ax。

羟基自由基(·OH)清除率(％)＝(1-A0/Ax)×100％

(4)ABTS清除力的测定：

0.2mL 7.4mmoL/L ABTS与0.2mL 2.6mmoL/L K2S2O8混合，在室温条件黑暗处反应12h，反应完成后用95％乙醇(pH＝7.4磷酸盐缓冲液，95％乙醇或甲醇)稀释40-50倍，使得混合液在734nm光度下吸收值处于0.68-0.72(工作液)。

配置并吸取浓度为0μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、12μg/mL、16μg/mL、20μg/mL的Vc标准液0.2mL于2mL离心管中，加入0.8mL稀释后的工作液，混合均匀后静置反应6-8min，迅速测定734nm波长处的吸光值。对以标准液浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。将不同处理酵素样品稀释后，分别吸取0.2mL，加入0.8mL稀释后的工作液，混合均匀后静置反应6-8min，迅速测定734nm波长处的吸光值。每个样品测3次平行。

(5)发酵物的体外抗敏实验

采用Elson-Morgan改良法测定透明质酸酶活性的抑制率。配制浓度为1mg/mL的样品溶液，待用。取0.1mL浓度为0.25mmol/L的CaCl₂溶液，加入0.5mL透明质酸酶溶液(1250U/mL)，37℃保温20min；加入0.5mL样品溶液，继续37℃保温20min；加入0.5mL浓度为0.5g/L的透明质酸钠溶液，37℃保温30min，然后常温放置5min；之后加入体积为0.1mL浓度为0.4mol/L的NaOH溶液和0.5mL乙酰丙酮溶液，置于沸水浴中加热15min后立即用冷水冷却5min；加入埃尔利希试剂的体积为1mL，用体积为3mL的无水乙醇进行稀释，混匀，放置20min进行显色。以甘草酸二钾做阳性对照，用紫外可见分光光度计测定吸光值。

其中，A：对照溶液吸光值(用醋酸缓冲液代替样品溶液)；B：对照空白溶液吸光值(用醋酸缓冲液代替样品溶液及酶液)；C：样品溶液吸光值，D：样品空白溶液吸光值(用醋酸缓冲液代替酶液)。先在450nm-700nm范围内扫描A液，以确定最大吸收波长。

(6)对KU812细胞组胺释放的影响

人外周血嗜碱性(KU812)细胞常被用作研究过敏反应的效应细胞，其与人体肥大细胞具有很大的相似性，适合用于建立人类肥大细胞激活和脱颗粒模型。采用KU812细胞组胺释放模型，考查样品对KU812细胞组胺释放的影响，以期探讨积雪草酶解发酵物以及组合物抗I型超敏反应的作用机理。

样品配制及处理：以DMSO配制积雪草和金盏花酶解发酵物，母液浓度为50mg/mL。

细胞培养及模型建立：用含10％胎牛血清的IMDM培养基进行稀释细胞，将细胞密度调整为2.2×10⁶个/mL，然后将得到的细胞悬液，接种于96孔板中，每孔接种量为180μL。分为模型对照组、积雪草和/或金盏花发酵物组、空白对照组、每组设6个复孔，37℃、5％CO₂培养箱培养静置10min，受试样品组分别加入相应浓度剂量的积雪草发酵物溶液20μL(终浓度为100μg/mL)，空白对照组和模型对照组分别加入20μL培养液，置培养箱中预温孵，2h后除细胞空白对照组外，各组细胞加入刺激剂40nM巴豆醇-12-十四烷酸酯-13-乙酸酯(PMA)、1μM钙离子载体A23187，PMA和A23187使用DMSO配制。空白对照组加入同体积含等浓度DMSO培养基。指标检测：2h后离心分离细胞，收集细胞上清液，测定上清液中组胺含量，方法按组胺ELISA检测试剂盒说明书进行。

(7)对KU812细胞促炎细胞因子表达的影响

采用KU812细胞组胺释放模型，考查样品对KU812细胞促炎细胞因子表达的影响，以期探讨样品抗I型超敏反应的作用途径。

样品配制：以DMSO配制积雪草和金盏花酶解发酵物，母液浓度为50mg/mL。

细胞培养及模型建立：用含10％胎牛血清的IMDM培养基将KU812细胞密度调整为2.2×10⁶个/mL的细胞悬液，接种于96孔板上，每孔180μL。分为空白对照组、模型对照组、积雪草和/或金盏花发酵物组，每组设6个复孔，37℃、5％CO₂培养箱培养静置10min后，受试样品组分别加入相应浓度剂量的积雪草和金盏花发酵物溶液20μL(终浓度为100μg/mL)，空白对照组和模型对照组分别加入20μL培养液，置培养箱中预温孵，2h后除细胞空白对照组外，各组细胞加入刺激剂40nM PMA、1μM A23187，PMA和A23187使用DMSO配制。空白对照组加入同体积含等浓度DMSO培养基。

指标检测：培养2h后离心分离细胞，收集细胞上清液，测定细胞上清液中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的含量，具体方法按R&D ELISA Kit说明书步骤进行。

实施例1：发酵酶解物及组合物抗氧化和抗过敏指标检测

结果见表1；

表1

由表1可以明显看出，积雪草酶解发酵物在各项自由基清除率以及抗过敏指标中均明显优于金盏花酶解发酵物；同时，组合物各项指标相对于积雪草酶解发酵物有更进一步的提高，并表现出协同作用。

实施例2：对KU812细胞组胺释放的影响

在过敏和炎症反应中，肥大细胞脱颗粒后释放的活性介质可以直接参与过敏反应，引起细胞通透性增强，参与淋巴细胞反应，对结缔组织也有一定的破坏作用。由于嗜碱性细胞系KU812与肥大细胞具有高度相似性，适合用于建立人类肥大细胞激活和脱颗粒模型。KU812细胞活化导致细胞脱颗粒，化学介质释放如组胺等促炎细胞因子。这些分子作用于血管、平滑肌、结缔组织，以及粘液腺，导致免疫细胞和炎症细胞向炎症病灶募集，从而扩大和维持炎症反应。肥大细胞脱颗粒和一些细胞因子合成，完全依赖钙流动，本实验采用PMA和钙离子载体联合刺激KU812细胞，造成细胞内钙升高，诱导肥大细胞脱颗粒。因此，本实验建立PMA和A23187联合诱导KU812细胞组胺释放模型，用来评价提取物对组胺释放的影响，以期探讨其抗I型超敏反应的作用途径。实验结果如表2所示。

表2

注：不同小写字母表示差异显著(p<0.01)；

从表中数据可以看出，经PMA和A23187联合诱导后，模型对照组组胺含量明显升高，与空白对照组比较有显著性差异。使用酶解发酵物和组合物后，组胺含量明显降低，组合物、积雪草发明酶解物、金盏花发酵酶解物抑制率从高到低依次为56.19％、46.18％和38.87％。

实施例3：对KU812细胞促炎性细胞因子表达的影响

由肥大细胞产生的促炎性因子在炎症反应急性期和后期均起重要作用。细胞因子如IL-6、IL-8也会促进肥大细胞向发生过敏反应的表皮及上皮层募集。抑制肥大细胞功能可以改善过敏反应。肥大细胞脱颗粒和一些细胞因子合成，完全依赖钙内流，本实验采用PMA和钙离子载体联合刺激KU812细胞，造成细胞内钙升高，诱导肥大细胞脱颗粒，产生促炎细胞因子。本实验建立PMA和A23187联合诱导KU812细胞促炎性因子释放模型，评价发酵酶解物和组合物对KU812细胞促炎性因子表达的影响，探讨其抗I型超敏反应的作用途径。实验结果如表3-6所示。

表3 发酵液对TNF-α释放的影响

注：不同小写字母表示差异显著(p<0.01)；

表4 发酵液对IL-1β释放的影响

注：不同小写字母表示差异显著(p<0.01)；

表5 发酵液对IL-6释放的影响

注：不同小写字母表示差异显著(p<0.01)；

表6 积雪草发酵液对IL-8释放的影响

注：不同小写字母表示差异显著(p<0.01)；

结果显示，经PMA和A23187联合诱导后，模型对照组促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8表达明显升高，与空白对照组比较有显著性差异。经酶解发酵物和组合物处理后的KU812细胞，各促炎细胞因子表达明显降低，积雪草和金盏花发酵物均可显著抑制促炎细胞因子表达，下调TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8的表达水平，以积雪草酶解发酵物较优，同时两者组合物表现出协同效果。

以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所申请的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (11)

1.一种积雪草酶解发酵物，其特征在于，由积雪草经香菇发酵后酶液预处理，再经乳酸菌和酵母菌发酵制得。

2.根据权利要求1所述酶解发酵物，其特征在于，所述酵母菌为酿酒酵母。

3.根据权利要求1所述酶解发酵物，其特征在于，所述乳酸菌为植物乳杆菌。

4.根据权利要求1所述酶解发酵物，其特征在于，所述香菇发酵后酶液由香菇在包含碳源、氮源、无机盐、积雪草和金盏花的培养基中发酵后获得。

5.权利要求1-4任意一项所述积雪草酶解发酵物在制备化妆品中的应用。

6.权利要求1所述积雪草酶解发酵物的制备方法，其特征在于，包括：

步骤1、香菇接种至产酶培养基中发酵获得酶液；

步骤2、积雪草用香菇发酵后酶液酶解预处理；

步骤3、酶解预处理液用乳酸菌和酵母菌发酵，获得所述积雪草酶解发酵物。

7.根据权利要求6所述制备方法，其特征在于，步骤1为：

香菇接种至包含碳源、氮源、无机盐、积雪草和金盏花的培养基中发酵，发酵液离心取上清获得香菇发酵后酶液。

8.根据权利要求6所述制备方法，其特征在于，步骤3为：

酶解预处理液先接种乳酸菌进行第一阶段的发酵，发酵完成后接种酵母菌进行第二阶段的发酵，发酵液离心的上清液为积雪草或金盏花酶解发酵物。

9.一种植物酶解发酵组合物，其特征在于，包括权利要求1-4任意一项所述积雪草酶解发酵物。

10.根据权利要求9所述植物酶解发酵组合物，其特征在于，还包括金盏花酶解发酵物，所述金盏花酶解发酵物经香菇发酵后酶液预处理，再经乳酸菌和酵母菌发酵制得。

11.权利要求9或10所述植物酶解发酵组合物在制备化妆品中的应用。